Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Влияние флавоноидов на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных систем при токсическом поражении печени

На правах рукописи

Додонов Николай Сергеевич

ВЛИЯНИЕ ФЛАВОНОИДОВ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ СИСТЕМ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14 00 25 - фармакология и клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

003058911

Самара 2007

003058911

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович

доктор медицинских наук, профессор Кулагин Олег Львович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шаталаев Иван Федорович

кандидат медицинских наук, Радимова Марипа Васильевна

Ведущее учреждение - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоится « ¿L » с^г^_ 2007 г в часов

на заседании диссертационного совета К 208 085 03 при ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава (443079, г Самара, проспект К, Маркса, 165 Б)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Росздрава (г Самара, ул Арцыбушевская, 171)

Автореферат разослан «

» 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент

Е. В. Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Печень является барьером на пути фактически всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека Ксенобиотики, всасывающиеся в желудочно-кишечном тракте, поступают в печень, где они биотрансформируются в основном под действием различных форм цитохрома Р450 Дополнительные этапы метаболизма предполагают связывание с глюкуронидом или сульфатом Образующиеся гидрофильные метаболиты переносятся транспортными белками, находящимися на мембране гепатоцитов, в плазму или желчь и выводятся через почки или желудочно-кишечный тракт Изменения активности печеночных ферментов (наследственный полиморфизм генов, влияние неблагоприятных экологических факторов, заболевания печени, индукция или ингибирование под действием различных веществ) влечет к повышению или снижению детоксикацнонной функции печени На печень, в свою очередь, чужеродные вещества могут оказывать токсическое воздействие, приводящее к токсическому гепатиту, фиброзу и циррозу Инфекционное поражение печени также является причиной развития печеночно-клеточной недостаточности Лекарственные средства, как чужеродные вещества, оказывают токсическое действие на печень, и доля гепатотоксических реакций, вызванных лекарствами, составляет 15% от общего числа, причем почти половина из них приходится на парацетамол

Широкая распространенность острых и хронических заболеваний печени, ранняя инвалидизация лиц трудоспособного возраста ставят поражения печени на одно из первых мест среди заболеваний желудочно-кишечного тракта Прогноз заболеваний печени во многом зависит от времени появления поздних осложнений при гепатитах, от сохранности функции печени в отдаленный период после перенесенного острого заболевания печени В патогенезе этих нарушений важную роль играет увеличение уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) В условиях нормы в крови и тканях определяется низкий уровень ПОЛ, который является важным фактором для осуществления функции цитоплазматических мембран и других структур клетки Однако повышение уровня ПОЛ приводит к нарушению структуры клеточных мембран и функции клеток При патологии печени отмечается повышение содержания высокоактивных форм молекулы кислорода, которые приводят к оксидативному стрессу и нарушают структуру и функцию клеток, в том числе и гепатоцитов, о чем свидетельствуют многочисленные исследования

Однако уровень ПОЛ зависит не только от уровня накопления свободных радикалов, но и от функции противоперекисной защиты Во многих экспериментах установлено, что такими антиоксидантными системами в организме являются ферменты

супероксиддисмутаза глутатионпероксидаза, каталаза, а также неферментные факторы

3

защиты, к которым относятся аскорбиновая кислота, витамин Е, глутатион, биофлавоноиды и другие

Лечение поражений печени антиоксидангными средствами широко исследуется в настоящее время Изучаются как широко известные препараты расторопши пятнистой (силимар, силимарин и др), так и исследуется активность новых препаратов -флавоноидов, производных кверцстина, аргинина, хеноксидезоксихолевой кислоты, производных тиобарбитуровой кислоты и других соединений, которые подробно рассмотрены в обзоре литературы Однако и известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, изучены не в полной мере

В этой связи представляются актуальными исследования по расширению спектра представлений и поиску новых возможностей в использовании лекарственных растений, уже применяющихся в качестве антиоксидантных и гепатопротектрных препаратов, а также выявлению перспективных сырьевых источников для получения фитопрепаратов с обсуждаемой активностью

Цель и задачи исследования. Цель работы - исследование лекарственных растений и субстанций, содержащих флавоноиды, как эффективных антиоксидантных лекарственных средств

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Получить жидкий экстракт и настойку расторопши пятнистой, установить соответствие показателей качества сырья и препаратов нормативной документации (НД), выделить и проанализировать индивидуальные вещества кверцетин и силибин

2 Изучить показатели качества препарата «Левзеи экстракт жидкий», их соответствие НД, определить содержание веществ экдистероидной и флавоноидной природы

3 Изучить интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов супероксиддисмутазы, катапазы и глутатионпероксидазы в гомогенате печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом

4 Изучить интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в гомогенате печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом и одновременном введении этилового спирта

5 Сравнить влияние карсила, силимара, настойки и жидкого экстракта расторопши на функции антиоксидантных систем в гомогеиатах печени на фоне токсического гепатита и установить возможные точки приложения гепатозащитного действия

препаратов на процессы перекисного окисления липидов и противоперекисной защиты

6 Изучить влияние на эти процессы препарата «Экстракт левзеи жидкий» и определить выраженность снижения уровня перекисного окисления липидов в ткани печени при ее токсическом поражении

7 Изучить влияние индивидуальных флавоноидов дигидрокверцетина, кверцетина, силибина и рутина на отдельные звенья перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты с целью выявления возможности дифференцированного влияния на активность супероксидцисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в ткани печени на фоне токсического гепатита

Научная новизна исследования. Расширен спектр представлений о некоторых лекарственных растениях (расторопша пятнистая, левзея сафлоровидная), содержащих флавоноиды, в плане их использования для получения суммарных препаратов и индивидуальных соединений с антиоксидантными свойствами

Впервые показано повышение активности супероксиддисмутазы под действием субстанции «Силимар» при токсическом поражении печени

Впервые установлена антиоксидантная и гепатопротекторная активность препарата «Экстракт левзеи жидкий» При его применении снижается уровень перекисного окисления липидов и повышается активность ферментов глутатионпероксидазы и каталазы при токсическом поражении печени Одним из механизмов гепатопротекторного действия экстракта левзеи является повышение активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы

Уточнен спектр антиоксидантной активности индивидуальных соединений флавоноидной природы, и на этой основе выявлены зависимости в ряду химическая структура - действие Кверцетин увеличивает активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени при ее токсическом поражении, что является одним из механизмов действия кверцетина Установлен дополнительный механизм действия силибина, заключающийся в повышении активности фермента глутатионпероксидазы при токсическом гепатите, что является одной из составляющих в реализации гепатопротекторного действия силибина Показано увеличение активности фермента каталазы под действием рутина при токсическом поражении печени, что также является одним из механизмов гепатопротекторного действия рутина

Практическая значимость работы. Создана основа для дальнейшей направленной разработки новых лекарственных средств с антиоксидантной активностью на основе сырья расторотни пятнистой и левзеи сафлоровидной Рекомендовано расширить показания к применению препарата «Экстракт левзеи жидкий» при гепатитах и других поражениях печени в качестве гепатопротектора Результаты исследования препаратов расторопши пятнистой и флавоноидов внедрены в учебный и научный процесс на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 06 04 2007 г) Положения, выносимые па защиту:

1 Соответствие сырья расторопши пятнистой и полученных препаратов экстракт расторопши жидкий и настойка расторопши требованиям нормативной документации

2 Зависимость антиоксидантной активности от химического строения ряда флавоноидов (флавонолы, флаванонолы, флаволигнаны)

3 Результаты изучения гепатопротекторной активности препаратов расторопши пятнистой - карсила, силимара, настойки расторопши и экстракта расторопши жидкого

4 Результаты изучения антиоксидантной активности флавоноидов -дигидрокверцетина, кверцетина, силибина и рутина

5 Результаты исследования гепатопротекторной активности экстракта левзеи жидкого

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200112941) и Республиканской программы «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536)

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на XXV межрегиональном съезде врачей «Управление качеством здравоохранения через новации» (Самара - Тольятти, 2005), на IV международной конференции «Медико-социальная экология личности состояние и перспективы» (Минск, 2006), на ХП1 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), на XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского 6

военно-медицинского института (Самара, 2006), на XXIII International Conference on Polyphenols (Winnipeg-Canada, 2006)

Основное содержание работы опубликовано в 7 научных работах Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 59 таблиц, 12 рисунков Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), глав 3 и 4, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение (глава 5), общих выводов и списка литературы, включающего 273 источника, из которых 119 — на иностранных языках

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В качестве объектов исследования служили фармакопейный препарат из корневищ левзеи сафлоровидной Rhaponticum carthamoides (Willd) Iljin - экстракт левзеи жидкий, экстракт из плодов расторопши пятнистой жидкий и настойка расторопши, препараты карсил и силимар, а также индивидуальные соединения - силибин (2) и кверцетин (3) В качестве препаратов сравнения использовали дигвдрокверцетин (1) (образец любезно предоставлен зав кафедрой органической химии ММА им ИМ Сеченова, профессором Н А Тюкавкиной), применяемый в виде препарата «Диквертин» в качестве антиоксидантного средства, также широко применяемый в медицинской практике ангиопротектор - рутин (4) (лекарственная субстанция) (Государственный реестр, 2004) 1. Выделение и анализ фитопрепратов и индивидуальных флавоноидов. Жидкий экстракт расторопши (11) получен методом реперколяции с использованием 80%-ного этилового спирта из плодов Stlybum marianum (L) Gaertn (собраны 20 августа 2004 г), культивируемой в Самарской области (п Антоновка Сергиевского района), настойка расторопши (1 5) получена методом дробной мацерации Плоды расторопши пятнистой соответствуют требованиям ВФС 42-3380-99 В соответствии с ВФС 42-3381-99 нами определена подлинность жидкого экстракта расторопши и содержание флаволигнанов в экстракте, а также установлена подлинность и содержание действующих веществ настойки расторопши в соответствии с проектом ФСП на препарат Содержание суммы флаволигнанов в полученных образцах экстракта расторопши жидкого в пересчете на силибин (2) - 2,43 ± 0,022 %, а в настойке расторопши - 0,48 ± 0,011 % В соответствии с ФС 42-1995-99 нами установлена подлинность и определено содержание экдистероидов экстракта левзеи жидкого, которое составило 1,41 ± 0,035 %, и по методике определения суммы флавоноидов (в

пересчете на рутин), в варианте дифференциальной спектрофотометрии, установлено содержание флавоноидов, которое составило - 1,39 ± 0,028 %

и *

Таксифолин (дигидрокверцетин) (1) О*

СН2ОН

Т

осн3

ОН С

1/И с

Кверцетин (3)

Рутин (4)

Флаволигнан силибин (2) выделен в индивидуальном виде с использованием колоночной хроматографии (силикагель Ъ 40/100) При этом элюирование целевых веществ осуществляли хлороформом и смесью хлороформ-этиловый спирт в различных соотношениях (99 1, 98 2, 97 3, 95 5, 93 7, 91 9, 90 10, 88 12, 85 15, 80 20) После упаривания фракций, содержащих силибин (2), очистку осуществляли перекристаллизацией из этилового спирта Кверцетин (3) получен в ходе кислотного гидролиза рутина (4) с последующей перекристаллизацией из водного спирта Химическое строение выделенных веществ устанавливали с использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии, а также сравнением физико-химических констант и хроматографической подвижности (ТСХ-анализ) с достоверно известными образцами веществ

2. Исследование антиоксидантной активности препаратов на животных.

Рандомизированное исследование антиоксидантной активности фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, осуществляли на белых половозрелых лабораторных крысах обоего пола массой тела 200-260 граммов В эксперименте участвовало 18 групп крыс по

10 штук в каждой группе В эксперименте участвовали половозрелые крысы одного года рождения, с целью свести к минимуму возрастные различия активности ферментов Крысы находились на обычном рационе вивария и были вовлечены в эксперимент одновременно, что исключает влияния внешних температурных, климатических и иных факторов на разницу активности ферментов у опытных и контрольных групп животных Во время эксперимента доступ крыс к воде и корму был свободным

Для воспроизведения токсического повреждения печени нами был выбран четыреххлористый углерод Его введение в желудок или парентерально вызывает токсическое повреждение печени По характеру действия четыреххлористого углерода можно отметить, что он является наркотическим средством с ярко выраженным токсическим действием на гепатоциты При остром отравлении может наступить потеря сознания, возбуждение, судороги, может возникнуть энцефаломиелит, кровоизлияния и эмболия сосудов мозга Однако повреждения печени являются превалирующими и определяют картину токсического действия этого соединения

При хроническом отравлении преобладает поражение печени и, в меньшей степени, почек Наблюдается увеличение печени, уменьшение количества выделяемой мочи, повышение содержания остаточного азота и мочевины крови, понижение содержания хлоридов В крови увеличивается уровень трансаминаз, в основном аланинаминотрансферазы, альдолазы, прямого и непрямого билирубина, что свидетельствует о преимущественном поражении печени

В обзоре литературы указывалось, что в результате токсического повреждения печени в крови увеличивается уровень перекисного окисления липидов Поэтому нами было применено многократное введение четыреххлористого углерода крысам в дозе 2,0 г/кг веса животного 50% масляный раствор четыреххлористого углерода вводился крысам внутримышечно ежедневно в течение шести дней Для растворения четыреххлористого углерода было использовано персиковое и абрикосовое масло

Для изучения влияния на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных ферментов были взяты фитопрепараты содержащие флавоноиды и индивидуальные флавоноиды

Фитопрепараты вводились крысам с целью защиты от поражения печени четыреххлористым углеродом Фитопрепараты вводились опытным крысам внутрижелудочно через зонд ежедневно в течение 6-ти дней параллельно с введением четыреххлористого углерода Настойка и экстракт расторопши, экстракт левзеи жидкий вводились в дозе 150 мг/кг массы тела животного, силимар вводился в дозе 100 мг/кг

массы тела, а индивидуальные вещества дигидрокверцетин, кверцетин, силибин, рутин и препарат карсил в пересчете на силимарин в дозе 25 мг/кг Выбор доз обусловлен литературными данными

Контрольной группе крыс 50% масляный раствор четыреххлористого углерода вводился ежедневно в течение 6-ти дней Была задействована интактная группа крыс, а также группа крыс, получавшая наряду с четыреххлористым углеродом 40% спирт в дозе 0,2 мл/кг в 10 раз разбавленный водой На седьмой день крысы забивались, у них удалялась печень Крысы забивались в соответствии с этическими нормами под эфирным наркозом методом декапитации Печень крыс была значительно увеличена в объеме и макроскопически изменена, ткань печени на разрезе приобретала серый оттенок После извлечения печень промывалась физиологическим раствором и сразу замораживалась в сосуде с твердой углекислотой («сухим льдом») при температуре -70 -80 °С Затем из ткани печени готовился гомогенат для проведения анализа на содержание малонового диальдегида (МДА), а также определения активности супероксиддисмугазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы Гомогенат готовился механическим измельчением ткани печени массой 1 грамм с 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) со скоростью 5000 об/мин в сосуде с двойными стенками, постоянно охлаждаемом проточной водой

Все данные активности ферментов и уровня перекисного окисления липидов рассчитывались на содержание белка Определение белка в печеночной ткани производилось микробиуретовым методом В основе метода лежит образование фиолетового комплекса соединения меди и пептида при обработке белка щелочным раствором сернокислой меди Для развития окраски необходимо, по крайней мере, наличие двух пептидных связей Чувствительность метода 0,1-2 мг белка в пробе В качестве реактивов применяется стандартный раствор альбумина 2мг/мл, 6% раствор едкого натра, реактив Бенедикта 17,3 г цитрата натрия и карбоната натрия растворяют в 50 мл воды при нагревании, не доводя до кипения Затем к раствору при помешивании добавляют 1,73 г сульфата меди, предварительно растворенного в 10 мл воды Смесь доводят водой до 100 мл

Исследуемый раствор белка, содержащий 0,1-2 мг белка, доводят водой до 2 мл Затем добавляют 2 мл 6% раствора щелочи и 0,2 мл реактива Бенедикта Через 15 минут измеряют экстинкцию при длине волны 330 нм на спектрофотометре Полученные данные используют для построения калибровочного графика в зависимости от величины оптической плотности и количества белка в пробе

Полученные данные являются выборками из генеральных совокупностей с нормальным распределением Для статистической обработки данных нами был применен однофакторный дисперсионный анализ Для статистического анализа средних выборок был использован t-критерий с поправкой Бонферонни

3. Изучение влияния фитопрепаратов на уровень малонового диальдегида, как показателя перекисного окисления липидов.

Определение конечного продукта перекисного окисления липидов - малоиового диальдегида (МДА) осуществляли на основе принципа (Стальная И Д , Гаришвили Т Г, 1977, модификация Коробейниковой О H, 1989), в соответствии с которым при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при длине волны 532 нм, который и регистрируется фотометрически

0,5 мл гомогената добавляют в 1 мл 15%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК), перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин К 1 мл надосадочной жидкости (центрифугат должен быть прозрачен) добавляют 2 мл 0,8%-го раствора ТБК Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 15 минут После охлаждения в течение 30 минут пробы колориметрируют при 532 нм на фоне контроля (1 мл ТХУК и 2 мл ТБК) Количество МДА в пробах рассчитывают, используя молярный коэффициент экстинкции 1,56 1 05М см

В результате исследований было установлено, что при интоксикации четыреххлористым углеродом в дозе 2,0 г/кг в печени повышается интенсивность перекисного окисления липидов, что проявляется в увеличении содержания малонового диальдегида в гомогенате (см таблицу 1)

Из таблицы 1 видно, что при интоксикации четыреххлористым углеродом в дозе 2,0 г/кг при параллельном введении спирта в дозе 0,2 мл/кг в печени повышается интенсивность перекисного окисления липидов Экстракт левзеи жидкий в дозе 150 мкл/кг уменьшает процессы перекисного окисления липидов в печени с токсическим

Таблица 1 - Влияние фитопрепаратов на уровень малонового диальдегнда

Фитопрепараты Малоновый диальдегид нмоль/мг белка печени (опыт) Малоновый диальдегид нмоль/мг белка печени (контроль)

Интактные (в сравнении с ССЦ) 13,33 ± 3,73 р<0,01 26,29 ±3,09

Интактные (в сравнении с ССЦ+спирт) 15,37 ± 2,85 р<0,01 28,06 + 4,44

ССЦ + экстракт левзеи 18,29 ± 1,88 р<0,01 22,48+3,02

СС14 + карсил 19,28 ± 2,39 р<0,01 26,29 ±3,09

ССЦ + экстракт расторопши 18,63 ± 2,81 р<0,05 22,48 ±3,02

ССЦ+ настойка расторопши 21,05 ± 3,19 р<0,01 26,75 ±4,02

ССЦ + силимар 22,10 ± 3,52 р<0,05 26,75 ±4,02

СС14 + дигидрокверцетин 17,21 ±2,20 р<0,01 26,29 ±3,09

CCI4 + кверцетин 21,21 ±2,12 р<0,01 28,02 + 3,50

ССЦ + силибин 20,93 ± 3,74 р<0,01 28,02 ±3,50

ССЦ + рутин 21,07 ± 1,48 р<0,01 28,02 ±3,50

Препарат карсил в дозе 25мг/кг силимарина понижает интенсивность процессов перекисного окисления липидов печени крыс отравленных четыреххлористым углеродом Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в печени крыс при токсическом воздействии Настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом Силимар в дозе 100 мг/кг снижает уровень малонового диальдегида в печени крыс Препарат дигидрокверцетин или таксифолин в дозе 25мг/кг понижает содержание малонового диальдегида в гомогенате Кверцетин в дозе 25 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в печени крыс с токсическим гепатитом Силибин в дозе 25 мг/кг уменьшает уровень малонового диальдегида в гомогенате Рутин в дозе 25 мг/кг снижает интенсивность процессов перекисного окисления в печени крыс при токсическом воздействии 12

4. Изучение влияпия фитопрепаратов па активность супероксиддисмутазы.

В гомогенате печени определяли активность супероксиддисмутазы (СОД) -фермента, инактивирующего супероксидные радикалы и уменьшающего интенсивность перекисного окисления липидов Супероксиддисмутаза относится к числу ферментов, входящих в состав антиоксидазной защитной системы организма Активность супероксиддисмутазы определялась по методу, описанному В С Гурвичем и др (1990)

Таблица 2 - Влияние фитопрепаратов на активность супероксиддисмутазы

Фитопрепараты Супероксиддисмутаза АЕД/мг белка печени (опыт) Супероксиддисмутаза АЕД/мг белка печени (контроль)

Интактные (в сравнении с CCI4) 1,20 ± 0,45 р<0,05 0,72 ±0,31

Интактные (в сравнении с ССЦ+спирт) 1,90±0,18р<0,05 1,47 ±0,46

ССЦ + экстракт левзеи 0,95 ± 0,33 р>0,05 0,86 ±0,17

ССЦ + карсил 1,28 ± 0,34 р<0,01 0,72 ±0,31

ССЦ+ экстракт расторопши 0,94 ± 0,37 р>0,05 0,86 ± 0,17

ССЦ + настойка расторопши 1,67 ± 0,46 р>0,05 1,24 ± 0,31

ССЦ + силимар 1,69 ± 0,29 р<0,05 1,24 ± 0,31

ССЦ + дигидрокверцетин 1,07 ± 0,29 р>0,05 0,72 ±0,31

ССЦ + кверцетин 2,18 ± 0,33 pcO.Ol 1,28 ± 0,55

ССЦ+ силибин 1,89 ± 0,45 р<0,05 1,28 ±0,55

ССЦ + рутин 1,47 ±0,11 р>0,05 1,28 ±0,55

В соответствии с данной методикой, гомогенат печени центрифугируют с охлаждением при 6000 об/мин в течение 10 мин К 1 мл гомогената приливают 3 мл фосфатного буфера (pH 7,4) и центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин К 0,5 мл верхней фазы добавляют 1 мл раствора хлороформа с метанолом (2 1) для осаждения гемоглобина Смесь охлаждают и тщательно перемешивают в течение 10 мин Затем содержимое пробирок центрифугируют для удаления гемоглобина и хлороформа Верхний слой отсасывают, добавляют несколько капель насыщенного раствора КН2РО4 и разводят фосфатным буфером в 20 раз 0,2 мл раствора вносят в инкубационную смесь содержащую 57 мкМ нитросинего тетразолия (HCT), 98,5 мкМ НАДН, 16 мкМ

13

феназинметасульфата (ФМС) Реакция протекает 10 мин в 0,5 М фосфатном буфере с ЭДТА (рН 8,3) при температуре 25°С в аэробных условиях В контрольную пробу фермент не вносят Затем смесь фотометрируют при длине волны 540 нм

Активность СОД рассчитывают по формуле А=Т %/(100 %—Т %), где А — активность фермента (в уел ед), рассчитанная/мг белка (в г), Т% — процент торможения реакции восстановления НСТ или окисления адреналина в пробе за 1 мин (50 % ингибирования этой реакции соответствует 1 уел ед)

Из таблицы 2 видно, что при интоксикации четыреххлористым углеродом снижается активность супероксиддисмутазы, как и при интоксикации четыреххлористым углеродом и одновременном введении спирта в дозе 0,2 мл/кг Экстракт левзеи жидкий в дозе 150 мкл/кг проявляет тенденцию к повышению активности супероксиддисмутазы (данные статистически не достоверны) Препарат карсил в дозе 25мг/кг силимарина повышает активность фермента Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мкл/кг и настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг проявляют тенденцию к повышению активности супероксиддисмутазы в гомогенате печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом Силимар в дозе 100 мг/кг повышает активность фермента супероксиддисмутазы печени крыс Препарат дигидрокверцетин или таксифолин в дозе 25мг/кг проявляет тенденцию к повышению активности супероксиддисмутазы в гомогенате Кверцетин в дозе 25 мг/кг повышает активность фермента Силибин в дозе 25 мг/кг, подобно карсилу и силимару, повышает активность фермента супероксид дисмутазы в гомогенате печени крыс Рутин в дозе 25 мг/кг статистически достоверно не повышает активность супероксиддисмутазы печени крыс при токсическом воздействии 5. Определение активности каталазы.

Определение активности каталазы основано на способности перекиси водорода

образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс (Королюк М А,

Иванова Л И , Майорова И Т, 1988)

Реакцию запускают добавлением 0,1 мл гомогената к 2 мл 0,03%-го раствора

перекиси водорода В холостую пробу добавляют дистиллированную воду вместо

исследуемой жидкости Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 1 мл 4%-го

молибдата аммония Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе на длине волны 410 нм на

фоне контроля (2 мл воды, 0,1 мл гомогената, 1 мл молибдата аммония)

Активность каталазы рассчитывают по формуле

_ (Ахспр-Aonj,p)xVxK t =-—- , где

t X С белка

V = объем гомогената (0,1 мл) К = 22,2 Ю'мМ'см1 t = время (600 сек),

Таблица 3 показывает, что при интоксикации четыреххлористым углеродом снижается активность каталазы, как и при интоксикации четыреххлористым углеродом и одновременном введении спирта в дозе 0,2 мл/кг Экстракт левзеи жидкий в дозе 150 мкл/кг повышает активность фермента каталазы Препарат карсил в дозе 25мг/кг силимарина проявляет тенденцию к повышению активности каталазы (данные статистически не достоверны) Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мкл/кг и настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг проявляют тенденцию к повышению активности каталазы в гомогенате печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом Силимар в дозе 100 мг/кг также проявляет тенденцию к повышению активности фермента каталазы печени крыс Препарат дигидрокверцетин или таксифолин в дозе 25мг/кг проявляет тенденцию к повышению активности каталазы в гомогенате Кверцетин в дозе 25 мг/кг повышает активность фермента Силибин в дозе 25 мг/кг проявляет тенденцию к повышению активности фермента каталазы в гомогенате печени крыс Рутин в дозе 25 мг/кг повышает активность каталазы печени крыс при токсическом воздействии

Таблица 3 - Влияние фитопрепаратов на активность каталазы

Фитопрепараты Каталаза нМоль/с Н2Ог/мг белка печени (опыт) Каталаза нМоль/с Н2О2/МГ белка печени (контроль)

Интактные (в сравнении с ССЦ) 0,0737 ±0,0101 р<0,05 0,0566 ± 0,0135

Интактные (в сравнении с ССЦ+спирт) 0,1070 ± 0,0226 р<0,05 0,0858± 0,0101

ССЦ + экстракт левзеи 0,0740 ±0,0145 р<0,05 0,0554 ± 0,0155

СС14 + карсил 0,0670 ± 0,0219 р>0,05 0,0566 ± 0,0135

ССЦ + экстракт расторопши 0,0642 ± 0,0201 р>0,05 0,0554 ± 0,0155

ССЦ + настойка расторопши 0,1047± 0,0369 р>0,05 0,1011± 0,0206

ССЦ + силимар ОД 104± 0,0269 р>0,05 0,1011± 0,0206

ССЦ + дигидрокверцетин 0,0663 ± 0,0079 р>0,05 0,0566 ± 0,0135

ССЦ + кверцетин 0,1060 ±0,0218 р<0,05 0,0839 ±0,0125

ССЦ + силибин 0,1050 ± 0,0256 р>0,05 0,0839 ± 0,0125

ССЦ + рутин 0,1045 ±0,0198 р<0,05 0,0839 ±0,0125

6. Определение активности глутатионпероксидазы.

Определение активности глутатионпероксидазы (ГП) осуществляют в соответствии со следующей методикой (Моин В М, 1986) 100 мкл гомогената преинкубируют с 830 мкл 0,1 М трис-НС1 буфера (рН 8,5), содержащего 6 мМ ЭДТА и 12 мМ азида натрия, в течение 10 мин при 37 °С, добавляют 70 мкл 20 мМ раствора гидроперекиси третичного бутила (готовят перед анализом разведением исходного реактива в 500 раз) и инкубируют точно 5 мин Реакцию останавливают добавлением 200 мкл холодной трихоруксусной кислоты (ТХУК), осажденные белки удаляют центрифугированием 100 мкл супернатанта вносят в 10 мл трис-НС1 буфера и добавляют 100 мкл реактива Эллмана (0,01 М раствор дитионитробеязойной кислоты в метаноле) Через 5 мин пробы фотометрируют при 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см Контрольная проба отличается тем, что гомогенат вносят непосредственно перед осаждением белков

С учетом разведения биологического материала в данном методе и коэффициента молярной экстинкции ТНФА при 412 нм — 11400, рассчитывают активность ГП в микромолях, израсходованного в реакции субстрата по формуле (Е контроля — Е опыта) 2147= мкМоль/мин/мг белка печени Разработанный метод достаточно точен коэффициент вариации равен 1,8 % Таблица 4 - Влияние фитопрепаратов на активность глутатионпероксидазы

Фитопрепараты Глутатионпероксидаза мкМоль/мин/мг белка печени (опыт) Глутатионпероксидаза мкМоль/мин/мг белка печени (контроль)

Интактные (в сравнении с СС14) 1,87 ± 0,66 р<0,05 1,12 ± 0,25

Интактные (в сравнении с ССЦ+спирт) 1,98 ±0,30 р<0,05 1,55 ±0,31

СС14 + экстракт левзеи 1,61 + 0,38 р<0,05 1,20 ± 0,32

СС14 + карсил 1,41 ± 0,49 р>0,05 1,12 ± 0,25

ССЦ + экстракт расторопши 1,41 ± 0,32 р>0,05 1,20 ± 0,32

ССЦ+ настойка расторопши 1,25 ± 0,41 р>0,05 0,96 ±0,34

ССЦ + силимар 1,17 ±0,33 р>0,05 0,96 ± 0,34

ССЦ+ дигидрокверцетин 1,45 ± 0,45 р>0,05 1,12 ± 0,25

ССЦ + кверцетин 2,03 ± 0,22 р<0,01 1,50 ±0,33

ССЦ + силибин 1,93 ± 0,22 р<0,05 1,50 ±0,33

ССЦ + рутин 1,70 ± 0,27 р>0,05 1,50 ±0,33

Как показывает таблица 4, при интоксикации четыреххлористым углеродом снижается активность глутатионпероксидазы, как и при интоксикации четыреххлористым углеродом и одновременном введении спирта в дозе 0,2 мл/кг Экстракт левзеи жидкий в дозе 150 мкл/кг повышает активность фермента глутатионпероксидазы Препарат карсил в дозе 25мг/кг силимарина проявляет тенденцию к повышению активности глутатионпероксидазы (данные статистически не достоверны) Экстракт расторонши жидкий в дозе 150 мкл/кг и настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг проявляют тенденцию к повышению активности глутатионпероксидазы в гомогенате печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом Силимар в дозе 100 мг/кг также проявляет тенденцию к повышению активности фермента глутатионпероксидазы печени крыс Препарат дигидрокверцетин или таксифолин в дозе 25мг/кг проявляет тенденцию к повышению активности глутатионпероксидазы в гомогенате Кверцетин в дозе 25 мг/кг повышает активность фермента Силибин в дозе 25 мг/кг повышает активность фермента глутатионпероксидазы в гомогенате печени крыс Рутин в дозе 25 мг/кг проявляет тенденцию к повышению активности глутатионпероксидазы печени крыс при токсическом воздействии четыреххлористым углеродом

Сравнительная оценка влияния препаратов на отдельные звенья аитиоксидантной защиты.

В результате исследований было установлено, что при интоксикации четыреххлористым углеродом в дозе 2,0 г/кг в печени повышается интенсивность перекисного окисления липидов, что проявляется в увеличении содержания малонового диальдегида в гомогенате При отравлении четыреххлористым углеродом снижается противоперекисная защита, в частности падает активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы (см таблицу 5)

Нами было показано, что при интоксикации четыреххлористым углеродом в дозе 2,0 г/кг при параллельном введении спирта в дозе 0,2 мл/кг в печени повышается интенсивность перекисного окисления липидов, и снижается противоперекисная защита, понижается активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы Спирт не влияет в значительной мере на токсическое действие четыреххлористого углерода, так как не нормализует перекисное окисление липидов печени крыс и активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы гепатоцитов Поэтому применение его в качестве растворителя не изменяет картину антиоксидантного, гепатопротекторного действия фитопрепаратов

Экстракт левзеи жидкий в дозе 150 мкл/кг уменьшает процессы перекисного окисления липидов в печени с токсическим гепатитом, а также повышает активность ферментов каталазы и глутатионпероксидазы Влияние на активность ферментов каталазы и глутатионпероксидазы является одним из механизмов гепатопротекторного действия экстракта левзеи, который, к тому же, проявляет тенденцию к увеличению активности фермента супероксидцисмутазы

Таблица 5 - Влияние фитопрепаратов на звенья антиоксидантной защиты

Фитопрепараты Малоновы? диальдегнд нмоль/мг белка печени (опыт) Малоновый диальдегнд нмоль/мг белка печени (контроль) Супероксид дисму-таза АЕД/мг белка печени (опыт) Супероксид дисму-таза АЕД/мг белка печени (контроль) Каталаза нМоль/с Н202/мг белка печени (опыт) Каталаза нМоль/с Н202/мг белка печени (контроль) Глугатионп ерокси-даза мкМоль/ми н/мг белка печени (опыт) Глутатиопп ерокси-даза мкМоль/ми н/мг белка печени (контроль)

Интактные (в сравнении с СС14) 13,33±3,73 р<0 01 2б,29± 3 09 1,20*0,45 р<0,05 0,72*0,31 0,0737* 0,0101 р<005 0,0566* 0,0135 1,87*0,66 р<0,05 1,12*0,25

Интактные (в сравнении с СС14+спирт) 15,37*2 85 р<0 01 28,06± 4,44 1,90*0,18 р<0,05 1,47*0,46 0,1070* 0,0226 р<0,05 0,0858* 0 0101 1,98*0,30 р<0 05 1,55*0,31

ССЦ + экстракт левзеи 18,29*1,88 р<0,01 22,48± 3,02 0,95 ±0,33 р>0,05 0 86*0,17 0,0740* 0,0145 р<0,05 0,0554* 0 0155 1,61*0,38 р<0,05 1,20*0,32

СО,+ карсил 19,28±2,39 р<0,01 26,29* 3,09 1,28*0,34 р<0,01 0,72*0,31 0,0670* 0,0219 р>0,05 0,0566* 0,0135 1,41*0,49 р>0,05 1,12*0,25

СС14 + экстракт расторопши 18 63*2,81 р<0,05 22,48± 3,02 0,94*0,37 р>0,05 0,86*0,17 0,0642* 0,0201 р>0,05 0,0554* 0,0155 1,41*0,32 р>0,05 1,20*0,32

ССЦ + настойка расторопши 21,05 ±3,19 р<0,01 26,75± 4,02 1.67*0,46 р>0,05 1,24*0,31 0,1047* 0,0369 р>0,05 0,1011* 0,0206 1,25*0,41 р>0 05 0,96*0,34

ССЦ + силимар 22,10±3,52 р<0,05 26,75* 4,02 1,69*0,29 р<0,05 1,24*0,31 0,1104* 0,0269 р>0,05 0,1011* 0,0206 1,17*0,33 р>0,05 0 96*0,34

ССЦ + дигидро-кверцетин 17,21±2,20 р<0,01 2б,29± 3,09 1,07 ±0 29 р>0 05 0,72*0,31 0,0663* 0,0079 р>0 05 0,0566* 0,0135 1,45*0,45 р>0 05 1,12*0,25

ССЦ + кверцетин 21,21*2,12 р<0,01 28 02±3,50 2,18*0,33 р<0,01 1,28*0.55 0,1060* 0,0218 р<0,05 0,0839* 0,0125 2,03*0 22 р<0,01 1,50*0,33

ССЦ + силибин 20,93*3,74 р<0,01 28 02± 330 1,89*0,45 р<0,05 1,28*0,55 0,1050 * 0,0256 р>0,05 0,0839± 0,0125 1,93*0,22 р<0 05 1,50*0 33

СС14 + рутин 21,07*1,48 р<0,01 28,02± 3,50 1,47*0,11 рэ0,05 1,28*0,55 0,1045 * 0,0198 р<0,05 0 0839* 0,0125 1,70*0,27 р>0,05 1,50*0,33

Препарат карсил в дозе 25мг/кг силимарина понижает интенсивность процессов перекисного окисления липидов печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом, и повышает активность фермента супероксиддисмутазы - основного фактора 18

противоперекисной защиты, что является одним из механизмов гепатопротекторного действия силимарина, который также проявляет тенденцию к повышению активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы гепатоцитов Следовательно, антиоксидантные свойства карсила могут быть объяснены повышением активности супероксиддисмутазы и, тем, что флавонолигнаны являются как бы ловушкой для активных форм кислорода Карсил снижает уровень перекисного окисления липидов и увеличивает статистически достоверно сниженную при отравлении четыреххлористым углеродом активность супероксиддисмутазы При этом статистически не достоверно повышается сниженная в результате отравления активность каталазы и глутатионпероксидазы

Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в печени крыс при токсическом воздействии, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы - факторов ферментной защиты печени

Настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы гепатоцитов Такое действие настойки расторопши аналогично действию экстракта расторопши жидкого, в отличие от карсила, силибина и силимара (см ниже), которые повышают активность супероксидцисмутазы, что объясняется меньшей дозой действующих веществ в настойке и экстракте расторопши -флавонолигнанов силимарина, силикристина, силибинина, непосредственно выступающих в роли эффективных гепатопротекторов, использующихся в медицине

Силимар в дозе 100 мг/кг снижает уровень малонового диальдегида в печени крыс, отравленных четыреххлористым углеродом, повышает активность фермента супероксиддисмутазы, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов каталазы и глутатиопероксидазы Это является одним из механизмов гепатопротекторного действия силимара

Препарат дигидрокверцетин или таксифолин в дозе 25мг/кг понижает содержание малонового диальдегида в гомогенате, проявляет тенденцию к усилению ферментатативной противоперекисной защиты гепатоцитов

Кверцетин в дозе 25 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в печени крыс с токсическим гепатитом, и повышает активность ферментов каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы Он проявляет активность в отношении

всех исследуемых ферментов печени, что является одним из механизмов гепатопротекторного действия кверцетина

Силибин в дозе 25 мг/кг уменьшает уровень малонового диальдегида в гомогенате, повышает, подобно карсилу (таблица 2), активность супероксиддисмутазы и повышает активность глутатионпероксидазы Влияние на активность ферментов является одним из механизмов гепатопротекторного действия силибина

Рутин в дозе 25 мг/кг снижает интенсивность процессов перекисного окисления в печени крыс при токсическом воздействии, и повышает активность фермента каталазы Нами показано, что рутин проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатионперроксидазы Такое действие рутина, являющегося рутинозидом кверцетина и содержащего кверцетин в составе молекулы, в отличие от кверцетина, статистически достоверно влияющего на эти ферменты, объясняется более низкой дозой кверцетина в рутине, поэтому действие рутина на некоторые ферменты -факторы противоперекисной защиты не проявляется в полной мере

ВЫВОДЫ

1 Осуществлена сравнительная оценка уровня содержания флавоноидов в лекарственных средствах из плодов расторопши пятнистой (экстракт расторопши жидкий, настойка расторопши) и корневищ левзеи сафлоровидной (экстракт левзеи жидкий), представленных флаволипнанами, флаванонолами и флавонолами

2 С использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии и физико-химических методов установлено химическое строение силибина, выделенного из плодов расторопши пятнистой, и кверцетина, полученного кислотным гидролизом из рутина

3 При интоксикации четыреххлористым углеродом в ткани печени статистически достоверно повышается перекисное окисление липидов в 2,0 раза, и снижается антиоксидантная защита, что проявляется в уменьшении активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы (каталазы в 1,3 раза, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в 1,7 раза)

4 Введение спирта одновременно с четыреххлористым углеродом приводит к повышению перекисного окисления липидов в 1,8 раза, и снижению исследуемых факторов ферментной защиты (каталазы в 1,2 раза, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в 1,3 раза)

5 Карсил в дозе 25 мг/кг силимарина при введении в желудок крысам вызывает снижение перекисного окисления липидов в 1,4 раза, значительно повышает (в 1,8 раза) активность супероксиддисмутазы, проявляет тенденцию к повышению

активности катапазы и глутатионпероксидазы Силимар в дозе 100 мг/кг вызывает снижение перекисного окисления лииидов в 1,2 раза, значительно повышает (в 1,4 раза) активность супероксидцисмутазы, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы и глутатнонпероксидазы

6 Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,2 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксидцисмутазы, каталазы и глутатнонпероксидазы Настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,3 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатнонпероксидазы

7 Препарат «Экстракт левзеи жидкий» в дозе 150 мкл/кг обладает антиоксидантным действием при токсическом повреждении печени Он снижает количество малонового диальдегида в гомогенате ткани печени в 1,2 раза, в 1,3 раза повышает активность ферментов глутатнонпероксидазы и каталазы, что позволяет использовать его в качестве гепатопротектора при заболеваниях печени

8 Выявлены зависимости антиоксидантной активности от химической структуры Флавонол кверцетин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление липидов в печени крыс в 1,3 раза и усиливает противоперекисную защиту за счет повышения активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатнонпероксидазы в 1,7 раза, 1,3 раза и 1,3 раза соответственно Его гликозид рутин в дозе 25 мг/кг оказывает антиоксидантное действие, проявляющееся в снижении содержания малонового диальдегида в гомогенате (в 1,3 раза), повышает активность каталазы (в 1,2 раза), проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатнонпероксидазы

9 Флаванонол дигидрокверцетин в дозе 25 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,5 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы

10 Флаволигнан силибин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление липидов в 1,3 раза, повышает активность супероксиддисмутазы в 1,5 раза и глутатионпероксидазы в 1,3 раза, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Кулагин, О Л Применение гепатопротекторных препаратов растительного происхождения при экспериментальном токсическом поражении печени /

О Л Кулагин, Е В Кантария, H С Додонов, А А Царева // Управление качеством здравоохранения через новации Материалы XXV межрегионального съезда врачей - Самара ГУСО «Перспектива», 2005 - 616с - С 239-242

2 Додонов, H С Особенности применения гепатопротекторных растительных препаратов при экспериментальном токсическом гепатите / НС Додонов // Аспирантский вестник Поволжья - 2005 - № 1 - С 101- 102

3 Кулагин, О Л Ферментативная активность гепатоцитов в опытах на животных при токсическом воздействии / О Л Кулагин, H С Додонов, А А Царева // Человек и лекарство Тезисы докладов XIII Российского национального конгресса -Москва, 2006 - С 547

4 Куркин, В А Исследование антиоксидантной активности некоторых фитопрепаратов, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды / В А Куркин, О Л Кулагин, H С Додонов, А А Царева, Е В Авдеева // Медико-социальная экология личности состояние и перспективы Материалы IV Международной конференции - Минск, 2006 - С 118-121

5 Кулагин, О Л Экологические аспекты изучения фитопрепаратов в опытах на животных в условиях токсического воздействия / О Л Кулагин, Е В Кантария, H С Додонов, А А Царева // Актуальные вопросы военной медицины Сборник тезисов и статей XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института - Самара, СамВМИ, 2006 - С 179-181

6 Phytochemical and pharmacological investigation of some plants containing flavonoids / V A Kurkin, О L Kulagin, N S Dodonov, A A Tsareva, E V Avdeeva, A V Dubischev, V В Braslavskn, О E Pravdivtseva, A V Kurkina, D V Kadatskaya, E A Dremova, A I Bontsevich // Polyphenols Communications ХХП1 International Conference on Polyphenols, Winnipeg, 22-25 august 2006 - Manitoba - Canada, 2006 -P 513-514

7 Кулагин, О Л Антиоксидантная активность некоторых фитопрепаратов, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды / О Л Кулагин, В А Куркин, H С Додонов, А А Царева, Е В Авдеева, А В Куркина, E А Дремова, ФШ Сатдарова//Фармация —2007 — Т55, №2 - С 26-31

Подписано в печать 19 04 2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Уел печ л 1 39 Тираж 100 экз Заказ 412

Издательство ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара, ул Революционная, 70, литера П Тел 372-00-56,372-00-57

Отпечатано в типографии ООО «ОФОРТ»

Актуальность темы. Печень является барьером на пути фактически всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека. Ксенобиотики, всасывающиеся в желудочно-кишечном тракте, поступают в печень, где они биотрансформируются в основном под действием различных форм цитохрома Р450. Дополнительные этапы метаболизма предполагают связывание с глюкуронидом или сульфатом. Образующиеся гидрофильные метаболиты переносятся транспортными белками, находящимися на мембране гепатоцитов, в плазму или желчь и выводятся через почки или желудочно-кишечный тракт. Изменения активности печеночных ферментов (наследственный полиморфизм генов, влияние неблагоприятных экологических факторов, заболевания печени, индукция или ингибирование под действием различных веществ) влечет к повышению или снижению детоксикационной функции печени. На печень, в свою очередь, чужеродные вещества могут оказывать токсическое воздействие, приводящее к токсическому гепатиту, фиброзу и циррозу. Инфекционное поражение печени также является причиной развития печеночно-клеточной недостаточности. Лекарственные средства, как чужеродные вещества, оказывают токсическое действие на печень, и доля гепатотоксических реакций, вызванных лекарствами, составляет 15% от общего числа, причем почти половина из них приходится на парацетамол.

Широкая распространенность острых и хронических заболеваний печени, ранняя инвалидизация лиц трудоспособного возраста ставят поражения печени на одно из первых мест среди заболеваний желудочно-кишечного тракта. Прогноз заболеваний печени во многом зависит от времени появления поздних осложнений при гепатитах, от сохранности функции печени в отдаленный период после перенесенного острого заболевания печени! В патогенезе этих нарушений важную роль играет увеличение уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ). В условиях нормы в крови и тканях определяется низкий уровень ПОЛ, который является важным фактором для осуществления функции цитоплазматических мембран и других структур клетки. Однако повышение уровня ПОЛ приводит к нарушению структуры клеточных мембран и функции клеток. При патологии печени отмечается повышение содержания высокоактивных форм молекулы кислорода, которые приводят к оксидативному стрессу и нарушают структуру и функцию клеток, в том числе и гепатоцитов, о чем свидетельствуют многочисленные исследования.

Однако уровень ПОЛ зависит не только от уровня накопления свободных радикалов, но и от функции противоперекисной защиты. Во многих экспериментах установлено, что такими антиоксидантными системами в организме являются ферменты супероксидцисмутаза; глутатионпероксидаза, каталаза, а также неферментные факторы защиты, к которым относятся аскорбиновая кислота, витамин Е, глутатион, биофлавоноиды и другие.

Лечение поражений печени антиоксидантными средствами широко исследуется в настоящее время. Изучаются как широко известные препараты расторопши пятнистой (силимар, силимарин и др.), так и исследуется активность новых препаратов - флавоноидов, производных кверцетина, аргинина, хеноксидезоксихолевой кислоты, производных тиобарбитуровой кислоты и других соединений, которые подробно рассмотрены в обзоре литературы. Однако и известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, изучены не в полной мере.

В этой связи представляются актуальными исследования но расширению спектра представлений и поиску новых возможностей в использовании лекарственных растений, уже применяющихся в качестве антиоксидантных и гепатопротектрных препаратов, а также выявлению перспективных сырьевых источников для получения фитопрепаратов с обсуждаемой активностью.

Цель И задачи исследования. Цель работы - исследование лекарственных растений и субстанций, содержащих флавоноиды, как эффективных антиоксидантных лекарственных средств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить жидкий экстракт и настойку расторопши пятнистой, установить соответствие показателей качества сырья и препаратов нормативной документации (НД), выделить и проанализировать индивидуальные вещества кверцетин и силибин.

2. Изучить показатели качества препарата «Левзеи экстракт жидкий», их соответствие НД, определить содержание веществ экдистероидной и флавоноидной природы.

3. Изучить интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в гомогенате печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом.

4. Изучить интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в гомогенате печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом и одновременном введении этилового спирта.

5. Сравнить влияние карсила, силимара, настойки и жидкого экстракта расторопши на функции антиоксидантных систем в гомогенатах печени на фоне токсического гепатита и установить возможные точки приложения гепатозащитного действия препаратов на процессы перекисного окисления липидов и противоперекисной защиты.

6. Изучить влияние на эти процессы препарата «Экстракт левзеи жидкий» и ^определить выраженность снижения уровня перекисного окисления липидов в ткани печени при ее токсическом поражении.

7. Изучить влияние индивидуальных флавоноидов дигидрокверцетина, кверцетина, силибина и рутина на отдельные звенья перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты с целью выявления возможности дифференцированного влияния на активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в ткани печени на фоне токсического гепатита.

Научная новизна исследования. Расширен спектр представлений о некоторых лекарственных растениях (расторопша пятнистая, левзея сафлоровидная), содержащих флавоноиды, в плане их использования для получения суммарных препаратов и индивидуальных соединений с антиоксидантными свойствами.

Впервые показано повышение активности супероксиддисмутазы под действием субстанции «Силимар» при токсическом поражении печени.

Впервые установлена антиоксидантная и гепатопротекторная активность препарата «Экстракт лсвзеи жидкий». При его применении снижается уровень перекисного окисления липидов и повышается активность ферментов глутатионпероксидазы и каталазы при токсическом поражении печени. Одним из механизмов гепатопротекторного действия экстракта левзеи является повышение активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы.

Уточнен спектр антиоксидантной активности индивидуальных соединений флавоноидной природы, и на этой основе выявлены зависимости в ряду: химическая структура - действие. Кверцетии увеличивает активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени при ее токсическом поражении, что является одним из механизмов действия кверцетина. Установлен дополнительный механизм действия силибина, заключающийся в повышении активности фермента глутатионпероксидазы при токсическом гепатите, что является одной из составляющих в реализации гепатопротекторного действия силибина. Показано увеличение активности фермента каталазы под действием рутина при токсическом поражении печени, что также является одним из механизмов гепатопротекторного действия рутина.

Практическая значимость работы. Создана основа для дальнейшей направленной разработки новых лекарственных средств с антиоксидантной активностью на основе сырья расторопши пятнистой и левзеи сафлоровидной. Рекомендовано расширить показания к применению препарата «Экстракт левзеи жидкий» при гепатитах и других поражениях печени в качестве гепатопротектора. Результаты исследования препаратов расторопшн пятнистой и флавоноидов внедрены в учебный и научный процесс на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 06.04.2007 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Соответствие сырья расторопши пятнистой и полученных препаратов экстракт расторопши жидкий и настойка расторопши требованиям нормативной документации.

2. Зависимость антиоксидантной активности от химического строения ряда флавоноидов (флавонолы, флаванонолы, флаволигнаны).

3. Результаты изучения гепатопротекторной активности препаратов расторопши пятнистой - карсила, силимара, настойки расторопши и экстракта расторопши жидкого.

4. Результаты изучения антиоксидантной активности флавоноидов -дигидрокверцетина, кверцетина, силибина и рутина.

5. Результаты исследования ^гепатопротекторной активности экстракта " левзеи жидкого.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 01200112941) и Республиканской программы «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы И публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на XXV межрегиональном съезде врачей «Управление качеством здравоохранения через новации» (Самара -Тольятти, 2005), на IV международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2006), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), на XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института (Самара, 2006), на XXIII International Conference on Polyphenols (Winnipeg-Canada, 2006).

Основное содержание работы опубликовано в 7 научных работах.

Объем И Структура работы. Диссертационная работа изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 59 таблиц, 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), глав 3 и 4, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение (глава 5), общих выводов и списка литературы, включающего 273 источника, из которых 119 — на иностранных языках.

выводы

1. Осуществлена сравнительная оценка уровня содержания флавоноидов в лекарственных средствах из плодов расторопши пятнистой (экстракт расторопши жидкий, настойка расторопши) и корневищ левзеи сафлоровидной (экстракт левзеи жидкий), представленных флаволигнанами, флаванонолами и флавонолами.

2. С использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии и физико-химических методов установлено химическое строение силибина, выделенного из плодов расторопши пятнистой, и кверцетина, полученного кислотным гидролизом из рутина.

3. При интоксикации четыреххлористым углеродом в ткани печени статистически достоверно повышается перекисное окисление липидов в 2,0 раза, и снижается антиоксидантная защита, что проявляется в уменьшении активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы (каталазы в 1,3 раза, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в 1,7 раза).

4. Введение спирта одновременно с четыреххлористым углеродом приводит к повышению перекисного окисления липидов в 1,8 раза, и снижению исследуемых факторов ферментной защиты (каталазы в 1,2 раза, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в 1,3 раза).

5. Карсил в дозе 25 мг/кг силимарина при введении в желудок крысам вызывает снижение перекисного окисления липидов в 1,4 раза, значительно повышает (в 1,8 раза) активность супероксиддисмутазы, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы и глутатионпероксидазы. Силимар в дозе 100 мг/кг вызывает снижение перекисного окисления липидов в 1,2 раза, значительно повышает (в 1,4 раза) активность супероксиддисмутазы, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы и глутатионпероксидазы. л

6. Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,2 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. Настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,3 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы.

7. Препарат «Экстракт левзеи жидкий» в дозе 150 мкл/кг обладает антиоксидантным действием при токсическом повреждении печени. Он снижает количество малонового диальдегида в гомогенате ткани печени в 1,2 раза, в 1,3 раза повышает активность ферментов глутатионпероксидазы и каталазы, что позволяет использовать его в качестве гепатопротектора при заболеваниях печени.

8. Выявлены зависимости антиоксидантной активности от химической структуры. Флавонол кверцетин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление липидов в печени крыс в 1,3 раза и усиливает противоперекисную защиту за счет повышения активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в 1,7 раза, 1,3 раза и 1,3 раза соответственно. Его гликозид рутин в дозе 25 мг/кг оказывает антиоксидантное действие, проявляющееся в снижении содержания малонового диальдегида в гомогенате (в 1,3 раза), повышает активность каталазы (в 1,2 раза), проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы.

9. Флаванонол дигидрокверцетин в дозе 25 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,5 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и

-----------глутатионпероксидазы.

Ю.Флаволигнан силибин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление липидов в 1,3 раза, повышает активность супероксиддисмутазы в 1,5 раза и глутатионпероксидазы в 1,3 раза, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы.