Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Технология и исследование лекарственных форм интерферона

■■ .V. ' и

ВСЕСОЮЗНОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "СОЮЗФАРМАЦИЯ" ПРИ МИНИСТЕРСТВЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР Всесоюзный научно-исследовательский институт фармации

На правах рукописи

КЛЯВИНА ЕЛЕНА АЛЬБЕРТОВНА

ТЕХНОЛОГИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ИНТЕРФЕРОНА

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва -1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте фармации Всесоюзного Объединения "Союзфармация" при Министерстве здравоохранения СССР.

Научный руководитель - кандидат фармацевтических наук

Ведущая организация - Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова.

часов на заседании Спещализированного совета Д 074.28.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте фарлации по адресу : 117418 г. Москва, ул. Красикова, д. 34.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института по адресу :: 117418 г. Москва, ул. Красикова, д. 34.

ст.науч.сотр. К.В.Алексеев

Официальные оппоненты - доктор фармацевтических наук

профессор А.И.Чирков

кандидат фармацевтических наук ст.науч.сотр. М.М.Астраханова

Автореферат разослан

и

//

Г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д 074.28.01 канд. фаргац. наук, ст.науч.сотр.

Л.М.Боброва-

•

{ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ ¡»ций 5

■■-•-—Актуальность темы. Среди вирусных заболеваний человека герпес занимает одно из ведущих мест. Возбудитель инфекции -вирус простого герпеса, характеризуется дерматонейротропно-стью: у него выражено родство к коже, слизистым оболочкам и к нервной ткани. Терапия герпеса представляет значительные трудности ввиду отсутствия четкого понимания патогенеза заболевания, длительного (часто бессимптомного) и рецидивирующего его тгчения и отсутствия высокоэффективных химиопрепаратов в практическом здравоохранении. Определенные надежды на решение этой проблемы связывают с интерфероном (ИФ) и его генноинженерным аналогом реафероном (РФ). Уникальная способность ИФ подавлять в культуре тканей и в организме репродукцию большинства известных вирусов, способность оказывать иммуномодулирующее и анти-пролиферативное действие позволяют рассматривать ИФ как эффективное средство для профилактики и лечения вирусных заболеваний, в частности, герпеса. По мнению клиницистов при герпетических поражениях кожи и слизистых оболочек следует отдавать предпочтение местному применению ИФ.

В нашей стране лекарственные формы ИФ для наружного применения промышленным способом не выпускаются.

Цель и_задачи исследования. Целью настоящих исследований являлась научно обоснованная разработка составов и технологии стабильных и эффективных лекарственных форм ИФ и РФ для наружного применения с целью профшвктики и лечения герпетических поражений кожи и слизистых оболочек с использованием в качестве геле образовате ля аксама - аммонийной соли редкосшитого сополимера акриловой кислоты с алжловым эфиром пентаэритрита.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить

следующие задачи:

- изучить физико-химические я технологические характеристики аксама, провести стандартизацию и предложить научно обоснованные рекомендации по его применению в фармацевтической технологии;

- обосновать оптимальные составы и рациональную технологию гидрофильных мазевых основ с использованием аксама;

- разработать и изучить лекарственные формы ИФ и РФ для наруженого применения, обосновать их технологию, выявить факторы, влияющие на стабильность ИФ и РФ;

- изучить специфическую активность и биологическую безвредность разработанных лэкарственных форм ИФ и РФ;

- разработать нормативно-техническую документацию на лэ-карственные формы ИФ и передать материалы в фармакологический комитет Минздрава СССР с целью получения разрешения на клинические испытания.-

Научная новизна. С учетом физико-химических и технологических свойств полимера аксама экспериментально обосновано его применение в качестве гелеобразующего вспомогательного вещества в фармацевтической технологии. Изучены реологические свойства гелей аксама и установлены закономерности влияния на вязкостные характеристики изменений концентрации полимера, скорости деформации, наличия белков, солей и других факторов.

Обоснована целесообразность создания гелей пролонгированного действия на основе аксама. Изучены пролонгирующие эффекты гелей аксама на культуре диплоидных фибробластов эмбрионов человека линии М-19. С использованием флуоресцентного метода проведен сравнительный анализ пролонгирующего действия гелей аксама и официнальной глазной основы на слизистой оболочке глаза кролика.

Разработаны составы и технология гелей интерферона и реаферона для лечения вирусных заболеваний коки и слизистых оболочек .

Предложено применение полимера аксама в качестве среды высушивания для стабилизации интерферона и реаферона. Экспериментально доказана возможность создания лиофилизированных лекарственных форм интерферона и реаферона для наружного применения, на которые Государственным комитетом по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР выдано положительное решение на получение авторского свидетельства на "Способ стабилизации лейкоцитарного интерферона" по заявке № 4732300/14 с приоритетом от 20.07.89г.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- параметры стандартизации нового вспомогательного вещества -аксам (технические условия ТУ 301-02-143-80, регламентирующие применение аксама в фармацевтической промышленности);

- показатели качества и технология получения геля интерфероно-вого сухого (Лабораторный регламент на производство геля ин-терферонового сухого, апробированный на базе предприятия по производству бакпрепаратов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР 26.06.90г.);

- методика количественного анализа интерферона в лекарственных формах на основе гидрофильных полимеров (Удостоверение на рационализаторское предложение № 6 "Способ определения интерферона в мази на основе гидрофильных полимеров" от 6.11.90г.);

- параметры контроля качества геля интерферонового сухого (проект ВФС на гель интерфероновый сухой, находится на рассмотрении Фармакологического комитета Минздрава СССР для получения разрешения на клинические испытания 07.02.91г.).

Апробация ра^оуы. Результаты исследований доложены на конференции молодых ученых ВНИИФ, посвященной 70-летию ВЛКСМ (Москва, 1988г.), на Всероссийской научно-практической конференции, молодых ученых, посвященной 70-летию декрета о национализации аптек (Куйбышев,1988г.), на Всесоюзной научно-технической конференции "Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фитохвмических препаратов" (Харьков, 1990г.).

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опуб-•сзаовано 6 печатных работ, получено положительное решение на вы-Едчу авторского свидетельства по заявке й 4732300/14 с приоритетам от 20.07.89г.

Связь задач исследования с проблемным планом Фармацевтических" наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с шв-нсм ВБИИФ и проблемной комиссией научного совета АМН СССР № 48 "Фармацевтическая технология и биофармация", а также Всесоюзной программой "Интерферон" (1985).

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 экспериментальных глав, общих выводов, библиографии и приложения. Библиография включает 171 источник, из них 78 на иностранных языках.

Работа изложена на 146 страницах машинописного текста и содержит 12 таблиц и 33 рисунка.

В обзоре рассмотрены вопросы, посвященные современнсму состоянию разработки и стабилизации лекарственных форм ИФ и РФ.

Во второй главе дана характеристика матёриалов исследований, методов и приборов, используемых в работе.

В третьей главе приведены результаты экспериментального изучения физико-химических и технологических свойств нового вспомогательного вещества аксама. Разработаны и обоснованы состав и технология гелей ИФ и РФ на основе аксама для наружного применения.

В четвертой главе представлены результаты исследований по созданию лиофильно высушенного геля ИФ (РФ), установлению показателей качества и сроков годности.

Приложение содержит следующие материалы: проект ВФС на гель интерфероновый сухой; лабораторный регламент на производство геля интерферонового сухого; отчет об экспериментальном изучении раздражающего и сенсибилизирующего действия лиофильно высушенного интерферонового геля; отчет об экспериментальном изучении специфической активности геля интерферонового сухого; заключение о положительном решении на заявку № 4732300/14 с приоритетом от 20.07.89г.; удостоверение на рационализаторское предложение № 6 от 6.11.90г. на способ определения ИФ в мазях на основе гидрофильных полимеров; акт наработки опытных партий геля интерферонового сухого.

На защиту выносятся следующие основные положения :

- результаты исследований по изучению физико-химических и технологических свойств нового гелеобразующего вспомогательного вещества - аксама;

- составы и технология производства стабильных интерфе-рон-содержащих гелей для лечения вирусных забожваний кожи и слизистых оболочек.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве материалов исследования использовали лекарственные вещества: человеческий лейкоцитарный интерферон, предоставленный лабораторией препаратов интерферона НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР (зав. профессор В.П.Кузнецов) и генноинженерный интерферон - реаферон. В работе использованы вспомогательные вещества: аксам, человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, натрия хлорид, поливинилпирролидон 40 и 360, маннит, сахароза, декстран 40 и 70, нипагин. Все вещества отвечали требованиям соответствующей нормативно-технической докумен-

тации.

Определение противовирусной активности ИФ и PS в разработанных гелях проводили микрометодом по ингибированию цитопати-ческого действия (ЦВД) вируса везикулярного стоматита на культуру клеток диплоидных фибробдастов эмрионов человека (ДФЭЧ) линии M-I9, модификация которого заключались в том, что в качестве экстрагентов использованы культуральные среды (Игла, № 199, раствор Хенкса) и физиологический раствор.

С целью оценки качества лекарственных форм ИФ осуществляли контроль на возможную токсичность препарата, на специфическую безвредность, контроль на возможное присутствие в препарате поверхностного антигена вируса гепатита Б, антигена вируса болезни Ньюкасла и куриной аллинтоисной жидкости.

Тип ИФ в гелях определяли с помощью реакции прямой нейтрализации противовирусной активности ИФ анти- оС -интерферонового иммуноглобулина барана.

Электрофорез белка проводили в 7% полиакриламидном геле на приборе GE-2/4ZS фирмы " Pharmacia " (Швеция). Обработку результатов осуществляли на денсиметре марки tls Scanner ц, фирмы " Camag « (Швейцария).

Изучение фармацевтической доступности ИФ и РФ из гелей проводили методом проточного диализа на приборе фирмы " Sartorius » (ФРГ), модель SM Г5703 и методом "вращающейся корзинки" на приборе " Sotax AG" (тип да 6, Швейцария). Оптическую плотность растворов измеряли с помощью спектрофотометров: " Chimadzu " (Япония) и СФ-26. Линеризацшо и обсчет кривых осуществляли на персональном компьютере " Olivetti до 240" (Италия) по программе GKAPHEB (1988).

Биодоступность ИФ и РФ из гелей определяли в культуре ДФЭЧ

линии M-I9 по таким критериям, как скорость появления и продолжительность противовирусного состояния, а также на кроликах при ректальном введении. Расчет основных фармакокинетических параметров и обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере " Olivet-ti м 240" (Италия) в рамках одноча- ' стевой модели внепараметного всасывания по программе askid .

Определение физико-химических и технологических характеристик порошка аксама проводили по общеизвестным методикам. Структурно-механические свойства гелей аксама и гелей ® и РФ изучали на приборе " Reotea-t-2« (Германия),

Отработку параметров лиофильной сушки геля ИФ(РФ)осуществляли на установке "Альфа 1/5" фирмы "Христ" (Германия). Точку эвтектики геля ИФ определяли с помощью датчика "Лиоконтрол" фирмы "Христ" (Германия).

При проведении доклинических испытаний разработанных лекарственных форм ИФ в опытах на животных и клеточных культурах исследовали специфическую активность ИФ, а также токсичность, раздражающее, сенсибилизирующее и парааллергизируодэе действие в соответствии с требованиями Фармакологического комитета Минздрава СССР.

Разработка гелей интерферона и реаферона на основе нового

вспомогательного вещества - аксам В последнее время, учитывая патогенетические особенности герпетической инфекции, специалисты отдают предпочтение различным гидрогелевнм основам. Так, фирма "Эгис" (ВР) выпускает гель ИФ на основе карбопола 940. Гелевые формы ИФ нашли широкое применение и в Японии. Поэтому на основании технического задания, выданного Ш0 "Биотехнология" Минмедпрома СССР, Государственным институтом прикладной химии АН СССР наработаны эксперименталь-

шз образцы аммонийной соли редкосшитого сополимера акриловой кпслоты с аллиловым эфиром пентаэритрита - аксама.

Изучены физико-химические и технологические свойства аксама. В качестве критерия загущающей способности полимера выбрана эффективная вязкость водных дисперсий. По способности загущать полярные жидкости и участвовать в общем структурообра-зовании исследуемые образцы аксама были подразделены на три группы. К первой отнесены образцы с высоким уровнем вязкости пх водных дисперсий - аксам Б, ко второй - сополимеры, облада-пцне средней загущающей способностью - аксам А и к третьей группе - низковязкостные сополимеры - аксам В. Результаты изучения свойств различных образцов аксама представлены в табл.1.

Исследования по стандартизации аксама позволили включить эти показатели в технические условия ТУ 301-02-143-90, регламентирующие использование нового вспомогательного вещества в фарлацевтической промышленности.

Сравнительное изучение реологических свойств гелей аксама в зависимости от концентрации полимера (от 0,5 до 4%) показало, что исследуемый загуститель характеризуется нелинейным ходом кривой в узком интервале концентраций (рис.1).

Как видно из рис.1, необходимый уровень вязкости достигался при концентрации аксама 1-2$, выше этoйs концентрации значения эффективной вязкости практически не изменялось, что соответствует горизонтальному участку кривой.

Поскольку препараты ИФ представляют собой сложные смеси белков и содержат в качестве стабилизатора человеческий сывороточный альбумин, изучали влияние концентрации белка - человеческого сывороточного альбумина - на реологические характеристики гелей аксама. Показано, что увеличение концентрации белка

Таблица I

Физико-химические и технологические характеристики порошка аксама

Наименование показателя

Марка полимера

аксам-А

аксам-Б аксам В

1. Описание

2. Массовая доля акриловой кислоты, %, не более

3. Массовая доля воды, %, не более

4. Вязкость водных гелей аксама, при градиенте скорости сдвига о = = 40,5 с"1, Па.с с массовой долей 0,2% в пределах

с массовой долей 1,0 в пределах

5. рН водного геля аксама с массовой долей 0,8%, в пределах

6. Набухаемость,

7. Плотность

Г0Ч

Белый мелкодисперсный порошок со слабым запахом аммиака

1,0.

1,2

Ю~3 кг/м3

3,5-6,0

5,8-7,0 3,Г±0,1 1,39+0,01

8. Насыпная масса »10

кг/м3

9. Сыпучее ть •10~3кг/с

10. Удельная поверхность

10'

-3 . 3

/кг

1.0

1.2

1,0

1.2

0,6-2,0

в,0-9,О

5,8-7,0 5,8-7,0 3,1+0,1 3,1±0,1 1,41+0,01 1,40+0,01

0,24+0,004 0,30+0,005 0,26+0,007 1,12+0,15 1,10+0,15 1,12+0,05

1,40+0,02 1,42+0,005 1,38+0,002

Б пределах 0,5-3 мг на I г гелевой основы не оказывало влияния на показатель еффективной вязкости.

Полулогарифмическая зависимость эффективной вязкости гелевых систем от концентрации полимера

Концентрация аксама, %

I - аксам А; 2 - аксам Б; 3 - аксам В» и = 15,2 с-1;

А-Б - границы реологического оптимума

Рис.1

В связи с тем, что препараты ИФ и РФ, подученные по разнил технологическим схемам, могут включать в свой состав неорганические соли, в частности натрия хлорид, проведена оценка влияния концентрации неорганических солей на структурно-механические свойства гелей аксама. При увеличении концентрации солей наблюдали снижение эффективной вязкости и разрушение систем.

С целью обеспечения стерильности гелевых систем аксама использованы различные методы стерилизации, в частности тепловая и 1С -стерилизация. Установлено, что оптимальным является режим тепловой стерилизации, рекомендованный ГФ XI (на 100 г

- II -

основы): температура (120±1,0) °С, давление 0,11 Ш1а, время экспозиции - 10 мин. Изучение структурно-механических свойстз гелей позволило заклвчить, что тепловая стерилизация в указанном режиме практически не изменяла значений эффективной вязкости гелей аксама. Испытания на стерильность показали, что помутнения питательных сред (среды Сабуро и'тиогликолевой среды) не происходило.

Сопоставительный анализ значений эффективной вязкости .1% и 1,5% гелей аксама до и после у -стерилизации показал, что -облучение не изменяет вязкостные свойства гелей. Так, для 1% геля аксама значение эффективной вязкости при В =48,6 с-1 составляло 4,88 Па.с до облучения и 3,99 Па-с после облучения в дозе 2,0 МРад. Аналогичные результаты получаля при дозе ионизирующего излучения 2,5 МРад.

Изучение физико-химических и технологических, а также реологических свойств нового полимерного носителя гидрофильной природы - аксама и влияния на них различных факторов, а также исходя из этиологии и патогенеза герпеса, позволяло предложить

следующий состав (в г):

ИФ (РФ) З'Ю5 МЕ

Пропиленгликоля' 20,О

Аксама 1,0

Нипагина О,I

Вода дистиллированной до 100,0■

Технологический процесс приготовления гелей ИФ и РФ с использованием в качестве структурообразователя аксама значительно сокращается и упрощается за счет исключения стадии нейтрализации. К водной дисперсии порошка аксама добавляли при постоянном перемешивании пропиленгликоль с растворенным в нем

нипагином. Полученную гелевую основу подвергали тепловой стерилизации. Затем в асептических условиях к стерильной основе добавляли стерильный раствор ИФ (РФ), перемешивали. Гель ИФ фасовали в тубы по 10,0 г.

Реологические параметры геля ИФ (РФ) соответствовали оптимуму намазываемости и оптимуму консистенции для гидрофильных мазевых основ (Аркуша A.A., 1982).

Отличительной особенностью гелей аксама является способность образовывать защитную плзнку. Для придания образующейся пленке эластичности и предохранения ее от высыхания, вводили 20$ пропиленгликоля.

В связи с тем, что гели ИФ и РФ содержат около 80$ воды и белки и тем самым создают благоприятные условия для роста микроорганизмов, в качестве консерванта ввели 0,1% шпагина, который надежно ингибирует рост микроорганизмов в интервале значений pH 4-8.

Выбор концентрации ИФ и РФ сделан в соответствии с рекомендациями дерматологов Центрального научно-исследовательского кожно-венерологического института Минздрава СССР и составил 3-Ю3 МЕ на I г геля.

Учитывая, что ИФ и РФ термолабильны и подвержены воздействию гидролитических фешентов в водном растворе, для получения лекарственной формы, сохраняющей специфическую активность ИФ длительное время, применяли метод лиофильной сушки.

Лиофилизированные продукты оценивали по следующим показателям: внешни:! вид, вспенивание, растворимость, титр противовирусной активности ИФ, остаточная влажность. Выбранные критерии качества высушенного продукта не позволили ввести в состав для лиофилизэции натрия хлорид, сахарозу, маннит, декстран 40 и 70, полтзинилшгршлидэн 40 и 360. Хорошие результаты получены при

использовании полимера аксама в качестве среды высушивания, который имеет способность к гелеобразованию.

На основании изучения сохранности противовирусной активности ИФ (РФ) и технологических исследований наиболее рациональным признан следующий состав (на I флакон):

ИФ (РФ) 3«Ю4 МЕ

Аксама 0,2

Перед применением к содержимому ф-тнкона добавляют 10 мл дистиллированной воды. При этом через 3-5 мин образуется прозрачный бесцветный гель.

Определение эвтектических температур 1% и 2% гелей аксама, содержащих 2 мг человеческого сывороточного альбумина в I г геля показало, что они соответствуют эвтектическому интервалу от минус 25 до минус 30 °С.

В качестве среды высушивания аксам обладает неоспоримыми преимуществами: служит структурирующим материалом, обеспечивающим образование таблетки сухого материала; тлеет гидрофильные компоненты, предотвращающие чрезмерное пересушивание препарата и оптимальный баланс влаги между материалом и средой при длительном хранении; компоненты среды не тормозят сублимации свободной воды; имеет достаточно высокую температуру замерзания; имеет способность к гелеобразованию; не является токсичным; не мешает определению противовирусной активности ИФ (РФ).

Технология получения геля ИФ (РФ) лиофильно высушенного аналогична получению гелей ИФ и РФ и отличается наличием дополнительной стадии лиофяльной сушей. Принципиальная схема технологического процесса получения геля ИФ (РФ) и геля ИФ (РФ) сухого представлена на рис.2.

При выборе параметров стандартизации разработанных лекарственных форм ИФ и РФ учитывали требования общих статей ГФ XI,

Принципиальная технологическая схема производства геля интерферона (реаферона) и геля интерферонового (реафе-ронового) сухого

Рис.2.

рекомендации ВОЗ по контролю качества биопрепаратов. Основными показателями качества выбраны следующие: сохранность специфической активности ИФ (РФ), отсутствие токсичности, специфических и неспецифических примесей, специфическая безвредность, подлинность (по белку и в реакции нейтрализации противовирусной активности ИФ), рН, стерильность, реологические характеристики; для лиофильно высушенного геля ИФ (РФ) дополнительно - остаточная влажность и точность дозирования.

Результаты по изучению стабильности разработанных лекарственных форм ИФ и РФ представлены в табл.2.

Ввиду того, что метод диализа через полупроницаемую мембрану неприемлем для изучения кинетики высвобождения ИФ и человеческого сывороточного альбумина (белок сорбируется на мембране), нами модифицирован и использован метод "вращающейся корзинки". К полученным экспериментальным данным подбиралось теоретическое уравнение, адекватно описывающее кинетику высвобождения. Наиболее точно процесс высвобождения ИФ и человеческого сывороточного альбумина из гелей описывался упрощенным уравнением Ш^соМ (рис.3).

Биологическую доступность разработанных лекарственных форм ИФ и РФ оценивали на клеточной культуре ДФЭЧ линии ГЛ-19 по продолжительности и интенсивности противовирусного состояния, вызываемого гелем ИФ в культуре клеток. Появление в ДФЭЧ противовирусного состояния определял! по ингкбкции репродукции вируса везикулярного стоматита. Сравнительное изучение аффектов, вызываемых гелэм ИФ и растворил ИФ-о^РЭ (референс-препарат) показало, что гель ИФ вызывал противовирусное состояние в культуре ДФЭЧ уже черёз 2 ч после контакта, а к 6 ч развивалось стойкое противовирусное состояние, сохраняющееся в течение суток. Полученные результаты доказывают, что гелевая основа обе-

Таблица 2

Результаты изучения сроков хранения разработанных препаратов интерферона

и реаферона

Препарат Срок хра- Описание,раст- рН Остато-Стериль- Подлин-хранения нения воримость (долж-чная ность ность (мес) но влажн., (должно

быть %(лот- быть 6,0- на быть стери-7,0) не выше льно) 2%

Точность дозирования (должна быть 0,1082+ 0,002Е> )

Токсичность, слециф. безвред. специф. и неспецифической примеси

Противовирусная активность, в(МЕ (должна быть не менее

3-103МЕ/г)

10

Гель ИФ (РФ)

+ 4 °С

+ 20

12

18

12 18

Бесцвет.прозр. желтообразн. масса.раство-ряется в диет, воде

6,25 -

6,20

6,25 6,23

Стериль- Соот-но ветст-вует

Отсутствуют

4»10"

4 •10"

2-Ю3 1.10е

от

I

Гель ИФ (РФ) сухлй

+ 4 12

18

12 18

Сухая пористая масса белого цвета с кремо-ватым оттенкам, набухает в дис-тил.воде

соответ- о

6,23 1.1 -"- -"- ствует -"- 4-10

6,23 1,1 -"- 2.103

6,26 1,2 4-Ю3

6,25 1,2 -"- -"- 2-Ю3

3

5

Тт

И

И

- 17 -

спечивает длительное противовирусное действие.

3

я5 &

К

си

с 120

80 40

Зависимость высвобождения человеческого сывороточного альбумина от времени

о

Ут=36,20191^т

+1,6766

¿=28,007 - +14,653

12 3 Время, ч

I - в фосфатном буфере; 2 - в 0,9$ растворе хлорида натрия.

Рис.3

Сопоставительный анализ пролонгирующего эффекта гелей аксама различной концентрации и официальной гдазной основы- на слизистой оболочке глаза кролика подтвердило, что гели аксама обладают значительным пролонгирующим действием. Кроме трго, с увеличением концентрации полимера прямо пропорционально возрастало время детектирования флуоресцеина натрия (ФН) в слезной жидкости - от (24^3,8)ч при концентрации аксама 0,25$ до (72±7,7)ч при концентрации аксама 2% (табл.3). Как видно из рис.4, увеличение концентрации' полимера ведет к увеличению показателя эффективной вязкости и времени детектирования ФН.

При разработке гелей ИФ и РФ для местного лечения герпетических поражений кожи и слизистых оболочек- необходимо учитывать неизбежность контакта с клетками кожи, слизистых оболочек, эро-

- 18

Зависимость времени детектирования ФН от концентрации аксама (I) и эффективной вязкости (2)

при в = 48,6 с-1

эф

а

ё

о о

О! (В

К <и

м л

ВТ

ЗГ

о 4-й

Таблица 3

Сравнительное изучение пролонгирующего эффекта гелей аксама и официнальной глазной основы

Носитель Время детектирования ФН в слезной жидкости» ч

Гель аксама

- 0,25$ 24^3,8

-0,5% 32^3,8

- 1,0% 56+11,5

- 2,0% 72+7,7

Гдазная

основа 8^0,8

Раствор 6+0,9

24 48 72 Время детектирования, ч —

Рис.4 «

зий, образующихся на месте лопнувших пузырьков. С этой целью проведено изучение токсичности пропиленгликоля и 1% гидрогелевых основ аксама, включающих в свой состав различные концентрации пропиленгликоля. В качестве модели использовали культуру ДФЭЧ линии М-19 и перевиваемую культуру Нер-2. Проведенные исследования показали, что пропиленгликоль в концентрации 10$ нетоксичен для клеточных культур в разведении 1:2, а в концентрации 20-60$ - 1:4. Аналогичные результаты получены для 1% гелей аксама, содержащих соответствующие количества пропиленгликоля. Не вызывает сомнения тот факт, что слабый токсический эффект обусловлен осмотической активностью пропиленгликоля и аксама. фи разведении 1:8 и т.д. токсического эффекта не наблюдали. Креме того, токсический эффект отсутствовал при испытании гелей ИФ и РФ, что, очевидно, можно объяснить присутствием белкового буфера.

- 19 -

Изучение биодоступности ИФ из геля проводили на кроликах, сравнивая с биодоступностью раствора ИФ при инъекционном и ректальном введении (рис.5). При сопоставите льном анализе фармако-кинетических параметров выявлено, что по всем основным показателям гель ИФ значительно превосходит инъекционный раствор ИФ и раствор ИФ, введенный ректально (табл.4).

Определение противогерпетяческой активности геля ИФ на клеточной культуре Vero * показало, что минимальная ннгибирующая концентрация препарата по отношению к вирусу простого герпеса типов I и 2 составила 1:16 и снижала инфекционный титр вирусов по сравнению с контролем на 2ig TLH5q/0,I мл (титр цитопати-ческого действия). Контролем служила культура клеток Уего , не защищенная препаратом от цитопатического действия вируса.

Исследованием специфической активности геля ИФ на морских свинках-самцах на модели гениального герпеса установлено, что лечение гелем ИФ через 24 ч после инфицирования дает терапевтический эффект, равноценный действию 3% геля ацикловира.

На базе лаборатории препаратов интерферона (зав. профессор В.П.Кузнецов) НШЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР проведено изучение противовирусной активности разработанных гелей ИФ и РФ на культуре клеток ДФЭЧ линии M-I9 против 100 ТЦЦздЛм мл вируса везикулярного стоматита (штамм "Индиана"). Препараты в разведении 1:800 оказывали 100$ ингибирущее действие на развитие вируса.

Комплекс исследований по оценке переносимости гелн ИФ, проведенный в лаборатории поверхностно-активных веществ Всесоюзного научно-исследовательского кожно-венерологического института

1 Изучение противогерпетической активности на клеточной культуре и на животных проведено в лаборатории сравнительной вирусологии Всесоюзного герпетического центра АМН СССР (зав. профессор И.Ф.Баринский).

Концентрация интерферона в швзме крови после: а - инъекционного введения; 6 - ректального введения раствора ИФ; в - ректального введения геля ИФ

2 3 4 5 6 7 Время, ч

Рис.5.

Таблица 4

Основные фармакокинетические показатели интерферона

Лекарственная форма

Показатель ■■ —■ ■ ■ .......

раствор раст- гель ИФ для вор ИФ инъек- ИФ _Ш2_

Время полувыведения, Т 1/2 ч 0,531 0,513 0,231

Время полного всасывания, Т ч 1,00 2,00 6,00

Среднее время удерживания' в организме, Мйт ч 1,54 2,09 4,16

Площадь под кривой "Концентрация-время" , АУС МЕ/ мл*ч 207 1567 1748

Общий клиренс, С1мл/ мин 40210 532 4575

Объем распределение* л 1849 23,6 91,6

Объем в стационарном состоянии,"УдаЛ 3708 66,6 1141

Константа элиминации, кэл ч"1 1,30 1,35 3,00

Степень биодоступности, % абсолют. 100 757 844

относит. - 100 111,55

Минздрава СССР (зав. канд.мед.наук Л.В.Алчангян), позволяет говорить об отсутствии местнораздражавдего, сенсибилизирующего и па-рааллергизирующего действия на кожу лабораторных животных.

ВЫВОДЫ

1. Проведены физико-химические и технологические исследования нового вспомогательного вещества для получения гелеобразных мазевых основ - аммонийной соли редкосшитого акрилового сополимера - аксам. Выбраны параметры стандартизации: набухаемость, эффективная вязкость» вдажность, рН водного раствора геля, массовая доля акриловой кислоты.

2. Экспериментально доказано влияние на реологические свойства гелевых систем аксама таких факторов, как концентрация полимера, пропиленгликоля, солей. Показано, что применение в качестве -с труктурообразовате ля аксама значительно сокращает и упрощает технологический процесс получения гелей.

Установлено, что для стерилизации гидрогелей аксама могут быть использованы тепловая стерилизация и ^-стерилизация.

3. В результате экспериментальных исследований обоснован оптимальный состав и разработана технология геля интерферона (реа-ферона) и геля интерферонового (реаферонового) сухого на основе полимера аксам. Предложен методический подход при стандартизации лекарственных форм интерферона, внлззчающий: сохранность специфической активности; отсутствие токсичности, специфических и неспецифических примесей; специфическую безвредность; подлинность;

рН 10$ водного раствора геля; стерильность; реологические показатели; для геля интерферонового сухого - остаточную влажность и точность дозирования.

Изучение сохранности специфической активности позволило рекомендовать срок хранения разработанных лекарственных форм ин-

- 22 -

терферона (реаферона), который составляет один год.

4. При изучении биодоступности интерферона из гелей показано, что кинетика высвобождения интерферона из лекарственной формы описывается уравнением Higuchi . Установлено пролонгирующее действие гелей аксама на культуре клеток диплоидных фибро-бластов эмбрионов человека линии M-I9 и на слизистой оболочке глаза кролика флуоресцентным методом.

Изучена биодоступность интерферона In vire при ректальном пути введения на кроликах. Рассчитаны основные фармакокинетиче-ские параметры. Показано, что гели интерферона могут быть рекомендованы в качестве новой лекарственной формы для системного введения интерферона в организм.

• 5. На моделях in vitro отмечен выраженный противовирусный эффект гелей интерферона и реаферона по отношению к вирусу везикулярного стоматита (штамм "Индиана"), вирусу простого герпеса типов I и 2, а также на модели генитального герпеса у морских свинок-самцов к вирусу простого герпеса типа 2.

Комплекс проведенных исследований показал, что гель'интерферона и его мазевая основа не оказывают токсического эффекта на культуру диплоидных фибробластов эмбрионов человека линии M-I9 и местнораздражающего, сенсибилизирующего и парааллергизи-рующего действия на кожу лабораторных животных.

6. Разработана нормативно-техническая документация на производство и контроль качества геля интерфероне® ого сухого, которая принята Фармакологическим комитетом Минздрава СССР на рассмотрение для разрешения клинических испытаний.

ПО ТБМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ: '

I. Алексеев К.В., Золоторевич у.Е., Шлдырван Е.А. Выбор рациональной композиции вспомогательных веществ для новых мазевых

основ // Тез.докл. Веерос. научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-легию декрета о национализации аптек. - Куйбышев, 1988. - С.70-71.

2. Шалдырван Е.А., Алексеев К.В. Определение интерферона в лекарственных формах // Тез.докл. третьего съезда фармацевтов Киргизской ССР. - Фпунзе, 1989. - С.ГОЗ.

3. Шалдырван Е.А., Алексеев К.В. .Разработка геля интерферона на основе редкосшитого акрилового сополимера // Тез.докл. Всесоюз.научно-технической конференции: "Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фотохимичес-

ких препаратов. - Харьков, 1990. - С.116-117.

4. Алексеев К.В., Шалдырван Е.А. Лекарственные формы интерферона // Антибиотики и химиотерапия, - 1990. - Т.24. - № 9. -

5. Алексеев К.В., Золоторевич U.E., Шлдарван Е.А. Сравнительная оценка загущающей способности полимеров (мет)акрилового ряда // Сб."Синтетические и биологические полимеры в фармации". Научные труды ВНИИФ. - М., 1990, - Т.28. - С.66-70.

6. Алексеев К.В., Шалдырван Е.А. Экспериментальное изучение геля интерферона // Биотехнология - медицине и народному хозяйству. T.I.: Медицинские аспекты биотехнологии. Сб.научных трудов ВНИИ биотехнологии, М., ВНИМСЭНТИ, 1990. - С.66-69.

7. Способ стабилизации лейкоцитарного интерферона. Положительное решение по заявке на авторское свидетельство J6 4732300/14 от 20.07.89 / Алексеев К.В., Шалдырван Е.А., Кузнецов В.П. и др.

С. 51-54