Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза

Потапова, Надежда Ивановна

Диссертации по фармакологии → Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Потапова, Надежда Ивановна Москва 2006 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 15.00.02

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза

На прмна рукописи

ПОТАПОВА Надежда Ивановна

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006

Работа выполнена на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета ГОУ ВПО Российский Университет дружбы народов и в Научно-производственном объединении «НАРВАК»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Гребенникова Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

Верховский Олег Анатольевич Байкова Валентина Николаевна

Ведущая организация:

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Почетного академика Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится «15» декабря 2006 г. в 14-00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского Университета дружбы народов

по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6. Автореферат разослан «^3» _ _2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор фармацевтических наук, доцент

'7 Лагуткина Т.П.

оУ/(Х'Ь^пъ^и^-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ежегодно в мире от туберкулеза умирают около 2 млн. человек, а в развивающихся странах один из пяти случаев смерти связан с туберкулезом. Это больше, чем от СПИДа, малярии и всех тропических болезней вместе взятых [Cheng et al., 2005].

Быстрое распространение туберкулеза, появление мультирезистентных форм, увеличение числа случаев заражения одновременно бактериями M tuberculosis и вирусом иммунодефицита требуют применения экспресс-методов диагностики и эффективных методов противотуберкулезной терапии [Pfyffer et al., 2003].

Использующиеся в настоящее время методы прямого обнаружения микобактерий в клиническом материале с применением микроскопии по Цилю-Нильсену и культурального метода являются классическими и признаются «золотым стандартом» диагностики туберкулеза [Cheng V.C et al., 2005]. Специфичность микроскопии составляет 89-100%, но метод не позволяет отличить туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных. [Pfiffer et al., 2003; Lipsky, 1984; Gordin, 1990]. Диагностика с использованием культурального метода требует нескольких месяцев. Несмотря на длительное использование этих методов, споры по поводу чувствительности и правильности интерпретации результатов продолжаются [Wei-Juin Su, 2002].

В последние десятилетия развитие молекулярной биологии способствовало появлению новых экспресс-методов лабораторной диагностики туберкулеза [Glennon et al., 2001]. Среди них значительное место занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода — ПЦР в реальном времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и классическими методами (микроскопией и культуральным методом) и позволяет диагностировать туберкулез в течение нескольких часов. Кроме того, ПЦР в реальном времени позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ, а также упрощает разработку мультиплексных тестов.

На фармацевтическом рынке разных стран представлено незначительное количество тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза. Большая часть из них предназначена для обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и не позволяет дифференцировать микобактерии, выявлять их жизнеспособность, проводить количественный анализ и ускоренную диагностику с применением мультиплексных реакций.

Проблема туберкулеза усугубляется сложностью лечения мультирезистентных форм [Wade, 2004]. Исследования в области мультирезистентности к противотуберкулезным препаратам состредоточены на изучении взаимодействия микобактерии с лекарственным препаратом [Zhang, 2000]. Однако в настоящее время нет исследований в области реакции клеток организма человека на воздействие противотуберкулезных препаратов.

Несмотря на широкое распространение метода ПЦР, в действующей ГФ отсутствуют как общая фармакопейная статья, так и статьи по применению конкретных тест-систем на основе ПЦР, например, для выявления и дифференцирования различных типов бактерий туберкулеза. Длительность сертификации, отсутствие или недоступность нормативной документации ограничивает распространение тест-систем на основе ПЦР, которые, в свою очередь, должны способствовать совершенствованию методов лечения и их стандартизации.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация тестов для диагностики туберкулеза на основе новой модификации ПЦР -метода ПЦР в реальном времени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать тест-систему на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

2. Оптимизировать условия проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis;

3. Разработать тест-систему для количественного определения M.tuberculosis-,

4. Оптимизировать условия для выявления жизнеспособности M.tuberculosis-,

5. Провести исследование возможности применения разработанных тест-систем с использованием культурального материала и клинического материала от больных туберкулезом.

6. Исследовать экспрессию гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом.

7. Разработать проекты ФСП, СТО и инструкцию по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

Научная новизна

Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая идентифицировать и дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis между собой и с другими микобактериями. Показано, что экспрессность реакции повышена в сравнении с «гнездовой» ПЦР с сохранением одинаковой чувствительности.

Разработана тест-система на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющая идентифицировать и дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis между собой и с другими микобактериями. Тест-система характеризуется более высокой экспрессностью в сравнении с обычной ПЦР в реальном времени.

Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени для количественной оценки содержания ДНК М. tuberculosis в образце.

Впервые разработана отечественная тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для дифференцирования жизнеспособных и нежизнеспособных микобактерий. В основе разработанной тест-системы лежит обнаружение мРНК М. tuberculosis.

Сравнительные результаты использования тест-системы для обнаружения мРНК М. tuberculosis и кулыурального метода свидетельствуют о возможности использования разработанного теста для быстрого дифференцирования живых и неживых микобактерий, а также дормантных форм.

Экспериментальное использование разработанных тест-систем показало возможность их применения при работе как с культуральным материалом, так и с клиническим материалом от больных.

Впервые обнаружена экспрессия гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом, что открывает широкие перспективы продолжения исследований причин резистентности к лекарственным препаратам у больных туберкулезом.

Практическая значимость работы

Разработанные в ходе проведения исследовательской деятельности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПЦР в реальном времени могут быть использованы в диагностических лабораториях для дифференциальной экспресс-диагностики М. tuberculosis и М. bovis.

Тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis применима для дифференцирования живых, неживых и дормантных форм М. tuberculosis, что важно для контроля эффективности лечения заболевания.

Разработанная тест-система для количественного анализа М. tuberculosis может быть использована для оценки эффективности лечения туберкулеза существующими лекарственными препаратами и прогнозировать эффективность новых лекарственных средств.

Обнаружение гена мультирезистентности у больных туберкулезом и проведение дополнительных исследований открывает перспективы выявления дополнительных причин лекарственной устойчивости и корректировки схем лечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Возможность идентификации и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis между собой и с другими микобактериями с использованием разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности реакции в сравнении с «гнездовой» ПЦР при сохранении одинаковой чувствительности.

2. Одновременное обнаружение и дифференцирование М. tuberculosis и M.bovis между собой и с другими микобактериями в одной пробирке с использованием разработанной тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности теста в сравнении с ПЦР в реальном времени.

3. Возможность количественной оценки содержания ДНК М. tuberculosis в образце с применением разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени.

4. Возможность быстрого дифференцирования живых, неживых и дормантных форм микобактерий с использованием тест-системы на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis.

5. Возможность применения разработанных тест-систем иа основе ПЦР в реальном времени при работе с культуральным материалом и клиническим материалом от больных.

6. Обнаружение экспрессии гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом и необходимость продолжения исследований резистентности к противотуберкулезным препаратам.

7. Проекты ФСП, СТО и наставление для тест-системы на основе ПЦР «в реальном времени» для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XII Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г.), на IV Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (Москва, 2005 г.), на Международной научной конференции «Современные проблемы генетики» (Минск, 2005 г.), на 16-м Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Ницца, Франция, 2006 г), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований» (Ростов-на-Дону, 2006). Публикации. По результатам диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты собственных исследований и обсуждение результатов, заключение, выводы, приложения, библиографический список ( -/ХЗ источников, из них JbЧ на русском и J£3 на иностранных языках). Работа содержит & таблиц, jtt, рисунков.

Материалы и методы исследования

В качестве исследуемого материала использованы 60 образцов ДНК микобактерий, 70 образцов мокроты, экссудата, содержимого туберкулем, содержимого каверн, бронхолегочного секрета, смывов из эмпиемы от больных, находящихся на лечении, 130 образцов крови и ликвора, 5 образцов подрощенных на питательной среде микобактериальных клеток из МГНПЦБТ.

Выделение мРНК М. tuberculosis из образцов проводили с использованием «Тризола» (Trizol Reagent, Life Technology, США) по методике производителя. Для выделения ДНК М. bovis и М. tuberculosis из суспензии бактерий и биологических образцов применяли методику с использованием неорганического сорбента [Гребенникова, 1997].

ПЦР на матрице ДНК и кДНК М. bovis и М. tuberculosis проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл суммы нуклеиновых кислот, по 10 пмоль каждого праймера, 10 пмоль зонда, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ Tris-HCl (рН=9,0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCb..

ПЦР в реальном времени на матрице ДНК и кДНК М. bovis и M.tubercülosis с использованием наборов фирмы Applied Biosystems проводили в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5-7 мкл ДНК, 10 пмоль каждого праймера, 10 пмоль зонда, 12,5 мкл смеси "TaqMan Universal PCR Master Mix"mm"TaqMan One-Step Rt-PCR Master Mix Reagents" (Applied Biosystems, США). ПЦР в реальном времени проводили на приборе ABI PMSM (Applied Biosystems, США).

Последовательности специфических олигонуклеотидов разрабатывали на основе консенсусной последовательности геномов референтных штаммов, представленных в Генбанке: _

Название праймера (температура отжига °С) Последовательность (5 '->5') \

Для обнаружения ДНК М. bovis методом ПЦР в реальном времени:

Taq Mpb70F (50) ctcggtgcagggaatgtcgcag

Taq Mpb70R(50) tgcagccgtcagcgttgtcaa

Для обнаружения ДНК М. tuberculosis методом ПЦР в реальном времени:

Taq Mtp40F(50) tggttcccaacaccacgttagggat

Taq Mtp40R(50) tgacctcagcgttcaactttgcgac

Зонд для обнаружения ДНК М. bovis методом ПЦР в реальном времени:

Probe МрЬ70 tcgcggtggcggcctcgaacaa

Зонд для обнаружения ДНК М. tuberculosis методом ПЦР в реальном времени:

Probe Mtp40 agcgctcccaccaacgggtggctca

Для ОТ на матрице мРНК гена Mtp40

Mtp40RNA (42) | aaaattttaaaattttccccggggttttaatgacctcagcgttcaact

Для обнаружения кДНК:

Taq Mtp40F(50) tggttcccaacaccacgttagggat

RNA (70) aaaattttaaaattttccccggggt1ttaa

Зонд для обнаружения кДНК

Probe Mtp40 1 agcgctcccaccaacgggtggctca

Дл я конструирования референтной плазмиды

mimicMtp40F (60) tggttcccaacaccacgttagggattcacccacactgtgcccatctacga

mimicMtp40R (60) tgacctcagcgttcaactttgcgac cagcggacccgcattgccaatgg

Для проведения ПЦР в реальном времени использовали 40 циклов амплификации при следующих температурных режимах: 94°С — 15 сек; отжиг при соответствующей праймеру температуре — 15 сек; 72 °С — 60 сек

Для проведения ОТ-ПЦР в одной пробирке на матрице мРНК МлиЪегси1о$1$ использовали те же температурные режимы, но вводили дополнительный цикл синтеза кДНК (ОТ) (50°С - 30 минут, 95°С - 5минут) перед основными циклами.

Для обнаружения мРНК и дифференцирования от геномной ДНК гена М1р40 проводили раздельно обратную транскрипцию и полимеразную цепную

реакцию. Использовали ПЦР и ГТЦР в реальном времени. Перед началом ПЦР реакционную смесь, не содержащую фермента Taq-полимеразы, прогревали до 94 °С в течение 3 минут. Фермент добавляли в течение 30 сек при 80 °С следующего цикла.

Для обнаружения мРНК MDR1 проводили совмещенную ОТ-ПЦР в конечном объеме 25 мкл. Для проведения реамплификации использовали 5 мкл амплификата, полученного после ОТ-ПЦР.

Анализ фрагментов ДНК после ПЦР проводили методом гель-электрофореза. Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм. Результаты ПЦР в реальном времени автоматически выводили на экран монитора компьютера в виде зависимости интенсивности флуоресценции от цикла реакции.

Наработанные в ПЦР фрагменты ДНК выделяли из геля с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Promega, США) по методике производителя. Определение первичной структуры ДНК проводили на автоматическом ДНК-секвенаторе (ABI 377, США) и анализировали с использованием компьютерных программ MacVector/AssemblyLign (Acceliys Inc.,CIllA).

Результаты исследований и обсуждение 3.1. Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis

Разработка тест-системы на основе ПЦР в реальном времени проводилась для идентификации М. tuberculosis и М. bovis и дифференциации их между собой и с другими микобактериями .

Mycobacterium tuberculosis принадлежит к микобактериям туберкулезного комплекса, который включает М. tuberculosis, М. bovis, М. bovis BCG, M.africanum и М. microti, однако только М. tuberculosis и М. bovis рассматриваются в качестве основных патогенов для человека [Frothingham et al., 1994]. Микобактерии туберкулезного комплекса имеют идентичные последовательности нуклеотидов многих генов [Kirschner et al., 1993], что осложняет их дифференциальную диагностику с использованием ПЦР.

В 1996 г. в лаборатории молекулярной диагностики института вирусологии им. Д.И. Ивановского впервые был проведен анализ и сравнение геномов различных видов микобактерии [Гребенникова, 1997]. Оказалось, что между М. bovis и М. tuberculosis существует отличие, которое заключается в присутствии в геноме М. tuberculosis генов Mtp40 и МрЬ70, а в М. bovis — только гена МрЬ70. В дальнейшем эти исследования нашли подтверждение в литературных источниках [Alfonso, 2002; Carr, 2003].

В ходе разработки теста были подобраны две пары праймеров TaqMpb70F-TaqMpb70R, TaqMtp40F-TaqMtp40R, специфичных генам Mtp40 и МрЬ70 соответственно, и пара олигонуклеотидных зондов (ProbeMtp40 и ProbeMpb70). Расчетная длина ПЦР-продуктов на матрице генов Mtp40 и МрЬ70 составила 135 п.о. Флуорофоры FAM и TAMRA были выбраны в качестве красителей в зондах. Для проверки специфичности праймеров и

зондов использовали 11 образцов нуклеиновых кислот, выделенных из культур микобактерий. Температура 50 °С оказалась оптимальной для отжига обеих пар праймеров. В результате ПЦР в реальном времени ген МрЬ70 был обнаружен во всех 11 пробах (рис.1).

А В

Рис. 1. Обнаружение гена МрЬ70 (А) и гена Mtp40 (Б) методом ПЦР в <феалыгам времени» на матрице ДНК микобактерий. Кривые 1-11 (А) соответствуют положительным результатам обнаружения гена МрЬ70. Кривые 1, 2, 3, 11 соответствуют положительным результатам обнаружения гена Míp40

Ген Mtp40 был обнаружен только в четырех пробах (1, 2, 3, 11) (см. рис. 1). Согласно характеристикам геномов микобактерий можно заключить, что в пробах 1, 2, 3, 11 присутствует М. tuberculosis, а во всех остальных пробах присутствует М. bovis. Результаты совпали с результатами бактериологических исследований (культуральным и микроскопией) (табл. 1.) и подтвердили специфичность подобранных олигонуклеотидов.

Таблица 1.

Результаты испытания тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, полученные

на матрице ДНК из культур М. tuberculosis и М. bovis

№ об раз ца Результаты, полученные бактериологическими методами Результаты, полученные методом ПЦР

«гнездовой» ПЦР ПЦР в реальном времени

Обнаружение ДНК M.tuberculosis Обнаружение ДНК М. bovis Обнаружение ДНК M.tuberculosis Обнаружени е ДНК М. bovis

1 М. tuberculosis + - + -

2 Mtuberculosis + - + -

3 Аituberculosis + - + -

4 М. bovis - + - +

5 М. bovis - + - +

6 М. bovis - + - +

7 М. bovis - + - +

8 М. bovis - + - +

9 М. bovis SCG - + - +

10 М. bovis BCG - + - +

И M.tuberculosis + - + -

Представляло интерес сравнение результатов ПЦР в реальном времени и «гнездовой» ПЦР в связи с близкой чувствительностью этих методов [Gruber, 2001]. Специфичность теста на основе ПЦР в реальном времени проверяли, используя тест-систему, основанную на одной из модификаций ПЦР -«гнездовой» ПЦР. Тест-система разработана лабораторией молекулярной диагностики [Гребенникова, 1999] и позволяет проводить дифференциацию микобактерий. Праймеры (Т1/Т1А, Т2ЛГ2А, ТЗ/ТЗА, Т4/Т4А) к специфическим фрагментам геномов различных микобактерий позволяют дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis от других «атипичных» штаммов микобактерий. Тест-система проверена более чем на 1500 животных образцов и клинических образцах от людей. Корреляция результатов, полученных с использованием данной тест-системы и результатов, полученных с использованием классических методов [Гребенникова, 1999], составила более 98%.

В результате «гнездовой» ПЦР пробы 1, 2, 3, 11 оказались положительными при проведении реакции с праймерами Т1/Т1А - ТЗ/ТЗА, специфичными к ДНК М. tuberculosis (рис.2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II К- К

Рис. 2. Результаты «гнездовой» ПЦР на матрице ДНК из культуры микобактерий с использованием праймеров Т1/Т1А, ТЗ/ТЗА (специфичных к ДНК М. tuberculosis). Дорожки 1, 2, 3, 11 - положительные результаты, дорожки 4-10 - отрицательные результаты, К- - отрицательный контроль, К+- положительный контроль.

Все пробы оказались положительными при проведении реакции с праймерами Т2/Т2А - Т4/Т4А, специфичными к ДНК М. bovis и М. tuberculosis (рис.3).

1 23456789 10 11 К-К+

Рис. 3. Результаты «гнездовой» ПЦР на матрице ДНК из культуры микобактерий с использованием праймеров Т2/Т2А, Т4/Т4А (специфичных к ДНК M.tuberculosis и AÍ bovis). Дорожки: 1-11 -положительные результаты, К- - отрицательный контроль, К+ - положительный контроль.

В соответствии с инструкцией к применению (ТУ 9388-040-00008064-99) пробы 1, 2, 3,11 содержат М. tuberculosis,а все остальные пробы содержат М. bovis.

Корреляция результатов «гнездовой» ПЦР, ПЦР в реальном времени и бактериологических испытаний для исследуемых образцов оказалась 100% (см. табл. 1).

Особый интерес представляла способность разработанного теста на основе ПЦР в реальном времени выявлять микобактерии в клиническом материале без предварительного культивирования. Параллельное исследование 40 образцов нуклеиновых кислот, выделенных из мокроты больных туберкулезом и типированных с использованием тест-системы на основе ПЦР фирмы Hoffman la Roche (Швейцария), «гнездовой» ПЦР и разработанного теста на основе ПЦР в реальном времени обнаружило некоторые несовпадения результатов (табл. 2).

Таблица 2.

Сравнительные результаты использования тест-системы на основе гнездовой ПЦР и тест-системы на основе ПЦР в реальном времени на матрице ДНК, типированной с использованием тест-системы фирмы Hoffman la Roche (Швейцария)

Результаты «гнездовой» ПЦР Результаты ПЦР в реальном времени

Положительные результаты (26) Положительные результаты (21)

Отрицательные результаты (5)

Отрицательные результаты (9) Отрицательные результаты (8)

Положительные результаты (1)

Слабоположительные результаты (5) Положительные результаты (5)

В скобках - число образцов

В пяти случаях мы получили положительный результат при использовании «гнездовой» ПЦР и отрицательный результат при использовании ПЦР в реальном времени. Причина различий может заключаться в наличии специфических ингибиторов, снижающих эффективность ПЦР в реальном времени. В пяти случаях получен слабый сигнал при использовании ПЦР, что связано с очень низким содержанием микобактерий в мокроте. Однако ПЦР «в реальном времени» показала положительный результат при анализе этих образцов, что подтверждает более высокую эффективность реакции. Восемь образцов, положительных при исследовании тест-системой фирмы Hoffman La Roche, были отрицательными по результатам тестирования методом «гнездовой» ПЦР и ПЦР «в реальном времени». Это объясняется тем, что тест-система фирмы Hoffman la Roche определяет ДНК всех микобактерий туберкулезного комплекса, в то время как тест на основе «гнездовой» ПЦР и разработанный тест на основе ПЦР в реальном времени определяют М. bovis, М. bovis BCG, М. tuberculosis.

Исследование показало, что тест на основе ПЦР в реальном времени для выявления микобактерий можно использовать при работе с первичным материалом без предварительного культивирования.

3.2. Разработка тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis Детектор амплификатора ABI PRISM 7000 для проведения ПЦР в реальном времени может одновременно фиксировать свет от нескольких

флюорофоров и разделять сигналы от разных красителей. Это позволяет вести наблюдение одновременно за несколькими реакциями амплификации в одной лунке, что позволяет проводить определение нескольких видов возбудителя в одной пробирке.

Для выявления одновременно М. tuberculosis и М. bovis были использованы те же пары праймеров (TaqMpb70F-TaqMpb70R, TaqMtp40F -TaqMtp40R), что и в ПЦР в реальном времени. Одинаковая температура отжига праймеров (50°С) позволила проводить реакции для выявления двух генов (Mtp40 и МрЬ70) в одной пробирке. При проведении мультиплексной ПЦР в одной пробирке содержится как минимум два красителя. Важным моментом в этом случае является оптимальный подбор красителей в зондах. В качестве красителей для одного из зондов был выбран FAM, а для другого — R6G. Разность эмиссий длин волн для выбранных флуорофоров составила 30 нм, что оказалось достаточным для разделения сигналов при считывании флуоресценции прибором. В итоге реакционная смесь для проведения мультиплексной ПЦР «в реальном времени» содержала одновременно 2 пары праймеров и 2 зонда в общем объеме реакционной смеси. Возможности такой мультиплексной реакции были исследованы с использованием 40 проб нуклеиновых кислот, выделенных из мокроты больных туберкулезом. Для этого мы параллельно проводили реакции для выявления M.tuberculosis и М. bovis в разных пробирках и в одной (рис.4). Результаты показали, что мультиплексная ПЦР не уступает по чувствительности обычной ПЦР, однако повышает экспрессность метода ПЦР «в реальном времени» на 20% и более (в зависимости от количества исследуемых образцов) при проведении дифференциальной диагностики микобактерий.

|80

§60 и

оЧа

JL 20Í

-2о|

номер цикла

номер шасла

номер хшкла

Рис.4. Обнаружение гена Мгр4-0 и гена МрЬ70 с использованием тестов на основе ПЦР в реальном времени (А, Б) и мультиплексной ПЦР в реальном времени (В)

3.3. Разработка теста для количественного определения М. tuberculosis

Для проведения количественного анализа необходимо иметь референтную матрицу, имеющую участки, комплементарные праймерам, которые используются для диагностики исследуемой инфекции. Для её

создания на матрице гена бетта-актина был наработан фрагмент, размером 345 п.о. При этом использовали праймеры пиппсМ1р40Р и тншсМ1р40К. Эти праймеры содержали фрагменты, комплементарные гену бетта-актина и фрагменты, идентичные праймерам TaqMtp40F и TaqMtp40R (рис.5.).

TaqMtp40R

"b-актин"

345 п.о.

N. Ь-актин TaqMtp40y^ "N^aqM^OR EcoRlipG^^iJEcoRI

Рис.5. Конструирование референтной матрицы для количественного анализа

Наработанный с использованием таких праймеров фрагмент был выделен из геля, очищен и встроен в плазмидный вектор pGemT-easy (Promega, США). Концентрацию полученной плазмиды определяли с использованием спектрофотометра. Она составила 1,46x10"8 г/мкл. Количество копий плазмиды рассчитывали, исходя из того, что молярная масса пары оснований ДНК 660 г/моль. Тогда 3360 пар оснований референтной плазмиды составляет 2 217 600 г/моль, а число молекул референтной плазмиды в мкл:

N= 1,4бх 10"У/мкл х 6 х 102Э молекул /моль - 4х 109 молекул/мкл

2 217 600 г/моль

С использованием серии последовательных разведений плазмиды проводили ПЦР в реальном времени с использованием праймеров TaqMtp40F-TaqMtp40R и зонда Probe mimicMtp40, комплементарного гену бетта-актина (рис.6). На основании полученных данных строили калибровочный график (рис.7.).

Количество .1x10»

1x10°

копий

1x10 fhxio3 ;ixio2

1x10'

Тс-

номер цикла Рис.6. Результаты ПЦР в реальном времени на матрице серии последовательных разведений референтной плазмиды для количественного анализа

2 3 4 5 6 7

log количества копий

Рис.7. Калибровочный график для количественного анализа

По такому графику можно рассчитать количество копий ДНК M.tuberculosís в зависимости от порогового цикла реакции.

3.4. Разработка теста для определения жизнеспособности микобактерий

Ограничением тестов для выявления и дифференциации М. tuberculosis и М. bovis методом ПЦР и ПНР в реальном времени является невозможность дифференцирования живых и неживых микобактерий. Микобактериальные клетки могут перейти в «дормантную» фазу (отсутствия роста) и не вызывать симптомов заболевания. Обнаружение ДНК микобактерий в таких случаях не является свидетельством заболевания.

Менее стабильной мишенью является прокариотическая мРНК, которая может быть обнаружена только в живых микобактериях. Время полужизни её составляет всего несколько минут [Belasco et al., 1986]. Эффективное лечение приводит к быстрому снижению числа живых микобактерий в клинических образцах [Desjardin, 1999] а затем и к полному их исчезновению. Следовательно, мРНК может служить маркером эффективности противотуберкулезной терапии.

Исходя из этого, мы разработали дополнительный тест на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени, позволяющий определять мРНК М. tuberculosis и отличать её от ДНК, а, следовательно, дифференцировать живые микобактерии и «дормантные». Для разработки тест-системы использовали штаммы M.tuberculosís, подрощенные на питательной среде и подходы, использованные ранее [Гребенникова, 2004].

Для обратной транскрипции подобрали праймер (Mtp40RNA), комплементарный гену Mtp40 М. tuberculosis. 17 нуклеотидов праймера комплементарны мРНК М. tuberculosis, остальные 30 - выбраны произвольно (рис.8).

Обратная транскрипция

Mlp40RNA

_„рнк

i. кДНК

Первый этап ПЦР

T¡4MÍp4ÓF

30 циклов ПЦР

TaqMtp40F RNA í/iO п.о.)

^фрагменты ПЦР 135 п.о.

Рис.8.Схема обнаружения мРНК гена Mtp40 М. tuberculosis

В результате обратной транскрипции в течение 1 часа при 42 °С получали фрагменты кДНК (135 пар оснований), ограниченные с одной стороны произвольно выбранной последовательностью, содержащей 30 пар оснований.

Наличие в составе кДНК фрагмента, состоящего из 30 пар оснований, комплементарного произвольно выбранной последовательности «RNA», позволило дифференцировать её от геномной ДНК. На следующем этапе проводили ПЦР с использованием праймера TaqMtp40F и праймера «RNA» (30 нуклеотидов), идентичного произвольно выбранной последовательности.

Основной проблемой стал подбор условий проведения реакции на матрице кДНК. После обратной транскрипции реакционная смесь может содержать остаточное количество праймера Mtp40RNA (47 нуклеотидов), который может служить затравкой для ПЦР на матрице ДНК. Для исключения таких процессов подбирали температуру, оптимальную для отжига праймера «RNA» (30 нуклеотидов) и исключающую отжиг праймера Mtp40RNA (47 нуклеотидов), вернее, его фрагмента, состоящего из 17 нуклеотидов, комплементарного геномной ДНК. Для этого ПЦР с использованием реакционной смеси после обратной транскрипции проводили параллельно с разными комбинациями праймеров: 1) TaqMtp40F - Mtp40RNA. Праймер Mtp40RNA (47 нуклеотидов) не добавляли, так как в реакционной смеси после реакции обратной транс1фипции присутствует его избыток; 2) TaqMtp40F - RNA (30 нуклеотидов). Следовательно реакционные смеси различались только наличием праймеров для «-» цепи. Далее проводили ПЦР при температурах отжига от 45° до 71°С (рис.9).

Al 2 5 ISS 7

~ -*■ Iii'* Ц*ШЦ»

Б I 2 1 4 5 (> 7

Рис.9. Выявление и дифференциация геномной ДНК (А) и кДНК (Б). Дорожки 1-7 рисунка А и Б соответствуют различным температурам отжига при проведении ПЦР (45, 55, 60, 65, 70, 71, 72°С соответственно).

Только при 70°С исчезла полоса, характерная для ампликона на матрице ДНК. В то же время ясно видна полоса, характерная для ампликона на матрице кДНК. Т.о, праймер Mtp40RNA (47 нуклеотидов) перестает отжигаться на матрице ДНК, т.е. температура 70°С является оптимальной для выявления кДНК и дифференцирования её от ДНК.

Описанный эксперимент был повторен с использованием ПЦР в реальном времени. Отличием явилось добавление в реакционные смеси зонда ProbeMtp40, комплементарного области между праймерами TaqMtp40F и «RNA». Результаты ПЦР в реальном времени с использованием комбинаций праймеров 1 и 2 при температуре 70°С иллюстрирует рисунок 10. Результаты свидетельствуют о том, что при 70°С ПЦР в реальном времени не протекает с использованием комбинации праймеров 1: на рисунке 10 - это кривая,

номер" цикла

Рис. 10. Результаты ПЦР в реальном времени на матрице геномной ДНК и кДНК

М. tuberculosis.

соответствующая реакции амплификации на матрице геномной ДНК. В то же время ПЦР в реальном времени с использованием комбинации праймеров 2 положительна (см. рис. 10). Это - кривая, соответствующая реакции амплификации на матрице кДНК. Полученные результаты эксперимента подтверждают возможность идентификации кДНК после проведения реакции обратной транскрипции на матрице мРНК, а температурный режим (температура отжига 70°С) исключает наработку фрагмента на матрице геномной ДНК.

3.5. Применение разработанных тестов при исследовании клинического материала от больных туберкулезом

С использованием разработанных тестов было проведено исследование 70 проб клинического материала от 64 больных легочными формами туберкулеза, находящихся на лечении в МНПЦБТ. Пробы одной и той же даты отбора параллельно исследовали с использованием микробиологических тестов (люминесцентной микроскопией и культуральным методом). Пациентов делили на 4 группы в соответствии с характеристиками их биопроб.

Одновременное присутствие ДНК и мРНК (группа 1) в пробах свидетельствует о том, что микобактерии живые. Присутствие в пробе мРНК и отсутствие ДНК (группа 2) свидетельствует о незначительном количестве микобактерии, большинство из которых являются жизнеспособными. Наличие ДНК и отсутствие мРНК (группа 3) может свидетельствовать о том, что большинство микобактерий погибло, либо находится в «дормантном» состоянии. Отсутствие ДНК и мРНК (группа 4) свидетельствует об отсутствии живых и мертвых микобактерий и затухающем леченом туберкулезе.

В первой группе оказалось 8 пациентов (табл. 3). В трех случаях (1,2, 11) результаты обнаружения ДНК и мРНК совпали с результатами микроскопии и культур алыгого метода. Обнаружение ДНК, также как микроскопия, свидетельствует о наличии микобактерий, в то время как обнаружение мРНК, как и культуральный метод, подтверждает их жизнеспособность.

Таблица 3.

Сравнительный анализ результатов бактериологических исследований и обнаружения ДНК и мРНК микобактерий методом ПЦР «в реальном времени» в образцах

№пп Обнаружение ДНК мРНК Результаты микроскопии Результаты культурального исследования

1 + + + +

2 + + + +

и + + + +

30 + + — —

36 + + + —

50 + + — +

61 + + — —

65 + + ... —

Представленные результаты свидетельствуют о возможности использования разработанных тестов на основе ПЦР в реальном времени для предварительной оценки наличия и жизнеспособности микобактерий в клиническом материале.

Отрицательный результат микроскопии при исследовании пробы 50 можно объяснить более низкой чувствительностью этого метода по сравнению с ПЦР и с кулыуральным методом.

В пробе 30 обнаружение ДНК и мРНК не подтвердилось микробиологическими методами. Однако после изучения истории болезни пациента было выяснено, что метод микроскопии выявлял микобактсрии туберкулеза за 20, а культуральный метод за 30 дней до настоящего отбора проб, после чего рост микобактерий до конца лечения не обнаруживался. Это может свидетельствовать о том, что чувствительность ПЦР в реальном времени позволяет выявлять жизнеспособных микобактерий по крайней мере в течение месяца после того, как микобактерии были обнаружены культуральным методом.

В пробах 36, 61, 65 обнаружение мРНК не было подтверждено культуральным методом. Больные, от которых были получены пробы, были выписаны из стационара, но через несколько месяцев были повторно госпитализированы. Обнаружение мРНК может служить маркером при исследовании антимикобактериальной эффективности препаратов [Ое8]аг<1ш, 1999]. Такой случай позволяет предположить, что в определенный момент лечения эффективность лекарств снизилась, и на фоне кажущегося затухающего заболевания некоторые микобактерии все же не погибли, а после прекращения лечения количество микобактерий стало увеличиваться, что привело к возобновлению симптомов болезни и повторной госпитализации.

Во второй группе (ДНК «-», мРНК «+») оказалось 8 пациентов (табл. 4). Обнаружение мРНК не было подтверждено культуральным методом. Обнаружение мРНК в пробе от пациента 17 незадолго до выписки из стационара подтверждает существование живых микобактерий в организме.

Таблица 4.

Сравнительный анализ результатов бактериологических исследований и обнаружения ДНК и мРНК микобактерий методом ГИДР в реальном времени в образцах клинического материала от больных туберкулезом группы 2 (ДНК «-» мРНК «+») и

№пп пациента Обнаружение ДНК мРНК Результаты бактериологических исследований Комментарии

17 — + — Повторная госпитализация

20 — + — Продолжает лечение

22 — + — Выписан досрочно по собственному желанию через месяц после начала терапии

24 — + — Заболел остро, РНК обнаружена через 3 дня после поступления

27 — + — мРНК обнаружена через 60 дней после начала лечения, за 30 дней до выписки

28 — + — Микобактерии обнаруживали культуральным методом 120 дней назад

33 — + — мРНК обнаружена за 30 дней до выписки.

47 + Культуральным методом микобактерии обнаруживали за 3 дня до настоящего исследования

Однако из-за малого количества микобактерий результаты бактериологических исследований были отрицательными. Видимо, прекращенное лечение привело к возобновлению туберкулезного процесса и повторной госпитализации.

Пациент 20 продолжал лечение в стационаре и в последующем в пробах материала от этого больного микробиологическими методами микобактерии обнаружены не были.

Можно предполагать, что выписанный досрочно по собственному желанию после месяца терапии пациент 22 является недолеченным, о чем свидетельствует обнаружение мРНК.

Пациент 24 поступил в стационар в тяжелом состоянии с признаками интоксикации, что свидетельствует об активном туберкулезном процессе и подтверждается наличием мРНК, то есть наличием живых активных микобактерий.

В пробах 28 и 47 рост микобактерий бактериологическими методами обнаруживался ранее. Возможно, во время исследования молекулярными методами количество микобактерий было так мало, что чувствительность бактериологических методов была недостаточна. В пробах 27 и 33 обнаруживалась мРНК, но бактериологическими методами не удавалось подтвердить наличие микобактерий. Наличие инфекционного процесса подтверждали клинические признаки.

Полученные результаты могут быть примером того, как молекулярные методы могут помочь, если бактериологический анализ для конкретных пациентов отрицателен.

В третью группу (ДНК «+» РНК «-») вошло 25 больных. Причем бактериологическими методами подтверждены результаты ПЦР не были. В эту группу вошли больные, пробы материала от которых отбирались как в первый день госпитализации и начала лечения, так и через год после начала противотуберкулезной терапии. Как подтверждает опыт, ДНК микобактерий можно обнаруживать в течение практически всего периода лечения и это подтверждает высокую чувствительность ПЦР в реальном времени. Вероятно, чувствительность бактериологических методов не позволяла определять микобактерии в этой группе больных.

В четвертой группе не было обнаружено ДНК и мРНК, а также все рузультаты бактериологических исследований в течение всего периода пребывания в стационаре были отрицательными. Позже туберкулезная этиология заболевания была исключена.

Были исследованы также 146 проб ликвора и крови от 21 больного с подозрением на туберкулезный менингит и находящихся на различных этапах лечения. Отбор проб проводили в течение 10 месяцев.

У трех больных туберкулезная этиология не подтвердилась, что совпало с отрицательными результатами при использовании теста для выявления микобактерий на основе ПЦР в реальном времени.

В результате исследований культур ал ьный метод дал положительные результаты при исследовании ликвора от пяти больных, в то время как ДНК M.tuberculosis в различные периоды заболевания была обнаружена у 11 пациентов, мРНК М. tuberculosis - у трех пациентов (табл. 5).

Таблица 5.

Результаты исследований в группе больных туберкулезным менишитом_

Результаты культуральвого метода (п=19) Результаты ПЦР в реальном времени Результаты гнездовой ПЦР

Обнаружение ДНК М. tuberculosis Обнаружение мРНК М. tuberculosis Обнаружение экспрессии гена MDR1

Положительные результаты (5) 5 0 3

Отрицательные результаты (14) б 3 6

Коммерческие тесты, основанные на детекции M.tuberculosis в образцах, отобранных из респираторных органов, в настоящее время доступны, но не все применимы для работы с образцами из других органов (например, цереброспинальной жидкости) [Johansen et al., 2004]. Мы исследовали возможность использования разработанных тестов на основе ПЦР в реальном времени для выявления микобактерий в ликворе и сравнение результатов с данными бактериологии, а также объективными данными врачей о течении заболевания у пациентов.

ДНК М. tuberculosis была обнаружена в ликворе 11 больных (см. табл. 5). Причем в 5 случаях результаты обнаружения ДНК совпали с ранее положительными результатами бактериологии, что подтверждает наличие

микобактерий в исследуемых пробах. В шести случаях ДНК М. tuberculosis обнаружена у пациентов, пробы от которых были отрицательны по результатам бактериологии. Это можно объяснить большей чувствительностью ПЦР в реальном времени в сравнении с чувствительностью бактериологического анализа. В трех случаях была обнаружена мРНК М. tuberculosis, но не обнаружена ДНК. Эта группа больных была отрицательна по результатам бактериологии. Результат может свидетельствовать о нарастании количества микобактерий в организме больного вследствие снижения эффективности лечения. В одном из таких случаев через 3 и 4 месяца в пробе от больного была обнаружена ДНК М. tuberculosis. Количественный анализ с использованием разработанного теста показал что количество ДНК микобактерий уменьшалось во времени в процессе лечения. Так, через 3 месяца после обнаружения мРНК М tuberculosis количество ДНК составило 100 копий в образце, а через 4 месяца — 10 копий. В двух случаях мРНК М. tuberculosis была обнаружена в ликворе от больных, выписанных из стационара через месяц и через 4 месяца, поэтому дальнейшие исследования проводить мы не смогли. Но одна из больных почувствовала ухудшение состояния после выписки из стационара, что, возможно, произошло вследствие рецидива заболевания. В другом случае за обнаружением мРНК М. tuberculosis следовало обнаружение ДНК М. tuberculosis через 4 месяца, что подтвердило подозрения о возможности рецидива.

В двух случаях ДНК от больных обнаруживалась дважды с промежутком в 1 месяц. Причем, в одном случае обнаружению ДНК не предшествовало обнаружение ДНК в более ранние сроки. А в момент обнаружения в первый раз количество ДНК в образце составляло несколько десятков копий, во втором случае 100 копий. В третьем случае пробы для эксперимента отбирались впервые, количество ДНК в образце в течение лечения уменьшилось от 1000 до нескольких десятков.

Эксперимент показал, что разработанные тесты на основе ПЦР в реальном времени могут применяться при исследовании ликвора, а тест для количественного анализа может применяться для оценки эффективности лечения.

В этой же группе больных мы проводили исследования экспрессии гена, отвечающего за множественную лекарственную устойчивость у человека. Феномен множественной лекарственной устойчивости был описан как для опухолевых клеточных линий, так и для человеческих раковых клеток. Этот феномен является главным препятствием для успешного лечения неопластических заболеваний. Одним из механизмов, лежащих в основе мул ьтирези сте нтности, является продукция в клетке большого количества Р-гликопротеина, трансмембранного протеина массой 170 kDa, который является продуктом MDR1 гена и принимает участие в работе АТФ-зависимого насоса, посредством которого происходит неспецифический выброс из клетки лекарственных соединений. Ген Р-гликопротеина экспрессируется во многих опухолевых клетках, а также в клетках нормальных человеческих тканей [Goldstein, 1996].

В своей работе мы пытались обнаружить экспрессию гена М1Ж1 в ¡слетках больных, получающих противотуберкулезную терапию. Мы предположили, что ген МОЯ1 может активироваться при длительной терапии противотуберкулезными препаратами, вследствие чего происходит наработка Р-гликопротеина и, вследствие этого, неспецифический выброс различных химических соединений из клеток, в которых присутствуют микобактерии. Такой процесс может сделать неэффективным противотуберкулезную терапию.

В качестве клинического материала была исследована кровь от больных туберкулезным менингитом. Экспрессию гена МЭИЛ мы обнаружили в пробах крови от девяти пациентов. Причем, в одном случае экспрессия гена наблюдалась у пациента с неподтвердившимся диагнозом туберкулезного менингита, а с онкологической этиологией. В трех случаях наблюдались тяжелые и трудно поддающиеся лечению пациенты.

Мы использовали «гнездовую» ПЦР, совмещенную с обратной транскрипцией [Гребенникова, 1995]. В результате амплификации при исследовании проб крови от 9 больных туберкулезным менингитом был обнаружен не только ген МЕ>Ш (фрагменты ПЦР на уровне 835 п.о.), но и экспрессия гена М1Ж1 (мРНК) (фрагменты ПЦР на уровне 295 п.о.) (рис.11).

Рис.11. Электрофореграмма, подтверждающая обнаружение экспрессии гена MDR1 в клетках больных туберкулезным менингитом. Дорожки 1-8 соответствуют результатам ПЦР на матрице РНК, выделешюй из образцов крови больных туберкулезным менингитом, дорожка 9 - маркеры молекулярной массы.

Представленный эксперимент свидетельствует об экспрессии в клетках гена мультирезистентности при лечении противотуберкулезными препаратами, что может влиять на эффективность противотуберкулезной терапии.

Для внедрения в практику молекулярных тестов разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП). Разработан проект стандарта организации (СТО) и инструкции по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и M.bovis методом ПЦР в реальном времени для ветеринарии. В основу проектов вошли требования Еропейской фармакопеи (ЕФ) (European Pharmacopoeia, 4-th Edition, 2001), нормы ГОСТов (ГОСТ Р 1.4(1.5.>-2004).

выводы

1. Получены актуальные результаты по стандартизации диагностики туберкулеза с использованием ПЦР в реальном времени. Разработаны проекты ФСП, СТО и инструкция по применению для тест-системы для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis.

2. Разработан способ, позволяющий идентифицировать и дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis между собой и с другими микобактериями с использованием теста на основе ПЦР в реальном времени; экспрессность проведения реакции повышена в сравнении с «гнездовой» ПЦР при сохранении одинаковой чувствительности (10" 5 г ДНК).

3. Оптимизированы условия для одновременного выявления и дифференцирования М. tuberculosis и М. bovis между собой и с другими микобактериями в одной пробирке на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени; экспрессность теста повышена в сравнении с ПЦР в реальном времени на 20% и более, в зависимости от количества исследуемых образцов.

4. Установлено, что тест-система на основе ПЦР в реальном времени для количественного анализа применима для оценки содержания ДНК M.tuberculosis в образцах.

5. Выявлено, что тест-система на основе ПЦР и ПЦР в реальном времени для обнаружения мРНК М. tuberculosis применима для быстрого дифференцирования живых, неживых и дормантных форм микобактерий.

6. Установлено, что применение разработанных тест-систем на основе ПЦР в реальном времени возможно при работе с культуральным материалом и биологическими образцами.

7. Обнаружена экспрессия гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом, что свидетельствует о необходимости применения лекарственных препаратов, подавляющих экспрессию этого гена для повышения эффективности противотуберкулезной терапии.

Список сокращений

ГОСТ — Государственный стандарт ГФ - Государственная фармакопея ДНК — Дезоксирибонуклеиновая кислота ЕФ - Европейская фармакопея кДНК - комплементарная ДНК

МГНПЦБТ - Московский городской научно-производственный

центр борьбы с туберкулезом

мРНК - матричная РНК

ОТ — обратная транскрипция

п.о. — пары нуклеотидных оснований

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

РНК - Рибонуклеиновая кислоты

СТО — стандарт организации

ФСП — фармакопейная статья предприятия

dNTP — дезоксирибонуклеотидтрифосфат

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Потапова Н.И., Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Краснова М.А., Скотникова О.И., Алипер Т.Н., Непоклонов Е.А. Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для дифференциальной диагностики микобакгерий //Вестник РУДН. Сер. Фармация. - 2004. - №4 (28). - С. 300-308.

2. Плетенева Т.В., Потапова Н.И., Скальный A.B., Елисеева Ю.А., Самылина ИА., Сыроешкин A.B. Тяжелые металлы и стандартизация настоек //Фармация. -

2004,-№4.-С, 9-10.

3. Гребенникова Т.В., Потапова Н.И., Богосьян A.A., Забережный АД., Алипер Т.И., Непоклонов ЕА. Тест-система для определения вируса лейкоза птиц методом ПЦР //Ветеринария. - 2004. -№.9. - С. 26-28.

4. Потапова Н.И., Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Краснова М.А., Скотникова О.И., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Оценка эффективности метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для диагностики туберкулеза //XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»:Тез.докп. - 18-22 апреля

2005. - М., 2005. - С.216-217.

5. Потапова Н.И., Гребенникова Т.В., Дорожкова И.Р., Мороз A.M. Разработка внутреннего контроля для количественного определения ДНК микобакгерий методом полимеразной цепной реакции в реальном времени //IV Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии»: Тез.докл. -22 апреля 2005. - М„ 2005. - №3 (16) - С. 32-33.

6. Потапова Н.И., Гребенникова Т.В., Дорожкова И.Р., Мороз A.M. Обнаружение экспрессии гена МТР40 М. tuberculosis с использованием полимеразной цепной реакции //Молекулярная и прикладная генетика.: Тез. докл. Междунар. науч. конф. 17-18 ноября 2005 г. - Минск, 2005. - Т. 1. - С.286.

7. Potapova N.I., Grebennikova Т., Zaberczhny A., Dorozhkova I., Moroz A. Development of tools for detection of DNA and mRNA from mycobacteria in clinical samples // Abstract of 16th ECCMID: April 1-4 2006. - Nice, France, 2006. - P.345.

8. Потапова Н.И., Гребенникова T.B., Забережный А.Д., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза //Ветеринария. - 2006. -№.9-С.54-55.

9. Гребенникова Т.В., Потапова Н.И., Сыроешкин A.B. Комплекс молекулярных методов исследования в диагностике и контроле эффективности химиотерапии туберкулеза //Международная научно-практическая конференция «Разработка противотуберкулезных терапевтических агентов нового поколения. Проблемы, подходы, перспективы»: Тез.докладов. - 26 сентября 2006. - М., 2006. - С. 13.

10. Плетенева Т.В., Потапова Н.И., Успенская Е.В., Попов П.И., Гребенникова Т.В., Сыроешкин A.B. Проблемы стандартизации в фармации: архаизмы и перспективы //Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация): Тез.докл. Всоюз. науч. конф. 16-17 октября 2006 г. - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 157.

Потапова Надежда Ивановна

Разработка тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза

Разработан комплекс методов для диагностики туберкулеза: тест-системы на основе ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПЦР в реальном времени для выявления М. tuberculosis и М bovis и дифференцирования их между собой и с другими атипичными микобактериями, тесты для количественной оценки ДНК М. tuberculosis в образцах, дифференциальной диагностики живых и дормантных форм М. tuberculosis а так же изучена возможность экспрессии гена MDR1 в группе больных туберкулезом. Показана возможность использования разработанных тестов для исследования культурального материала, а также биологических образцов от больных легочными формами туберкулеза и туберкулезным менингитом. Тесты позволяют выявлять микобактерии в течение одних суток, определять их количество, определять жизнеспособность и мониторировать эффективность лечения туберкулеза. Выявление гена MDR1 может быть дополнительным методом оценки эффективности лечения противотуберкулезными средствами.

Potapova I. Nadezhda

Development of Real-Time PCR-based test-systems for diagnostics of tuberculosis

In this thesis development of tools for diagnostic of the tuberculosis has been demonstrated. Test-systems based on Real-Time PCR, multiplex Real-Time PCR for identification and differentiation of M. tuberculosis and M. bovis and other Mycobacteria, quantitative test for identification of M. tuberculosis, test-sestem for differentiation of viable and nonviable M. tuberculosis have been developed. Expression of MDR-1 gene in treated tuberculosis patients has been studied. The possibility of using the developed test-systems for detection of mycobacterium in pulmonary and extrapulmonary specimens and monitoring the efficacy of treatment have been demonstrated. Detection the expression of MDR-1 gene can be additional method for assessment the efficacy of antituberculosis treatment.

Принято к исполнению 02/11/2006 Исполнено 03/11/2006

Заказ № 885 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш.. 36 (495)975-75-56 www.autoreferat.r4

Оглавление диссертации Потапова, Надежда Ивановна :: 2006 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ 5 I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Туберкулез - одна из основных проблем современной медицины

1.2. Клинические признаки туберкулеза

1.3. Характеристика возбудителя туберкулеза

1.4. Характеристика генома микобактерии туберкулеза

1.5. Диагностика туберкулеза

1.5.1 Полимеразная цепная реакция (ПНР)

1.5.2 Теоретические основы метода ПЦР

1.5.3 Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний

1.5.4 Ограничения метода ПЦР

1.5.5 Выделение ДНК из образцов

1.5.6 ПЦР в реальном времени

1.5.7 Генодиагностика туберкулеза

1.5.8 Стандартизация метода ПЦР

1.6. Основные проблемы, связанные с лечением туберкулеза

1.7. Резистентность к лекарственным препаратам

1.8. Профилактика туберкулеза

1.8.1. Неспецифическая профилактиака

1.8.2. Специфическая профилактика

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Потапова, Надежда Ивановна, автореферат

Ежегодно в мире от туберкулеза умирают около 2 млн человек, а в развивающихся странах один из пяти случаев смерти связан с туберкулезом. Это больше, чем от СПИДа, малярии и всех тропических болезней вместе взятых [55].

Быстрое распространение туберкулеза, появление мультирезистентных форм, увеличение количества случаев заражения одновременно бактериями М. tuberculosis и вирусом иммунодефицита требуют применения экспресс-методов диагностики и эффективных методов противотуберкулезной терапии [139].

Использующиеся в настоящее время методы прямого обнаружения микобактерий в клиническом материале с применением микроскопии по Цилю-Нильсену и культурального метода, являются классическими и признаются «золотым стандартом» диагностики туберкулеза [55]. Специфичность микроскопии составляет 89-100%, но метод не позволяет отличить туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных. [139, 116, 88]. Диагностика с использованием культурального метода требует нескольких месяцев. Несмотря на длительное использование этих методов, споры по поводу чувствительности и правильности интерпретации результатов продолжаются [180].

В последние десятилетия развитие молекулярной биологии способствовало появлению новых экспресс-методов лабораторной диагностики туберкулеза. Среди них значительное место занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время широкое распространение получает современная модификация метода - ПЦР в реальном времени. Метод обладает рядом преимуществ по сравнению с обычной ПЦР и классическими методами (микроскопией и культуральным методом) и позволяет получать результаты в течение нескольких часов. Кроме того, ПЦР в реальном времени позволяет проводить не только качественный, но и количественный анализ, а также упрощает разработку мультиплексных тестов.

На фармацевтическом рынке представлено очень незначительное количество тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для диагностики туберкулеза. Большая часть из них предназначена для обнаружения микобактерий туберкулезного комплекса и не позволяет дифференцировать микобактерии, выявлять их жизнеспособность, проводить количественный анализ и ускоренную диагностику с применением мультиплексных реакций.

Проблема туберкулеза усугубляется сложностью лечения мультирезистентных форм [177]. Исследования в области мультирезистентности к противотуберкулезным препаратам состредоточены на изучении взаимодействия микобактерии с лекарственным препаратом [184]. Однако в настоящее время нет исследований в области реакции клеток организма человека на воздействие противотуберкулезных препаратов.

Несмотря на широкое распространение метода ПЦР, в действующей ГФ отсутствуют как общая фармакопейная статья, так и статьи по применению конкретных тест-систем на основе ПЦР [9], например, для выявления и дифференцирования различных типов бактерий туберкулеза. Длительность сертификации, отсутствие или недоступность нормативной документации ограничивает распространение тест-систем на основе ПЦР, которые, в свою очередь, должны способствовать совершенствованию методов лечения и их стандартизации.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка и стандартизация тест-систем для диагностики туберкулеза на основе новой модификации ПЦР -метода ПЦР в реальном времени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

3. Разработать тест-систему для количественного определения М. tuberculosis',

4. Оптимизировать условия для выявления жизнеспособности М. tuberculosis',

5. Провести исследование возможности применения разработанных тест-систем при использовании культурального материала и клинического материала от больных туберкулезом.

Научная новизна

Разработана тест-система на основе ПЦР в реальном времени, позволяющая идентифицировать М. tuberculosis и М. bovis и дифференцировать их между собой и с другими микобактериями. Показано, что экспрессность реакции повышена в сравнении с «гнездовой» ПЦР с сохранением одинаковой чувствительности.

Оптимизированы условия для проведения мультиплексной ПЦР в реальном времени, позволяющей идентифицировать М. tuberculosis и М. bovis и дифференцировать их между собой и с другими микобактериями. Тест-система характеризуется более высокой экспрессностью в сравнении с обычной ПЦР в реальном времени.

Сравнительные результаты использования тест-системы для обнаружения мРНК М. tuberculosis и культурального метода свидетельствуют о возможности использования разработанного теста для быстрого дифференцирования живых и неживых микобактерий, а также дормантных форм.

Практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

1. Возможность идентификации М. tuberculosis и M.bovis и дифференцирования их между собой и с другими микобактериями с использованием разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности реакции в сравнении с «гнездовой» ПЦР при сохранении одинаковой чувствительности.

2. Одновременное обнаружение и дифференцирование в одной пробирке М. tuberculosis и М. bovis с использованием разработанной тест-системы на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени; повышение экспрессности теста в сравнении с ПЦР в реальном времени.

5. Возможность применения разработанных тест-систем на основе ПЦР в реальном времени при работе с культуральным материалом и клиническим материалом от больных.

7. Проекты ФСП, СТО и инструкции по применению для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени для выявления и дифференцирования М. tuberculosis и M.bovis.

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза"

V. выводы

3. Оптимизированы условия для одновременного выявления М. tuberculosis и М. bovis и дифференцирования их между собой и с другими микобактериями в одной пробирке с использованием мультиплексной ПЦР в реальном времени; экспрессность теста повышена в сравнении с ПЦР в реальном времени на 20% и более, в зависимости от количества исследуемых образцов.

7. Обнаружена экспрессия гена MDR1 в группе больных туберкулезным менингитом, что свидетельствует о необходимости применения лекарственных препаратов; подавляющих экспрессию этого гена для повышения эффективности противотуберкулезной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследований разработаны тест-системы, основанные на современной модификации ПЦР в реальном времени. Тесты позволяют выявлять и дифференцировать М. tuberculosis и М. bovis, производить количественную оценку генетического материала в образце, дифференцировать живые, неживые и дормантные формы микобактерий М. tuberculosis. Мы попытались найти взаимосвязь между экспрессией гена мультирезистентности и туберкулезом, трудно поддающимся лечению. В работе продемонстрировано использование разработанных тестов в группах больных туберкулезом. Сравнительный анализ результатов ПЦР в реальном времени с «гнездовой» ПЦР, а также классическими тестами (микроскопией и культуральным методом) показал возможность применения разработанных тестов на практике, а обнаружение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости в группе больных теберкулезом, длительно получающих противотуберкулезную терапию, показал необходимость широкомасштабных исследований в этой области.

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2006 года, Потапова, Надежда Ивановна

1. Балышев А.В., Плетенева Т.В., Гребенникова Т.В., Каприльянц А.С.,

2. Сыроешкин А.В. К вопросу о разработке нового противотуберкулезного2+

3. Zn -содержащего препарата //Вестник ОГУ («Приложение «Биоэлементология»). -2004. -№4 (29). -С. 13-14.

4. Бардисявичене И., Сосновская А. Сравнительная эффективность ВАСТЕС 460 ТВ и ИФА в диагностике туберкулеза легких //В сб.: Проблемы ускоренной бактериологической диагностики туберкулеза. Материалы научно-практической конференции. Обнинск, 1996.-С.35.

5. Белкин А. Д. Новые звенья в патогенезе хронических инфекций //Врач. -1997.- №7.-С.-40-42.

6. Борисов С.Е., Соколова Г.Б. Этиотропное лечение туберкулеза при лекарственной устойчивости М. tuberculosis взгляды и рекомендации международных организаций //Consilium medicum. -2001. -Т.З. -№12. -С.1-18.

7. Браженко Н.А. Составные элементы современной профилактики туберкулеза //Большой целевой журнал о туберкулезе. -1999 -№4. -С. 2127.

8. Всемирная организация здравоохранения. Лечение туберкулеза. Рекомендации для национальных программ. -ВОЗ, Женева, 1998. -77с.

9. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 е., ил.

10. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа /МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 е., ил.

11. Ю.Гребенникова Т.В., Грабовецкий И.И., Шумский Н.И., Кальнов C.JL, Непоклонов Е.А. Дифференциальная диагностика микобактерий методом полимеразной цепной реакции//Ветеринария. -1999. -№3. -С. 17-20.

12. П.Гребенникова Т.В. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике и мониторировании лечения инфекционных заболеваний /Методические указания для студентов медицинского факультета РУДН.-М.-2005.-40с.

13. Земская, 3. С., Дорожков? И. Р. Скрыто протекающая туберкулезная инфекция /З.С. Земская, И.Р. Дорожкова. М.: Медицина, 1984. - 83 с.

14. Интенсивное комбинированное лечение туберкулеза (Записки практика) Издание III, дополненное и исправленное. Медпрактика, 96 е., 2001.

15. Козулицына Т.И. Микробиологические исследования./ В руководстве для врачей: Туберкулез органов дыхания. М.,1981.- с.136-149.

16. Мишин В.Ю. Современная стратегия лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза легких. //Лечащий врач. 2000. - № 3. - С.4-9.

17. Рекомендации по лечению резистентных форм туберкулеза.- ВОЗ -Женева, 1998.- Пер. с англ. 47.

18. Мишин В.Ю., Степанян И.Э. Контролируемая химиотерапии туберкулеза органов дыхания в современных условиях. Проблема лекарственной устойчивости. //Русский медицинский журнал. -2000. -№12. -С. 469-500.

19. Сазыкин Ю.О., Швец А.В., Иванов В.П. Антибиотикорезистентность и системы активного выброса ксенобиотиков у бактерий //Антибиотики и химиотерапия. -1999. -№9.-С.З-6.

20. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток //Биохимия. -2000. -Т.65. -вып.1. -С.112-126.

21. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль: Пер. с англ./ Под ред. Барри Р.Блума.- М.: Медицина, 2002.- 696 е.: ил.

22. Туберкулез. Руководство для врачей /Под ред. А.Г. Хоменко. -М.: Медицина, 1996.-496 с.

23. Шлеева М.О., Мукамолова Г.В., Телков М.В., Березинская Т.Л., Сыроешкин А.В., Бикетов С.Ф., Капрельянц А. С. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление //Микробиология. -2003. -Т.72. -с.76-83.

24. Abu-Amero К.К., Halablab М.А. Evaluation of the COBAS AMPLICOR MTB test for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex //East Mediterr Health J. -2004. -№10(3). -P.329-335.

25. Alfonso R., Romero R.E., Patarroyo M.E., Murillo L.A. Mtp-40 and alpha antigen gene fragment amplification for the detection of Mycobacterium tuberculosis in Colombian clinical specimens //Mem Inst Oswaldo Cruz. -1999. -№97(8).-P.l 157-1163/

26. Alvarez S., McCabe W.R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review ofexperience at Boston City and other hospitals //Medicine. -1984. -№63.-P.25-55.

27. An Q., Buxton D., Hendricks A., Robinson L., Shah J., Lu L., Vera-Garcia M., King W., Olive D.M. Comparison of amplified Q beta replicase and PCRassays for detection of Mycobacterium tuberculosis //J Clin Microbiol. -1995. -№33(4). -860-8677.

28. Andersen P., Doherty Т. M. The success and failure of BCG implifications for a novel tuberculosis vaccine //Nature Reviews. Microbiology. -2005.- Vol.3. -P.657-652.

29. Anon. Fifteen year follow up of trial of BCG vaccines in south India for tuberculosis prevention //Indian J. Med. Res. -1999. -№110.-P.56-69.

30. Anon. Global Tuberculosis control //World Health Organization (WHO) report. P.l81

31. Armstrong J.A., Hart P.D. Response of cultured macrophages to Mycobacterium tuberculosis, with observations on fusion of lysosomes with phagosomes //J. Exp. Med. 1971. -№1134.-P.713-740.

32. Balamurugan R, Vencataraman S., John K.R., Ramakrishna B.S. PCR amplification of the insertion elements of Mycobacterium tuberculosis in fecal samples from patients with intestinal tuberculosis //J Clin Microbiol. -2006. -№44(5). -p. 1884-1886.

33. Вагпит H. N., Tarantola, Setaidy I. F. Cost-effectiveness of an immunization programme in Indonesia//Bull. W.H. O. 1980. №58.-P.499-503.

34. Baylan O. Culture based diagnostic methods for tuberculosis. //Microbiyol Bui. 2005.- №39(1).-P.107-124.

35. Berger H.W., MejiaE. Tuberculous pleurisy//Chest. -1973. -№63.-P.88-92.

36. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry. 1999. - № 273.-P.221-228.

37. Berney S., Goldstein M., Bishko F. Clinical and diagnostic features of tuberculous arthritis //Am. J. Med. 1972. - №53.-P.36-42.

38. Beveridge, T.J., Murray R. G. E. Sites of metal deposition in the cell wall of Bacillus subtilis //J. Bacteriol. 1980. - №141.P.876-887.

39. Brewer T.F., Heymann SJV To control and beyong: moving towords eliminating the global tuberculosis treat //J Epidemiol Community Health.2004. №58.-P. 822-825.

40. Brodie D., Schluger N. W. The diagnosis of tuberculosis //Clin Chest Med.2005. №26(2).-P.247-271.

41. Butler W. R., Kilburn J. O. Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high-performance liquid chromatography of their mycolic acids //J. Clin. Microbiol. 1988. - №26.-P.50-53.

42. Butler W.R., Jost K.C., Kilburn J.O. Identification of mycobacteria by high-performance liquid chromatography //J. Clin. Microbiol. 1991. - №29.-P.2468-2472.

43. Cameron S. J. Tuberculosis and the blood //Tubercle. 1974. - №55.-P.55-72

44. Carr W.P., Kyle R.A., Bowie J.W. Hematologic changes in tuberculosis //Am. J. Med. 1964. - №248.-P.709-714.

45. Caws M, Wilson S. M, Clough C. Role of IS6110-targeted PCR, culture, biochemical, clinical, and immunological criteria for diagnosis of tuberculous meningitis //J Clinical Microbiol. 2000. - №38.-P.3150-3155.

46. Center for Disease Control and Prevention. Tuberculosis elimination revisited: obstacles, opportunities, and a renewed commitment //Advisory Council for Elimination of Tuberculosis (ACET). MMWR. 1999. - №48(RR-9).-P.l-13.

47. Chakhaiyar P., Hasnain S.E. Defining the mandate of tuberculosis research in post genomic era //Med Princ Prac. 2004. - №13.-P. 177-184.

48. Cheng V. C, Yew W. W., Yuen K. Y. Molecular diagnostics in tuberculosis //Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005. - №11.-P.711-720.

49. Chevrier D., Casademont I., Guesdon J.L., Cloning of a gene from Mycobacterium tuberculosis coding for a hypothetical 27 kDa protein and its use for the specific PCR identification of these mycobacteria //Mol Cell Probe. -2000.-№14.-P.241-248.

50. Christensen W. I. Genitourinary tuberculosis: review of 102 cases //Mediicine. 1974. - №53.-P.377-390.

51. Chua H.C. Use of ligase chain reaction in early diagnosis of tuberculosis meningitis //Ann Acad Med Singapore. 2005. - №34(2).-P. 149-53.

52. Cleary T.J., Roundel G., Casillas O., Miller N. Rapid and specific detection of Mycobacterium tuberculosis by using the Smart Cycler instrument and specific fluorogenic probe //J. Clin. Microbiol. 2003. - №41.-P.4783-4786.

53. Cole S.T., Brosh R., Parkhill J. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence //Nature. 1998. - №393. P.-537-544.

54. Colice G.L. Decision analysis, public health policy, and isoniasid chemoprophylaxis for young adult tuberculin skin reactors //Arch. Intern. Med.- 1990.-№150.-P.2517-2522.

55. Comstock G.W. Epidemiology of tuberculosis //Am. Rev. Respir. Dis. 1982.- №125.-P.8-16.

56. Corbett E.L., Watt C.J., Walker N., Maher D., Williams B.G., Raviglion M.C., Dye C. The growing burden of tuberculosis: global trends and interactions with the HIV epidemic //Arch. Intern. Med. 2003. - №163.-P.-1009-10021.

57. Czerkinsky C.C., Nilsson L.A., Nygren H., Ouchterlony O., Tarkowsky A.A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) essay for enumeration of specific antibody-secreting cells //J. Immunol. Methods. 1983. - №65.-P.109-121.

58. Davies J. Antibiotic resistance in mycobacteria //Novartis found symp. 1998.- №217.-P. 195-208.

59. Demkow U., Ziolkowski J., Filewska M., Bialas-Chromiec В., Zielonka Т.,

60. Michalowska-Mitczuk D., Ku.s J., Augustynowicz E., Zwolska Z., Skopinska

61. Rozewska E., Rowinska-Zakrzewska E. Diagnostic value of different serological tests for tuberculosis in Poland //J Physiol Pharmacol. -2004. -№55.-P.57-66.

62. Donald P.R., Schoeman J.F Tuberculous meningitis //N ENGL J MED. 2004.- №17.-P.1719-1722.

63. Drapper P. The walls of Mycobacterium leprae-murium: chemistry and ultrastructure //J. Gen. Microbiol. -1971. №69.-P.313-324.

64. Dyck V., Iemen V., Pattyn S., Damm V, Laga M. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by enzyme immunoassay, culture, and three nucleic acid amplification tests //J.Clin. Microbiol. -2001. -№39. -P.1751-1756.

65. Dye C., Dolin P., Pathania V., Raviglione M. For the WHO global surveillance and monitoring progect. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country //JAMA. 1999. - №282.-P.677-686.

66. Edwards, K., Logan, J., Saunders, N., 2004. Real-time PCR, An Essential Guide. //Horison Bioscence, Wymondham. 2004. P.346.

67. Ellner J.J. Pleural fluid and peripheral blood lymphocyte function in tuberculosis //Ann. Intern. Med. 1978. - №89.-P.932-933.

68. European Pharmacopoeia. Fourteenth Edition. Strasbourg. France. -2001. -2416 p.

69. Evans C.C. Historical background, in clinical tuberculosis (ed. Davies, P.D.O.) 1-19 (Chapman and Hall Medical, London, 1994).

70. Farer L.S., Lowell L.M., Meador M.P. Extrapulmonary tuberculosis in the United States //Am. J. Epidemiol. 1979. - №109.-P.205-217.

71. Fine P.E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity //Lancet. 1995. - №346.-P. 1339-1345.

72. Frehel C., Ryter A., Rastogy N., David H. Electron-transparent zone in phagocytosed Vycobacterium avium and other mycobacteria: formation, persistence and role in bacterial survival //Microbiol. -1986. -№137. -P.239-257.

73. Friden T.R, Sterling T.R, Munsiff S.S, Watt C.J, Dye C. Tuberculosis //Lancet. 2003. - №362.-P.887-899.

74. Frothingham R., Hills H.G., Wilson K.H. Extensive DNA sequence conservation throughout the Mycobacterium tuberculosis complex //J. Clin. Microbiol. 1994 - №32.-P. 1639-1643.

75. Gordin F, Slutkin G. The validity of acid-fast smears in the diagnosis of pulmonary tuberculosis //Arch Pathol Lab Med. 1990. - №114.-P.1025-1027.

76. Grebennicova T.V., Grabovetsky V.V., Kalnov S.L., Nepoklonov E.A. Differential diagnostics of mycobacteria by PCR in blood and tissues from animals. 1997, Conference, Madison, Wisconsin, USA, 27-31, July, P.72.

77. Grebennikova Т. V., Nepo^lonov E. A. //Detection and identification of Mycobacteria isolates from human clinical samples. -1999, 9th ECCMID. -March 21-24, Berlin, Germany, P. 204.

78. Grieco M.H., Chmel H. Acute disseminated tuberculosis as a diagnostic problem: a clinical study based on twenty-eight cases //Am. Rev. Respir. Dis. -1974. №109.-P.554-560.

79. Gruber F., Falkner F.G., Dcrner F., Hammerle T. Quantitation of viral DNA by real-time PCR applying duplex amplification, internal standardization, and two-color fluorescence detection. Appl Environ Microbiol. -2001 -№67(6). -P.2837-9.

80. Gupta S., Chatterji D. Stress responses in mycobacteria //IUBMB Life. -2005 -№57(3). -P.149-159.

81. Hammerschlag M.R. Nucleic acid amplification tests (polymerase chain reaction, ligase chain reaction) for the diagnosis of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in pediatric emergency medicine //Pediatr Emerg Care. -2005. -№21(10). -P.705.

82. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-P.986-994.

83. Heitmann A., Laue Т., Schottstedt V., Dotzauer A., Pichl L. Occurrence of hepatitis A virus genotype III in Germany requires the adaptation of commercially available diagnostic test systems //Transfusion. -2005. -№45(7). -P. 1097-1105.

84. Herrera E.F., Perez О., Segovia M. Differentiation between Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis by a multiplex-polymerase chain reaction //J Appl Bacteriol. 1996. - №80(6).-P.596-604.

85. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions//Biotechnology. 1993. - №11.-P.1026-1030.

86. Hines N., Payeur J.B., Hoffman L.J. Comparison of the recovery of Mycobacterium bovis isolates using the BACTEC MGIT 960 system, BACTEC 460 system, and Middlebrook 7H10 and 7H11 solid media //J Vet Diagn Invest. 2006. -№18(3). -P.-243-250.

87. Hirschfield G.R., McNeil M., Brennan P.J. Peptidoglycan-associated polypeptides of Mycobacterium tuberculosis //J. Bacteriol. 1990. - №172.-P.1005-1013.

88. Howell, W.M., Jobs, M., Brookes, A.J.iFREET:an improved fluorescence system for DNA-melting analisis. //Genome Res. 2002. -№12.-P.1401-1407.

89. Huitric E., Werngren J., Jureen P., Hoffner S. Resistance Levels and rpoB Gene Mutations among In Vitro-Selected Rifampin-Resistant Mycobacterium tuberculosis Mutants //Antimicrob Agents Chemother. -2006. -№50(8). -P.2860-2862.

90. Hung, D.-K., Habbard W.W. Hyponatremia in untreated active pulmonary tuberculosis //Am. Rev. Respir. Dis. 1969. - №99.-P.595-597.

91. Huseby J.S., Hudson L. D. Miliary tuberculosis and the adult respiratory distress syndrome //Ann. Intern. Med. 1976. - №85.-P.609-611.

92. Jacobs M.R. Activity of quinolones against mycobacteria //Drugs. -1999. №58.-P.19-22.

93. Johansen I. S., Lundgren В., Tabak F., Petrini В., Hosoglu S., Saltoglu N., Thomsen V.O. Improved sensitivity of nucleic acid amplification for rapid diagnosis of tuberculosis meningitis //J Clin Microbiol. 2004. - №42(7).-P.3036-3040.

94. Kolk A.H., Кох L.F., I.eeuwen J., Kuijper S., Jansen H.M. Clinical utility of polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis //Eur Respir J. 1998. - №11.-P. 1222-1226.

95. Konya A., Andor A., Satorhelyi P., Nemeth K., Kurucz I. Inhibition of the MDR1 transporter by new phenothiazine derivatives //Biochemical and Biophysical research communications. -2006. -№30. -p.47-49.

96. Kopanoff D., Snider D., Caras G. Isoniasid-related hepatitis //Am. Rev. Respir. Dis. -1978. №117. - P.991-1001.

97. Lakshmi V, Patil MIA., Subhadha K., Himabindu V. Isolation of mycobacteria by BACTEC 460 ТВ system from clinical specimens //Indian J Med Microbiol.-2006. -№24(2).-P. 124-126.

98. Lanckriet C., Levy, B. D., Bingono E., Siopathis R. M., Gueerin N. Efficacy of BCG vaccination of the of the newborn: evaluation by a follow-up study of contacts in Banguil //Int. J. Epidemiol. 1995. - №24.-P. 1042-1049.

99. Lederer E., Adam A., Ciorbaru R., Petit J.F., Wietzerbin J. Cell walls of mycobacteria and related organisms; chemistry and immunostimulant properties //Mol. Cell. Biochem. 1975. - №7.-P.87-104.

100. Lipsky B. A, Gates J;, Tenover F.C., Plorde J.J. Factors affecting the clinical value of microscopy for acid-fast bacilli //Rev Infect Dis. 1984. -№6.-P.-214-22.

101. Lu C.Z., Qiao J., Shen Т., Link H. Early diagnosis of tuberculosis meningitis by detection of anti-BCG secreting cells in cerebrospinal fluid //Lancet. 1990. - №336.-P.10-13.

102. McKenna SL., Padua RA. Multidrug resistance in leukaemia //Br. J. Haematol. -1997. -№96. -P.659-674.

103. Martins L. C., Paschoal I. A., von Nowakonski A., Silva S. A., Costa F.F., Ward L. S. Nested-PCR using MPB64 fragment improves the diagnosis of pleural and meningeal tuberculosis //Rev Soc Bras Med Trop. 2000. -№33.-P.253-257.

104. Massaro D., Katz S., Sachs M. Choroidal tubercles: a clue to hematogenous tuberculosis //Ann. Intern. Med. 1964. - №60.-P.-231-241.

105. McClatchy J. K., Waggoner R. F., Kanes W., Arnick M.S., Bolton T. L. Isolationof mycobacteria from clinical specimens by use of a selective 7H11 medium //Am. J. Clin. Pathol. 1976. - №65.-P.412-415.

106. McDonough K. A., Kress Y., Bloom B. R. Pathogenesis of tuberculosis: interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages //Infect. Immun. 1993. - №61.-P.2763-2773.

107. Middlbrook G., Cohn M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods IIAm.. Public Health. 1958. - №48.-P.844-853.

108. Middlbrook G., Cohn M.L., Dye W.E. Microbiologic procedures of value in tuberculosis //Acta Tuberc. Scand. 1960. - №38.-P.66-81.

109. Middlbrook G., Riggiardo Z., Tigertt W. D. Automatable radiometric detection of growth of M. tuberculosis in selective media //Am. Rev. Respir. Dis. 1977. - №115.-P.1066-1069.

110. Mittal S.K., Aggarwal V., Rastogi A. Saini N. Does BCG vaccination prevent or postpone the occurrence of tuberculosis meningitis? //Indian J. Pediatr. 1996. - №63.-P.659r664.

111. Modok S., Mellor H., Calaghan R. Modulation of multidrug resistance efflux pump activity to overcome chemoresistance in cancer //Current Opinion in Pharmacology. -2006. -№6. -p. 1-5.

112. Moulding T.S., Redeker A.G, Kanel G.C. Twenty isoniazid-assotiated deaths in one state //Am. Rev. Respir. Dis. 1989. - №140. - P.700-705.

113. Munt P.W. Miliary tuberculosis in the chemotherapy era with a clinical review in 69 American adults //Medicine. 1971. - №51.- P.139-155.

114. Murray H.W., Tuazon C.U., Kirmani N., Sheagren J.H. The adult respiratory distress syndrome associated with military tuberculosis //Chest. -1978. №73.-P.37-43.

115. Negi S.S., Anand R., Pasha S.T., Gupta S., Basir S.F., Khare S., Lai S. Molecular characterization of mutation associated with rifampicin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates //Indian J Exp Biol. -2006 №44(7). P.547-553.

116. Netto E.M, Dye C, Raviglione M.C. Progress in global tuberculosis control 1995-1996, with emphasis on 22 high-incidence countries. Global Monitiring and Surveillance Project //Int J Tuberc Lung Dis. 1999. - №3.-P.310-320.

117. Nicaido H., Jarlier V. Permeability of the mycobacterial cell wall //Res. Miccrobiol. -1991. №142.-P.437-443.

118. Nikaido H., Thanassi D.G. Penetration of lypophilic agents of multiple protonation sites into bacterial cells: tetracyclines and fluoroquinolones as examples //Antimicrob. Agents Chemomether. 1993. - №37.-P.1393-1399.

119. Ninet B, Rohner P, Metral C, Auckenthaler R // Assessment of use of the COB AS AMPLICOR system with BACTEC 12B cultures for rapid detection of frequently identified mycobacteria. J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37. -№ 3.- P. 782-784.

120. O'Brien R. J., Paul P. Nunn. The need for new drugs against tuberculosis //Am. J. Respir Crit Care Med. 2001. - №162.-P. 1055-1058.

121. Pfyffer G. E, Broun-Elliot B. A, Wallace R. G. Mycobacterium: General characteristics, isolation, and staining procedures //Manual of clinical microbiology, Washington, District of Columbia. 2003.- 8th edn. - P.532-559.

122. Prout S., Benatar S. R. Disseminated tuberculosis: a study of 62 cases //S. Afr. Med. J. 1980. - №58.-P.835-842.

123. Rastogi N., Legrand E, Sola C. The mycobacteria: an introduction to nomenclature and patogenesis //Rev.Sci Tech. 2001. - №20(l).-P.21-54.

124. Ratledge C. Nutrition, growth and metabolism //Ratledge C., Stanford J. L. (ed.), Biology of Mycobacteria, vol. 1. Academic Press, Inc. (London) Ltd., London. 1982 .p. 186-212.

125. Raviglione M.C, Snider D.E, Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic //JAMA. -1995.-№273.-P.220-226.

126. Rosenblatt M. В., Fullan E. F., Gessler A. E. Studies of mycobacteria with the electron microscope //Am. Rev. Tuberc. 1942. - №46 587-599. 1942.

127. Sahn, S.A., and T.A. Neff.1974. Miliary tuberculosis //Am. J. Med. -№56.-P.495-505.

128. Saunders, N.A., 2004. Quantitative real-time PCR. In: Edwards, K., Logan, J., Saunders, N. (Eds.), Real-Time PCR, An Essential Guide. Horizon Bioscence, Wymondham.

129. Schluger N.W, Rom W.N. Current approaches to the diagnosis of active pulmonary tuberculosis //Am J Respir Crit Care Med. 1994. - №149.-P.264-267.

130. Sedgewick J.D., Holt P.G. A solid phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody-secreting cells //J. Immunol. Methods. 1983. - №65.-P.301-309.

131. Selwyn P.A., Sckell В., Alcabes M.P., Friedland G.H., Klein R.S., Schoenbaum E.E. High risk of active tuberculosis in HIV-infected drug users with cutaneus allergy //JAMA. 1992. - №268.-P.504-509.

132. Shaffer R.W, Edlin B.R. Tuberculosis in patients infected with human immunodeficiency virus: perspective on the past decade //Clin Infect Dis. -1996. №22.-P.683-704.

133. Shamputa I.C., Rigouts L., Portaels F. Molecular genetic methods for diagnosis and antibiotic resistance detection of mycobacteria from clinical specimence //APMIS. 2004. - №112.-P.728-752.

134. Shi X., Jarvis D.L. A new rapid amplification of cDNA ends method for extremely guanine plus cytosine-rich genes. //Anal Biochem. -2006. -№10. -P.-323.

135. Shilova M.Y, Dye C. The resurgence of tuberculosis in Russia //Philos Trans К Soc Lond Biol Sci. 2001. - №356. - P. 1069-1075.

136. Shrestha N., Tuohy J., Gerri S., Reischl U., Gordon S., Procop G. Detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacterial isolates by Real-Time PCR //Clin. Microbiology. -2003. -№11. -p.5121-5126.

137. Silva M. Т., Macedo ?. M. The interpretation of the ultrastructure of mycobacterial cells in transmission electron microscopy of ultrathin sections //Int. J. Lepr. №51. - 1983.-P.225-234.

138. Simon H. В., Weinstein A. J., Pasternak M. S., Swartz M. N., Lunz L. J. Genitourinary tuberculosis: clinical features in general hospital //Am. J. Med. -1977.-№63.-P.410-420.

139. Slavin R. E., Walsh T. J., Pollack A. D. Late generalized tuberculosis: clinical patologic analysis of 100 cases in the preantibiotic and antibiotic eras //Medicine. 1980. - №59.-P.352-366.

140. Snider D.E., Caras G.J., Koplan J.P. Preventive therapy with izoniazid //JAMA. 1986. - №255. -P.1579-1583.

141. Sonnenberg P., Glyn J. R., Fielding K., Murray J., Godfrey-Faussett P., Shearer S. HIV and pulmonary tuberculosis: the impact goes beyond those infected with HIV //AIDS. 2004. - №18.-P.657-662.

142. Sra K.K., Torres G., Rady P., Hughes Т.К., Payne D.A., Tyring S.K. Molecular diagnosis of infectious diseases in dermatology //J Am Acad Dermatol. -2005. -№53(5). -P'.749-765.

143. Sterne J. A., Rodrigues L. C., Guedes I. N. Does the efficacy of BCG decline with time since vaccination? //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1998. - №2.-P.200-207.

144. Sybirna R.I, Kondratiuk N.V. Cultivating of Mycobacterium tuberculosis with application of the completely automated system Bactec MGIT 960 //Mikrobiol Z. -2006. -№68(3). -P.47-51.

145. Sybirna R.I., Kondratiuk N.V., Iavors'ka H.V. Isolation of infectious agent of extrapulmonary tuberculosis by different microbiological methods //Mikrobiol Z. -2004.-№66(l).-P.62-67.

146. Takashima Т., Ueta C., Tsuyuguchi I., Kishimoto S. Production of tumor necrosis factor alpha by monocytes from patients with pulmonary tuberculosis //Infect. Immun. 1990. - №58.-P.3286-3292.

147. Tarai В., Gupta A., Ray P., Shivaprakash M.R., Chakrabarti A. Polymerase chain reaction for early diagnosis of post-operative fungal endophthalmitis //Indian J Med Res. -2006. -№123(5). -P. 671-678.

148. Ten D., Hitze K. L. Does BCG vaccination protect the newborn and young infants //Bull. W.H.O. 1980. - №58.-P.37-41.

149. Tyagi S., Kramer F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization //Nat Biotechnol. 1996. - №14.-P.303-308.

150. Valone S. E., Rich E., Willis R. S., Ellner J. J. Expression of tumor necrosis factor in vivo by human mononuclear phagocytes stimulated with whole Mycobacterium tuberculosis, BCG, mycobacterial antigens //Infect. Immun. 1988,-№56.-P.3313-3315.

151. Vera-Cabrera Lucio, Howard S. Т., Laszlo A., Johnson W. M. Analisis of genetic Polymorphism in the Phospholipase Region of Mycobacterium tuberculosis //J Clin Microbiol. 1997. - №5.-P.l 190-1195.

152. Vergne I, Singh S, Roberts E, Kyei G, Master S, Harris J, de Haro S, Naylor J, Davis A, Delgado M, Deretic V. Autophagy in Immune Defense Against Mycobacterium tuberculosis //Autophagy. -2006. -№2(3). -P. 175178.

153. Wade K. A., June I. P., Joann L. C., Gail L. W. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR //J.Clin.Microbiol. 2005. -№43.-P.2471-2473.

154. Wade M. M, Zhang Y. Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis /-Front Biosci. 2004. - №l;9.-P.975-94.

155. Wang H., Chen Z. Jbservations of properties of the L-form of M.tuberculosis induced by the antituberculosis drugs //Zhonghua Jie . -2001. -№24(1). -P.52-55.

156. Wei-Juin Su. Recent advances in molecular diagnosis of tuberculosis //J Microbiol Immunol Infect. 2002. - №35.-P.209-214.

157. Wheeler P. R. Biosynthesis and scavering of purines by pathogenic mycobacteria including Mycobacterium leprae //J. Gen. Microbiol. 1987. -№133.-P.2999-3011.

158. Wheeler P. R. Biosynthesis and scavering of pyrimidines by pathogenic mycobacteria//J. Gen. Microbiol. 1990. - №136.-P.189-201.

159. World Health Organization.: Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing, WHO Report 2003 (WHO/CDS/TB/2003.316). Geneva: WHO, 2003

160. Zhang Y, Telenti A. Genetics of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis In: Molecular genetics of mycobacteria. Eds: Hatfull G, Jacobs

161. W.R, AMS Press, Washington D.C. 235-254 (2000)

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Разработка тест-систем на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики туберкулеза

Оглавление диссертации Потапова, Надежда Ивановна :: 2006 :: Москва

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Потапова, Надежда Ивановна, автореферат

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2006 года, Потапова, Надежда Ивановна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций