Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка способов определения производных тетрациклина на основе образования внутрикомплексных соединений

На правах рукописи

Цебро Василий Семенович

Разработка способов определения производных тетрациклина на основе образования внутрикомплексных соединений

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск-2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Хабаров Анатолий Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

кандидат фармацевтических наук, доцент Дурицын Евгений Петрович

Ведущее учреждение:

[ осударственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Росздрава».

Защита состоится «¿3_>> ¿¿¿е**?/^-^ 2005 г. в /часов на заседании диссертационного совета К.208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « » С2-& 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

В настоящее время ни у кого не вызывает сомнений ведущая роль антибиотиков в лечении инфекционных заболеваний человека. Антибиотик можно охарактеризовать как низкомолекулярный продукт метаболизма микроорганизмов, подавляющий в малых концентрациях рост других микроорганизмов.

Тетрациклиновые антибиотики относятся к группе веществ, первое из которых было выделено из Бй-ерЮтусеБ аигеоГааепв,. в дальнейшем активные антибиотики этой группы выделялись из 8^ер1отусез пто-чиБ или получались синтетическим путем. Тетрациклины и в настоящее время считаются наиболее важными для клинического использования. Их активное применение объясняется широким спектром действия, высокой эффективностью и дешевизной. Тем не менее, многие особенности биологических свойств тетрациклинов выяснены недостаточно. Механизм, благодаря которому они блокируют функцию рибосом, и сейчас неясен. Теоретически тетрациклины должны быть токсичными, поскольку действуют также и на рибосомы клеток эукариот, однако на самом деле они хорошо переносятся больными, и их токсическое действие может быть связано только с некачественным производством, передозировкой или индивидуальной непереносимостью.

Поэтому совершенствование способов контроля их качества при производстве и особенно количественное определение при клиническом использовании может считаться одной из наиболее важных задач современной клинической фармации. Необходимость проведения таких исследований вытекает из различия фармакокинетических показателей лекарственных средств у различных людей при индивидуализации фармакотерапии.

Существующие методы анализа тетрациклиновых антибиотиков основываются на использовании уже известных приемов определения органических соединений, что явно недостаточно. Следует отметить дефицит знаний в области физико-химических закономерностей хроматографического поведения данного класса соединений. Закономерности сорбции тетрациклиновых антибиотиков изучены лишь фрагментарно, при этом отсутствует ясность, в какой степени общетеоретические представления обращенно-фазовой хроматографии применимы к данному классу веществ. Выбор условий хроматографии тетрациклинов осуществляется чаще всего методом проб и ошибок. Результаты такого подхода зачастую далеки от оптим

Описание реакций образования внутрикомплексных соединений тетрацик-линов с ионами переходных металлов при их введении в подвижную фазу в доступной нам литературе вообще отсутствует. Поэтому на данном этапе актуальным и закономерным является изучение возможности построения аналитических моделей для тетрациклиновых антибиотиков, которые способны приблизиться к решению основной задачи теории удерживания - развитию теоретических представлений, позволяющих рассчитывать величины удерживания исследуемых соединений, исходя из их строения и условий проведения хроматографиче-ского эксперимента.

Цель работы

Изучить возможности использования комбинированного метода анализа (хроматография с флуоресцентным детектированием) для фармацевтических и биофармацевтических исследований тетрациклиновых антибиотиков.

Основные задачи исследования

1. Осуществить поиск оптимальных условий проведения реакций ком-плексообразования тетрациклиновых антибиотиков с катионами металлов, выявить функциональные группы, способные образовывать флуоресцирующие соединения с этими катионами.

2. Изучить зависимость удерживания тетрациклиновых антибиотиков от композиционных факторов подвижной фазы.

3. На основании полученных закономерностей разработать модель удерживания тетрациклиновых антибиотиков в условиях ВЭЖХ с обращенными фазами, связывающую строение исследуемых соединений, условия эксперимента и величины удерживания.

4. Исследовать возможность использования способа введения комплексо-образователя в подвижную фазу при хроматографическом определении тетрациклиновых антибиотиков.

5. Разработать методики выделения и пробоподготовки тетрациклиновых антибиотиков при их определении в объектах биологического происхождения.

6. Провести биофармацевтический анализ тетрациклиновых антибиотиков с использованием разработанных флуоресцентно-хроматографических ме-

Научная новизна

Впервые проведено систематическое исследование хроматографического поведения тетрациклиновых антибиотиков в режиме обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектирования. Предложен модифицированный критерий для априорной оценки хроматографического поведения доксициклина, метациклина и окситетрациклина.

'1 Получен ряд линейных уравнений регрессии, позволяющий прогнозиро-

вать хроматографическое поведение антибиотиков производных тетрациклина и определять оптимальные условия их анализа в лекарственных формах и биологических объектах.

С целью проведения контроля качества разработаны методики определения доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида в лекарственных формах. Доказана возможность использования этих методик в практике клинической фармации.

Практическая значимость

Предложены модели хроматографического поведения тетрациклиновых антибиотиков в условиях ВЭЖХ с обращенными фазами. Данный подход позволяет оптимизировать условия хроматографического определения тетрацик-линов.

Результаты изучения механизма образования флуоресцирующих хелатов и хроматографических харакп еристик доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида положены в основу разработанных методик их качественного определения и рекомендованы в практическую работу контрольно-аналитических лабораторий на предприятиях-изготовителях.

Разработанные методики определения доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида в лекарственных формах дают возможность повысить их качество в процессе промышленного производства, а способ определения в субстанциях - усилить контроль по содержанию действующих веществ в исходных продуктах.

Предлагаемые нами способы определения доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида в крови позволят использовать их в клинических исследованиях с целью коррекции схем дозиро-

вания препарата с учетом индивидуальных особенностей организма пациента для эффективного и безопасного лечения.

Разработанные методики анализа рекомендованы и могут быть использованы в научных исследованиях и учебном процессе при изучении аналитической, фармацевтической, токсикологической химии и клинической фармакотерапии студентами, аспирантами и научными работниками.

Внедрение результатов работы

Полученные результаты внедрены в работу ОАО «Фармстандарт-лексредства» г. Курска (акт № 116/04 от 27.05.2004), Курского областного онкологического диспансера (акт № 8 от 25.01.2004), Курской городской клинической инфекционной больницы им. H.A. Семашко (акт № 22 от 05 октября 2004 г.)

Основные положения, выносимые на защиту

1. Методики определения тетрациклинов, основанные на образовании флуоресцирующих комплексных соединений.

2. Определение корреляционной зависимости между параметрами удерживания теграциклиновых антибиотиков и содержанием органического модификатора в подвижной фазе.

3. Модели удерживания антибиотиков тетрациклинового ряда в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами.

4. Методики хроматографического определения доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида в субстанциях и лекарственных формах с прямым введением в подвижную фазу ком-плексообразователя.

5. Способ пробоподготовки и методики хроматографического определения с флуоресцентным детектированием доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида в биологических объектах.

Апробация работы

Результаты исследования доложены и обсуждены на конгрессе «Человек и его здоровье», на конференции КГМУ, на итоговой сессии КГМУ, 2003, 2004, 2005 гг., на III конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке», Томск, 2004., на IV Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств», Москва 2004.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 1 - в центральной печати. Из научных трудов, опубликованных в соавторстве, в диссертацию включены материалы, полученные лично автором.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), 3-х глав (II - IV), в которых изложены результаты исследований, выводов и списка литературы, включающего 145 источников, в том числе 60 - зарубежных авторов.

Диссертационная работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 44 таблицы и 8 рисунков.

ИЗУЧЕНИЕ РЕАКЦИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ВНУТРИКОМПЛЕКСНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Ионы металлов могут способствовать объединению и разрыву органических молекул, даже не вступая с ними в связь. Дело в том, что у многих молекул электронное облако довольно несимметрично. Так, на одном конце молекулы возникает избыток отрицательного заряда, а на другом - избыток положительного. Такие молекулы называются полярными. Если к ним приближается ион металла, они поворачиваются и притягиваются к нему своим отрицательным концом. Основной проблемой в этом случае может быть отсутствие специфического реагента, способного к комплексообразованию. Многие потенциальные лиганды, способные к реакциям комплексообразования, являются лекарственными веществами и достаточно широко используются в практическом здравоохранении. Одними из таких веществ являются природные и полусинтетические антибиотики из группы тетрациклинов. Тетрациклин и его производные представляют собой октагидронафтацены; теоретически можно предположить, что комплексы с катионами металлов могут иметь вид:

Структура и объем работы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ТЕТРАЦИКЛИНОВ С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

Ме

Ме

а, Ь, с - возможны комплексные структуры

В наших исследованиях определение механизма и оптимальных условий проведения реакций комплексообразования тетрацикпинов с ионами металлов занимает ключевое место в разработке комплексных способов анализа на основе флуоресцентного детектирования.

Механизм данной реакции был нами установлен по спектрам ЯМР. Спектры ЯМР'Н и 13С регистрировали на спектрометре WH-90 (ВгиЬег, ФРГ) для 0,1 М (Н) и 0,33 М (13С) растворов в метаноле - Б при 40°С. В качестве внутренних стандартов для измерения ХС использовали - тетраметилсилан и диок-

сан (для С, 67,4 м.д.). Схематически такие реакции имеют следующий вид:

в

и и

/ ^ОН / ^О—Ме

я в

II II :

/Ч.ме

н

Нами также было установлено, что тетрациклины образуют флуоресцирующие комплексы с рядом катионов (М§2+, А13+ и Ztíl+).

Для разработки методик флуоресцентного определения доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида и окситетрациклина гидрохлорида мы использовали реакции получения полидентантных комплексных соединений. Выбор оптимальных условий анализа включал детальное изучение влияния вида комплексообразователя и его концентрации на интенсивность и стабильность флуоресценции, определение диапазона линейной зависимости между интенсивностью флуоресценции и концентрацией изучаемых соединений.

В ходе эксперимента было определено, что в качестве оптимального комплексообразователя выступает магний в среде диметилформамида. Интенсивность флуоресценции магниевых хелатов от 1,3 до 2 раз выше, чем интенсивность аналогичных комплексов с ионами алюминия и цинка (табл. 1).

Аналогичная картина нами наблюдалась и при исследовании интенсивности флуоресцентного свечения комплексных соединений метациклина гидрохлорида и окситетрациклина гидрохлорида.

Таблица I

Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса доксициклина гидрохлорида с катионами металлов при различной интенсивности возбуждающего флуоресценцию света (п=5)

Интенсивность флуоресценции (мкА)

Концен- Интен. Интен. Интен. Интен.

Катион трация возб. света возб. света возб. света возб. света

(мкг/мл) 1„=73000 1о=109500 10=146000 1о=1825000

(мкА) (мкА) (мкА) (мкА)

1 2 3 4 5 6

А13+ 0,10 6,0 14,0 18,0 21,0

0,50 30,0 46,0 66,1 81,0

1,00 39,0 59,0 77,0 93,0

Mg2+ 0,10 8,2 4,1 6,2 9,2

0,50 19,0 22,0 34,0 43,0

1,00 49,0 67,5 90,2 119,0

Zn2+ 0,10 за 4,7 5,3 8,7

0,50 18,0 20,4 32,1 40,5

1,00 35,0 50,5 73,0 91,5

С целью изучения стабильности хелатных комплексов производных тет-

рациклина с магнием было важно определить, как изменяется интенсивность флуоресценции от времени после образования продукта реакции. Данный показатель является определяющим в любом методе анализа, основанном на свето-поглащении, но при флуориметрировании эта характеристика служит и доказательной базой правильного прогнозирования механизма образования хелата (табл. 2).

Таблица 2

Зависимость интенсивности флуоресценции комплексных соединений производных тетрациклина от времени после прибавления 1% раствора ацетата магния (С = 0,5 мкг/мл, п = 5)

Время после проведения реакции, мин Относительная интенсивность флуоресценции, %

20 100

30 100

40 100

50 100

60 100

70 100

80 100

90 100

Как следует из полученных результатов, интенсивность флуоресценции стабильна в течение 1,5 часа, что вполне достаточно для проведения измерений и соответствует оптимальным характеристикам люминисцентного анализа.

Кроме этого, нами были изучены спектры возбуждения и излучения флуоресцирующего хелата доксициклина, метациклина и окситетрациклина с магнием (табл. 3).

В ходе исследований нами была выявлена область линейной зависимости между интенсивностью флуоресценции образцов и концентрацией доксициклина в пробе, она находится в диапазоне концентраций от 0,3 мкг/мл до 10 мкг/мл, для метациклина этот интервал составил от 0,1 мкг/мл до 10 мкг/мл и для окситетрациклина - от 0,1 мкг/мл до 10 мкг/мл.

Таким образом, нами были подобраны оптимальные условия флуоримет-рирования продуктов реакций тетрациклинов с раствором ацетата магния и подтвержден предполагаемый механизм образования флуоресцирующих внут-рикомплексных соединений с ионами магния.

Таблица 3

Спектральные караю еристики флуоресценции производных тетрациклина с магнием в растворе ДМФА

Доксициклина гидрохлорид

Длины волн возбуждения, нм Длины волн излучения, нм Стоксов сдвиг, нм

от до шах от до Мах 92

335 435 402 435 | 535 494

Метациклина гидрохлорид

Длины волн возбуждения, нм Длины волн излучения, нм Стоксов сдвиг, нм

от ДО шах от до Мах 103

350 450 I 402 420 520 505

Окситетрациклина гидрохлорид

Длины волн возбуждения, нм Длины волн излучения, нм Стоксов сдвиг, нм

от ДО шах от ДО Мах 92

335 435 402 435 535 494

ОПТИМИЗАЦИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ В УСЛОВИЯХ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ОБРАЩЕННЫМИ ФАЗАМИ

Известно, что при оптимизации выбора методов анализа главную роль играют строение и физико-химические свойства изучаемых соединений.

Нами проводилось исследование по оптимизации условий обнаружения и количественного определения антибиотиков тетрациклинового ряда и созданию математической модели их хроматографического поведения, которая может быть использована в прикладной аналитической химии.

Эксперимент проводили на отечественном жидкостном микроколоночном хроматографе «Милихром», оснащенном флуоресцентным детектором и колонками 64x2 мм, заполненными сорбентами Nucleosil Си и Separan С]8. В процессе проведения хроматографического анализа непосредственно в подвижной фазе проходило образование флуоресцирующего продукта реакции комплексооб-разования, который и являлся объектом определения. Спектры поглощения исследуемых препаратов в УФ-области (диапазон 250-400 нм с шагом 5 нм) измеряли на спектрофотометре «LKB Biochrom ULTROSPEC И». В качестве характеристик удерживания нами использовались исправленный объем удерживания и коэффициент емкости, вычисляемый из полученных данных по формуле:

где V удерживаемый объем вещества (мкл);

Уо - удерживаемый объем условно несорбируемого компонента (мкл).

Удерживание тетрациклиновых антибиотиков как ионогенных соединений определяется, помимо обычных для обращенно-фазовой хроматографии факторов (полярность сорбента, концентрация органического модификатора, полярность подвижной фазы), также значениями рН и ионной силой подвижной фазы.

Полученный характер зависимостей свидетельствует, что удерживание определяется в основном сольвофобным механизмом. В случае амфотерных тетра-циклинов наблюдается параболический характер кривой к'-рН, соответствующей двум стадиям ионизации. С увеличением рН удерживание сначала уменьшается благодаря постепенному увеличению количества анионов и цвиттерионов, удер-

живающихся в меньшей степени, чем катионные формы к'^/к'т„=3. Минимум удерживания наблюдается вблизи изоэлекгрической точки амфотерных тетрацикли-нов, при которой вследствие наличия как положительного, так и отрицательного зарядов затрудняется гидрофобное взаимодействие со стационарной фазой. Дальнейшее увеличение рН до 8 не приводит к увеличению удерживания ктл/к1^, =1,3.

Для случая, когда удерживание антибиотиков на обращенной фазе определяется двумя механизмами, коэффициент емкости может быть выражен К' = К'] + К'2, где K'i и К'2 - вклады в удерживание за счет сольвофобного и силанофильного механизмов соответственно. Учитывая, что при удерживании за счет сольвофобного эффекта In К' - линейная функция от объемной доли воды в бинарной подвижной фазе {tp Н20), а при сорбции на ^модифицированном силикагеле К \ = (с + d^x)"1, где <рх - объемная доля более полярного компонента бинарной подвижной фазы, коэффициенты емкости разделяемых веществ могут быть выражены как

К' = а^хр (Ь?Н20) + (с + d? Н20)"'

Таким образом, взаимодействие полярных функциональных групп антибиотиков с полярными группами элюента уменьшает их время удерживания.

Уравнение модели Ri = f (Ci Si) (1.1), связывающей хроматографическое удерживание соединений со строением анализируемого вещества, в частном случае выглядит как зависимость

Л = /(с) (1.2)

Известно, что связь между хроматографическим удерживанием и концентрацией органического модификатора чаще всего отражают линейные зависимости:

\gK' ~ a~m\gc (1.3.1) \%K'=b-p\gc (1.3.2) 1 gX" = lg (1.3.3)

lg K' = a,+b,p' (1.3.4)

где: С - молярная концентрация (ммоль/литр) органического модификатора; tp - объемная доля органического модификатора; р' - параметр полярности подвижной фазы.

Для оценки возможности использования уравнений (1.3.1. - 1.3.4.) при описании поведения тетрациклиновых антибиотиков нами проведено исследование хроматографического поведения на сорбенте Separon С18. Интервал про-

центного содержания ацетонитрила составил 20-80%. Удерживание сорбата вьфажается через коэффициент емкости К:', определяемый как коэффициент распределения сорбируемого вещества между подвижной и стационарной фазами. Коэффициенты емкости веществ приведены в таблице 4.

Таблица 4

Коэффициенты емкости (К') тетрациклиновых антибиотиков (сорбент - Separon С18, подвижная фаза буферный раствор - AcN)

Препарат К' при содержании метанола ф %

20 30 40 50 60 70 80

Доксициклина г/х 2,08 2,14 1,84 1,60 1,25 1,11 0,85

Метаци клина г/х 2,06 2,10 1,89 1,60 1,28 1,09 0,88

Окситетрациклина г/х 2,10 2,19 1,88 1,75 1,25 1,07 0,84

Анализируя полученные данные значений К', можно утверждать, что хроматографическое поведение исследуемых соединений схоже и по мере уменьшения полярности элюента значения К' тетрациклиновых антибиотиков сближаются, обращает на себя внимание закономерное изменение коэффициентов регрессии всех уравнений: с увеличением угловых коэффициентов значения свободных членов уравнения также увеличиваются (по абсолютной величине). Эти величины линейно коррелированны между собой. Например, для уравнений (1.3.1) и (1.3.2) это выглядит следующим образом:

а = ад + а,т (1.3.5) Ь = Ь0+ Ъхр (1.3.6) Зависимости (1.3.6.) подтверждаются механизмом сорбции в условиях обращенно-фазовой хроматографии и экспериментально наблюдаются для самых различных классов соединений, неподвижных и подвижных фаз. При этом можно ожидать, что если зависимость удерживания от концентрации органического модификатора определяется только гидрофобностью сорбата, значение 1»1 не должно зависеть от того, по каким соединениям оно найдено, но должно определяться гидрофобностью органического модификатора. И таким образом механизм сорбции сходных соединений, подчиняясь и не подчиняясь уравнению (1.З.6.), в сравнении с другими сорбатами может служить критерием единства механизма сорбции.

Полученные нами значения Ь0 для изучаемых тетрациклиновых антибиотиков показывают, что зависимость (1.3.6.) соблюдается. Однако значение Ь] позволяет предположить, что механизм их сорбции несколько отличен от сорб-

ции других веществ. Величины Ь0 хотя и менее стабильны, чем Ьь но также наблюдаются в довольно узких пределах. Поэтому особенности рассматриваемых систем оказывают на этот параметр большое влияние. Вероятно, наблюдаемое отличие позволяет предположить наличие электростатических взаимодействий.

Приблизительное постоянство координат указанной точки для данного модификатора и сорбента при каждом значении рН может быть использовано в целях прогнозирования условий хроматографического удерживания при произвольных концентрациях органического растворителя, исходя из одного экспериментального значения К'. Для расчета значений удерживания использованы уравнения:

ЫК'1 = 1Л£1±И(]шК:_а)+а (1.3.7) ^с, +т

= (1.3.8)

Чтобы охарактеризовать возможность этого подхода для экстраполяции в широком интервале концентрации, в качестве С, брали самую низкую концентрацию ацетонитрила, дня которой имелись экспериментальные данные. Прогнозировали удерживание при более высоких концентрациях органического модификатора.

С целью построения математической модели, адекватно описывающей хроматографическое поведение тетрациклинов, нами применен метод статистического планирования эксперимента. В качестве факторов, существенно влияющих на хроматографический процесс, рассмотрены значения рН подвижной фазы и концентрации органического модификатора (С %). Для определения коэффициентов регрессии было проведено множество опытов, согласованных по полному факторному плану З2.

Матрица планирования эксперимента и натуральные значения факторов представлены в таблице 5.

Математическое описание процесса, по данным проведенного факторного эксперимента, получили в виде уравнения регрессии (1.4.1.) ЦК' = 6 -рЯг/), . МеОН + />.,« рП1 -Ьхг • рН• МеОН + Ь22 • МеОН2 (1.4.1.)

где Ь0 -константа;

Ь), Ь-1 - коэффициенты, характеризующие линейные эффекты;

Ь] ь Ьгг - квадратичные эффекты;

Ь[2 - эффекты взаимодействия.

Таблица 5

Матрица планирования при полном двухфакторном эксперименте

Кодированные значения Натуральные значения Функция

Опыт факторов факторов отклика

X, х2 РН и С % 1« к-

1 + 1 0 3,0 1,10

2 0 0 6,0 1,0(5

3 + 1 0 8,0 1,16 ЬвГз

4 -1 +1 3,0 1,00

5 + 1 -1 6,0 1,16

6 -1 +1 8,0 1,250

7 0 -1 3,0 1,16

8 0 -1 6,0 1,16 1*11',

9 + 1 +1 8,0 1,25

Знаки и величины коэффициентов определяют характер влияния соответствующих факторов на хроматографический процесс. Наибольшее значение имеет концентрация ацетонитрил. Полученные уравнения регрессии проверялись иа адекватность, то есть на точность описания поверхности отклика, с помощью критерия Фишера.

Условие адекватности имеет вид Рэксп. <Ртабл. Полученные модели оказались адекватными в пределах изучаемой области. Процедура оптимизации осуществлялась методом Бокса - Уилсона - крутого восхождения по поверхности отклика. Полученный прогноз удерживания по математической модели совпал с экспериментом с вероятностью 95%.

Благодаря проведенному факторному анализу, общее количество необходимых опытов было сокращено в пять раз. Модели дали возможность оценить влияние каждого фактора на удерживание тетрациклиновых антибиотиков. Определив параметры уравнения, мы получили полную информацию о виде и свойствах поверхности удерживания, что позволило выбрать оптимальные условия хроматографирования исследуемых антибиотиков и прогнозировать их хроматографическое поведение.

Полученные закономерности хроматографического поведения тетрацик-линов позволяют оптимизировать их методики анализа с учетом представленных выше параметров рассчитанной нами математической модели. Оптимальным составом элюента для исследования доксициклина гидрохлорида является смесь 45 частей ацетонитрила и 55 частей оксалатно-аммиачного буферного раствора с рН = 6,0. При исследовании метациклина гидрохлорида целесооб-

разно использовать смесь ацетонитрила и буферного раствора с рН = 6,5, взятых в объемных отношениях 45 : 55, при определении окситетрациклина элю-ентом служит смесь, состоящая из 40 частей ацетонитрила и 60 частей буферного раствора с рН = 6,5.

Для построения калибровочных графиков готовились стандартные растворы (по объему) с концентрацией 100 мкг/мл в соответствующих элюентных смесях. После чего в мерные колбы на 25 мл вносили определенные объемы стандартных растворов препаратов с концентрацией 100 мкг/мл и одинаковый объем соответствующих соединений, выбранных в качестве внутреннего стандарта, с концентрацией 100 мкг/мл, после перемешивания объем жидкости в колбе доводили до метки буферным раствором, рН которого соответствовал рН элюента. Пробы объемом 10 мкл вводили в микроколонку и проводили элюи-рование. Полученные хроматограммы обрабатывались математическим интегратором.

Нами были рассчитаны отношения площадей полученных пиков определяемых веществ к площадям пиков препаратов, выбранных в качестве внутренних стандартов.

На основании полученных данных были построены калибровочные графики (рис. 1.) и проведен расчет линейной зависимости для определения препаратов по методу абсолютной калибровки и по методу внутреннего стандарта.

5 им2

0 0' 0.2 0,3 0,4 снкг

Рисунок 1. Калибровочные графики зависимости площадей хроматограмм от концентрации антибиотиков. Примечание: 1. Метациклина г/х

2. Доксициклина г/х

3. Окситетрациклина г/х

Относительная ошибка определения доксициклина гидрохлорида составляет по методу абсолютной калибровки - 2,20% , по внутреннему стандарту -2,07%; метациклина гидрохлорида по абсолютной калибровки - 2,61%, по внутреннему стандарту - 2,43%; окситетрациклина гидрохлорида - 2,69% и 1,90% соответственно.

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТЕТРАЦИКЛИНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

Анализ лекарств в цельной крови не всегда дает нужный результат, так как использование суммарной концентрации препарата может исказить фармако-кинетические параметры и затруднить установление связи уровня препарата с фармакологическим эффектом. Наиболее удовлетворительным следует считать анализ сыворотки или плазмы крови.

В нашем случае (для определения лекарственного вещества методом ВЭЖХ) была подобрана приемлемая схема осаждения белков. Цельную кровь центрифугировали, затем добавляли в 1 мл сыворотки, 7 мл воды, 1 мл метанола и 1 мл 10% раствора вольфрамата натрия и вновь центрифугировали. В фильтрате проводили определение концентрации лекарственного препарата Хроматографическая устойчивость аналитических колонок в результате такого подхода увеличивалась в 10 раз - с 20 до 200.

Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии при проведении биофармацевтических и клинических экспериментов является наиболее перспективным направлением и способствует повышению достоверности и экспрессивности анализа. Поэтому нами была исследована возможность использования разработанной методики хроматографического определения для анализа доксициклина гидрохлорид, метациклина гидрохлорид, окситетрациклина гидрохлорид в биожидкостях (табл. 6).

Таблица 6

Метрологические характеристики количественного определения содержания тетрациклиновых антибиотиков в модельных смесях крови методом ВЭЖХ (п = 5)

Препарат Метрологические характеристики

Х% в вх дх ДХ 1%

Доксициклина г/х 64,62 1,8861 0,8435 5,24 ±2,35 3,63

Метациклина г/х 60,84 1,5845 0,7086 4,41 ±1,82 4,82

Окситетрациклина г/х 64,12 1,6291 0,7286 4,53 ±2,03 4,59

Для описания динамики концентрации препаратов в сыворотке крови использовали известную математическую модель фармакокинетики при внесосу-дистом способе введения со всасыванием (адсорбцией). Для получения результатов определения тетрациклинов в биологических жидкостях были проанализированы образцы крови, отобранные в ходе эксперимента (табл. 7). Полученные результаты количественного определения тетрациклинов в крови наблюдаемых были использованы для расчета «терапевтического коридора» при индивидуальной фармакотерапии этими препаратами.

Таблица 7

Метрологические характеристики количественного определения тетрациклиновых антибиотиков в крови людей (время после приема препаратов 6 часов, п = 5)

Препарат Метрологические характеристики

Х% 8 Ях ДХ

Доксициклина г/х 68,33 4,0731 1,5394 ±3,63 4,17

Метациклина г/х 65,22 4,8112 1,8184 ±4,29 5,29

Оксшетрациклина 1/х 66,90 5,14880 1,9461 ±4,59 5,84

По полученным экспериментальным данным построена фармакокинети-ческая модель, характеризующая /8-фазы изучаемых соединений. Данная модель отражает зависимость тетрациклинов от времени и позволяет рассчитать кинетические показатели элиминации препаратов. Для изучаемых тетрациклинов величина наблюдаемой константы скорости элиминации составляла: доксициклина гидрохлорида -0,300 ч"1, метациклина гидрохлорида - 0,183 ч'\ окситетрациклина гидрохлорида - 0,470 ч"1.

В ходе работы нами было доказано, что для биофармацевтического анализа тетрациклинов с успехом могут быть использованы хроматографические методики с флуоресцентным детектированием. Надо отметить, что полученные результаты позволяют характеризовать предлагаемый подход анализа исследуемых соединений как обладающий высокой достоверностью и значительными прогностическими критериями.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Раскрыт механизм образования флуоресцирующих соединений тетра-циклинов с рядом катионов (магний, алюминий, цинк), показано участие элек-тронодонорных групп тетрациклинового цикла в образовании хелатов. С помощью УФ- и ИК-спектроскопии доказано, что с солями магния в среде диме-тилформамида производные тетрациклина образуют комплексные соединения полидентантного характера, обладающие желтой флуоресценцией с максимумом возбуждения флуоресценции в области 400—420 нм и излучения флуоресценции в области 480-510 нм.

2. Определена структура образующегося флуоресцирующего комплекса, найдены оптимальный состав реагента и условия проведения реакции. Установлено, что флуоресценция продуктов реакции комплексообразования тетра-циклинов с ионами магния остается стабильной в течение 1,5 часа.

3. Изучен механизм удерживания тетрациклиновых антибиотиков на ал-килсиликагелях. Доказано, что в механизме удерживания тетрациклинов на неполярных сорбентах преобладают гидрофобно-дисперсионные взаимодействия.

4. Выявлено наличие линейной связи между коэффициентами емкости доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида и окситетрациклина гидрохлорида на алкилсиликагелях в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ и их гидрофобностью. Установлено существование линейной связи между логарифмами коэффициентов емкости антибиотиков и содержанием ацетонитрила, что указывает на единый механизм сорбции в данных условиях. Полученные данные легли в основу определения оптимальной концентрации органического модификатора в подвижной фазе.

5. Благодаря проведенному многофакторному анализу, общее количество необходимых опытов было сокращено в 5 раз, с 10 до 2. Предлагаемые нами модели дали возможность оценить влияние каждого фактора на хроматографи-ческое удерживание тетрациклинов. Доказана возможность оптимизации прогнозирования хроматографического поведения изучаемых соединений по методу Бокса-Уилсона - крутого восхождения по поверхности отклика. По-

лученный прогноз удерживания по математической модели совпал с результатами эксперимента с вероятностью 95%.

6. Разработаны комбинированные методики качественного и количественного определения доксициклина гидрохлорида, метациклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида в субстанциях и лекарственных формах для обращенно-фазового варианта ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием, в основу которых положен прием введения комплексообразователя (ионов магния) в подвижную фазу с дальнейшим определением образующегося флуоресцирующего продукта. Ошибка методик определения тетрациклинов в субстанции по методу абсолютной калибровки не превышает 2,01%, внутреннего стандарта - 1,77%, ошибка определения их в лекарственных формах по методу абсолютной калибровки не превышает - 2,69%, по внутреннему стандарту -2,43%.

7. Изучены оптимальные условия выделения тетрациклинов из объектов биологического происхождения, показано влияние природы и состава осадите-ля на полноту осаждения белковых компонентов биожидкостей. Наиболее эффективным оказалось осаждение с использованием метанола и 10% раствора вольфрам ата натрия.

8. Разработаны хроматографические методики количественного определения доксициклина гидрохлорида, окситетрациклина гидрохлорида и метациклина гидрохлорида в крови и моче, которые апробированы на модельных смесях с известным содержанием препаратов. Относительная ошибка определения доксициклина в крови составляет 3,63%, в моче - 3,12%, окситетрациклина в крови - 4,59%, в моче - 3,89%, метациклина в крови - 4,82%, в моче -3,96%.

9. С использованием разработанных хроматографических методик изучена динамика изменения концентраций тетрациклинов в крови после перо-рального приема. По полученным данным построена фармакокинетическая модель, доказывающая, что полулогарифмическая зависимость ^Сч для /3-фазы тетрациклинов определяет величину наблюдаемой (реальной) константы скоро-

ста элиминации и составляет для доксициклина гидрохлорида -0,300 ч"1, для метациклина гидрохлорида - 0,183 ч"1, для окситетрациклина гидрохлорида -0,470 ч'.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Определение примесей в лекарственных препаратах по квазилинейчатым спектрам флуоресценции / Е.В. Воскобойникова, B.C. Цебро, О.В. Бело-усова, В.А. Новикова// Сб. науч. тр. конф., посвящен. 100-летию со дня рождения профессора Г.Е. Островерхова. - Курск, 2004. - С. 302-303.

2. Использование способов хелатирования в профилактике профессиональных заболеваний, вызванных загрязнением окружающей среды металлами / В.А. Новикова, Ф.М. Милюков, О.В. Белоусова, B.C. Цебро, Е.В. Воскобойникова // Объединен, научи, журн. - 2004. - № 35 (127). - С. 66-67.

3. Исследование прочности внутрикомплексных соединений при изучении нарушений метаболизма / B.C. Цебро, О.В. Белоусова, А.Г. Чеботарев, Ф.М. Милюков, В.А. Новикова // Курский научн.-практ. вестн. «Человек и его здоровье»,-2004.-№ 1.-С.61-62.

4. Биофармацевтический анализ тетрациклинов и антибиотиков антра-циклинового ряда в хелатной фармакотерапии / B.C. Цебро, В.А. Новикова, В.В. Новиков // Объединен, научн. журн. - 2004. - № 13 (105). - С. 73-74.

5. Использование метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным детектированием для оценки качества лекарственных средств / B.C. Цебро, В.А. Новикова, О.В. Белоусова, Е.В. Белоусова // Курский научн.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2004. - № 4. - С. 69-72.

6. Флуориметрическое определение примесей в лекарственных препаратах / О.В. Белоусова, B.C. Цебро, В.А. Новикова, A.A. Хабаров, Д.А. Новиков // Объединен, мед. журн. - 2004. - № 1 (7). - С. 75-76.

7. Изучение реакций образования флуоресцирующих хелатов / A.A. Хабаров, В.А. Новикова, B.C. Цебро, Д.А. Новиков // Сб. тр. 69-й итог. науч. сессии КГМУ и Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН: в 2 т. - Курск, 2004. -Т. 2.-С. 317-318.

8. Использование реакций комплексообразования в фармацевтической технологии / Д.А. Новиков, B.C. Цебро, В.А. Новикова, А.Н. Костин // Человек и Вселенная. - 2004. - № 5 (38). - С. 54-55.

9. Применение флуоресцентного метода в комплексном изучении профессиональных патологий на химико-фармацевтических предприятиях / Ф.М. Милюков, В.А. Новикова, B.C. Цебро, О.В. Белоусова // Человек и Вселенная. - 2004. - № 5 (38). - 48-49.

10. Новые способы исследования профессиональных заболеваний работников химико-фармацевтических предприятий / Е.В. Воскобойникова, В.П. По-доляко, Ф.М. Милюков, B.C. Цебро // Брянский мед. вестн. - 2004. - № 6 (17). -С. 40-44.

11. Исследование возможности использования неорганических катионов в реакциях комплексообразования / О.В. Белоусова, C.B. Цебро, Е.В. Воскобойникова // Сб. тр. юбилейной науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Чернозем. науч. центра РАМН, посвящен. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск, 2005.-Т. 2.-С. 210-211.

12. Использование флуоресцентного метода в качественном анализе органических соединений / О.В. Белоусова, Е.В. Воскобойникова, B.C. Цебро // Сб. тр. юбилейной межвуз. науч. конф. студен, и молод, ученых, посвящен. 70-летию КГМУ: в 2 т. - Курск, 2005. - Т. 2. - С. 82-83.

Лицензия JIP № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 19.05.2005 г. Подписано в печать 20.05.2005 г. Формат 30х42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 83 А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

!И 1 Р 6

РНБ Русский фонд

2006-4 8005