Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка путей модификации природных полисахаридов с целью создания новых биологически активных веществ

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая

академия

На правах рукописи

УДК 547.458:615

ИОЗЕП АНАТОЛИИ АЛЬБЕРТОВИЧ

РАЗРАБОТКА ПУТЕЙ МОДИФИКАЦИИ ПРИРОДНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ НОВЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

15.00.02 Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

Санкт-Петербург 1999

Работа выполнена в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии

Научные консультанты:

доктор химических наук, профессор, чл. - корр. РАЕНИвин Б. А. доктор химических наук, профессор Пассет Б.В.

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, академик МАИ Северцев В. А.

доктор фармацевтических наук, профессор Казьмина Э.М. доктор химических наук, профессор Севбо Д.П.

Ведущая организация - Пермская государственная фармацевтическая академия

Защита состоится 16 ноября 1999 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д-084.63.01 при Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии (г. Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 14)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 4/6.

Автореферат разослан /7 октября 1999 г. Ученый секретарь

диссертационного совета Д-084.63.01

кандидат фарм. наук, доцент

Рыжкова М.В.

%

Введение

Полисахариды к их производные нашли широкое применение в биотехнологии, пищевой, косметической и других отраслях промышленности и все большее значение приобретают в медицине и фармации. Многие полисахариды нередко стимулируют неспецифическую резистентность организма животных и человека к инфекциям, ингибируют рост злокачественных опухолей, могут проявлять антикоагулянтную, гиполипидемическую и другие виды активности. Введение в их молекулы карбонильных, карбоксильных, сульфатных, фосфатных и других функциональных групп и низкомолекулярных фрагментов приводит к созданию ценнейших лекарственных препаратов (например, лакрисин, полифер, поликапран, терридеказа, стрептодеказа и другие). Кроме того, полисахариды представляют интерес как группа неспецифических транспортных макромолекул, т.к. улучшают доставку лекарственных веществ к биомишени. Поэтому модификация биологически активных веществ полисахаридами, например, химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице, позволяет создавать пролекар-сгва, новые препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно-гидрофильных свойств.

Работы в области использования модификации полисахаридов в медицинских целях проводятся как в России, так и за рубежом. При этом в значительной мере они направлены на создание новых типов транспортных систем с целью повысить терапевтический эффект существующих лекарственных веществ. Вместе с тем, методы химической модификации полисахаридов и методы анализа целевых продуктов разработаны недостаточно. Большинство ранее предложенных схем модификации полисахаридов многостадийны, сложны, требуют дорогих и часто токсичных реагентов, нетехнологичны, что затрудняет их внедрение в промышленную практику. Наконец, подавляющее большинство схем разработано в основном только для целлюлозы и декстра-на. Другие полисахариды в этих целях применяются редко.

В связи с этим, целью работы является разработка эффективных схем и методов химической модификации полисахаридов низкомолекулярными соединениями для создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ, а также разработка методов фарманализа и стандартизации полученных веществ. В работе используются полисахариды - декстран, аубазидан, родэксман, ронасан и некоторые другие, отличающиеся молекулярной массой, строением моносахаридных звеньев, типом связи между ними, разветвленностью полисахаридной цепи и набором функциональных групп, биологической активностью. Несомненным достоинством выбранных полисахаридов является их доступность. Декстран (полиглюкин) разрешен к клиническому применению и производится отечественной промышленностью, внедрение родэксмана и ронасана в медицинскую практику завершается, выпущены опытные партии аубазидана.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка новых и совершенствование уже известных методов модификации полисахаридов:

- Разработка «карбоксиэтильной» схемы модификации полисахаридов, исследование реакционной способности производных карбоксиэтилполиса-харядов и возможности применения их при конструировании физиологически активных полимеров.

- Исследование закономерностей взаимодействия полисахаридальдеги-дов с С-нуклеофшгами и разработка новой схемы модификации полисахаридов фенолами, гетероциклическими соединениями, малоновым эфиром и другими соединениями.

- Создание эффективного метода синтеза алкиловых эфиров и амидов полисахаридкарбоновых кислот, исследование их реакционной способности и возможности использования в синтезе других производных полисахаридов.

- Разработка и совершенствование методов модификации полисахари-дальдегидов N - нуклеофилами и использование их для синтеза новых биологически активных веществ.

2. Разработка простых и надежных методов анализа качества, количественного определения и стандартизации производных полисахаридов.

3. Синтез и исследование новых физиологически активных полимеров производных аубазидана, декстрана, родэксмана и ряда биологически активных и лекарственных веществ.

Научная новизна разрабатываемого направления заключается в создании системы методов химической модификации полисахаридов, позволяющей связывать органические соединения разных классов с полимерной матрицей для синтеза новых биологически активных полимеров; количественном исследовании этих процессов; синтезе и изучении новых биологически активных соединений; разработке новых методов установления их качества, количественного определения и стандартизации.

Предложены новые схемы и методы модификации полисахаридов, в том числе лекарственными субстанциями:

- разработана «карбоксиэтильная» схема модификации полисахаридов, включающая алкилирование полисахаридов акрил амидом, гидролиз полученных амидов до карбоновых кислот, синтез сложных эфиров, гидр азидов, азидов карбоксиэтилполисахаридов и использование их в реакциях с биологически активными соединениями, в рамках которых предложен оригинальный метод синтеза аминоэтилкарбоксиэтилполисахаридов;

- установлена возможность взаимодействия полисахарид альдегидов с С-нуклеофилами и исследованы закономерности его протекания, послужившие основой для нового метода модификации полисахаридов фенолами и их производными, гидроксипиримидинами, другими гетероциклами, и способа синтеза дикарбоксиметиленовых производных полисахаридальдегидов;

- показана целесообразность использования автокатализа в сцщрзе сложных эфиров полисахаридкарбоновых кислот;

- установлена способность карбоксиметилполисахаридов образовывать лактоны, изучены условия их образования, строение, зависимость степени лактонизации от строения поликислоты и других факторов;

- определены условия и границы применения полисахаридкарбоновых кислот, их эфиров, лактонов и азидов для ацилирования спиртов, фенолов, аминов, гидразинов и их производных.

Практическая значимость работы. Разработаны технологичные схемы синтеза новых биологически активных производных полисахаридов и метод ацилирования биологически активных аминов и гидразидов алкиловыми эфирами и лактонами полисахаридкарбоновых кислот. Это позволило осуществить синтез ряда малотоксичных биологически активных соединений производных аубазидана, декстрана и родэксмана, проявляющих иммуномоде-лирующее, антимикробное, противовирусное и антигипоксическое действие и способность влиять на деятельность центральной нервной системы. Для углубленного фармакологического изучения предложены декстраны, модифицированные многоатомными фенолами, обладающие противовирусной активностью, и М-(«-гидрокси- и я-карбоксифенил)амиды карбоксиметилдекст-рана, обладающие иммуномоделирующей активностью.

Разработаны простые и удобные спектрофотометрические методы для установления качества, количественного определения и стандартизации по-лисахаридальдегидов, сложных эфиров, амидов, гидразидов и азидов полисахаридкарбоновых кислот.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Постановлением Правительства России № 68 от 26.12.1991 г. и Государственной программы РФ "Улучшение лекарственного обеспечения и развития фармацевтической промышленности в 1992 - 1995 г." и Тематическим планом НИР СПХФА.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 16 международных, всесоюзных и всероссийских конгрессах, конференциях и симпозиумах в СССР, России, Белоруссии и на Украине в 1977- 1999 гг. (Тбилиси 1977, Ленинград - С. Петербург, 1978, 1984,19S9, 1994, 1995, 1996, 1998, 1999 гг.; Москва 1991, 1996, 1998 гг.; Пенза 1992 г.; Самара 1996 г.; Днепропетровск и Минск 1998 г.).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 1 Авторском свидетельстве СССР и 55 публикациях (в т.ч. в 24 научных статьях в журналах РАН - ЖПХ, ЖОХ и ЖОрХ).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов (4 главы), экспериментальной части, выводов ( 420 стр. машинописного текста), приложения и иллюстрирована 127 таблицами и 111 рисунками. Список литературы включает 455 источников.

КАРБОКСИАЛКИЛЬНАЯ СХЕМА МОДИФИКАЦИИ ПОЛИСАХАРИДОВ

11

С1СН:СООН, N»011

Ре — Полисахарид 1

—N«01

СНг=СНСОРга2. №0Н

Р8(ОСпН2пСООМа)х

ГШ3

КАП(Ыа) 2

-N8

НзО ОН

АКЭП 3

Р8(ОС21Щ1ЧН2)у АЭКЭЛ 12

(ОС„Н2пСООН)х-у Р8(ОС„Н2„СО)5 —

10С -Н1О

^ОСпН^СООН), 4

ион

—цо

рЮС„Н2„СООН)х.у ^^ОСпНгпСООЩу—

М12М12, N8011

КОН

р ЮСпНгпСООШ^-у Ч0СпН2пС01ЧН1ЧН2)у

7

ГО02, II

-!Ча, Н20

р ЮСПИ2„СОО^)£у Р.(ОСпН2пСООН)*-у

Р8(ОС„Н2пСО!ЧНК=СНАг)у ,5(ОСпН2„СО\3)у

АГКАП АзКАП

АГКАП 10

Азк 8

КНгХ,1ЧаОН

-ы2о (иондаз)

р ЮСпН2„СООЛ*а),-(OCnH2nCONHX)y

АмкАП 9

1.0." Карбоксиап(сильная" схема модификации полисахаридов

До наших исследований карбоксиалкилполисахариды в синтезе ФАП были представлены в основном производными целлюлозы и декстрана. Мно-гостадийность синтеза, необходимость использования дорогих, токсичных реагентов для реализации известных методов активации карбоксильных групп препятствовали созданию и исследованию широкого круга конъюгатов БАВ с полисахаридной матрицей. В связи с этим для разработки удобной в применении карбоксиалкильной схемы, [схема 1] синтеза полимерных лекарств необходимо было расширить число применяемых полимеров и использовать новые более перспективные полисахариды, а также разработать новые методы синтеза карбоксиалкилполисахаридов и их производных и физиологически активных полимеров на их основе.

В качестве полимерной матрицы в синтезе ФАП наряду с декстраном (а-1,6-глюкан) нами предлагаются такие оригинальные полисахариды, как аубазидан (разветвленный Р-1,3-Р-1,6-а-1,4-глюкан) и родэксман (Р-1,3-р-1,4-маннан), у которых в отличие от декстрана физико-химические свойства полимера сочетаются с физиологической активностью. Они не токсичны, повышают неспецифическую резистентность макроорганизмов к некоторым инфекциям. Родэксман нормализует систему свертывания крови и ли-пидный обмен при атеросклерозе, обладает антилипидемической активностью и радиозащигным действием. Аубазидан проявляет седативный эффект, противовирусное действие и рекомендован в качестве вспомогательного и пролонгирующего средства для получения лекарственных форм. На их основе уже получены ценные лекарственные вещества (ронасан) и перспективные лекарственные формы известных субстанций.

Полисахаридкарбоновые кислоты и их производные исследовали методами ИК-, УФ- и ПМР- спектроскопии, объемного и кондуктометрического титрования, элементного анализа, ТСХ, ионообменной и гель-хроматографии и др. Для качественного и количественного анализа полученных веществ использовали также разработанные нами спектрофотометр ические методы определения сложных эфиров, амидов, гидразидов и азидов. Синтезированные полисахаридные соединения характеризовали степенью замещения Сза - числом соответствующих групп, в расчете на моносахаридное звено полимера (степенью карбоксиметилирования Скм, карбоксиэтшгарования Сю, амино-карбонилэтилирования Са1Г, и аминокарбонилалкилирования Самка, алкокси-карбонилалкилирования Сака, гидразинокарбонилалкилирования С11гм или Спо, азидокарбонилалкилирования Сазка и аминоэтилирования Саэ)- В ряде случаев рассчитывали общую степень замещения (С, = Сасэ +СЮ или С3 = Са-, + Скэ). Реакции гидролиза, элиминирования, этерификации, ацилирования и образования гидразонов соответственно характеризовали степенью гидролиза Сг = (Со - Сю]) / Сакэ • ЮО, % (где СКЭ1 степень карбоксиэтилирования исходного образца АКЭП), элиминирования (% отщепившихся введенных в полисахарид заместителей Се = (С зо - Сз)/Сзо'Ю0 (где Сзо— степень замещения ис-

ходного образца АКЭП), этерификации Сэ, лактонизации Сл, амидирования Сам, гидразидирования Cr и превращения гидразинокарбонилалкильных групп в гидразоны Сщ. (процент вступивших в реакцию функциональных групп полисахарида от их общего числа в образце).

Карбоксильные, сложноэфирные, амидные, гидразидные, азидные и аминогруппы в полисахаридных образцах определяли с помощью ИК-спектроскопии по наличию полос карбоксилат-иона (1570-1600 см'1), v(C=0) сложного эфира (1730 см"1), 8Ы-н "амид ГГ'(1535-1590) и vc=o "амид I " (16401685 см'1), азида (2150-2160 см"1), аминогруппы и катиона аммония (1600 -1630 и 1575 - 1600 см"1), отсутствующих в спектрах исходных полисахаридов. В ИК спектрах фермент-полисахаридных конъюгатов имеются отсутствующие в спектрах КМП полосы поглощения 1640-1680 см"1, характерные для белка.

1.1. Методы введения карбоксильных групп в молекулу нейтрального полисахарида

Карбоксиметилпроизводные целлюлозы и декстрана используются не только в медицине и фармации, но и в других отраслях промышленности, и их синтез хорошо изучен. Карбоксиэтиллолисахариды мало изучены и редкс применяются при конструировании ФАЛ. Между тем, удлинение «вставки» между полисахаридом и карбоксильной группы может повысить доступносп активного фрагмента и эффективность действия биополимера. Поэтому нашей задачей было решить проблему синтеза карбоксиэтилполисахаридов в изучить закономерности карбоксиметилирования аубазидана и родэксмана.

Карбоксиметилполисахариды (КМП) [Схема 1(2)] получали известным методом алкилирования полисахаридов монохлоруксусной кислотой Исследование зависимости характеристик целевых продуктов от соотношения реагентов и времени реакции позволило определить условия синтез« карбоксиметилпроизводных декстрана, аубазидана и родэксмана с заданное Сш (от 0,2 до 2,0).

Направление алкилирования полисахаридов изучали методами перио-датного окисления и ПМР-спектроскопии. Оказалось, что числс а-гдикольных групп в карбоксиметиддекслране (КМД) (до Си, < 1) по сран нению с исходным полисахаридом уменьшается на 1 моль на каждую введенную в моносахаридное звено карбоксиметильную группу(рис. 1.1). С учетом литературных данных это позволяет нам считать, что в первую очеред! алкилируется С2-0 моносахаридного звена декстрана. Спектры ПМР продуктов гидролиза КМД также свидетельствует, что > 60% карбоксиметильны? групп находятся у С2-0.

Способность образцов карбоксиметилаубазидана окисляться периода том натрия также зависит от Сш. Каждая введенная в моносахаридное звене карбоксиметильная группа уменьшает число а-гликольных групп в полиса хариде по сравненшо с исходным аубазиданом на ~ 0.75 моль. Несмотря н; сложность строения молекулы аубазидана, это позволяет считать, что в пер вую очередь алкилируются моносахаридные фрагменты боковых цепей, т.к

только в этом случае при карбоксиметилировании полимера возможно уменьшение числа а-гликольных групп.

Рис. 1.1. Зависимость числа а - гликольных групп (п, моль/моль моносахаридно-го звена полимера) в декстра-не от степени карбоксимети-лирования Скм-

[Схема 1(2)] получали О-алкилированием алкоголятов полисахаридов акриламидом с последующим гидролизом образующихся амидов [Схема 1(3)]. Предложенный нами метод технологичен и позволяет регулировать количество заместителей в полимере.

При 40-50°С и 1-5 моль акриламида на моль гидроксильных групп в 2% водном растворе ИаОН алкилирование полисахаридов завершается за 4-5 ч. Повышение температуры приводит к установлению равновесия между продуктами прямой и обратной реакций при более низких значениях С3. Для получения целевых продуктов с заданными значениями С3 (от 0,5 до 2,0), мы использовали пропорциональную зависимость общего число заместителей в молекуле полисахарида от количества акриламида в реакционной массе.

Увеличение концентрации №ОН от 1 до 4-6% повышает степень замещения полисахаридов. Дальнейшее увеличение её приводит к ускорению обратного процесса - отщепления заместителей от полимера - и практически полному гидролизу введенных в полисахарид амидных групп (рис. 1.2). Такое влияние концентрации щелочи на направление реакции полисахаридов с акриламидом дает нам возможность синтезировать образцы КЭП с Скэ 0,5 - 0,8.

Рис. 1.2. Зависимость степени замещения С3, амино-КарбоНИЛЭТИЛИрОВаНИЯ Сак, и карбоксиэтилирования Сю декстрана в реакции с акриламидом от концентрации ИаОН С (%) (40°С, 3 ч, 3 моль акриламида на моль гидроксильных групп полимера).

Гидролиз амидов КЭП до карбоновых кислот осуществляли растворами щелочи. Оказалось, что наряду с гидролизом амидов от полисахарида отщепляется часть введенных групп, которая с повышением концентрации ще-

0,5 -

О -I-!-1

0 0,5 1

с

Карбоксиэтилполисахариды (КЭП)

лочи и температуры увеличивается до 60% и более (табл. 1.1). В связи с этим гидролиз вели при 17-20°С (рис. 1.3) и установили, что основная часть амид-пых групп в АКЭП гидролизуется за трое суток. Однако время их полного гидролиза в 2-3 раза больше. Степень элиминирования в этом случае наименьшая (около 20%) (табл.1.2).

Таблица 1.1

Результаты щелочного гидролиза амидов карбоксиэтилдекстрана (С3=1,22,0,3=0,97, Сю=0,25) в зависимости от температуры реакции

(0,5% водный раствор 1ЧаОН, 3 часа)

Температура, °С Характе] эисгики продукта реакции СЕ, %

С, Саю Сю

20 1,21 0,96 0,25 0,8

40 0,79 0,44 0,35 35,2

60 0,45 0 0,45 63,1

80 0,41 0 0,41 66,4

Рис. 1.3. Зависимость степени гидролиза амидных групп Сг(%) (1), степени элиминирования заместителей СЕ(%) (2), содержания амидных групп (в % от первоначальной величины) (3) образца АКЭД (С3=1,16, 0*3=0,84, 0,0=0,32) от времени гидролиза т ^ (сутки) в 1 н ЫаОН при 17-20°С и концентрации АКЭД 10%.

Таблица 1.2

Характеристика некоторых амидов карбоксиэтилполисахаридова и _______________________л б

Полисахарид Амиды карбоксиэтилполисахаридов Со СЕ, %

С3 Сакэ Сю КЭП

Декстран 1,63 1,14 0,49 1,36 16,4

Аубазидан 1,75 1,27 0,48 1,35 22,7

Родэксман 1,85 1,55 0,30 1,47 20,3

'-условия синтеза: 3 ч, 60°С, 5 моль акриламида на моль гидроксильных групп; -условия гидролиза: 1 н водный КаОН, 17-20°С, 9 суток.

В связи с тем, что щелочной гидролиз АКЭП длителен (до 8 суток) и сопровождается отщеплением от полимера до 20% аминокарбонилэтильных групп, мы изучили реакцию амидов КЭП с азотистой кислотой по Буво. Этот метод позволил в течение часа гидролизовать более 70% амидных групп, при этом степень элиминирования не превысила 8%. Сочетание щелочного гидролиза и метода Буво позволяет сократить время гидролиза АКЭП до 2-3 суток.

Результаты периодатного окисления образцов КЭД и АКЭД с разной степенью замещения совпали с результатами окисления образцов КМД (рис. 1.1). Уменьшение расхода окислителя в реакциях с полученными образ-

дамп, по сравнению с окислением декстрана, происходило строго эквивалентно числу карбоксиэтильных (аминокарбонилэтильных) групп, введенных в полисахарид. Это позволяет сделать вывод об отсутствии сополимеризации акриламида с полисахаридом, т.к. при сополимеризации введенный в полимер акриламид не уменьшает в такой степени расход периодата. Полученные результаты позволяют с большой уверенностью предположить, что алкили-рование декстрана акриламидом, подобно карбоксиметашфовашда, идет преимущественно по С -О.

Дикарбокашетилирование - введение в молекулу полисахаридальде-гида двух карбоксильных групп - осуществляли реакцией полиальдегидов с малоновым эфиром (см. с. 35).

Н-формы полисахаридкарбоновых кислот [Схема 1(4)], которые мы использовали как для образования солей с биологически активными основаниями (например, основания канамицина, ремантадина) [Схема 1(11)], так и для дальнейшей модификации полисахаридов, получали из их натриевых солей с помощью ионообменной хроматографии.

Таким образом, для получения аубазидан-, декстран- и родэксманкар-боновых кислот с заданной степенью замещения необходимо использовать стандартную методику алкилирования полисахаридов монохлоруксусной кислотой, а также предложенные нами оригинальные методики синтеза КЭП с помощью акриламида и метод введения в полисахаридальдегиды карбоксильных групп с использованием малонового эфира. Алкшшрование полисахаридов акриламидом не сопровождается сополимеризацией. Карбоксиме-тильные и карбоксиэтильные группы направляются преимущественно в положение С2-0 моносахаридного звена декстрана. Максимальные степени замещения в случае карбоксиалкилполисахаридов 2,0, а полисахаридмалоно-вых кислот 0,5-0,7.

1.2. Сложные эфиры, гидразиды и аз иды карбоксиалкилполисахаридов и методы их получения

Существующие способы повышения реакционной способности КАП нетехнологичны, поэтому нашей задачей было их совершенствование, а также разработка новых более удобных методов.

Алкиловые эфиры карбоксиалкилполисахаридов [Схема 1(5)] мало изучены. Между тем, в ряде случаев, например, в реакциях с антибиотиками и ферментами, эти вещества могут быть более удобными реагентами, чем другие производные КАП. В связи с этим, нами предложен метод синтеза сложных эфиров полисахаридкарбоновых кислот этерификацией карбоксильных групп избытком спирта при нагревании в условиях автокатализа, который ранее в химии полисахаридов не применялся.

Наличие сложноэфирных групп в полисахаридных образцах определяли с помощью ИК-спектроскопии после обработки их этилатом натрия для нейтрализации не вступивших в реакцию этерификации карбоксильных групп, которые препятствуют идентификации сложных эфиров. Исследуя зависимость степени этерификации КАП от времени и температуры реакции,

от степени карбоксиалкилирования полимера и строения спирта мы установили, что карбоксиэтилполисахариды реагируют со спиртом медленнее, чем карбоксиметил- и дикарбоксиметилполисахариды (рис.1.4).

Рис.1.4. Зависимость степени этерификации С, (%) дек-странмалоновой кислоты (Сда, = 1,04) (1), карбоксиметилдекстра-на (Сга = 0,84) (2) и карбокси-этилдекстрана (Сю = 1,0) (3) в реакции с этанолом при 78°С от времени реакции, ч.

Таблица 1.3

Результаты этерификации карбоксимеггилдекстрана разными спиртами ИОН (время реакции 4 ч, Скы 0,82 - 0,84)

Я Температура,°С Саш с,,%

СН3 60 0,31 38

СН3СН2 60 0,28 34

СН3СН2СН2 60 0,14 17

СНз СН2СН2СН2 60 0,1 12

СНз СН2СН2СН2СН2 60 0,09 11

СНз 64 0,33 39

СН3СН2 78 0,35 42

СН3СН2СН2 97 0,46 55

СНз СН2СН2СН2 117 0,38 45

СНз СН2СН2СН2СН2 138 0,45 54

(СН3)2СНСН2 108 0,24 29

(СН3)2СНСН2СН2 131 0,41 49

сн=ссн2 114 0,38 45

С6Н5СН=СНСН2 100 0,25 30

С«Н5СН2 100 0,25 30

(СН3)2СН 81 0,27 32

(СН2)5СН 100 0,23 27

(СНз)зС 82 0,15 18

Рис.1.5. Зависимость степени этерификации Сэ (%) кар-боксиэтил - (1, 2, 3) и карбок-симетилдекстрана - (4) в реакциях с кипящими этанолом - (1, 2,4) и бутанолом - (3) от степени карбоксиалкилирования (Сю _ и Скм) полимера. Время этери-с««. Ска фикации КЭД 6 ч - (1, 3); 12 ч -(2);КМД 4ч-(4).

Степень этерификации КАП повышается с увеличением температуры реакции и степени карбоксиалкилирования (С,ш и Сю), но лишь до определенного предела (для КМД 50-55%, КЭД около 40%). Как и в случае низкомолекулярных кислот, замена первичного спирта разветвлёнными или с большей длиной цепи спиртами снижает степень этерификации поликислоты (рис. 1.5, табл. 1.3). Добавление минеральных кислот повышает Сэ до 60%, но сопровождается деполимеризацией полисахаридов.

Предложенный метод синтеза сложных эфиров апробирован на примере карбоксиметил- и карбоксиэтилпроизводных аубазидана, декстрана и род-эксмана. Как и ожидалось, способность к этерификации карбоксиалкилполи-сахаридов мало зависит от строения молекулы полимера (табл. 1.4). Повышенную активность КМД можно объяснить большим содержанием более активных карбоксимегильных групп связанных с С2-0. Зависимость реакционной способности карбоксиметильной группы от её положения в моносаха-ридном звене полимера подтверждается тем, что карбоксиэтилполисахариды, в которых моносахаридное звено значительно меньше влияет на электро-фильность углерода карбоксильной группы, реагируют со спиртами примерно одинаково.

Таблица 1.4

Результаты этерификации карбоксиалкилполисахаридов. (этанол, 78°С, время этерификации КМП = 4 ч, КЭП = 6 ч)

Полисахарид С км Скэ С,(в %) КМП Сэ(в %) КЭП

Декстран 0,96 1,00 52 10,5

Декстран 1,08 - 53 -

Аубазидан 0,95 0,73 42 10,1

Родэксман 1,02 1,31 39 7,5

Лактоны карбоксиалкилполисахаридов [Схема 2(6)] были обнаружены при изучении свойств Н-форм КМД. Термин "лакгоны" нами используется применительно ко всем возможным формам внутримолекулярных сложных эфиров, которые могут образоваться как между двумя звеньями цепи полимера, так и внутри одного и того же моносахаридного фрагмента. Данных об исследовании лактонов КАП в литературе нет. Между тем, в ряде случаев, они более доступны, чем сложные эфиры, поэтому нами изучена лакгонизация поликислот.

Синтез лактонов осуществляли нагреванием порошка КАП в вакууме или в инертном органическом растворителе. Н-формы полисахаридкарбоно-вых кислот образуют лактоны уже при сушке в вакууме при 20°С. При этом Сл полученных веществ не зависит от строения и типа поликислот и во всех случаях приблизительно одинакова (6-7%). Можно предположить, что при такой обработке поликислот сложные эфиры образуются функциональными группами разных полимерных цепей. С повышением температуры и времени реакции число лактонов в полисахаридных образцах увеличивается. Учитывая деструкцию полисахаридов при повышенных температурах, лактониза-

цию КМД проводили при температурах, не превышающих 110°С, поэтому максимальные значения Сжг в образцах не более 0,4 и сильно зависят от строения полисахаридкарбоновых кислот (табл. 1,5) и степени карбоксимети-лирования полисахарида (рис. 1.6).

Таблица 1.5

Степень лакто низании карбоксиалкилпроизводных некоторых полиса-

харидов (20 мм рт.ст 110°С, 4 ч)

Полисахарид Скм С*ка Сл,%

Карбоксиметилдекстран (КМД) 1,06 0,266 25,1

Карбоксиметилаубазидан (КМА) 0,76 0,142 18,7

Карбоксиметиламилоза (КМАм) 1,06 0,17 16,0

Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) 1,04 0,13 12,5

Карбоксиметилродэксман (КМР) 0,75 0,085 11,3

Карбоксиметил-р-1,3-глюкан 1,05 0,08 7,6

Карбоксютилдекстран (КЭД) 1,02 0,076 7,4

Рис.1.6. Зависимость степени лактонизации Сл. карбоксиметилекстрана в диоксане (101°С, 4 ч) - 1 и в вакууме (20 мм рт. ст., с 110°С, 4 ч) - 2 от степени " карбоксиметилирования

2 Сцм.

В растворах ДМСО Сл КМД не зависит от концентрации полисахарида, поэтому можно предположить, что сложноэфирные связи в нолисахаридных образцах в растворах образуются между звеньями одной полимерной цепи. В связи с этим, разную степень лактонизации поликислот можно объяснить, их способностью замыкать шестичленные циклические эфиры. Наименьшую Сл имеют образцы карбоксиметил-р-1,3-ппокана и КЭД, которые не могут их образовывать. Расчет возможных комбинаций замыкания шестичленных лак-тонных циклов в моносахаридном фрагменте КМП показывает, что в 1,6-глюкане их в 2 раза больше, чем в 1,4-, и в 4 раза больше, чем в родэксмане. Действительно, если учесть межмолекулярную этерификацию образцов (-7,5%), то приведенные в табл. 2.3 степени лактонизации карбоксиметил-производных декстрана, амилозы и родэксмана относятся как 4,6 : 2,2 : 1. Способность к лактонизации карбоксиметилпроизводных аубазидана и целлюлозы объясняется, вероятно, и другими факторами (разветвленностью цепи, конформацией моносахаридного звена и цепи полимера и т.д.)

В работе использовались разные реакционные среды (декалин, тетра-хлорэтан, 2-гексанон, диметилсульфоксид и др.), отличающиеся по полярности и способности растворять полисахарид, но степень лак-тонизации образцов КМД оказалась примерно одинаковой (22-25% при прочих равных условиях). Наилучшие результаты получены в диоксане (гетерогенные условия,

Сл 31%) и диметилформамиде (гомогенные условия, Сл 34%).

Гидразиды [Схема 1(7)] карбоксиметилпроизводных целлюлозы и дек-страна применяют в синтезе азидов, которые используют для модификации полисахаридов антибиотиками и ферментами. Гидразиды других полисаха-ридкарбоновых кислот мало изучены, поэтому нашей задачей была разработка и совершенствование методов синтеза и анализа гидразидов карбоксиме-тил- и карбоксиэтилпроизводных аубазидана, декстрана и родэксмана.

Гидразин ацилировали в воде эфирами КАП или амидом КЭП. В среде гидразин-гидрата при 10-15°С за 24 ч. все сложноэфирные группы КАП превращаются в гидразидные. Для достижения полного превращения сложно-эфирных групп в гидразидные необходим большой избыток и высокая концентрация гидразина, так как параллельно основному процессу идет щелочной гидролиз эфиров. Замена воды спиртом и повышение температуры приводили к образованию нерастворимых в воде продуктов, которые, несмотря на большое содержание азота, плохо реагировали с п-нитробензальдегидом и азотистой кислотой. Это объясняется сшиванием полимерных цепей за счет взаимодействия одного моля гидразина с двумя сложноэфирными группами полимера.

Сг, %

-3-2

Рис.1.7. Зависимость степени превращения амидных групп АКЭД в гидразидные Сг (%) от времени реакции т (ч) при температуре 17-20"С - (1), 40°С - (2) и 60°С - (3).

2 4 6 8 10 12 14 16 13 20 22 24 ^ 4

Синтез гидразидов КЭП из сложных эфиров длителен и трудоемок. Поэтому нами предложен метод получения их из амидов [Схема 1(3)], которые образуются при алкилировании полисахаридов акриламидом. При этом мы сократили схему синтеза гидразидов КЭП до 2 стадий и сделали их более доступными, чем гидразиды КМП.

При 20°С за 8-10 суток, а при 40°С за 16-18 ч. все амидные группы КЭД в среде гидразин-гидрата превращаются в гидразидные (рис.1.7.). При 60°С реакция завершается за 8 часов, но при этом, наряду с гидразидами КЭД, образуется продукт ацилирования гидразина по двум атомам азота (до 30%).

Азиды карбоксиалкилполпсахаридов [Схема 1(8)] - активные ацили-рующие агенты, незаменимые при модификации антибиотиков и ферментов. В литературе описаны в основном азиды карбоксиметилпроизводных целлюлозы и декстрана. В связи с этим нами исследованы синтез и устойчивость азидов карбоксиметил- и карбоксиэтилпроизводных аубазидана, декстрана и родэксмана.

Азиды КАП получали из соответствующих гидразидов известным ме-

ходом с помощью азотистой кислоты и показали, что при 0°С водные растворы азидов КАП устойчивы как в кислых, так и в щелочных средах и сохраняются более суток, особенно при рН >7. С повышением температуры их устойчивость, особенно в кислых средах, заметно уменьшается (табл. 1.6).

Таблица 1.6

Число азидных групп (в % от исходного) в растворах азидов карбокси-

алкилполисахаридов через 2 ч после их получения

Полисахаридкарбоновая ки- рН Температура, °С

слота раствора 0 17-20 40

2 92 38 0

Карбоксиметилдекстран 7 93 67 6

>9 99 96 98

2 100 85 0

Карбоксиэтилдекстран 7 99 89 48

>9 98 92 52

Азиды КАП, полученные в виде аморфных порошков осаждением из раствора этанолом или ацетоном, устойчивы при хранении и содержат более 90% теоретически возможного количества азидных групп. При этом число азидных групп в образцах зависит ог способа выделения их из растворов.

Было также установлено, что уменьшение числа азидных групп в водных растворах азидов КАП является результатом гидролиза их до карбоно-вых кислот. В образцах полисахаридов, после полного разложения азидных групп в кислой среде, были обнаружены только карбоксильные группы, и степень карбоксиалкилирования совпала с общей степенью замещения исходного образца азида.

Таким образом, при нагревании КАП в вакууме или в среде инертного растворителя до 40% карбоксильных групп образуют лактоны, число лактон-ных групп в полисахариде зависит в основном от его строения. При действии спирта в условиях автокатализа до 50% карбоксильных групп аубазидан-, декстран- и родэксманкарбоновых кислот образуют сложные эфиры, превращающиеся в реакциях с гидразин-гидратом в соответствующие гидразиды с 100% выходом. Однако синтез гидразидов КЭП из соответствующих амидов предпочтителен. Гидразиды полисахаридкарбоновых кислот также с 100% выходом превращаются в азиды, растворы которых можно хранить 2 + 24 ч в зависимости от температуры и рН раствора. В водных растворах при рН < 7 азиды гидролизуются до соответствующих кислот.

1.3. Синтез аминоэтилкарбоксиэтилполисахаридов (АЭКЭП)

Расщепление амидов карбоксиалкилполисахаридов по Гофману как метод введения аминогрупп в молекулу полисахарида не изучено. В связи с этим нами исследована перегруппировка Гофмана амидов карбоксиэтилпо-лисахаридов [Схема 1(12)], которую проводили в свежеприготовленном растворе гипобромита натрия от 1 до 20 ч при 0°С. Непрореагировавшие амид-ные группы гидролизовали в растворе №ОН при 17 - 20°С.

Таблица 1.7

Характеристика некоторых образцов продуктов расщепления амидов

Характеристика исходного Характеристика аминоэтилкарбокси-

Полисахариды амида КЭП этилполисахаридов

Сакэ сю С, Саэ с„ С,

Аубазидан 1,14 0,26 М 0,41 0,52 0,93

Декстран 1,38 0,5 1,78 0,3(0,33) 1,29(1,2) 1,59(1,51)

Декстран 1,1 0,32 1,42 0,24(0,25) 1,07(1,05) 1,31(1,3)

Родэксман 1,43 0,36 1,79 0,61 0,59 1,2

* В скобках указаны значения, рассчитаные по результатам элементного анализа образцов АЭКЭД и титрования образцов гидроксизгалкарбоксиэтилдекстрана, полученных после обработки продуктов расщепления амидов КЭД по Гофману азотистой кислотой.

Количество аминоэтильных групп в полисахариде определяли по данным элементного анализа, карбоксиэтильных - по результатам кондуктомет-рического титрования как самих АЭКЭП, так и их образцов, обработанных азотистой кислотой для удаления аминогрупп.

Исследовав влияние времени реакции, концентрации и соотношения реагентов на Саэ получаемых образцов установили, что при 0°С, избытке брома 1,5 моля на моль амидных групп, концентрации амида 12 - 15% , щелочи 12% за 3-6 ч с последующей выдержкой при 80°С 15 мин. 20 - 50% ами-нокарбонилэтильных групп полисахаридов превращаются в аминоэтильные. Остальные - в условиях эксперимента гидролизуются до соответствующих кислот либо отщепляются от полисахаридной матрицы. При этом амино-этилкарбоксиэтилполисахариды в условиях выделения из раствора могут образовывать внутримолекулярные амиды, которые затрудняют как анализ первичных аминогрупп в полимере, так и их реакции с альдегидами и сложными эфирами низкомолекулярных кислот.

Таким образом, до 50% амидных групп АКЭП в свежеприготовленных растворах гипобромита натрия расщепляются по Гофману с образованием аминоэтилкарбоксиэтилполисахаридов.

1.4. Методы конструирования физиологически активных полимеров на основе карбоксиалкилполисахаридов

Амиды и гидразиды, образующиеся при ацилировании биологически активных аминов и гидразинов производными целлюлозы и декстрана, являются ценными полимерными пролекарствами и отличаются как устойчивостью, достаточной для транспортировки БАВ к биомишени, так и способностью гидролизоваться в присутствии кислотных и основных катализаторов или ферментов (Платэ H.A., Васильев А.Е., 1986). Применение других полисахаридов и алкиловых эфиров КАП в этих целях в литературе не описано. Мало изучена также реакционная способность КАП, их гидразидов и азидов. В связи с этим нашей задачей было исследование закономерностей ацилиро-вания аминов и замещенных гидразинов карбоксиметил- и карбоксиэтилпро-изводными аубазидана, декстрана и родэксмана, их сложными эфирами и азидами, а также разработка метода модификации полисахаридов биологиче-

ски активными карбонильными соединениями.

Ацилирование аминов и производных гидразина проводили, используя карбоксиалкилполисахариды, их сложные эфиры, лактоны и азиды. Чистоту продуктов реакции контролировали методом ТСХ. УФ-спектры водных растворов Ы-ариламидов КАП и соответствующих ацетамидов совпадают, но отличаются от спектров самих аминов, полисахарид в этой области не поглощает.

Для определения условий реакций, позволяющих связывать с полисахаридом заданное количество биологически активных веществ, исследовали зависимость Сам и Сг от концентрации и соотношения реагентов, природы растворителя, времени и температуры реакции и др. В качестве модельных соединений в реакциях использовали амины и производные гидразина, которые отличаются строением молекул, нуклеофильностью, р^а, растворимостью в воде и другими физическими свойствами.

Карбоксиалкилполисахариды использовали для ацилирования и аминов, и гидразинов [Схема 1(4,9)]. Реакции проводили в диоксане, ДМСО и одноатомных спиртах.

Как оказалось, карбоксильные группы полисахаридов вступают в реакцию лишь при температуре £ 80°С (рис.1.10), что связано с образованием аммониевых солей при взаимодействии исходных веществ. Нагревание солей выше 80°С вызывает их частичный распад, и чем выше температура, тем больше образуется карбоксильных групп, способных реагировать с нуклео-филом. Скорость образования амидов, как и следовало ожидать, зависит от нуклеофильности амина и электрофилькости карбонильного углерода. Поэтому реакционная способность карбоксиметилполисахаридов выше (до 10 раз), чем карбоксиэтил, и их реакции с бензиламином идут в 1,4-3 раза быстрее, чем с ароматическими аминами (табл. 1.8; 1.9).

Таблица 1.8

Ацилирование аминов (ДМСО, 100°С) карбоксиметилдекстраном (Сш 0,84; 16 ч; 3 моль амина на моль карбоксильных групп) и его этиловым эфи-

ром (Скм 0,84; Сакм 0,4; 4 ч; 5 моль амина на моль сложноэфирных групп)

Амин рА"а амина Сам,%

КМД Этилового эфира КМД

СбН5СН2Ш2 9,37 74 98*

4-(С2Н5ООС)СбН4МН2 2,41 21 8

4-ВгС6Н4Ш2 3,90 29 21

СбН51ЧН2 4,60 45 40

4-СН,С6ШМН2 5,12 52 53

4-СН3ОС6Н4МН2 5,29 58 67

*При 75 °С, за 3 ч.

С помощью полисахаридкарбоновых кислот с полимерной матрицей были связаны такие биологически важные амины, как анестезин, п-аминобензойная кислота, л-этоксианилин и некоторые другие.

Таблица 1.9

Результаты взаимодействия карбоксиэтил- и карбоксиметалдекстраиов с беизиламином и анилином (100°С, 16 ч, 5 моль амина на моль карбоксиль-

ных групп)

Производные декстрана Амин С.м(%)

ДМСО Диоксан

Карбоксиэтил (Сю 1,00) Бензиламин 60 42

Карбоксиметил (СкмО,84) Бензиламина 74 62

Карбоксиэтил (Сю 0,66) Анилин 5 20

Карбоксимсткл (С™ 1,15) Анилин 57 63

а 3 моля амина на моль карбоксильных групп.

Алкиловые эфиры и лактоны карбоксиалкилполисахарвдов

ацилируют первичные и вторичные алифатические и ароматические амины в диоксане, ДМСО и воде при температурах ниже 80°С, и могут быть применимы для модификации полисахаридов биологически активными соединениями.

В органических средах сложные эфиры КМП с первичными алифатическими аминами уже при 15-20°С реагируют на 35 (диоксан, гетерогенно) -70% (ДМСО, гомогенно). Увеличение температуры, времени реакции, концентрации реагентов и избытка амина позволяет повысить Сам до 100%. При этом надо учитывать, что избыток амина более 5 моль на моль сложноэфир-ных групп не приводит к значительному повышению Сам эфира КАП и то, что в ДМСО при концентрации эфира выше 0,15 М, образуется гель.

Таблица 1.10

Ацилирование бензиламина сложными эфирами карбоксиметилдекст-рана в диоксане (20 моль амина на моль сложноэфирных групп полисахарида) и ДМСО (5 моль амина на моль сложноэфирных групп полисахарида; ус-

ловия и результаты указаны в скобках)

Сложный эфир КМД Температур а,°С Время, ч Сам, %

Этиловый 17 48(24) 35(72)

50 6 74(100)

100(75) 3 117(98)

Пропиловый 17 48 67

50 6 84

Лактон 17 48 27

50 6 31

Все синтезированные эфиры и лактоны КМП являются хорошими аци-лирующими агентами. В диоксане наиболее реакционноспособным оказался пропиловый эфир КМД, особенно при низких температурах. По-видимому, более гидрофобный радикал способствует лучшему набуханию полимера, что облегчает атаку реакционного центра нуклеофилом. Действительно, лактоны КМД слабо взаимодействовали с диоксаном и оказались малореакцион-носпособными. При повышении температуры до 100°С количество амидных групп в продуктах реакции начинает превышать количество сложноэфирных в исходном полимере (Сам >100%), что объясняется участием в реакции карбоксильных групп полисахарида (табл. 1.10).

В диоксане скорость ацшшрования анилина этиловым эфиром КМД больше зависит от температуры, чем в ДМСО (рис. 1.8). В ДМСО для аминов с рКь > 9 эта зависимость с повышением рКй уменьшается (рис. 1.9). Вероятно, прочность сольватной оболочки в растворах ДМСО увеличивается с повышением рА"а амина, что и отражается на скорости реакции. Этим же можно объяснить и разную ацилирутощую способность эфиров КМП в реакциях с алифатическими и ароматическими аминами в диоксане и ДМСО (табл. 1.11).

Рис. 1.8. Влияние температуры на степень амиди-рования Сам сложных эфиров КМД (С^ 0,75; С^ 0,43) в реакциях с анилином в диоксане (1) и ДМСО (2) (время реакции 6 ч).

и'С

Рис. 1.9. Зависимость С».« этилового эфира КМД от температуры I (°С) реакции с морфолином (1), метилбен-зиламином (2), пиперидином

(3) и Ы-бензилпиперазином

(4) в ДМСО (время реакции 6 ч для 1,2 и 1 ч для 3,4).

°С

Таблица 1.11

Результаты взаимодействия этиловых эфиров карбоксиэтил- и карбок-симетилдекстранов с бензиламином и анилином (6 ч, 5 моль амина на моль

сложноэфирных групп)

Производное декстрана Амин Температура, °С Сам, % в среде

ДМСО Диоксана

Этоксикарбонилэтил Бензиламин 75 46 44

(Сю 0,65; С»а 0,35)

Этоксикарбонилметил Бензиламин 50 100 74

(Сш 0,40; Са™ 0,57)

Этоксикарбонилэтил Анилин 100 17 43

( С„ 0,65; Саю 0,35)

Этоксикарбонилметил Анилин 90 58 91

(С1М 0,75; Сакм 0.43)

20 40 60 80 100

Как и ожидалось, скорость реакции сложных эфиров КАП с аминами зависит от электрофилыюсти углерода карбонильной группы эфира и приро-

ды амина. Реакционная способность эфиров карбоксиметилполисахаридов, из-за влияния атома кислорода в а-положении, в 5-10 раз выше, чем эфиров КЭП (табл. 1.11). Первичные алифатические амины реагируют в 10 и более раз быстрее ароматических. Введите элеюгронодонорных заместителей в бензольное кольцо анилина повышает на 10-20%, а электроноакцепторных -понижает до 4 раз Сам эфира, которая линейно зависит от ст-констант заместителей в бензольном кольце: Сам = 67,82 - 87,42а (г2=0,985, п=5) и Сам = 42,98 - 81,99а (/ =0,985, п=5) (в диоксане и ДМСО, соответственно). Ацили-рование вторичных алифатических аминов идет медленнее, чем первичных, из-за пространственных факторов (табл. 1.12, рис. 1.9). В реакциях эфиров КАП с ароматическими и вторичными циклическими алифатическими аминами прослеживается зависимость Сам от рамина.

Таблица 1.12

Ацилирование аминов этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана (5,3 моля амина на моль сложноэфирных трупп полисахарида)

Амин рКа амина С ЭМ) %

Вода,1ГС, 24ч ДМСС>,50°С,6ч

Бензил амин 9,37 100 (за 1 ч) 100

Метилбензиламин 9,58 22 44

Диэтиламин 10,93 5 14

Диаллиламин 9,29 - 12

3-фенилпирролидин 11,30 - 95

Пиперидин 11,22 12 77

М-Бензилпиперазин 9,80 23 71

Морфолин 8,36 9 35

Таблица 1.13

Ацилирование бегоиламина сложными эфирами карбоксиметил- и кар-

Сложный эфир карбок-сиалкилдекстрана С«эфираКМД% (1ч; 5,0±0,4 моля амина на моль сложноэфирных групп) См эфира КЭД,% (3 ч; 20 моль амина на моль сложноэфирных групп)

Метиловый 100 -

Этиловый 92 43

Пропиловый 79 50

Бутиловый 76 57

Пентиловый 73 69

Лактон 92 -

Эфиры КАП оказались очень удобными реагентами для ацшгарования растворимых в воде аминов. Реакцию в воде проводили при 15-20°С, чтобы свести до минимума возможный гидролиз исходных эфиров и образующихся амидов. За 1 ч этиловые эфиры КМД реагируют с пятикратным избытком амина на 100%. Как и у эфиров нгокомолекулярных кислот, увеличение числа углеродных атомов в алкильном радикале сложного эфира КМД затрудняет реакцию в воде. (табл. 1.13). Меньшая элеюрофильностъ карбонильного углерода эфиров КЭД приводит к тому, что в реакциях с аминами в воде их

Сам не превышает 45% даже через 24 ч. Удлинение алкильного радикала от 2х до 5 атомов углерода увеличивает Сам ДО 72%. Можно предположить, что увеличение длины радикала понижает гидрофильность и растворимость в воде полисахаридного образца, что приводит к снижению скорости щелочного гидролиза сложного эфира. Влияние щелочного гидролиза сложного эфира КАЛ на результаты реакции наблюдается и при ацилировании вторичных аминов. Появление второго радикала у атома азота замедляет основную реакцию, а высокая концентрация гидроксид-иона ускоряет гидролиз сложного эфира. В результате скорость щелочного гидролиза оказывается выше скорости основной реакции.

В диоксане и ДМСО способность сложных эфиров карбоксиметилпро-изводных декстрана, аубазидана и родэксмана ацилировать амины изменяется так же, как реакционная способность соответствующих полисахаридкар-боновых кислот в реакциях этерификации. Соотношение Сэ КМД, КМА, КМР 1:0,81:0,74, а Сам их этиловых эфиров 1:0,79-0,81:0,69-0,73, соответственно (табл. 1.4; 1.14). Это можно объяснить расположением карбоксиме-тильных радикалов в С2-0 и С6-0 положениях моносахаридного звена полимера, электроноакцепторные свойства которых отличаются. Действительно, карбоксиэтил -декстран и -аубазидан реагируют с этанолом примерно одинаково. Однако, родэксманкарбоновые кислоты и их эфиры всегда реагируют труднее, что связано, вероятно, со строением и конформацией макромолекулы полисахарида.

Таблица 1.14

Зависимость степени амидирования (в %) этиловых эфиров карбокси-

метилполисахаридов от природы полисахарида и амина

Полисахарид Скм Сш Бензиламин Анилин

Вода, 1ГС, 1ч ДМСО, 50°С, Зч 1,4-диоксан, 90"С, 6 ч

Декстран 046 0,50 100 86 91

Аубазидан 0,55 0,40 100 70 72

Родэксман 0,62 0,40 62 59 66

По разработанным методикам ацилирования аминов синтезированы потенциально биологически активные производные, в которых с полисаха-ридной матрицей связаны гентамицин, канамицин, 1 -адамантил-1 -этаиамин (ремантадин основание), 1-(л-нитрофенил)-2-амино-1,3-пропандиол, 2-ф-имидазолил)-1-этанамин, 2-(и-гидроксифенил)-1-этанамин, анестезин, новокаин, ПАСК, стрептоцид, норсульфазол, и-этокси-, я-гидроксианилин и др.

Ацилирование производных гидразина этиловым эфиром и лактоном карбоксиметилдекстрана изучали на примере реакции с фенилгидразином в воде и диметилсульфоксиде.

Оказалось, что эфиры КМД реагируют с фенилгидразином приблизительно так же, как с ароматическими аминами (табл. 1.15). При 70°С за 9 ч с фенилгидразином реагирует 75% сложноэфирных групп полисахарида, при этом требуется в три раза большее количество нуклеофила, чем при ацилиро-

вании алифатических аминов. Изменяя время реакции можно увеличить Сам до 100% и вводить в полимер заданное количество гидразина.

Таблица 1.15

Реакционная способность этиловых эфиров карбоксиметилдекстрана в реакциях с разными нуклеофилами (3 ч, 5 моль нуклеофила на моль сложно-

эфирных групп)

Нуклеофил Температур а,°С Са„ ИЛИ Ст,%

Бензиламин 50 86

Метил бензиламин 50 34

Фенилгидразин 50 4

Фенилгидразин 100 32

Анилин 100 27

Рис.1.10. Влияние температуры на степень амиди-рования КМД (Скм 0,96) (1) и его этилового эфира (Сакм 0,53; Скм 0,57) (2) в реакции с фенилгидразином (ДМСО, 3 ч, 8 моль нуклеофила на моль карбоксильных и 15 моль на моль сложноэфир-ных групп полимера).

Таблица 1.16

Результаты ацилирования замещенных гидразинов этиловым эфиров

■ 0,57, Са!

ЯвШ2ШЯ в воде" в ДМСО5

Самш Сашм Сам,%

Метил - - 0,33 62

Фенил 0,13 24 0,40 75

2,4-динитрофенил - - 0,14 26

3-фенилпропеноил 0,45 85 048 91

Беюоил 0,12 23 0,4 75

3-бромбензоил - - 0,18 34

4-мегоксибензоил 0,06 И 0,33 62

Пиколиноил 0 0 0,2 38

Никотиноил 0,12 23 0,21 40

Изоникотиноил 0,13 24 0,19 36

Урацил-4-карбоноил 0,17 32 0,52 98

" 17 - 20°С, 48 ч; 70°С, 9 ч; 15 моль гидразина на моль сложноэфирных групп полисахарида

КМД с производными гидразина взаимодействует лишь при температурах выше 80"С, но при дальнейшем увеличении температуры его реакционная способность возрастает быстрее, чем у сложных эфиров (рис.1.10).

Для разработки метода модификации полисахаридов замещенными гидразинами, исследовали влияние заместителей в молекуле гидразина на Сам. Для этого в условиях реакции эфиров КМД с фенилгидразином с полимерной матрицей связывали гидразины алифатического, ароматического и

гетероциклического рядов (табл. 1.16).

Как мы и ожидали, введение радикалов в молекулу гидразина сильно влияет на величину степени амидирования этилового эфира КМД. Она колеблется в широких пределах, и в сопряженных системах электроноакцеп-торный заместитель в молекуле гидразина уменьшает Сам-

Во всех случаях, как и в реакциях с ароматическими аминами, ацшга-рование производных гидразина эфирами КМД в ДМСО дает лучшие результаты, чем в воде, что объясняется, прежде всего, более быстрым щелочным гидролизом сложных эфиров в воде, и, в ряде случаев, низкой растворимостью производных гидразина. Последнее весьма существенно, так как эфиры КМД в воде также не растворяются.

Использование сложных эфиров полисахаридкарбоновых кислот позволяет модифицировать полисахариды гидразидом изоникотиновой кислоты и другими биологически активными гидразинами.

Азиды карбоксиалкилполнсахаридов при 0-20°С за 0,5-18 часов при пятикратном избытке первичного, вторичного алифатического или ароматического амина позволяют получать амиды соответствующих кислот со 100% выходом. При этом кислотно-основные взаимодействия аминов в реакционной среде в большинстве случаев определяют результат реакции. Оптимальной для ацилирования ароматических аминов является сильнокислая среда (рис. 1.11), а для алифатических - близкая к нейтральной (6-8) в случае азидов КМД и слабокислая в случае азидов КЭД. Несоблюдение этих условий может уменьшить Сач в 10 раз. Степень амидирования азидов КМД линейно зависит от рКа амина (табл. 1.17). Она может быть выражена уравнением: Сам = а ' рК, амина - Ь (л=5, ^=0,980), где а (19,23; 18,35;16,47) и Ь (0,02; 14,25; 20,43) - коэффициенты, значения которых зависят от рН среды, в которой проведено ацилирование аминов. В скобках приведены значения коэффициентов полученные при рН 2,4,6, соответственно.

Рис. 1.11. Зависимость степени амидирования Сам азидов КМД (2,3,5) и КЭД (1,4) от величины рН растворов в реакциях с бензилами-ном (1,2), И-

бензилпиперазином (5) и анилином (3,4).

Реакционная способность ацильного соединения зависит от электро-фильности углеродного атома карбонильной группы, поэтому реакция азидов КМП с аминами завершается за 30 мин, а азидов КЭП - за 1 18 ч. При прочих равных условиях, чем активнее азид, тем в большей степени концентрация нуклеофила и рН среды влияют на Сам, т.к. образование амидов сопровождается гидролизом азидов. В связи с этим кривые зависимости Сам от рН

среды в реакциях азидов КЭД с аминами более пологие, чем в реакциях азидов КМД (рис. 1.11). Взаимодействие азидов КАП с ароматическими аминами целесообразно проводить в кислой среде потому, что кислота увеличивает активность ацильной группы полисахарида, что очень важно при малой нук-леофильности ароматических аминов, и потому, что реакция при этом протекает в гомогенной среде. Кривые зависимости Сш от рН среды для ароматических аминов также имеют максимумы, но величина рНшах большинства из них менее 2.

Таблица 1.17

Результаты ацшгарования ароматических аминов азидами КМД (Скм=0,72, Сазкм=0,48) в водной среде (17-20°С; 30 мин.;5 моль амина на моль

Амин рк„ Сам(%) при рН среды

2 4 6 8 10

4-СН3ОС«Н4Ш2 5,29 100 84 67 44 -

4-СН,С6Н4МЬ 5,12 98 78 63 46 19

СбН5Ш1 4,60 92 73 60 46 18

4-Вг-С6ЩЧН1 3,90 74 54 38 22 -

Д-НООССбВДНг 2,41 46 31 21 11 1

В кислых средах азиды КМП легко гидролизуются, их концентрация быстро уменьшается, и ацилирование аминов прекращается, в щелочных -время реакции можно увеличивать до 24 ч. Азиды КЭП менее активны и более устойчивые к гидролизу, поэтому время реакции может достигать 24 ч и более независимо от кислотности среды. В некоторых случаях ацилирование аминов удобнее вести в органическом растворителе. Так Сш азидов КМД в реакциях с морфолином в диоксане и б водном растворе при рН 8 составляют через 1 ч - 61 и 19%, через 24 ч - 98 и 33%, соответственно.

Таблица 1.18

Степень амидирования азидов карбоксиметилполисахаридов в зависимости от природы полисахарида и амина (17-20°С; 30 мин.; 5 моль амина на

моль азидных групп полимера)

Азид карбоксимепшголисахарида Саэкм Амин С,м(%)

Декстрана 0,46 Бензиламин 100

Аубазвдана 0,12 100

Родэксмана 0,48 99

Декстрана 0,46 Анилин 95

Аубазвдана 0,12 92

Родэксмана 0,48 90

Как оказалось, в реакциях с низкомолекулярными алифатическими и ароматическими аминами степень амидирования азидов КМП практически не зависит от строения полисахарида (табл. 1.18).

Этим методом с полисакаридной матрицей были связаны гентамицин, канамицин, ГИНК и др. БАВ.

Ацилирование аиилгидразипов азидами КМП подчиняется тем же закономерностям, что и ацилирование аминов. Как и в случае аминов, для дости-

жения максимальной степени превращения азидных групп в целевой продукт, необходимо правильно выбрать рН среды. Так для гидразидов пири-динкарбоновых кислот оптимально рН 2, а для бензойных кислот 4-5 (рис. 1.12). При этом в одинаковых условиях электронодонорный заместитель в бензольном кольце гидразида кислоты увеличивает, а акцепторный - уменьшает Сам.

Рис.1.12. Влияние величины рН среды на степень превращения азидных групп КМД (СКм 0,6; Сазш 0,3) Сам в реакциях с гидразидами анисовой(1), изоникотиновой(2), бензойной (3) и и-нитробензойной кислот (17-20°СД ч, 5 моль гидразида на моль азидных групп).

Синтез конъюгатов полисахаридов с РНК-азой (ФПК) осуществляли для повышения стабильности и термостабильности фермента, а также для определения лучшего метода связывания его с полисахаридной матрицей.

Фермент ацилировали азидами и этиловыми эфирами КМП по разработанным нами методикам для алифатических аминов. Продукт реакции фракционировали либо методом гель-хроматографии, либо дробным осаждением спиртом. Ковалентное связывание фермента с полисахаридом доказывали гель-хроматографией на колонке с сефадексом й-ЮО.

Таблица 1.19

Результаты иммобилизации РНК-азы на аубазидане, декстране и род-

Производное полисахарида Сака И Сазкм % белка в ФПК % связывания фермента

Этиловый эфир КМА (ЭЭКМА) 0,14 12,2 28

Азид КМА (АзКМА) 0,12 7,4 16

Этиловый эфир КМД (ЭЭКМД) од 4,9"

Азид КМД (АзКМД) 0,1 6,7 296

Этиловый эфир КМР (ЭЭКМР) 0,48 25,2 67,4

Азид КМР (АзКМР) 0,46 26,1 70,7

Этиловый эфир КМД (ЭЭКМД) 0,3 26,3 71,4

Азид КМД (АзКМД) 0,3 32,6 96,7'

0,25 мг фермента на мг ЭЭКМД; 0,25 мг фермента на мг азида КМД, 24 ч,' 24 ч.

Положение максимумов поглощения водных растворов полученных образцов конъюгатов и исходного фермента в УФ спектрах совпадают (растворы КМП в этой области не поглощают).

Мы установили, что количество фермента в образцах ФПК повышается с увеличением концентрации реагирующих веществ, времени реакции до 48 ч., количества ацилирующих центров в КМП (Сакм и Сазкм) и достигает

максимума при рН 8. При этом трудно отдать предпочтение эфирам или азидам карбоксиметилпроизводных полисахаридов (табл. 1.19). Только в случае КМД видны преимущества азидов, которые позволяют быстрее и полнее связывать РНК-азу с полисахаридом. Эфиры и азиды КМА и КМР имеют приблизительно одинаковую реакционную способность и в целом несколько меньшую, чем производные КМД. Учитывая это и тот факт, что синтез эфи-ров КМП значительно менее трудоемок и длителен, чем азидов, можно рекомендовать ацилирование ферментов эфирами КМП как метод иммобилизации их на полимерной матрице.

Модификация полисахаридов карбонильными соединениями [Схема 1(7,10)] осуществлялась с использованием гидразидов карбокси-алкилполисахаридов. Нами исследована их реакционная способность в реакциях с ароматическими альдегидами.

Ацилгидразоны (АГ) альдегидов получали в кипящем этаноле либо водном спирте. В ПК спектрах всех синтезированных веществ обнаружены полосы валентных колебаний бензольных колец, отсутствующие в спектрах исходных полисахаридов. УФ спектры водных растворов полученных веществ и исходных альдегидов огличаются, а полисахарид в этой области не поглощает. Это позволило не только делать вывод о наличии в декстране ко-валентносвязанных альдегидов, но и наряду с результатами ТСХ, судить об отсутствии в образцах примесей исходных альдегидов.

Количественное определение арилиденовых групп в полисахариде осуществляли после гидролиза АГ в присутствии формальдегида. При этом было установлено, что электроноакцепторная группа в пара-положении ароматического кольца затрудняет, а электронодонорная облегчает гидролиз ацилгидразонов ароматических альдегидов (табл. 1.20.).

Таблица 1.20

Время полного гидролиза продуктов реакции гидразидов карбокси-этилдекстрана с ароматическими альдегидами (0,1 н раствор H2SO4,18 -

20°С, избыток формальдегида)

Ацилгидразоны альдегидов Время, ч

4-N02C6H4CH0 6

4-С1СбН4СНО 2,5

2-НОСбШСНО 2

4-(CH3)2NCsH4CHO 1,5

CsHJCHO 1

4-НОСбН4СНО 0,33

Это объясняется тем, что электроноакцепторный заместитель повышает реакционную способность альдегида и его конкурентную способность по отношению к формальдегиду, поэтому для полного вытеснения его из ацил-гидразона требуется более длительное время. Не вызывает сомнений и продолжительность гидролиза АГ я-(диметиламино)бензальдегида, т.к. в кислой среде идет протонирование аминогруппы с превращением ее в электроноакцепторный заместитель.

На основании приведенных в табл. 1.21 результатов можно сделать вывод, что выход целевого продукта увеличивается при замене электронодо-

норных заместителей в ароматическом кольце альдегидов электроноакцеп-торными, а также при использовании гидразидов КЭП. Гидразиды КМД труднее реагируют с альдегидами, чем гидразиды КЭД, т.к. более электро-фильный углерод карбоксильной группы уменьшает их нуклеофильность.

Таблица 1.21

Результаты реакций гидразидов натриевых солей карбоксютил- и кар-

боксиметилдекстрана с альдегидами

Альдегид Спг,% гидразидов

КМД КЭД

4-NO2C6H4CHO 55 100

4-С1СбН4СНО 31 90

С6Н5СНО 40 88

4-НОС6Н4СНО 32 52

4-(а1,)2мСбН4аю 27 42

г-носбшсно 40 100

Разработанные методики позволяют связать с полисахаридной матрицей такие биологически активные соединения, как доксициклин, стрептомицин и другие, содержащие карбонильные группы.

Таким образом, карбоксиметил- и карбоксиэтилпроизводные аубазида-на, декстрана, родэксмана, их сложные эфиры, лактоны и азиды могут быть использованы для ацшшрования биологически активных аминов и гидразинов. При этом карбоксиалкилполисахариды ащшируютБАВ при температурах выше 80°С, их алкиловые эфиры и лактоны - при 20 - 80°С, а азиды при 0 - 20°С. Реакционная способность полимерных ацилирующих агентов уменьшается в ряду: азиды, лактоны, алкиловые эфиры и сами поликислоты. Карбоксиметилполисахариды и их производные более сильные ацилирую-щие агенты, чем соответствующие производные карбоксиэтилполисахари-дов.

Эффективность связывания РНК-азы с полисахаридами эфирами и азидами КМП приблизительно одинакова. Однако, учитывая тот факт, что синтез эфиров КМП значительно менее трудоемок и длителен, чем азидов, можно рекомендовать ацилирование ферментов эфирами КМП как метод иммобилизации их на полимерной матрице.

Не требующие малодоступных или токсичных реагентов методики позволили получить околоЮО ранее не описанных в литературе моно- и диза-мещенных амидов и гидразидов КАП и полисахаридкарбоноилгидразонов низкомолекулярных альдегидов и кетонов.

"АЛЬДЕГИДНАЯ" СХЕМА МОДИФИКАЦИИ ПОЛИСАХАРИДОВ

(Снн\"-он)у -77^Р1С01\11-0Н)У Г-

КаОН

н?о

Ре ( ОСНгСОСЖа)*-,

КМП(Ыа) 2

С1СН2СООН, КяОН

П-КК(Ыа) 18

рь(0/,)ж(СН0)гк

Р (02)х(СН0)у.ы

(СН(ОН)Лг)к(СНАг2)1

где г=ви}1, СН2СООКа или Х^й, Лг, ЫПК(Лг). КН2,

ШСОШа, №КЗМНг, >ЩСОЕ(Аг) а др. Псгака фрагменты урацила, 2,4-дигидроксипири-мидина, барбитуровой кислоты, индола и др. гетероциклов.

Р4сн(1^(н)н1)цснне2)|

,Р4с!?4^с8Ь]И)(СОСШа))|1

ДКМ-ПА 22

1(СОСШ)1)к

ДКМ-ПС(Ыа) 23

ДКМ-П 25

ЭЭДКМ-П 26

К)

2.0."Альдегидная" схема модификации полисахаридов

Введение альдегидных групп в молекулу полисахарида делает полисахарид удобной матрицей для синтеза физиологически активных полимеров. Полиальдегиды (ПА) целлюлозы и декстрана применяют для химической модификации биологически активных аминов и производных гидразина, однако обоснованного подхода к выбору условий модификации до сих пор нет. Для создания «альдегидной» схемы модификации полисахаридов биологически активными соединениями необходимо было, прежде всего, изучить важнейшие закономерности реакций ряда полисахаридальдегидов с и С-нуклеофилами и определить оптимальные условия проведения этих реакций в зависимости от природы нуклеофила и строения полисахарида.

В работе использовали аубазидан, декстран, родэксман, ронасан (суль-фатированный родэксман) и карбоксиметилаубазидан. Образующиеся при их окислении ПА отличаются не только строением молекул, но и молекулярно-массовыми, физико-химическими свойствами и биологической активностью. Некоторые свойства ПА родэксмана исследованы И.Г. Смирновой (1994), реакционная способность ПА аубазидана и ронасана не изучалась.

Периодатное окисление полисахаридов является наиболее эффективным методом синтеза полисахаридальдегидов, т.к. позволяет получать целевой продукт с высоким выходом и регулируемым числом альдегидных групп. Полисахаридальдегиды [Схема 2(14)] и продукты их реакции с и С-нуклеофилами [Схема 2(15-22)] исследовали методами ИК- и УФ-спектроскопии, объемного, кондуктометрического и потенциометрического титрования, элементного анализа, ТСХ и др.. Число альдегидных групп определяли оксимным, йодным и разработанным нами спектрофотометриче-ским методами. Количество двойных связей в образцах определяли методом Кноппа. Исходные и модифицированные образцы ПА характеризовали степенью замещения - числом альдегидных групп или нуклеофила, приходящихся на моль фрагмента полимера (С,а или С3), а реакции ПА с нуклеофи-лами - степенью превращения альдегидных групп - % прореагировавших альдегидных групп (Сш).

2.1.Реакции полисахаридальдегидов с Ы-нуклеофилами

Для установления общих закономерностей модификации полисахаридов биологически активными аминами и производными гидразина, исследовали взаимодействие полиальдегидов с разными по нуклеофильности, рКй и физическим свойствам модельными соединениями (анилин, бензиламин, гидроксиламин, гидразин, №,К-диметилгидразин, изоникотиноилгидразин и некоторые другие). Реакции проводили, меняя условия для введения в молекулу полисахарида заданного количества нуклеофила. В ИК-спектрах полученных веществ [Схема 2(19)] были обнаружены полосы (1650-1670 см"1), а после их кислотного гидролиза в УФ-спектрах гидролизатов обнаружены характерные для исходных нуклеофилов максимумы поглощения, отсутствующие в спектрах ПА. Способность этих соединений реагировать с

декстранполиальдегидом (ДПА) близка, подобна их способности реагировать с низкомолекулярными альдегидами и симбатна их нуклеофильности. Количество нуклеофила в реакциях с ПА часто оказывает большее влияние на полноту превращения альдегидных групп в азометины и гидразоны, чем температура. Учитывая это и то, что многие БАВ (ферменты, антибиотики) при яагревании разрушаются, мы рекомендуем проводить такие реакции при 18-15аС, используя 3-4 кратный избыток нуклеофила. Так же как и в случае ииз-(омолекулярных альдегидов, оптимальная кислотность среды, линейно зави-;ит от рЛ"а нуклеофила. Так, например, в реакциях декстранполиальдегида с шилином, гидроксиламином, 14,}>!-диметилгидразином и бензиламином при Ю°С рН=0,83рА'а+2,29 (п=4, г2=0,998). Её использование позволяет опреде-1ять оптимальные величины рН реакционной среды для любого нуклеофила.

Реакционная способность других полиальдегидов с аминами в оптимальных для ДПА условиях сильно различается (табл.2.1) вследствие осо-Зенностей строения молекул полисахаридов и способности 2,3-окисленных фрагментов существовать в разных формах:

Схема 2.1. Некоторые из возможных таутомерных форм

2.3-окисленного периодатом моно-сахаридного фрагмента в полимере с

1.4-гликозидными связями.

Таблица 2.1

Степень превращения альдегидных групп (в %) в реакциях полиальдегидов с бензиламином при рН 10 и анилином при рН 5-7 (20°С, 2ч, 2-3 моль

амина на моль альдегидных групп)

Полиальдегиды Бензиламин Анилин

Декстрана 97 74

Аубазидана 76 16

Родэксмана 38 77

Ронасана 38 79

При периодатном окислении родэксмана и ронасана образуются в ос-овном 2,3-окисленные фрагменты в гидратированных или полуацетальных юрмах (схема 2.1,Ь,с). Циклические полуацетали устойчивы в щелочных редах, в которых к тому же часть альдегидных групп находится в енольной юрме. В связи с этим число свободных альдегидных групп, способных реа-яровать с нуклеофилами, у этих ПА зависит от рН среды. Этим, вероятно, бъясняется тот факт, что степень замещения продуктов реакции полиальде-4 до в родэксмана и ронасана с анилином в кислых средах в 2 раза выше, чем ри рН >7 с бензиламином. Для достижения таких же С3, как и в реакциях с яилином, избыток бензиламина увеличен в 2 раза. В полиальдегидах декст-ана и аубазидана преобладают 2,4-окисленные фрагменты, которые не обра-

.....N

сн2 >СН2ОН # сн2

-о \—о , К—о

Ь о-у/^н 4 )гон

Ъ а с

зуют устойчивых циклических полуацеталей, поэтому степени замещения продуктов реакции, как и ожидалось, зависят от нуклеофильности реагентов.

Реакционная способность полиальдегидов зависит и от их растворимости. Легкорастворимые в воде полиальдегиды родэксмана и ронасана реагируют с анилином на ~80% за 1 ч, а труднорастворимый ДПА - только за 2 ч. Полиальдегид аубазидана (АПА), который в растворах кислот даже набухает плохо, за это время реагирует лишь на 16%. Увеличение времени реакции и количества амина мало влияют на Сщ, АПА, но при 90°С прореагировало более 90% альдегидных групп. Сравнение реакционной способности аубази-данполиальдегида и его растворимого карбоксиметильного аналога показало, что последний реагирует лучше, чем АПА, но не всегда. Поэтому низкую реакционную способность АПА в кислых средах мы объясняем конформаци-онными особенностями его макромолекулы. Тем не менее, АПА образует ок-симы, гидразоны, семикарбазоны, тиосемикарбазоны и другие производные с С» а 60.

Аубазидашюлиальдегид и продукты его взаимодействия с нуклеофи-лами не растворяются ни в воде, ни в органических растворителях, что затрудняет изучение и применение этих веществ. С целью создания водорастворимых ФАП нами получены полиальдегиды карбоксиметилаубазидана. Введение альдегидных групп в карбоксиметилаубазидан снижает растворимость полимера. Для получения растворимых в воде ФАП пригодны лишь образцы карбоксиметилаубазиданполиальдегида (КМ-АПА) с содержанием 0,8 - 1,0 моль карбоксиметидьных и 0,6 - 1,0 моль альдегидных групп в расчете на моль моносахаридного звена.

На основании результатов проведенных исследований разработаны методики, позволившие связать с полиальдегидами такие лекарственные субстанции, как у-аминомасляная кислота, ПАСК, изониазид, канамицин, генга-мицин и некоторые другие.

Таким образом, ПА аубазидана, родэксмана, ронасана можно использовать в качестве матриц при создании ФАП, так же как и декстранполиальде-гид. Выбирая условия модификации необходимо учитывать рКа нуклеофила и особенности строения полиальдегида. Для получения растворимых в воде целевых продуктов необходимо использовать ПА, полученные из предварительно сульфатированных (ронасан) или карбоксиметилированных полисахаридов.

1.2. Модификация полисахаридальдегидов С-нуклеофилами

Реакции полисахаридальдегидов с С-нуклеофилами до сих пор не исследовались. В то же время известно, что ряд лекарственных веществ, реагируя с альдегидами, нередко сохраняют биологическую активность. Для определения возможности модификации полисахаридальдегидов С-нуклеофилами и исследований закономерностей этих процессов, нами изучены реакции ПА с одно- и многоатомными фенолами, полигидроксипирими-динами, индолом, малоновым эфиром и другими соединениями, которые различаются нуклеофильностью, физическими свойствами и широко исполь-

зуются в синтезе лекарственных веществ.

Реакции ПА с С-нуклеофилами проводили в воде или спирте. Для введения в полисахарид заданного количества нуклеофила, исследовали влияние условий реакции на С3.

Реакции полисахаридальдегидов с фенолами увеличивают растворимость полимеров в воде и уменьшают вязкость их растворов независимо от концентрации взятых в реакцию веществ. Это даёт основание предположить, что фенолы взаимодействуют с альдегидными группами только одной полимерной цепи. Расчет энергий образования моделей возможных продуктов реакции ПА с фенолом [Схема 2(20)] показал наименьшую вероятность взаимодействия фенолов с двумя альдегидными группами одного фрагмента ПА (схема 2.2, а).

Схема 2.2. Вероятные структуры продуктов реакции полисахаридальдегидов с фенолом, a bed

Элементный анализ и ЙК-спектросколия образцов ДПА-фенол, после восстановления непрореагировавших альдегидных групп и обработки гидро-ксиламином, позволили установить отсутствие хинонметидных структур (Ь) в полисахаридных образцах.

В ИК-спектрах продуктов реакции ДПА с фенолом (ДПА-Ф) обнаружены полосы поглощения при 695 и 770 см'1, относящиеся к колебаниям связей С-Н в 1,2-дизамещенном бензоле, поэтому мы предположили, что в использованных условиях протекает электрофильное замещение орто-атомов водорода фенола. При исследовании реакционной способности ДПА в реакциях с n-замещенными фенолами (CHj, Hlg, NO?, СООН), были получены соединения, в ИК-спектрах которых наблюдаются полосы поглощения 1,2,4-тризамещенного бензола (800-860 см"1).

В присутствии фенола альдегидные группы полисахарида не окисляются кислородом воздуха, и на один моль фенола расходуется в среднем 2 моль альдегидных групп. Можно предположить, что' указанные образцы имеют лактольные структуры (d), которые устойчивы в нейтральных и щелочных средах. Нельзя, однако, исключить и участие альдегидных групп ПА в реакциях конденсации.

ДПА реагирует с фенолами уже при 18-20°С. При этом степень замещения коррелирует с о-констаптами заместителей. Для «-замещенных фенолов (СН3, CI, N02, СООН, ОН) эта зависимость выражается уравнением: Спа = - 46,03оп ь 43,23 (п=6, г2 =998). Электроноакцепторный заместитель в кольце фенола уменьшает (до 4-5 раз), а электронодонорный увеличивает (до 1,5 раз) Сш. Увеличение соотношения реагентов более чем 1:3 мало влияет на С3.

-о—сн2 Л—О

но-нс он

Ту

Наибольшие степени замещения получены при нагревании в щелочных средах.

В одинаковых условиях с резорцином реагирует в 2 раза больше альдегидных групп ДПА, чем с фенолом. В отличие от фенола степень замещения в образцах продукта реакции ДПА с резорцином (ДПА-Р) при повышении температуры реакции выше 60°С в присутствии щелочи мало меняется, и конденсация, в основном, завершается через 1 час. Увеличение количества резорцина в реакции более чем 2 моль на моль альдегидных групп не приводит к повышению С3.

Полученные образцы ДПА-Р представляют собой коричневые порошки. При этом коэффициенты экстинкции £440 (Н-форма) и £50(1 (Ыа-форма) водных растворов образцов с приблизительно одинаковыми степениями замещения с увеличением температуры и времени реакции их синтеза повышаются, а е284уменьшается (рис. 2.1). В связи с тем, что хромофорные группы появляются и в продуктах реакции ДПА с резорцином, проведенной в атмосфере азота, их образование можно объяснить дегидратацией гидроксиал-кильных производных резорцина. Последние, полученные при 15-20°С, оказались настолько неустойчивыми, что при выделении из раствора отщепляли воду и окрашивались. Это свидетельствует о наличии в полисахаридных образцах нескольких структур, в том числе, и хинонметидных, т.к. сам резорцин в видимой области не поглощает. После восстановления не вступивших в реакцию альдегидных групп образцы ДПА-Р образуют с гидроксиламином оксимы, которые были идентифицированы методами ИК-спектроскошш и элементного анализа.

Рис.2.1. Изменение экстинкции образцов дек-странрезорцината натрия (С„а « 100%) при 500 (1) и 284 (2) нм от времени реакции (60°С, 2 моль резорцина на моль ДПА).

Для получения образцов ДПА-Р с наиболее стабильной структурой вводимого фрагмента, реакционную массу нагревали до установления постоянных значений оптической плотности при 500 пм (рис.2.2). Оказалось, что не все введенные в полимер структуры могут отщеплять воду (Схема 2.3, 1-3). При примерно одинаковых степенях замещения в образцах ДПА-Р максимальное количество хромофорных групп образуется при использовании в реакции эквимолыюго соотношения реагентов. Повышение избытка резорцина приводит к увеличению числа диарилме-тильных фрагментов (3), которые хинонметидные структуры не образуют.

Рис.2.2. Зависимость оптической плотности реакционной массы, разбавленной в 500 раз, декстранпо-лиальдегида с резорцином от времени при 60°С и соотношении реагентов 1:1 (1), 1:3 (2), 1:0,5(3), 1:5(4).

Схема 2.3. Некоторые продукты реакции полиса-харидальдегидов с резорцином.

1 2 3

Из изученных полиальдегидов с фенолом и резорцином наиболее легко реагирует ДПА (табл.2.2). Устойчивые лактольные формы полиальдегидов родэксмана и ронасана, конформационные особенности макромолекулы АЛА затрудняют основную реакцию, что способствует щелочной деструкции альдегидных групп. Это, вероятно, и определяет меньшие степени замещения в полученных продуктах.

Таблица 2.2

Степень превращения альдегидных групп (в %) в реакциях полисаха-

ридальдегидов с некоторыми С-нуклеофилами

Полиальдегид Фенол (90°С,4ч,1:3) Резорцин (60°С,2ч,1:2) Барбитуровая кислота (90 °С, 3 ч, 1:3) Малоновый эфир (20°С, 7ч, 1:5)

Декстрана 74 104 133 55

Аубазидана 58 55 79 44

Родэксмана 65 85 151 56

Ронасана 64 76 132 59

Аналогично резорцину с ПА реагируют и другие многоатомные фенолы (гидрохинон, пирогаллол, флороглюцин).

Реакции полисахаридапьдегидов с гидроксипроизводными пиримидина проводили, так же как и с одноатомными фенолами при 90°С, соотношении реагентов 1:3, в течение 4 часов, но при рН 7. В этих условиях урацил, 4,6-дигидроксипиримидин, барбитуровая и тиобарбитуровая кислоты реагируют с ДПА приблизительно одинаково (Спа=105-И1%). 1-Фенил-2-фениламино-4-гидрокси-б-оксопиримидин (мафедин) менее активен (Спа=85%). Содержание гетероциклических фрагментов в полисахаридных образцах зависит от температуры реакции, рН раствора и почти не зависит от соотношения реагентов при избытке гетероцикла более чем 2-3 моль на моль альдегидных групп полимера. За исключением АПА, который в отличие от

х.ч

других полиальдегидов в воде не растворяется, все остальные взаимодействуют с гидроксипиримидинами приблизительно одинаково (табл. 2.2).

ИК- и УФ-спектры полученных веществ [Схема 2(21)] отличаются от спектров исходных полиальдегидов наличием полос и максимумов поглощения, введенных в полимер гетероциклических фрагментов. Электронные спектры продуктов реакции ДПА с дигидроксипиримидинами совпадают со спектрами исходных гетероциклов. Учитывая то, что урацил в этих условиях на 90% реагирует с формальдегидом с образованием 5-гидроксиметилурацила, можно считать, что и с ПА гидроксипиримидины образуют гидроксиалкилпроизводные.

С барбитуровыми кислотами ПА реагируют так же, как с резорцином. Строение вводимых в полимер фрагментов зависит от условий реакции. При 15-20°С образуются вещества, не поглощающие в видимой области спектра. При повышении температуры до 40-50°С в спектрах продуктов реакции появляется максимум при 510 нм, а при температурах более 50°С - при 430 и 480 нм (рис. 2.3). Учитывая это, синтез образцов декстранбарбитуровой кислоты (ДБК) . осуществляли до полного завершения образования наиболее стабильных структур (рис.2.4). Оказалось, что зависимость оптической плотности водных растворов образцов ДБК при 430 нм от количества взятой в реакцию барбитуровой кислоты такая же, как в образцах ДПА-Р. В связи с этим мы предположили, что при взаимодействии барбитуровой кислоты с ПА на одном из этапов реакции образуется её алкили-деновое производное, которое затем превращается в бис-производное. Для доказательства нашего предположения сравнили результаты бро-матометрии с интенсивностью пиков поглощения при 430 нм. Оказалось, что зависимость линейна: Б4зо=24798с + 0,0003 (п=8,1^=0,999), где с - число моль вещества в 50 мл раствора, Б - оптическая плотность.

X,, им

Рис.2.3. Электронные спектры продуктов реакции декстранполиальдегида (Сш 1,2) с барбитуровой кислотой, проведенной при 20°С 4 ч (1), 90°С 1 ч (2), 2 ч (3) и 4 ч (4) (рН 6-7; 0,5-1 моль барбитуровой кислоты на моль альдегидных групп; С3 полученных образцов ДБК - 0,3-0,6).

Максимум на рис.2.4(4) можно объяснить сначала быстрым накоплением в реакционной массе алкилиденбарбитуровой кислоты, а затем превращением её в продукты реакции альдегидной группы с двумя молями кислоты (формулы аналогичны представленным на схеме 2.3).

Рис.2.4. Зависимость оптической плотности (^таХ430 нм) реакционной массы (разбавленной в 500 раз) от времени взаимодействия декстранполиальде-гида с барбитуровой кислотой. Количество барбитуровой кислоты 0,5 (1), 1 (2), 3 (3) и 5 (4) молей на моль альдегидных групп (рН 6; 90°С; Сза ДПА 0,8 -1,2).

Реакции декстранполиальдегида с индолом и метилиндолом проводили в тех же условиях, что и с производными пиримидина. ИК- и УФ-спектры продуктов реакции [Схема 2(21)] содержат полосы и максимумы поглощения, характерные для индолов.

Индол и метилиндол реагируют с ДПА (Спа=25-27%) значительно труднее урацила. При взаимодействии ДПА с более нуклеофильным метилиндолом в спирте степень замещения почти в 2 раза больше, чем с индолом. В воде это различие не наблюдается из-за плохой растворимости метилиндола.

Исследование реакции полисахаридальдегидов с малоновым эфиром осуществляли с целью создания полимерной матрицы, позволяющей фиксировать биологически активные соединения на полисахариде за счет азомети-новых, амидных, гидразидных, эфирных и ионных связей.

Реакцию проводили в ДМСО при 20°С. Условия конденсации определяли на примере реакции ДПА с малоновым эфиром. В ИК-спектрах полученных веществ [Схема 2(22)] наблюдаются полосы поглощения, характерные для карбоксилат-иона, альдегидной и сложноэфирной групп. Наличие двойных связей доказывали броматометрией. Как и в других реакциях с С-нуклеофилами конденсация АПА с малоновым эфиром идет наиболее трудно. Однако в среде ДМСО растворимость и Сга АПА в наименьшей степени отличается от соответствующих характеристик других ПА (табл. 2.2). Полученные результаты позволили разработать метод получения дикарбоксиме-тиленполисахаридов и продуктов их восстановления полисахаридмалоновых кислот. Этерификация кислот этиловым спиртом в условиях автокатализа идет также как и карбоксиметилполисахаридов. Синтезированные эфиры использовали для модификации полисахаридов аминами.

Таким образом, полисахаридальдегиды реагируют не только с но и с С-нуклеофилами подобно низкомолекулярным альдегидам с образованием гидроксиалкил-, алкилиденовых и других производных этих соединений. Реакционная способность ПА и с И- и с С-нуклеофилами определяется их растворимостью, способностью образовывать стабильные внутримолекулярные

Т,ч

лакюльные структуры и заметно зависит от pH среды и нуклеофильности реагентов. Эта, ранее неизвестная в ряду полисахаридов реакция, может служить удобным методом модификации полисахаридов такими биологически важными соединениями, как одно- и многоатомные фенолы, гидроксипири-мидины, индолыгае соединения, малоновый эфир. Определение условий введения в полисахарид заданных количеств этих веществ позволило синтезировать более 30 ранее неописанных, потенциально биологически активных соединений

3.0. Биологическая активность полученных соединений

Предложенные «альдегидная» и «карбоксиалкильная» схемы и разработанные нами методики позволили получить новые биологически активные соединения, а также связать с полисахаридной матрицей ряд известных лекарственных субстанций. Биологическая активность полученных веществ изучена на кафедрах фармакологии, биотехнологии и микробиологии СПХФА, кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМУ им. Павлова, в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН и областной санитарно-эпидемиологической станции .

3.1. Полисахаридные производные известных лекарственных веществ сохранили биологическое действие, а в ряде случаев их активность и стабильность стала выше, а токсичность ниже исходных лекарственных препаратов.

Антимикробное действие конъюгатов антибиотиков с полисахаридами и исходных препаратов в опытах in vitro определяли методом диффузии в агар и двукратных серийных разведений. Антимикробную активность препаратов оценивали по спектру действия и установили что, как и исходные антибиотики, полисахаридные производные канамицина и генга-мицина не проявляли активности в отношении дрожжевых микроорганизмов. Активность соли канамицина с КМД против Е. coli практически не изменилась, а в отношении Вас. subtilis и St. aureus, повысилась в 1,8 раза по сравнению с сульфатом канамицина.

Оказалось, что активность канамицин-полисахаридных соединений зависит от условий ацилирования основания аминогликозида (табл.3.1). Можно предположить, что при pH реакционной массы 7-8 с полисахаридом в наименьшей степени взаимодействуют аминогруппы, отвечающие за антимикробную активность. При этом антимикробная активность полученных веществ сохраняется или даже возрастает по сравнению с исходным канамицина сульфатом и не зависит от типа поликислоты (КМД или КЭД). Соединения, полученные ацилированием основания гентамицина эфирами и азидами карбоксиметилдекстрана при pH 8, также обладали высокой антибактериальной активностью, сравнимой с активностью исходного антибиотика, а в ряде случаев она превышала контроль в 1,4 -1,6 раза (табл.3.2).

Повышенной антимикробной активностью по сравнению с исходным антибиотиком обладают и антибиотик-фермент-полисахаридные конъюгаты (табл.3.3). Их получали добавлением к раствору антибиотик-

полисахаридного соединения, в котором антибиотик ковалентно связан с полимерной матрицей, рассчитанного количества РНК-азы (РНК-аза-гентамицин-КМД и РНК-аза-канамицин-КМД), либо наоборот, уже к раствору фермент-полисахаридного соединения, в котором РНК-аза ковалентносвя-зана с полимерной матрицей, добавляли антибиотик (канамицин-РНК-аза-КМД). При этом тип используемого полисахаридного ацилирующего агента практически не влияет на биологическую активность полученных соединений.

Таблица 3.1

Влияние величины рН среды при ацилировании канамицина азидами и этиловыми эфирами карбоксизтилдекстрана на антимикробную активность

полученных веществ

Образец Содержание антибиотика, % Величина pH Антимикробная активность, определенная методом диффузии в агар, в % к контролю6

Вас. Subtilis Ps.aeruginosa

1" 24 4 90 86

Т 30.3 6 99 95

3" 28,7 7 115 100

4' 25,9 10 80 75

5Э 12,9 6 105 100

6Э 22,4 7-8 110 105

7' 24,2 8 130 118

Примечание. Образцы получены ацилированием канамицина-основания азидом (э) и этиловым эфиром О КЭД (вода, 17-20°С, 2',7Э суток);6 - в качестве контроля использовали канамицина моносульфат.

Таблица 3.2

Антимикробная активность некоторых аминогликозидов, ковалентнос-вязанных с карбоксиметилдекстраном, определенная методом диффузии в

ara р

Препарат Содержание антибиотика в % Вид бактерий Антимикробная активность, в % к контролю®

Натриевая соль "гентамицино" карбонилметил КМД* 16 Вас. Mycoides Вас. Subtilis Ps. Aeruginosa 150 160 140

Натриевая соль "гентамицино" карбонилметил КМД6 27 Вас. Mycoides Вас. subtilis Ps. aeruginosa 110 135 105

Натриевая соль канамицино "карбонилметил-КМД* 16,5 Вас. subtilis Ps. aeruginosa 122 115

то же 6 34 Вас. subtilis 115

Примечание: вещества синтезированы с использованием азида С) и этилового эфира (б ) КМД при рН раствора 8; д - в качестве контроля использовали канамицина моносульфат и гентамнцина сульфат.

Связанные с полисахаридной матрицей доксициклин и стрептомицин, как и в случае аминогликозидов сохраняют антимикробную активность на уровне исходных антибиотиков, а в некоторых случаях превосходят их активность в 2 раза.

Таблица 3.3

Антимикробная активность антибиотик-фермент-полисахаридных конъюга-

тов

Соединение Содержание ан- Содержание Вид бактерий Активность в %

тибиотика, % белка,% к контролю"

РНКаза-гентамицино- 16,5 9 Вас. subtilis 195

КМД" Ps. aeruginosa 162

тоже6 3 66 Вас. subtilis 200

Ps. aeruginosa 130

РНКаза-канамицино- 18,9 6 Вас. subtilis 145

КМДа Ps. aeruginosa 143

б " тоже 24,7 8 Вас. subtilis 130

Ps. aeruginosa 132

Канамицин-РНКазо- 20 32,6 Вас. subtilis 176

КМДа Ps. aeruginosa 160

ь то же 20 26,3 Вас. subtilis 185

Ps. aeruginosa 155

Примечание: вещества синтезированы с использованием азида (*) и этилового эфира (®) КМД при рН раствора 8, 11 - в качестве контроля использовали канамицина моносульфат и гентамицина сульфат.

Таблица 3.4

Изменение активности РНК-зы и фермент-полисахаридных конъюгатов во времени при 17 - 20°С ( в % от активности исходного ферментного препарата ). Сю,, КМД 0,93; этиловых эфиров и азидов карбоксиметил полисахари-

дов 0,6 - 0,65

Производное полисахарида, Сазкы Активность ферментных препаратов

использованное для модификации или (в %) через

фермента Сака 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч

(Нативный фермент) - 15 12,5 10 10 10

КМД* - 15 53 91 92 90

Азид КМД6 0,3 98 94 96 96 93

0,23 99 98 94 90 84

0,1 96 94 92 90 84

Азид КМД 0,3 94 89 84 46 36

0,23 88 88 72 56 50

0,1 97 94 92 71 69

Этиловый эфир КМД 0,3 94 89 84 46 36

0,21 86 83 75 55 52

0,1 92 92 73 70 60

АзидКМР 0,46 - 92 70 46 43

Этиловый эфир КМР 0,48 - 92 75 50 44

Азид ЮЛА 0,12 98 94 74 64 58

Этиловый эфир КМА 0,14 84 80 73 60 52

* Комплекс РНК-азы с карбоксимегтилдекстраном (Сю< 1,2). Фермент-полисахаридные конъюгаты содержат ионосвязанный фермент.

Исследование активности РНК-аза-полисахаридных конъюгатов и нативного фермента проводили спектрофотометрическим методом, основанным на измерении оптической плотности при 260 нм водных растворов веществ, освобождаемых рибонуклеазой при гидролизе РНК.

Полученные фермент-полисахаридные конъюгаты более стабильны, [ нативный фермент (табл.3.4) при хранении их водных растворов. Причем ¡более ценными оказались вещества, содержащие как ковалентно- так и юсвязанный фермент, что становится понятным, если учесть, как меняется ивность у препарата с ковалентносвязанным ферментом и у смеси РНК: с КМП. Активность конъюгатов не зависит от полисахарида, типа и со-жания ацилирующего агента в КМП, используемого при модификации >мента. У всех ковалентносвязанных ферментных конъюгатов активность времени также меняется приблизительно одинаково. Однако чем меньше ивных центров было в КМП, взятого в реакцию, тем выше активность ученных веществ и тем дольше она сохраняется. Это объясняется, веро-о, тем, что увеличение числа реакционных центров в полисахариде увели-ает количество связей между ним и ферментом, что затрудняет доступ страта к активному центру фермента.

Особый интерес представляет термостабильность синтезированных [ъюгатов. Для её определения сравнивши* активность синтезированных хеств и нативного фермента после выдержки их при 100°С в течение 30, я 90 мин.

Таблица 3.5

Термостабильности РНК-аза - полисахаридных конъюгатов при 100°С

Соединение Сим или Активность препарата (%) через

Саш 30 мин. 60 мин. 90 мин.

Нативный фермент - 96 20 0

РНК-аза-КМД' 0,1 85 60 50

0,23 100 70 64

0,3 96 76 70

РНК-аза-КМД6 0,1 85 61 44

0,23 81 78 68

0,3 81 74 76

РНК-аза-КМР" 0,46 96 84 82

РНК-аза-КМЛ* 0,12 92 67 54

Примечание: вещества синтезированы с использованием азида (*) и этилового эфи-5) КМП при рН 8.

Ковалентносвязанный фермент значительно более устойчив к нагрева-о, чем нативный (табл. 3.5). Термостабильность полученных веществ за-ит от величины С^ш или Сака взятого для модификации фермента прошлого полисахарида: чем она больше, тем стабильнее ферментный конъю-

Гидролитическая активность водных растворов полученных фермент-ибиотик-полисахаридных конъюгатов (табл.3.6.), в которых антибиотик ¡алентносвязан с полисахаридом, а РНК-аза за счет ионных и водородных зей, и соединений, в которых, наоборот, фермент ковалентносвязан с по-;ахаридом, а антибиотик - ионно, резко увеличивается по сравнению с ис-(ной РНК-азой и сохраняется в течение двух месяцев без значительных :ерь. При этом она не зависит от используемого антибиотика и типа связи

его и фермента с полисахаридной матрицей.

Таблица 3.6

Гидролитическая активность антибиотик-фермент-полисахаридных

конъюгатов

Количество Активность соединения (У ¡>) через

Соединение Антибио- Фермен- 1с 5с 30с 60с

тика, % та, %

РНК-аза-гентамицино-КМДа 16,5 9 179 178 179 137

То же® 3 66 125 128 128 112

РНК-аза-канаммцино-КМД' 18,9 6 183 184 182 154

Тоже6 * 24,7 8 179 180 175 158

Канамицин-РШС-аза-КМД" 20 32,6 154 153 153 -

Тоже6 20 26,3 168 168 152 -

РНК-аза 0 100 15 10 0 0

Примечание: вещества синтезированы с использованием азида (а) и этилового эфира С) КМД при рН 8.

Полисахаридные производные ремантадина проявляют 2,5 +10 и более раз меньшую цитотоксичность для клеток МДСК, чем ремантадин. Установлено, что декстран не подавляет репродукцию вируса, натриевая соль КМД подавляет ее в незначительной степени. Препараты с ковалентносвя-занным 1 -адамантил-1 -этанамином ингибирует репродукцию вируса в клетках на 60-70%, а с ионосвязанным - почти такую же, как сам ремантадин 2:78%.

Полисахаридные производные гидразида изоникогиновой КИСЛОТЫ (ГИНК) независимо от способа связывания проявили подавляющую способность против Mycobacterium tuberculosis (30 - 95%).

Как мы и ожидали, в опытах in vitro сульфаниламидные препараты (стрептоцид, норсульфазол, сульфадимезин), ацилированные азидами КЭД по аминогруппе в бензольном кольце, антибактериальную активность не проявляют.

3.2. Исследование биологической активности других поли-сахаридных производных показало, что большинство изученных соединений обладают разными видами активности. 16 из них проявляют антиги-поксический эффект. а натриевая соль 1Т-2-(и-гидроксифенил)-этиламида КМД проявляет выраженный антигилоксический эффект: увеличивает выживаемость животных на 60% и продолжительность жизни на 756%, превосходящий эффект гугамина.

Амиды КМД, полученных ацшшрованием бензил амина, 2(п-гидроксифенил)-1-этанамина, N-бензгидрилшшеразина, потенцшруют снотворный эффект гексенала (увеличение продолжительности сна в 2-10 раз), что доказывает наличие у них депримирующего действия на ЦНС. При внут-рибрюшинном введении Ы-2(и-гидроксифенил)-этиламид КМД оказывал влияние на животных, сравнимое с действием транквилизаторов дневного типа.

Амид, гидразид и аминоэтил КЭД, подавляют рост Mycobacterium tuberculosis и проявляют аитихламидийную активность на 40-50%. Против

хламидий действуют и продукты реакции ДПА с барбитуровой кислотой и урацилом (до 40%).

Все продукты реакции декстранполиальдегида с резорцином, 2,4-дигидроксипиримидином, мафедином, а также амид и гидразид КЭД подавляют размножение вируса простого герпеса на 20-40%.

Продукты взаимодействия гидразида КЭД с о- и п-гидроксибензальдегидом и N-(n-Kap6orai- и п-тидроксифенил) амиды КМД обладают интерферонилдуцируюшей активностью на уровне неовира. При уменьшении концентрации активность некоторых полисахаридпых препаратов в 6,7 раз превышает активность Poly U /Poly С и в 20 раз активность цик-лоферона. Цитотоксическое действие и острая токсичность полисахаридных препаратов не обнаружены.

Таким образом, химическая модификация декстрана, аубазидана, род-эксмана антибиотиками, 1-адамантам-1-этанамином и РНК-азой получены соединения, которые не только сохранили, а в некоторых случаях и повысили активность исходных веществ до 200%, но и, как показано на примере ферментных соединений, проявили большую стабильность и длительность действия, а в случае 1-адамантял-1-этанамина меньшую токсичность. Синтезированы оригинальные соединения, проявляющие антимикробную, противовирусную, интерферониндуцирующую активность, антигипоксические и психотропные свойства при низкой токсичности.

4.0. Разработка методов стандартизации, установления качества и количественных определений биологически активных производных полисахаридов

Традиционные методы анализа низкомолекулярных органических соединений не всегда применимы для количественных исследований полимеров. В связи с этим возникла необходимость в совершенствовании существующих и разработке новых методов анализа синтезированных веществ. Наиболее удачным оказалось применение гидроксамовой реакции для анализа эфиров, амидов, гидразидов, азидов карбоксиалкилполисахаридов и водорастворимых полисахаридальдегидов по схеме:

/"NaNObH* /Р

Ps—С -* PsC

nh-nh2

Ps—С

/

где Z=RO-,NIl2- Z

nh2oh

-hn3" -hz

-Fe

V

Ps-C

У/

о

с 43

Fe .

Vh-ohh

-h20

H

A

, +2 Fe

I-O

Эта реакция легла в основу спектрофотометрических методик анализа синтезированных веществ. При этом интенсивность и максимум поглощения (470-500 нм) окрашенных комплексов гидроксамовых кислот с железом

практически одинаковы для всех полисахаридов, но зависят от электрофиль-ности атома углерода группы С=0. По результатам метрологической оценки разработанных методик анализа производных полисахаридов по ГФ XI относительная погрешность определений не превысила 3%.

Результаты количественных определений сложноэфирных, амидных, гидразидных, азидных и альдегидных групп в полисахаридных образцах по разработанным нами методикам были подтверждены элементным анализом, иодометрическим, УФ спектрометрическим и другими известными методами анализа органических соединений. Различие результатов анализа полисахаридных образцов разными методами < 3+5%.

4.1. Анализ сложных эфиров карбоксиалкилполисахаридов. Оптимальные условия превращения эфиров разных КАП в соответствующие гид-роксамовые кислоты и окрашенные комплексы близки (15-20°С, 10-20 мин., объемное соотношение щелочного раствора гидроксиламина, раствора HCl и FeCb 0,4-0,8 : 1 : 1). Х^нагаг окрашенного в красно-коричневый цвет раствора 470-500 нм. При построении калибровочных графиков использовали этиловый эфир метоксиуксусной кислоты или эфир КАП с известной степенью замещения.

4.2. Анализ амидов карбоксиалкилполисахаридов. Скорость превращения амидов полисахаридкарбоновых кислот в гидроксамовые кислоты зависит от строения ацильного радикала. Поэтому для определения условий анализа АКЭП и построения калибровочного графика использовали образцы амидов карбоксготилдекстрана, для которых число амидных групп вычислено по данным элементного анализа. Оптимальные условия превращения АКЭД в гидроксамовые кислоты: 90°С, 1 ч, объемное соотношение 2н раствора NH2OHHCl, 4н NaOH и 2н К2С03 2 :1,2 : 0,8.

4.3. Анализ гидразидов и азидов карбоксиалкилполисахаридов. Электронные спектры и оптическая плотность окрашенных комплексов гидрокса-мовых кислот с Fe(HI), полученных из эквивалентных количеств гидразида и этилового эфира одной и той же кислоты, одинаковы. При этом условия получения азидов и гидроксамовых кислот зависят от строения поликислоты. Так, если на образование азидов КМП и превращение их в гидроксамовые кислоты требуется 10-15 мин (0°С) и 15 мин (15-20 °С), соответственно, то в случае гидразида КЭП - 90-120 мин при 0 °С и 15 мин при 40°С.

4.4. Спектрофотометрический метод анализа водорастворимых полисахаридальдегидов. Выделение оксимов водорастворимых полиальдегидов из реакционной массы является трудоемкой операцией, поэтому разработанная нами методика предполагает их синтез в процессе анализа. Установлено, что при 15-20°С синтез оксимов завершается за 20 мин, а при 60°С за 5 мин, что в условиях проведения анализа Fe(III) не окисляет ПА, но реагирует с его оксимом и гидроксиламином, причем на один моль оксима расходуется 2 эквивалента окислителя. Реакция окисления и образования комплексов продолжается в течение 2 ч при 20°С и 0,5 ч при 40°С. Мольное соотношение гидроксамовая кислота : железо (III) в окрашенных комплексах равно 1,0:1,2.

Полиальдегиды декстрана, родэксмана, ронасана и аубазидана в условиях проведения анализа образуют окрашенные соединения, устойчивые при 15-40°С. Однако электронные спектры водных растворов их окрашенных комплексов имеют разные максимумы поглощения и для каждого ПА необходимо строить свой калибровочный график.

4.5. Спектрофотометрический метод анализа гидразидов КМП с использованием п-нитробензальдегида. Метод основан на количественном взаимодействии гидразидов кислот, в том числе и гидразидов КМП, с п-нитробензальдегидом и способности образовавшихся ацилгидразонов в присутствии щелочи образовывать окрашенные растворы. Для построения калибровочного графика использовали растворы гидразида метоксиуксусной кислоты.

Таким образом, разработанные нами спектрофотометрические методы качественного и количественного анализа производных карбоксиалкилполи-сахаридов и полиальдегидов просты, удобны, позволяют уменьшить количества анализируемых веществ до 10 и более раз и резко сократить время и трудоемкость анализа (например, в случае полиальдегидов с 2-3 суток до 3 ч). Для сложных эфиров КАП другого столь доступного метода анализа просто не существует. Результаты анализа хорошо воспроизводятся, относительная погрешность определения степени замещения по сравнению с другими известными, в том числе фармакопейными методами, не превышает 3-5%.

4.6. Молекулярно ■ массовое распределение полисахарида оказывает существенное влияние на его физические, химические свойства и биологическую активность. Поэтому методом гель-хроматографии нами осуществлен контроль степени деструкции гомогенной фракции полисахарида, полученной фракционированием товарного декстрана этанолом, при введении в его молекулу карбоксильных, сложноэфирных и амидных групп.

Как и предполагалось, деструкция полимера обнаружена только в случае синтеза сложных эфиров КМД в присутствии минеральной кислоты, при замене в синтезе эфиров сухого порошка КМД его водным сиропом, а также при синтезе пентилового эфира КМД, что можно объяснить сравнительно жесткой температурной обработкой образца (138°С). Во всех остальных случаях заметной деструкции полисахарида при его модификации не обнаружено.

Заметной деполимеризации полисахаридной цепи не наблюдается и в случае синтеза КЭП. Образцы АКЭД и КЭД имеют практически идентичное молекулярно-массовое распределение с исходной фракцией декстрана.

Таким образом, предлагаемые нами методы химической модификации полисахаридов в большинстве своем не приводят к деструкции полимерной цепи.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработаны перспективные алгоритмы конструирования физиологически активных полимеров путем химической модификации полисахаридов с целью создания новых и совершенствования уже известных лекарственных веществ.

2. Предложена новая оригинальная схема создания физиологически активных полимеров, включающая синтез амидов карбоксиэтилполисахаридов алкилированием полисахаридов акриламидом, превращение их в соответствующие кислоты, эфиры, гидразиды, азиды и аминоэтилполисахариды и последующее использованием ацилирующей способности эфиров и азидов, реакций гидразидов и аминов с карбонильными соединениями, ацилирующими и алкилирующими агентами.

3. Впервые разработаны научные основы химической модификации полисахаридов эффективными БАВ - производными пиримидина, индола, малонового эфира и соединениями фенольной природы в результате исследования неизвестной для класса полисахаридов реакции полисахаридальде-тидов с С-нуклеофилами.

4. Установлено, что полисахаридкарбоновые кислоты при нагревании со спиртами либо без них в условиях автокатализа образуют сложные эфиры и лактоны со степенью превращения карбоксильных групп до 40-50% без изменения молекулярно-массовых характеристик полимера. Полученные таким образом эфиры и лактоны полисахаридкарбоновых кислот являются удобными ацилирующими агентами биологически активных аминов и производных гидразина при конструировании физиологически активных полимеров.

5. Разработанные схемы и методы отличаются универсальностью и применимы не только к декстрану, но и к таким разным по структуре и физико-химическим свойствам полисахаридам, как аубазидан, амилоза, корапу-лан, родэксман и другие, которые в связи с этим могут быть использованы для конструирования эффективных физиологически активных полимеров, как и декстран.

Сформулированные закономерности взаимодействия полисахаридов и их производных с низкомолекулярными соединениями позволили определить оптимальные значения технологических параметров и создать основу для направленного синтеза новых модифицированных полисахаридов с заданными степенью замещения (от 0,1 до 1,0), прочностью связи и размером вставки между вводимым фрагментом и полисахаридной матрицей и высоким выходом целевых продуктов (>50%).

6. Впервые показано, что реакции полисахаридальдегадов, сложных эфиров, амидов, гидразидов и азидов полисахаридкарбоновых кислот с гид-роксиламином протекают количественно и могут быть использованы для стандартизации и анализа синтезированных производных полисахаридов. Разработанный спектрофотометрический метод прост, позволяет до 10 раз сократить время и количество веществ, необходимые для анализа, повышает точность определения (ошибка в определении <4%, разница результатов ана-

лиза полученных веществ предлагаемым и известными методами <5%).

7. Разработанные схемы модификации полисахаридов позволяют получать новые малотоксичные биологически активные соединения, которые проявляют антигипоксические и психотропные свойства, обладают антимикробным, антивирусным действием, интерферониндуцирующей активностью превышая активность известных лекарств в 7-20 раз. (Отобраны препараты для доклинических исследований). Хинонметидные и полигидроксипирими-диновые производные полисахаридальдегидов представляют собой новую группу противовирусных агентов. Разработанные схемы синтеза перспективны для стабилизации, пролонгации и детоксикации ферментов, антибиотиков и других лекарственных веществ.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах

1. A.c. 1336535 СССР, AI С 08 В37/00, А 61 К 31/35. 2-кето-2-дезоксиманнан, обладающий иммуностимулирующей активностью / Стуков А Н., Мовсесян К С., Корбелайнен Э.С., Кириллова Л.Е., Ивин Б.А., Филов В.А., Иозеп A.A. и др.

2. Иозеп A.A., Горделянова Л.Н., Ильина Т.Ю., Ивин Б.А. Синтез аубазиданполиальде-гида и реакции его с некоторыми нуклеофилами. //ЖОХ. 1992. Т.62, №3. С. 668 - 673.

3. Иозеп АА., Горделянова Л.Н., Ильина Т.Ю., Корбелайнен Э.С., Папп В Т., Ивин Б. А. Синтез водорастворимого аубазиданполиальдегида и его реакции с некоторыми ну-леофилами. //ЖОХ. 1992. T.62.N 3. С. 674-679.

4. Иозеп A.A., Горделянова Л.Н., Ивин Б.А. Синтез замещенных амидов и гидразидов карбоксиметилаубазидана. // ЖОХ. 1992. Т.62, № 8. С. 1869 - 1877.

5. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Синтез сложных эфиров карбоксиметилдек-страна. //ЖПХ. 1993. Т.66,№5. С. 1106 - 1110.

6. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Лактоны карбоксиметилдекстрана. // ЖПХ. 1994. Т.67,№3. С. 467 - 469.

7. Иозеп А.А, Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Синтез замещенных амидов карбоксиметилдекстрана. // ЖПХ. 1994. Т.67, №3. С. 470 - 474.

8. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Кузнецова Т.Е., Пассет Б.В. Устойчивость декстрана в химических реакциях и особенности выделения целевых продуктов. // ЖПХ. 1994. Т.67, №¡6. С. 1012-1016.

9. Ильина Т.Ю., Сибихина О.В., Иозеп A.A. Новый подход к химической модификации декстрана. //ЖОрХ. 1994. Т.30,№9. С. 1326 - 1330.

10. Иозеп А.А, Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Исследование ацилирующей способности сложных эфиров карбоксиметилдекстрана в реакциях с первичными и вторичными алифатическими аминами. // ЖПХ. 1995. Т.68, №1. С. 106 - 109.

11. Иозеп A.A., Сибикина О.В., Кузнецова Т.Е., Пассет Б.В. Реакции карбоксиметилдекстрана и его сложных эфиров с ароматическими аминами. // ЖПХ. 1995. Т.68, №2. С. 307 -311.

12. Иозеп АА., Куприянова Л.Н., Пономаренко М.Н., Ивин Б.А., Пассет Б.В. Синтез и анализ гидразидов карбоксиметилпроизводных некоторых микробных полисахаридов. // ЖПХ. 1996. Т.69, №9. С. 1537-1542.

13. Иозеп A.A., Бессонова Н.К., Строкам Д А., Пассет Б.В. Исследование реакции полисахаридов с акриламидом. //ЖПХ. 1997. Т.70, №5. С. 824-828.

14. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Иозеп A.A. Исследование полимерных комплексов, включающие ферменты и растворимые полимеры. // ЖПХ. 1997. Т. 70, №6. С. 1040-1043.

15. Иозеп A.A., Кузнецова Т.Е., Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Влияние условий реакции на степень аминокарбонилметилирования полисахаридов.//ЖПХ.1997.Т.70,№ 9. С. 1548-1551.

16. Иозеп A.A., Пономаренко М.Н., Пассет Б.В. Ацилированне аминов азидами карбок-

симетилпроизводных полисахаридов. // ЖПХ. 1998. Т.71, № 1, С. 140 - 145.

17. Иозеп A.A., Бессонова Н.К., Пассет Б.В. Синтез карбоксизтшщексграна. П ЖПХ. 1998. Т.71, №2. С. 320 - 323.

18. Иозеп А А, Бессонова Н.К., Пассет Б.В. Синтез сложных эфиров карбоксиэтилполиса-харидов. //ЖПХ. 1998. Т.71, №6. С. 995 - 998.

19. Иозеп A.A., Бессонова Н.К., Пассет Б.В. Синтез гидразидов, азидов и замещенных амидов карбоксиэтилполисахаридов. //ЖПХ. 1998. Т.71, №6. С. 998 - 1003.

20. Иозеп A.A., Суворова О.Б., Иозеп Л И., Пассет Б.В. Спектрофотометрический метод анализа водорастворимых лояисахаридальдегидов. // ЖПХ. 1998.Т.71,№7.С. 1202-1205.

21. Иозеп A.A., Матулло JIB., Пассет Б.В. Синтез аминоэтилкарбоксиэтилполисахаридов. //ЖПХ. 1998. Т.71,№9. С. 1513-1517.

22. Иозеп A.A., Суворова О Б., Пассет Б.В. Реакции полисахаридальдегидов с барбитуровой кислотой // ЖПХ. 1998. Т.71, №11. С. 1859 - 1863.

23. Ильина Т.Ю., Пономаренко М.Н., Иозеп A.A. Синтез замещенных гидразидов карбок-симегилдекстрана. //ЖПХ. 1999. Т.72, №6. С. 985-990.

24. Пономаренко М.Н., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Синтез и исследование рибонуклеаза - по-лисахарвдных препаратов. //ЖПХ. 1999. Т.72,№ 5. С. 823-828.

25. Иозеп A.A., Суворова О.Б., Лебедько A.B., Пассет Б.В. Реакции декстранполиальдеги-да с гетероциклическими соединениями. //ЖПХ. 1999. Т.72,№7. С.Н65-1168.

26. Блинов H П., Витовская Г. А,, Иозеп A.A. Использование хроматографических методов при анализе некоторых микробных полисахаридов, представляющих интерес для целей фармации. // Хроматографические методы в фармации (материалы симпозиума). Тбилиси, 1977. С. 25 - 30.

27. Корбелайнен Э.С., Коновалов В.И., Иозеп АА. Карбоксиметилирование глюкана Aureobasidium pullulans и машина Rhodotorula rubra. // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. ''Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов". Л: ЛХФИ, 1978.С.68-69.

28. Кириллова Л.Е., Корбелайнен Э.С., Иозеп A.A., Ивин Б.А. Окисление маннана Rhodotorula rubra. II Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. "Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов" Л.: ЛХФИ, 1984. С. 80.

29. Горделянова Л.Н., Иозеп A.A., Корбелайнен Э.С. Исследование процесса получения биологически активного глюкана. // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармации". Л,: ЛХФИ, 1989. С. 46.

30. Воротынская СЛ., Витовская Г.А., Ананьева Е.П., Торгашев В.И., Иозеп A.A. Получение и исследование биологически активных дрожжевых полисахаридов и их производных. // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Современные направления развития биотехнологии". М., 1991. С. 96.

31. Воротынская C.B., Витовская Г.А., Ананьева Е.П, Гиршович М.З., Иозеп A.A. Получение и исследование свойств биологически активных дрожжевых гетерогликанов,// Тез. докл. Всесоюз. конф. Пенза, 1992, С.44.

32. Ильина Т.Ю., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Синтез сложных эфиров, как способ модификации микробных полисахаридов.// Материалы Всеросс. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ". СПб.: СПХФИ, 1994. С.62.

33. Ильина Т.Ю., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Синтез амидов карбоксиметил- декстрана. Л Материалы Всеросс. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ," СПб.: СПХФИ, 1994. С.62.

34. Ильина Т.Ю. .Суворова Ю.В., Стукалова И.А., Иозеп A.A., Пассегг Б.В. Модификация декстрана вторичными аминами. //Материалы Всеросс. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ." СПб.: СПХФИ, 1994. С.63.

35. Иозеп Л.И., Петрова RM., Строкач Д. А., Иозеп A.A., Беляев H.H. Синтез комплексо! карбоксиметилдестрангидроксамовой кислоты . // Материалы Всеросс. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ." СПб.: СПХФИ, 1994. С. 63.

36. Сибикина О.В., Кузнецова Т.Е., Дорохин К.В., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Исследование ацилирующей способности карбоксиметилдекстрана в реакциях с алифатическими и ароматическими аминами. II Материалы Всеросс. науч. ковф. "Химия и технология лекарственных веществ." СПб.: СПХФИ, 1994. С. 72.

37. Сибикина О.В., Кузнецова Т.Е., Матулло JI.B., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Реакции эфира карбоксиметилдекстрана с ароматическими аминами. // Материалы Всеросс. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ." СПб.: СПХФИ, 1994. С. 73.

38. Козелецкая К.Н., Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Со Минина A.A. Конструирование антивирусных препаратов на основе промышленных декстранов (полиглюкин) я производных адамантана. // Материалы Всеросс. науч. конф. "Химия и технология лекарственных веществ." СПб.: СПХФИ. 1994, С. 18.

39. Иозеп АА., Пассет Б.В. Модификация биологически активных веществ полисахаридами. // Тез. докл. Ш Росс. нац. конгресса "Человек и лекарство". М., 1996. С. 24.

40. Иозеп АА, Ильина Т.Ю., Куприянова Л.Ы, Сибикина О.В., Кузнецова Т.Е. Химическая модификация микробных полисахаридов.// Материалы симпозиума по оргашга. химии "Петербургские встречи."-СПб., 1995. С. 275.

41. Иозеп A.A., Пономаренко МЫ., Пассет Б.В. Новый метод анализа гидразидных групп в полисахаридах и в некоторых лекарственных субстанциях.// Тез. докл. науч. -практ. конф., посвящ. 25-летию фарм. факультета Самарского гос. мед. университета. Самара: СамГМУ, 1996. С. 94 - 95.

42. Иозеп АА., Пономаренко М.Н., Пассет Б.В. Исследование реакций азидов карбоксиметилдекстрана с аминами. // Тез. докл. Всеросс. науч. конф. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств." СПб: СПХФА, 1996. С. 47.

43. Иозеп A.A., Строкач Д.А., Бессонова Н.К., Пассет Б.В. Синтез и исследование производных карбоксиэгиддекстрана. // Тез. докл. Всеросс. науч. конф. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств." СПб: СПХФА, 1996. С.48.

44. Кузнецова Т.Е., Иозеп АА, Пассет Б.В., Коломийцева ГА Ацшшрование анилина лактоном и этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана. // Тез. докл. Всеросс. науч. конф. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств." СПб: СПХФА, 1996.С.53.

45. Иозеп A.A., Строкач Д.А., Бессонова Н.К., Матулло J1.B., Пассет Б.В. Фотоколориметрический метод анализа амидов карбоксиэтилполисахаридов. // Тез. докл. Всеросс. науч. конф. "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств." СПб: СПХФА, 1996. С. 48.

46. Иозеп АА, Суворова О.Б., Пассет Б.В. Использование комплексов Fe(III) в анализе полисахаридальдегидов// Тез. докл. Всеросс. науч. конф. "Актуальные проблемы созда-пияповых лекарственных средств." СПб: СПХФА, 1996. С.47.

47. Пономаревко М.Н., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Синтез и исследование фермент-декстрановых препаратов. // Tea докл. V Росс. нац. конгресса "Человек и лекарство." М., 1998. С. 606.

48. Бессонова Н.К., Иозеп АА., Пассет Б.В. Конструирование биополимеров на основе лекарств и карбоксиэтилполисахаридов. // Тез. докл. V Росс. нац. конгресса "Человек и лекарство" М., 1998. С.548.

49. Коржавина Е.Г., Кузнецова Т.Е., Иозеп АА, Пассет Б.В. Сульфатирование декстрана // "Химия и применение фосфор-, сера- и кремнийорганических соединений". Сб. науч. тр. по материалам Симпозиума по химии и применению фосфор-, сера- и кремнийорганических соединений "Петербургские встречи". СПб, 1998. С. 233.

50. Суворова О.Б., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Исследование реакции конденсации полисаха-ридальдегидов с малоновым эфиром. // XVIII УкраГнсыса конферендая з оргатчноГ xîmh'. Дншропетровськ. 6-8Жовгая. 1998. С. 384.

51. Суворова O.S., Иозеп АА, Лебедько A.B. Реакции полисахаридальдегидов с гетероциклическими соединениями. // XVUI УкраГнська конференция з opranwimi' xiMii'. Дншропетровськ. 6-8 Жовтня. 1998. С. 264.

52. Иозеп A.A. Химическая модификация полисахаридов как путь создания пролекарств.// «Лекарственные препараты на основе модифицированных полисахаридов» Тез. докл. междунар. науч. конф. Минск, 1998. С.32-34.

53. Суворова О.Б., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Исследование реакции полисахаридальдегидов с некоторыми аминами и производными гидразина// «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» Тез. докл. междунар. конф. 7-8 апр. 1999 г. СПб., 1999. С.38.

54. Суворова О.Б., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Модификация полисахаридов замещенными фенолами. // «Фармация в XXI веке: инновации и градации» Тез. докл. междунар. конф. 78 апр. 1999 г. СПб., 1999. С.38.

55. Кузнецова Т.Е., Сибиюша О.В., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Модификация декстрана аминокислотами. // «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» Тез. докл. междунар. конф. 7-8 апр. 1999 г. СПб., 1999. С.25.

Список используемых сокращений:

АГ -ацилгидразоны КМД -карбоксиметиддекстран

АКЭД -амид карбоксиэтилдекстрана КМП -карбоксиметилполисахарид

АКЭП -амид карбоксиэтшшолисахарида КМР -карбоксиметилродэхсман

АПА -аубазиданполиальдегид КЭД -карбоксиэтилдекстран

ДБК -декстранбарбитуровая кислота КЭП -карбоксиэтилполисахарид

ДМСО -диметилсульфокснд ПА -полисахаридальдегады

ДПА -декстранполиальдегид РНК-аза-

КМА

ДПА-Р -продукт реакции ДПА с резорци- РНК-аза- -фермент, иммобидизованнй

ном КМД на КМА, КМД, КМР

ДПА-Ф -продукт реакции ДПА с фенолом РНК-аза-

КМР

КАП -карбоксиалкилполисахарид ФАП -физиолошческиакшвные

полимеры

КМА -карбоксимегилаубазидан ФПК Фермент-полисахаридный

конъюгат

КМ- -полиальдегид КМА

АПА