Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование спектральными методами в твердой фазе строения химически модифицированных микробных полисахаридов

На правах рукописи

НЕЙШЛОС Арье Леон

(Neishlos Arye Leon)

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ В ТВЕРДОЙ ФАЗЕ СТРОЕНИЯ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРОБНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

15.00.02 - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических

наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2004

Работа выполнена на кафедре химической технологии лекарственных веществ и витаминов Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Пенсильванском государственном университете (США) (Репп State NMR Facility Department of Chemistry The Pennsylvania State University).

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор химических наук, профессор ИВИН Б.А. доктор химических наук, профессор ЗОБАЧЕВА ММ.

Ведущая организация: Научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов (ВНИТИАФ)

Защита состоится " ^ " _ 2004 г. в-ч"У с о в на за-

седании Диссертационного Совета Д 208.088.01 при Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПХФА по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 4/6.

Автореферат разослан" " 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор ПАССЕТ Б.В.

кандидат фармацевтических наук

М.В.Рыжкова

2004-4 27905

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Модифицированные микробные полисахариды нашли широкое применение в биотехнологии, пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности. В ряде случаев они стимулируют неспецифическую резистентность организма животных и человека к инфекциям, ингибируют рост злокачественных опухолей, проявляют гипо-липидемическую, антикоагулянтную и другие виды биологической активности. Химическая модификация полисахаридов низкомолекулярными фрагментами привела к созданию ряда ценных лекарственных средств (например, лакрисин, полифер, поликапран, терридеказа и др.). Химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице позволяет создавать новые препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно-гидрофильных свойств.

В связи с этим, разработка эффективных схем и методов химической модификации полисахаридов низкомолекулярными соединениями для создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ, а также разработка методов фарманализа и стандартизации полученных веществ имеет существенное значение и является актуальной задачей фармацевтической химии.

Очевидно, что реализация достипгутых успехов и выпуск на фармацевтический рынок новых лекарственных средств невозможны без разработки методов анализа и стандартизации как целевых лекарственных субстанций, так и промежуточных продуктов для их синтеза.

Целью исследования была разработка методов изучения строения химически модифицированных микробных полисахаридов с помощью ЯМР и ИК спектроскопии в твердой фазе, что объясняется как их нерастворимостью или низкой растворимостью, так и необходимостью разработки методов стандартизации товарной продукции в твердой фазе. Параллельно с этим было необходимо уточнить и чисто химические аспекты синтеза модифицированных полисахаридов: таутомерные переходы, изомерию, структуру соединений, устойчивость в твердой фазе и т.п.

Научная новизна. Впервые были исследованы ЯМР 13С, I5N и ИК спектры химически модифицированных полисахаридов в твердой фазе, что доказало эффективность и перспективность использования этих методов для исследования БАВ сложной структуры. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена химическая схема взаимных превращений разных форм декстранполиальдегидов (ДПА). Показано, что каноническая форма полисахаридполиальдегидов является наименее выгодной, а потому в продуктах химической модификации декстрана по альдегидной схеме она встречается только в тех случаях, когда она стабилизирована водородными связями или иными факторами. Энергетически наиболее выгодной является гид-ратированная форма ДПА. Для продуктов химической модификации 2,4-

окисленного декстрана предпочтительной оказывается циклическая полуаце-тальная структура, что необходимо учитывать при разработке реакций "подлинности" и методов количественного анализа целевых БАВ.

Впервые доказано строение значительного числа БАВ - химически модифицированных декстранов.

Практическая значимость. Разработана методика исследования БАВ в твердой фазе ЯМР и ИК спектральными методами. Разработанные методики являются необходимой предпосылкой для стандартизации ЛС и промежуточных продуктов для их синтеза, выпускаемых в твердом виде. Установленные вышеупомянутыми новыми для данного класса соединений методами состав и структура БАВ должны учитываться не только при разработке методов их анализа и соответствующих стандартов, но также при изучении их биологической активности и механизма действия на живой организм.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" и на IV Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке".

Публикации. По теме диссертации опубликована статья в Журнале прикладной химии и материалы 2-х докладов на вышеупомянутых конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 195 страницах, включая 30 таблиц и 12 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, основных результатов работы и их обсуждения, описания материалов и методов (экспериментальная часть), выводов, списка литературы (125 источников) и приложения (31 стр.).

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Приведенный в разделе 2 диссертации обзор литературы по теме исследования доказывает перспективность химической модификации микробных полисахаридов биологически активными фрагментами с целью создания новых биологически активных полимеров.

Вместе с тем строение полученных перспективных продуктов во многих случаях не была строго доказана. Отсутствуют данные, позволяющие разработать стандарт на модифицированные полисахариды, используемые как в качестве промежуточных продуктов, так и в качестве БАВ. Отсутствует типовая методика, позволяющая научно обоснованно, надежно и в короткие сроки устанавливать химическую структуру модифицированных полисахаридов.

Во всех рассмотренных нами случаях методический подход к установлению структуры исследуемых соединений был одинаков. Квантово-химические расчеты молекул проводили полуэмпирическим методом РМЗ, используя пакет программ ОАМЕ88. Спектры ЯМР ПС рассчитывали используя пакет программ ACD и сравнивали с экспериментально получении-

ми спектрами образцов. Спектры ЯМР С и l5N в твердой фазе снимали на приборе Chemagnetic. С вращением образца под магическим углом со скоростью 3,6 кГц снимали спектры ЯМР CPTOSS и CPMAS.

При съемке ЯМР спектров 15N химические сдвиги интерпретировали относительно нитрометана (сигнал которого принимался за 0, при этом сигнал глицина должен быть -345,05 м.д.).

ИК спектры отражения всех образцов модифицированных полисахаридов записывали на Фурье-ИК спектрометре фирмы Perkin-Elmer.

Поскольку ранее не исследовались ЯМР спектры в твердой фазе ни декстранов, ни декстранполиальдегидов, то, прежде всего, необходимо было решить вопрос об отнесении сигналов 13С ЯМР спектров. Это удобнее всего было сделать, сравнивая опубликованные ЯМР спектры декстрана в различных растворителях с расчетными спектрами и спектрами декстрана в твердой фазе снятыми нами на приборе "Chemagnetic".

Сеймор, Кнэп и Бишоп изучили ,3СЯМР спектры растворов различных марок декстрана и установили ряд общих для всех декстранов закономерностей. Аналогичные сведения о спектрах декстрана в D^O приводят Горин, Усманов и др. авторы.

В монографии Хеберлена и Меринга и обзоре Слонима и Аршавы указано, что в ЯМР спектрах высокого разрешения в твердых телах величины химсдвигов должны быть примерно такими же, как и растворах, но в растворе на величину химического сдвига может влиять полярность растворителя. При возможности различных конформаций эквивалентные атомы могут давать различные сигналы. На изменение положения сигналов ЯМР спектров в твердых телах оказывают влияние водородные связи.

Спектры ЯМР товарного декстрана. были сняты на приборе "Chemagnetic". Частота водорода 297,37 МГц, частота углерода 74,78 МГц с вращением образца под "магическим углом" со скоростью 3,6 кГц. Сняты два типа спектров: I3C CPMAS - кросс-поляризация с вращением под "магическим углом" (cross polarization with magnetic angle spinning) и CPTOSS -кросс-поляризация с подавлением вращения (total suppression of spinning sidebands).

В спектре декстрана |3С CPMASS прибор фиксировал 4 сигнала: 99,1; 94,5; 72,6 и 66,6 м.д. В спектре "С CPTOSS были обнаружены только 3 сигнала: 99,0; 72,9; 66,3 м.д.

Для отнесения сигналов в спектрах была использована компьютерная программа ACD (Advanced Chemistry Development). Надежность интерпретации спектров полисахаридов этой программой была проверена с помощью сопоставления результатов компьютерного анализа спектра 13С карбоксиме-тилцеллюлозы (карбоксиметильная группа у С2) с значениями сигналов угле-родов в спектре 13С, приведенными в работах Перлина.

В спектрах твердофазного декстрана сигналы от углеродных атомов С2, С3, С4 и С3 сливаются в один (72,6 м.д.), что может быть объяснено наличием

межмолекулярных связей. Следует отметить, что эти сигналы мало отличаются и в растворах, сигнал 66,6 м.д. относится к С6.

Можно предположить, что сигнал 94,5 м.д. Относится к несвязанному С1 а-О-глюкопиранозы, а 99,1 - к связанному С1.

Полученные нами ИК спектры отражения интерпретированы с использованием данных по ИК спектрам декстрана, приведенных в книге В.Г.Жбанкова, а также на основании результатов расчета частот, форм нормальных колебаний и распределения потенциальной энергии декстрана и его конформеров.

Исследование спектров полисахаридполиальдегидов

Как было показано Е.В.Новиковой и Е.В.Тищенко строение декстран-полиальдегида зависит от условий синтеза, главным образом от значения рН среды при окислении декстрана метапериодатом натрия. В связи с тем, что ДПА применяется для конструирования полимерных лекарств, его стандартность является одним из важнейших условий химической модификации. Поэтому было необходимо изучить структуру образцов ДПА, полученных в цитированных работах. Высказывалось предположение, что образцы ДПА, выделенные из раствора с определенным значением рН, могут существовать в разных формах:

/- альдегидная форма, II а, б — альдоенольная форма, III— гидратиро-ванная форма, 1Уа-г - полуацетальная форма.

Исследованные нами твердые образцы ДПА были получены окислением декстрана метапериодатом натрия при рН от 2,78 до 5,34 и выделены из раствора как описано в работе Е.В.Тищенко.

Для определения энергетически предпочтительной формы ДПА в результате квантово-химических расчетов мономерных звеньев ДПА были определены теплоты образования (Д/Но) (I-IV) в вакууме и тепловые эффекты

(АГН^) взаимных превращений этих форм. Для форм (II, IV) были рассчитаны теплоты образования их пространственных изомеров (II а,б; IV а-г):

Таблица 1.

Теплоты образования различных форм декстранполиальдегида (I-

IV), рассчитанные полуэмпирическим квантово-химическим методом РМЗ в вакууме при ОК. и тепловые эффекты (АГН$) их взаимных превращений:

Д¡Ио форм ДПА, кДж-моль"1

альдегидной альдоенолыюй гидратированной полуацетальной

-830,6 (I) -1053,6 (Па) -1063,9 (И б) -1382,7 (III) -1125,9 (IV а) -1118,1 (IV б) -1113,9 (IV в) -И 16,4 (IV г)

Аг#о взаимных превращений форм ДПА, кДж-моль'1

0(I-»IV)

-9,17 -103,98 -71,26 32,72

Согласно квантово-химическим расчетам в газовой фазе гидратирован-ные формы ДПА (II-IV) предпочтительнее негидратированной формы (I). При этом наиболее вероятной является гидратированная форма (III), а наименее вероятной - альдоенольная форма (II б). Среди рассмотренных полу-ацетальных структур наиболее предпочтительна форма (IV а).

Нумерация атомов углерода моносахаридных звеньев исходного декст-рана и различных форм продуктов его окисления (I-IV) представлена ниже.

В спектрах ЯМР 13С образцов ДПА положения сигналов атомов С'-С5 смещены в сильное поле по сравнению с положением соответствующих сигналов в спектрах декстрана. Это обычно наблюдается в спектрах углеводов при введении заместителей в положения 2, 3 или 4.

Согласно спектрам ЯМР 13С окисление декстрана происходит по связям С2-С3 и С3-С4 и в них отсутствует поглощение в области 70,2-71,7 м.д., соответствующее поглощению С3.

Можно полагать, что альдегидная форма (I) в исследованных образцах отсутствует, поскольку в спектрах ЯМР 3С отсутствуют сигналы в области 200 м.д., характерные для группы -СНО.

В спектрах образцов ДПА, полученных при рН 2,78 и 4,88, наблюдаются сигналы в области 122,1 м.д. и 122,7 м.д., соответствующие сигналу С2 альдоенола (И), однако отсутствует сигнал С1 в области 150 м.д.

В спектрах ЯМР 13С всех образцов ДПА, синтезированных в интервале рН от 2,78 до 5,34, присутствуют сигналы в области 87,9 м.д. и 92,4-93,3 м.д., соответствующие сигналам С2 и С4 гидратированной (III) или иолуацеталь-ной (IV) форм.

Таким образом, на основании спектровЯМР 13С можно заключить, что образцы ДПА, полученные при рН от 2,78 до 5,34, представляют собой смесь полуацетальной и гидратированной, а полученные при рН 2,78 и 4,88 еще и альдоенольной форм.

Анализ ИК спектров отражения образцов, синтезированных при рН 2,57; 2,78; 4,86; 5,34 показал, что альдегидная форма (I) в небольшом количестве обнаруживается только в образцах, полученных при рН 5,34, поскольку в спектре наблюдается отчетливая полоса 17Gf В спектрах всех остальных образцов ДПА полосы поглощения в этой области намного менее интенсивны. Кроме того, в этой области спектра поглощает вода, всегда присутствующая в полисахаридах в связанном виде, что затрудняет определение альдегидных групп методом ИК спектроскопии.

Во всех образцах обнаружены полосы поглощения при 1610 см"1 и 1500 см"1, что свидетельствует о присутствии альдоенольной формы (II), содержание которой максимально в образце, синтезированном при рН 4,88. Некоторое уменьшение интенсивности этих полос в образце с рН 5,34 вероятно объясняется уменьшением общего количества окисленных звеньев.

Максимальное содержание гидратированной формы (III) наблюдается в образце, полученном при рН 2,57. В его ИК спектре присутствуют сильные полосы поглощения в области 1250-1310 см"1, В образцах, синтезированных при более высоких рН, ее содержание уменьшается и в образце, полученном при рН 5,34 гидратированная форма (III) отсутствует.

Таким образом, анализ ИК и ЯМР спектров образцов ДПА, полученных окислением декстрана при различных рН, показывает, что ДПА в твердом виде представляет собой смесь гидратированной формы (III) с небольшим содержанием альдоенольной (II) и при рН 5,34 - альдегидной форм (I).

ftXSB* is SI

7 .. i i i

p—I—I-1-1—p—I—I-1—I—J—I—I—I—I—|—I-1-Г—1-J-1-1-1-1—J—I

аза за« iao mi и •

С13 TOSS спектр декстранполиальдегида, полученного при рН 5,34

I 1 ' 1 1 I 1 ' ' » I 1 ■ « ■ I ■ ■ ■ ■ I 1 < ' ■ 1

и* ка ш |и »« а

С13 TOSS спектр декстранполиальдегида, полученного при рН2,78

1Ю11

ог/ом» 13:94 ям: I.. wim.cs X: 16 «сам, «.Ос»-!, ммюЦь ♦25.8РА-З.Э4

ИК спектр ДПА при рН 5,34

жм|

200Й 19Ш1 МО 1700 1ЫН 13М 1'И> 1300 1200 110« и«

ПЛ1ЛЗ 1411)8 МПС I. ЮМ.К Х( 16 мм*, 4.0вг'|| НИИ) «8, В«-г.4в

ИК спектр ДПА при рН 2,46

На основании анализа большого числа спектров 13С ЯМР и ИК спектров можно утверждать, что:

ДПА, полученный окислением декстрана при рН ^ 5,34 в твердом виде не содержит альдегидной формы (I), а существует преимущественно в виде смеси гидратированной (III) и полуацетальной (IV) структур;

количество гидратированной формы (III) в образцах ДПА уменьшается с увеличением рН от 2,57 до 4,88;

альдоенольная форма (II) присутствует во всех образцах от рН 2,57 до 5,34, причем ее содержание растет с увеличением рН.

Как следует из исследований Е.В.Новиковой и Е.В.Тищенко получить индивидуальный 2,3- или 2,4-окисленный декстран стандартным методом невозможно. Во всем диапазоне исследованных значений рН (2,5 - 5,5) окисление декстрана приводит к получению 2,3- и 2,4-окисленных фрагментов в соизмеримых количествах. Таким образом, отсутствие в спектрах 13С сигнала в точности совпадающего с расчетным для С3 не означает, что 2,3-окислснная форма ДПА отсутствует, т.к. ожидаемый сигнал для С в области 70,2-5-71,1 м.д. вполне мог слиться с близкими значениями для С2 и С4.Кроме того, как следует из изложенного выше, альдегидная форма ДПА в образцах, полученных при рН 2,5 - 5 практически отсутствует, а альдоенольные и гид-ратированные формы ДПА для 2,3- и 2,4-окисленных фрагментов спектрально не должны различаться.

Проведенное аналогично исследование родэксманполиальдегида и ау-базиданполиальдегида показало, что и эти соединения в твердой фазе существуют преимущественно в гидратированной или полуацетальной форме.

Исследование спектров продуктов взаимодействия декстранполи-альдегида (ДПА) с гетероциклическими соединениями

О.Б.Суворова в 1999 г. разработала альдегидную схему химической модификации микробных полисахаридов С- и ^нуклеофилами, включая урацил и др. производные гидроксипиримидина, барбитуровую кислоту, малоновый эфир, резорцин и др. соединения. Во всех случаях О.Б.Суворова предложила наиболее вероятные структуры образующихся соединений, однако, в ряде случаев без строгих доказательств. В связи с этим мы по разработанным О.Б.Суворовой прописям ресинтезировали эти вещества и исследовали их спектры в твердой фазе.

Модификацию ДПА урацилом проводили в соответствии с предполагаемой схемой:

Расчетный спектр ЯМР 13С урацила, сделанный по программе ACD, дает 4 сигнала для кольца урацила: С4Ю -154,4; С2=0 -151,4; С5 -100,3; С6 -142,2 м.д. В спектре |3С CPTOSS синтезированного нами образца точно таких сигналов нет, т.к. связь с полимером, естественно, приводит к смещению сигналов углеродов урацильного кольца, но область 170 * 100 м.д. представлена хорошо и все сигналы достаточно четкие. Так как сигнала свободной карбонильной группы нет, то следует предположить, что замещение ураци-лом идет как по С2, так и по С3 ДПА. Для симметричного дизамещения, соответствующего структуре VI должен быть один общий сигнал для С4=0 обеих молекул урацила (163,2 м.д.). Сигнал 169,2 м.д. относится к С4=0 третьей молекулы урацила в структуре VII. В этом случае сигнал 149,4 м.д. должен быть отнесен к С2=0 всех трех молекул урацила в структуре VII. Возможно, что для структуры VII сигнал С4=0 тоже должен быть один (наиболее близкий к С4=0 в свободном урациле).

О том, что структура VII существует, говорит наличие сигнала 31,1 м.д., которого в структуре VI не может быть. Кроме того, сигнал С5 лежит в более низком поле (для свободного урацила ~ 100). Наличие двух сигналов для С5 (88 и 81 м.д.) тоже говорит в пользу структуры VII. Результаты расчетов для структур VI и VII и сравнение с экспериментальными спектрами ЯМР 13С полученного образца позволяют утверждать, что продукт взаимодействия ДПА с урацилом соответствует смеси структуры VI и VII.

Рассмотрение полученных ИК спектров подтверждает сделанный вывод.

При исследовании продукта взаимодействия ДПА с 6-аминоураилом мы рассматривали три варианта возможных структур продукта реакции ДПА с 6-аминоурацилом (наличие в экспериментальных образцах >C=N связи с

молекулой полисахарида было ранее показано Суворовой О.Б. и Тищенко Е.В.):

В спектре 13С образца отсутствует сигнал 87,9 м.д., который относится к С4 ДПА. Но в спектрах образца и в спектре ДПА наблюдается сигнал С2 (92,1 м.д.). Следовательно, можно предположить, что произошло только монозамещение по С4 ДПА. (В противном случае исчез бы сигнал 92,1 м.д. -С2). Если бы произошло дизамещение, то исчезли бы сигналы С4 (87,9 м.д.) и С2'(92,1 м.д.).

Если полагать, 6-аминоурацил присоединяется к атому С4 гидратиро-ванной или полуацетальной формы ДПА, то сигнал 166,2 м.д. относится к С и урацила. Поэтому он самый интенсивный. Сигналы 160,2 м.д. и 153,3 м.д относятся к и С =0 6-аминоурацила. Новый сигнал 84,6 м.д., которого нет в спектре ДПА, к С3 аминоурацила.

Таким образом, есть основания полагать, что в результате взаимодействия декстранполиальдегида с 6-аминоурацилом образуется продукт монозамещения по С4' атому ДПА, т.е. X.

Продукт взаимодействия ДПА с мафедином (3-фенил-2-фениламино-4-гидрокси-6-оксопиримидин), полученный впервые О.Б.Суворовой, интересен как новое лекарственное вещество с улучшенными характеристиками по токсичности и пролонгации действия. Строение этого вещества постулирована О.Б.Суворовой на основании ряда косвенный свидетельств:

В РЖ спектре (тв. фаза) есть полоса 1745см"' - Уоо (альдегида), 1695 см"1 - Усбо мафедина, а также 1504 см"1 - Ус-с и Ус-м мафедина. Таким образом, РЖ спектр подтверждает постулированную структуру продукта.

В спектре 13С в твердой фазе образца наблюдаются сигналы: 178,8; 165,9; 162,0; 149,6; 135,7; 129,2; 120,0; 96,3; 88,4; 86,01; 71,7; 55,5; 49,9; 42,5; 33,7 м.д. Сигнал 178,8 м.д. лежит в более слабом поле, чем свободная альдегидная группа (~ 200), однако с учетом сдвига за счет сильной водородной связи, его можно отнести к

|-I-I-I-I-|-I-I-1 I | I 1 I I | I I I I | I I-1-1-1-I

as* iw iu in a* i

С13 TOSS спектр продукта реакции ДПА с мафедином

Сигнал 165,9 следует отнести к атому С2 гетероцикла, 162,0 - к С6=0 гетероцикла, 149,6 - к С4-ОН, 86,0 - к С5 гетероцикла, 135,7 - к С(РЬ)-1Ч, 120,0-плечо С'РЬ, 129,2-к СН(1)Р1ш т.д.

В снятом спектре ЯМР 15К твердого образца исследуемого продукта имеется три хорошо выраженных сигнала: -219,6 м.д., -246,1 м.д. и -273,7 м.д.

РЬ-КИ-РЬ в ДМСО дает сигнал -288 м.д.

Поэтому можно считать, что -219,6 м.д. и -246,1 м.д. - это сигналы азотов пиримидинового кольца (они очень близки к сигналам азота кольца ура-цила в ДМСО: -222,4 и -250 м.д.). Сигнал -273,7, таким образом, соответствует §N3- Следовательно структуру продукта взаимодействия ДПА с мафеди-ном, приведенную в диссертации О.Б.Суворовой, можно считать доказанной.

Результат, как нам кажется, логичный и ожидаемый: С3 = 0,99, дизаме-щения в этом случае ожидать было трудно, т.к. пространственные затруднения весьма велики. Существование альдегидной группы в канонической форме в этом случае оправдано наличием водородной связи 3СН=О...НО-

этим же объясняется сдвиг сигнала альдегидной группы.

По данным О.Б.Суворовой является реакция ДПА с барбитуровой кислотой протекает легче, чем с другими С-нуклеофилами, при этом в зависимости от условий проведения реакции образуются продукты с высокими степенями замещения. Разделить их точно установить структуру каждого не удалось. В связи с этим, мы синтезировали продукты с разными степенями замещения (Сз) 0,61; 0,84; 1,0 и 1,89 (на 1 альдегидную группу приходится соответственно 0,61; 0,84; 1,0 и 1,89 фрагментов барбитуровой кислоты) и подвергли их сравнительному спектральному изучению. Для сравнения были также изучены спектральные характеристики барбитуровой кислоты в тех же условиях и на тех же приборах.

Предполагалось, что при малых степенях замещения наиболее вероятной структурой будут XIII или XIV, при высоких - XII.

В спектреЯМР 13С твердого образца со Сз = 0,61 сигнал С4=Обк - 176,3 м.д. проявляется в виде плеча сигнала 180,9 м.д. (альдегидная группа), а сигнал без замещенной барбитуровой кислоты - в виде плеча сигнала 89,4 м.д. С4 ДПА. По мере увеличения степени замещения сигнал С5 барбитуровой кислоты в образцах С3 1,0 и 1,89 проявляется более ярко - 84,8 м.д. Что касается образца Сз = 0,84, то интенсивность сигналов атомов углерода декстрана 72,3 м.д. и 98,7 м.д. мала по сравнению с интенсивностью сигналов свободной барбитуровой кислоты. Известно, что углероды С=С связей обычно дают сигнал ~ 144 м.д. Такого сигнала нет ни в одном спектре, что дает основание утверждать, что структура XIII не образуется. Расчетный сигнал С2=С5бК 142,8 м.д. также отсутствует.

« ь

Образец со Сз = 0,61, судя по спектрам, содержит нспрореагировавшую барбитуровую кислоту и небольшое количество вещества со структурой XIV (наличие сигнала 85,8 м.д. - С5б.к-С2Н-ОН). Аналогичную структуру имеет и образец со Сз = 0,84, т.е. оба об_разца имеют по одной молекуле барбитуровой кислоты, присоединенной к С2.

Образцы Сз 1,0 и 1,89 по спектрам очень похожи и имеют сигналы 84,8 м.д. (С3б.к) и 88 м.д. (С4). Эти образцы также содержат структуру XIV (монозамещение), но, кроме того, в их спектрах есть сигналы С2 - 44,0 (образец С, 1,0) и 46,1 м.д. (образец Сз 1,89) и сигналы С56к - 49,3 (С, = 1,0) и 50 м.д. (С, = 1,89). Это позволяет утверждать, что с увеличением степени замещения кроме структуры XIV (монозамещение НО-С2 Н-С5®«) появляется структура XII (дизамещение у С2). Структуре XII спектры 13С не соответствуют.

Спектр ЯМР твердой барбитуровой кислоты имеет только один сигнал -227,4 м.д. В спектрах образцов со С3 1,0 и 1,89 наблюдается по два сигнала атома азота: бщ = -232,9 м.д. и = -222,8 м.д. (образец со Сэ 1,0); 5к] = -232,8 м.д. и 5\з = -223,0 м.д. (образец со С, 1,89), т.е. в обоих образцах сигналы практически одинаковы, при этом сигналы 232,8 и 232,9 м.д. интенсивны и ярко выражены, в отличие от слабого сигнала 223 м.д. Появление еще одного сигнала по сравнению со спектром барбитуровой кислоты объясняется нарушением симметрии барбитуровой кислоты вследствие присоединения через С5 кДПА.

В спектре ЯМР 15К образцов С3 0,61 и 0,84 один сигнал вблизи -233 м.д. выражен также ярко, как в образцах со С3 1,0 и 1,89, а сигнал ~ 222 м.д. почти не виден, что можно объяснить малой степенью замещения. Таким образом на основании спектров можно говорить, что связь молекулы барбитуровой кислоты с ДПА во всех четырех образцах одинакова.

Анализ ЯМР С и и ИК спектров показал, что при взаимодействии ДПА с барбитуровой кислотой образуется продукт монозамещения, соответствующий структуре XIV. При больших степенях замещения дополнительно к нему образуется дизамещенный продукт структуры XII. Замещения с образованием непредельной С=С связи (структура XIII) не происходит, т.е. общие закономерности аналогичны наблюдаемым при реакциях с урацилом и мафе-дином.

Исследование спектров продукта взаимодействия ДПА с резорцином

Среди продуктов взаимодействия полисахаридполиальдегидов с фенолами особое внимание привлекает продукт взаимодействия декстранполи-альдегида с резорцином, поскольку он обнаружил очень высокую активность на модели герпетической пневмонии мышей.

Используя ранее разработанные методиками мы синтезировали производное декстранполиальдегида и резорцина, содержащее 1,37 фрагмента резорцина на 1 моносахаридный фрагмент.

он

Поскольку спектров ЯМР 13С резорцина, резорцината и декстранрезор-цинов в литературе мы не нашли, пришлось проводить анализ спектров всех

С13 TOSS спектр продукта реакции ДПА с резорцином

возможных вариантов по программе ACD, сравнивая полученные данные со

13/1

спектрами ЯМР С полученного образца в твердой фазе.

Единственной структурой, которая в значительной мере соответствовала полученному спектру, была XVIII.

Структура XVIII, поскольку синтез проводился в щелочной среде, может содержать не только -ОН группу, а также анионную CTNa+. При этом соответствующий сигнал должен сместиться ~ на 10 м.д. в слабое поле.

В спектре образца есть сигнал 171,9 м.д., который соответствует аниону резорцина; есть сигнал 196,9 м.д., который соответствует альдегидной группе С3=0 ДПА и обе молекулы резорцина присоединены к атому С2 ДПА.

Сигналы углеродов энолятной формы резорцина (C-ONa, а не С-ОН) должны быть смещены в слабое поле, т.е. бен и бае =171,9 м.д. Однако сигнал 155,7 м.д. очень интенсивный, скорее всего это С8(ОН), а также С14 и С16 для ОН формы. Три широких интенсивных сигнала 130,2; 118,5; 106,2 м.д. относятся к атомам углерода молекулы резорцина.

Таким образом, анализ спектров |3С ЯМР подтверждает структуру XVIII при условии, что часть ОН-групп ионизированы. Анализ РЖ спектров также подтверждает структуру XVIII.

Исследование спектров продуктов взаимодействия ДПА с амидами

кислот

Впервые исследовала взаимодействие полисахаридальдегидов с амидами кислот Е.В.Новикова. Реакция является удобным и перспективным методом создания новых ФАП, результаты неоднозначны и требуются дополнительные исследования для более надежной идентификации продуктов. Что касается изучения спектров продуктов этой реакции в твердом виде, то оно никогда не проводилось.

Взаимодействие декстранполиальдегида с ацетамидом - простейший пример рассматриваемой реакции, но даже в этом случае возможно образование нескольких продуктов:

Мы синтезировали два образца продуктов взаимодействия ДПА с аце-тамидом с разными степенями замещения и исследовали ихЯМР |3С, 15N и ИК спектры отражения твердых образцов.

Спектры ЯМР 13С обоих образцов были практически одинаковы. В них наблюдаются следующие сигналы (м.д.): 173,7; 125,7 (очень слабый); 96,9; 93,0; 87,6; 80,4; 72,0; 65,7; 58,5; 50,3; 23,6. В спектрах не обнаружено сигнала в близи ~ 200 м.д. (-СНО), что говорит об отсутствии альдегидной группы. Нет и сигнала -C=N-. Слабые сигналы 125,7 м.д. и 128,4 м.д. относится, скорее всего, к примеси альдоенолыюй формы ДПА (-С=С-ОН). Поскольку сигнала 144 м.д. в спектрах нет, то в продуктах отсутствует структура XX.

В спектре ЯМР 15N прибор отметил только по одному сигналу (-241,5 для одного образца и -241,4 для другого). Такой сигнал в каталоге отмечен для СД^ЫН-СО-СНз (-241,6 м.д.). Сигнал для структуры XXII должен существенно отличаться (например, для (СНз^ЫСОСНз это -281,0 м.д.). Сигналы при двойной связи (структура XX) вообще лежат в области от -10 до -20 м.д. Поскольку сигнал только один, то можно предполагать, что в продукте присутствует целиком или преимущественно только одна структура, а именно XXI.

Если спектры ЯМР 13С образцов № 1 и № 2 практически, то в ИК спектрах наблюдаются некоторые отличия. Так в образце № 2 проявляются полосы 1520 см"1 (5мн ацетамида) и 1098 см"' и 980 см*', которые, по всей вероятности, относятся к полуацеталыюй форме. Наличие полос 1500 см"1 и 1600 см"1 можно отнести к Vc-c_oh> т.е. альдоенольной форме ДПА с сильной внутримолекулярной водородной связью. В целом ИК спектры подтверждают, что продукт реакции, в основном, находится в полуацеталыюй форме XXI, но имеется также примесь альдоенольной формы (1500 см"1 и сигнал 125,7 в t3C спектре).

Следующий пример — продукт взаимодействия ДПА с антибиотиком тетрациклинового ряда - доксициклином, обнаружившим высокую антимикробную активность.

Кроме спектров продукта реакции были сняты спектры исходного антибиотика - доксициклина. Однако оказалось, что спектр доксициклина вместо 22-х ожидаемых сигналов |3С содержит 33 сигнала. Объяснить это можно значительной примесью тетрациклина, который почти не отличается от него по структуре:

22 20Д1 и 20 Л

СН, OH NfCHib н,г пн NfCHiVi

доксициклин тетрациклин

В связи с этим мы попробовали просчитать такую возможность. Компьютерный анализ по ACD спектров доксициклина и тетрациклина и отнесение сигналов исходного антибиотика показало, что образец доксициклина содержит значительную примесь тетрациклина. Для решения нашей задачи (т.е. определения способа присоединения молекулы антибиотика к ДПА) это значения не имеет, т.к. структуры доксициклина и тетрациклина аналогичны.

Реакция ДПА с доксициклином может протекать двояко: взаимодействием альдегидной группы ДПА с амидной группой доксициклина (I) или взаимодействием альдегидной группы с активированным гидроксиположением ароматического кольца антибиотика (II):

Расчеты двух возможных структур продукта взаимодействия ДПА с доксициклином показывают, что формы XXIV нет, т.к. отсутствует сигнал альдегидной группы. Сигнал 193,5 принадлежит доксициклину. Весомым аргументом в пользу структуры XXIII является наличие сигнала углеродного атома С19=0 (ССШН) 172,3 в спектре доксициклина и отсутствие этого сигнала в спектре продукта реакции (вместо сигнала 172,3 м.д. появляется сигнал 168,9 м.д.).

При взаимодействии ДПА с диамидом малоновой кислоты возможно образование продукта присоединения одной амидной группы (XXVI) или двух с образованием циклической структуры, аналогичной барбитуровой кислоте (XXVIII). Кроме того, возможна реакция по метиленовой группе (I) и образование полуацетального цикла (XXVII).

Структуры, аналогичные XXV, могут образоваться при взаимодействии ДПА с малабеном (Н,Ы'-ди-(и-карбоксифенил)-малонамидом.

Второй пример, где может образоваться структура аналогичная XXV (взаимодействие альдегидной группы полисахарида с активной метиленовой группой) - это реакция ДПА с анилидом ацетоуксусной кислоты, для продукта которой доказана структура:

Рассмотрим спектр ЯМР 13С для продукта ДПА-малабен в твердой фазе:

м.д.

В нем имеются сигналы: 208,6 м.д. - альдегидная группа ДПА; 174,9 - карбоксильная группа малабена; 167,4 и 165 м.д. - ССЖН малабена;

148,5 м.д.

м.д. - (.

атома С4 и 2 атома С5 ); 112,5 м.д,

С —С , т.е. малабен соединен с ДПА непредельной связью; 138,9 связь Срь-Г^ГН; 131,4 м.д. - 4 атома углерода фенильного кольца (2 углерод

Результаты компьютерного анализа по АСБ приведенной выше формулы соединения и отнесение сигналов 13С реального продукта реакции в твердой фазе показали, что возможна небольшая примесь малабена (сигнал СНг-группы - 50 м.д. и сигнал карбоксильной группы - 167,4 м.д.) и, кроме того, возможна примесь продукта в карбоксилат-форме (СОСГКа*).

В ИК спектре отражения этого соединения помимо полос 1731 см"1 (Усно альдегида и Усоон малабена), 1 6 сбл'З (¡Уй^ои Д ) , 1 л а -

бена), наблюдаются очень сильные полосы 1602 см"1 и 1392 см'1. В полосу 1602 вносит вклад , но интенсивность ее очень высока и кроме

того есть интенсивная полоса 1390 см"1. Эти полосы появляются тогда, когда мы имеем не кислоту, а соль, тогда 1602 см"1 Vascocr» а 1390 см"1 - Vscoo-> следовательно, образец представляет собой продукт в виде соли. В этом случае сигнал в спектре 13С 165 м.д. можно отнести к СОО"

Спектр *"3С ЯМР продукта ДПА-анилид ацетоуксусной кислоты имеет сигналы (м.д.): 204,1; 170,7; 167,7; 146,1; 138,0; 129,0; 125,1; 120,3; 105,9; 98,7; 89,7; 72,0; 66,0; 58,6; 53,6; 29,3; 23,6.

Отнесение сигналов и компьютерный анализ структуры показали, что в спектре есть все сигналы, характеризующие продукт в форме, приведенной выше. Кроме того, в полном объеме есть сигналы анилида ацетоуксусной кислоты.

ИК спектр отражения продукта отличается от спектра декстрана появлением Vc=o 1740 см'1 для-СНО и -СОСН3, vCONH 1695 см-1, vcc + 5Ш 1512 см"1, Ynh -898 см"1.. Т.о. изученный образец имеет ранее предложенную структуру и, по-видимому, содержит примесь анилида ацетоуксусной кислоты.

Для решения поставленной задачи (определения структуры продукта реакции ДПА с диамидом малоновой кислоты) для нас важны только те фрагменты XXIX и XXX, которые являются общими для них и структуры I продукта взаимодействия ДПА и диамида малоновой кислоты.

Сигнала ~ 200 м.д. в спектре 13С продукта реакции нет, а потому структуры XXV, XXVI и XXVIII должны быть отвергнуты. В спектре продукта нет ни одного сигнала из характерных для структуры XXV.

В реальном спектре есть сигналы (м.д.): 172,8; 127,5; 98,4; 92; 80,4; 72,3; 58,9; 44,0.

Сигнал 127,5 м.д. можно отнести к боснон альдоенольной формы ДПА (такой же сигнал 125,7 м.д. есть, как мы видели, в спектре ДПА+ацетамид).

ЯМР 13N спектр продукта реакции декстранполиальдегида и диамида малоновой кислоты имеется два сигнала -239,7 м.д. и -265,0 м.д. Последний соответствует атому азота амидиой группы CONH2 (например, для H2NCOCH3 сигнал 15N -269,5 м.д., адля Н2МСОСбН3 -279,5 м.д.). Второй сигнал соответствует сигналам в полиамидах, которые лежат в области -239,0 до -254 м.д. Таким образом, сигнал -239,7 м.д. следует отнести к • азоту Ps-NH-CO-. Следует отметить, что наличие двух сигналов азотов свидетельствует о том, что продукт не может соответствовать структуре XXV или XXVIII, т.к. в них атомы азота одинаковы и спектр 15N для них имел бы только один сигнал.

Следовательно, продукт реакции имеет структуру XXVII - полуаце-тальная форма + моиозамещение.

Таким образом, рассмотрение спектров продуктов взаимодействия ДПА с ацетамидом, доксициклином и диамидом малоновой кислоты в относительно мягких условиях доказывает, что предпочтительной структурой

С13 TOSS спектр продукта реакции ДПА с ацетамидом (образец № 2)

С13 TOSS спектр продукта реакции ДПА с бензол сульфамидом

продуктов реакции является полуацетальная. В связи с этим, было интересно, как будут реагировать с ДПА амиды не карбоновых, а сульфоновых кислот.

Можно предположить, что 2,3-окисленные фрагменты будут давать продукты нуклсофильного присоединения амида, а 2,4-окисленные фрагменты будут замыкать характерные для полисахаридальдегидов полуацетальные циклы.

В снятом спектреЯМР 13С продукта реакции в твердом виде нет сигнала ~ 200 м.д., что означает, что альдегидная форма XXXI отсутствует. Анализ сигналов углеродов проведен по программе ACD.

В спектре 15N продукта в твердой фазе наблюдался только один сигнал -237,5 м.д. По литературным данным сигнал l5N бензолсульфамида в 9%-ом ДМСО наблюдался при -285,9 м.д. В спектре CH3-CO-NH-SO2C6H5 сигнал "N лежит при -210,8 м.д. Поскольку делокализация неподеленной электронной пары азота в нашем случае меньше, чем в ацетиламинобензолсульфами-де (за счет отсутствия С=0 группы), то он должен лежать в более высоком поле. Следовательно спектры 3С и ,5N подтверждают наличие полуацеталь-ной структуры. Нельзя исключать и присутствия структуры I, если альдегидная группа находится в альдоенольной форме.

ИК спектр продукта содержит полосы, относящиеся к колебаниям связей бензолсульфамида 1600 см"1 Voc аром.» 1520 см'1 Ônh» 1320 см"1 v^ os-o> 1032 см"1 Vs o-s-o- Повышается интенсивность полосы 940 см'1 и появляется полоса 990 см"1 Vcoc полуацетальной формы.

Таким образом, 13С, 15N ЯМР и ИК спектры подтверждают полуаце-тальную структуру продукта реакции, и следовательно, амиды сульфоновых кислот реагируют с полисахаридальдегидами аналогично амидам карбоно-вых кислот.

Как следует из приведенных выше результатов спектрального исследования, декстранполиальдегиды и продукты их химической модификации почти никогда не содержат альдегидную группу в канонической форме -СНО. Обычно это альдоенольная или гидратированная форма. Если исходный ДПА находится в 2,4-окисленной форме, то продукт его химической модификации в твердом виде, как правило, стремится к образованию циклической полуацетальной структуры. Что касается моно- или дизамещения, то это зависит от условий проведения реакции и химической активности низкомолекулярного реагента.

ВЫВОДЫ

1. ЯМР спектроскопия высокого разрешения в твердых телах в сочетании с ИК спектроскопией и приближенными квантово-химическими расчетами являются удобным и надежным методом изучения строения модифицированных полисахаридов и являются необходимой предпосылкой для разработки стандартов модифицированных полисахаридов медицинского назначения.

2. Декстранполиальдегиды (ДПА) и продукты их химической модификации в твердом виде находятся, предпочтительно в гидратированной или полуацетальной форме, которые являются энергетически наиболее выгодными структурами.

3. Поскольку прямой переход гидратированной формы ДПА в полуаце-тальную энергетически невыгоден, химическая модификация ДПА должна протекать через образование альдегидной формы.

4. При химической модификации ДПА нуклеофилами продукт реакции стабилизируется в случае 2,4-окисленного ДПА, главным образом, в полуацетальной форме, а в случае 2,3-окисленного - в гидратированной.

5. Использование подхода, изложенного в п.1, позволило установить строение ряда перспективных биологически активных модифицированных полисахаридов. Разработанная методика может быть предложена как типовая.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Пассет Б.В., Нейшлос А.Л. Исследование структуры декстранполи-альдегида // X Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". -Тез. докл. М., 2003, с. 742.

2. Нейшлос А.Л., Новикова Е.В., Пассет Б.В. Исследование структуры биологически активных модифицированных полисахаридов // Материалы IV-ой Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке: Health and Education Millenium". - 2003, с. 416-417.

3. Нейшлос А.Л., Новикова Е.В., Пассет Б.В., Москвин А.В. Изучение структуры декстранполиальдегида методами ИК и ЯМР спектроскопии // Ж. прикл. хим. - 2004. - Т.77. - Вып.1. - С.132-134.

Направахрукописи

НЕЙШЛОС Арье Леон (Neishlos Л^ Leon)

ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ В ТВЕРДОЙ ФАЗЕ СТРОЕНИЯ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ МИКРОБНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ЛР № 021251 от 23.10.97. Подписало к печати 16.01.2004. Печать ризограф. Бумага тип. Тираж 100. Заказ 500.

Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия. Издательство СПХФА — член Издательско-полиграфической ассоциации вузов

Санкт-Петербурга, 197376, С-Петербург, ул. Профессора Попова, 14

РЫБ Русский фонд

2004-4 27905

Актуальность темы. Модифицированные микробные полисахариды нашли широкое применение в биотехнологии, пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности. Полисахариды в ряде случаев стимулируют неспецифическую резистентность организма животных и человека к инфекциям, ингибируют рост злокачественных опухолей, проявляют гиполипидемическую, антикоагулянтную и другие виды активности. Химическая модификация полисахаридов низкомолекулярными фрагментами привела к созданию ряда ценных лекарственных средств (например, лакрисин, полифер, поликапран, терридеказа, стрептодеказа, пирогенал, продигиозан и ДР-)

Химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице позволяет создавать пролекарства, новые препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липо-фильно-гидрофильных свойств.

В связи с этим, разработка эффективных схем и методов химической модификации полисахаридов низкомолекулярными соединениями для создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ, а также разработка методов фарманализа и стандартизации полученных веществ имеет огромное значение и является актуальной задачей фармацевтической химии.

Работы в области модификации микробных полисахаридов в медицинских целях проводятся как в России, так и за рубежом. Следует, в частности, отметить новые методы химической модификации микробных полисахаридов, разработанные в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии под руководством проф. Б.В.Пассета и проф. А.А.Иозепа [7, 22, 23-26,42, 43, 50, 51, 60, 61, 65 и др.].

Очевидно, что реализация достигнутых успехов и выпуск на фармацевтический рынок новых лекарственных средств невозможны без разработки методов анализа и стандартизации как целевых лекарственных субстанций, так и промежуточных продуктов для их синтеза.

Однако работы по изучению структуры модифицированных полисахаридов, их анализу и стандартизации сильно отстают от разработки методов химической модификации, что объясняется сложностью структуры изучаемых объектов и нерастворимостью их в большинстве растворителей.

Качество лекарственных средств (ЛС), их эффективность и безопасность гарантируются соблюдением стандартов на всех этапах сложного процесса создания ЛС: стандартов при проведении доклинических (правила вЬР) и клинических (вСР) испытаний, стандартов производства (вМР), государственных стандартов качества ЛС (ВФС, ФС).

Поэтому в исследованиях ведущих ученых РФ в области анализа химико-фармацевтических препаратов (А.П.Арзамазцев, Л.В.Акашкина, В.Л.Багирова, Т.Н.Боковикова, Н.Н.Дементьева, Н.С.Евтушенко и др.) прослеживается тенденция по введению более жестких требований к качеству субстанций, в частности по обязательному использованию новых спектральных методов исследования.

В нашей работе мы впервые применили для исследования строения

I <2 1С модифицированных микробных полисахаридов ЯМР Си Ы, а также ИК спектроскопию изучаемых субстанций в твердой фазе и показали эффективность этих новых методов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования была разработка методов изучения строения химически модифицированных микробных полисахаридов с помощью ЯМР и ИК спектроскопии в твердой фазе, что объясняется как их нерастворимостью (или низкой растворимостью), так и необходимостью разработки методов стандартизации товарной продукции в твердой фазе.

Параллельно с этим, уточнялись и чисто химические аспекты синтеза (таутомерные переходы, изомерия, реакционная способность модифицированных полисахаридов, структура соединений и устойчивость в твердой фазе и т.п.).

Научная новизна. Впервые химически модифицированные полисахариды были исследованы ЯМР 13С, 15N и ИК спектральными методами в твердой фазе, что доказало эффективность и перспективность использования этих методов для исследования БАВ сложной структуры. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена химическая схема взаимных превращений различных форм альдегидных групп в декстранполиальдегидах (ДПА). Показано, что каноническая форма альдегидной группы в полисаха-ридполиальдегидах является наименее выгодной, а потому в продуктах химической модификации декстрана по альдегидной схеме встречается только в тех случаях, когда она стабилизирована водородными связями или иными факторами. Энергетически наиболее выгодной является гидратированная форма ДПА. Для продуктов химической модификации 2,4-окисленного декстрана в твердом виде предпочтительной оказывается циклическая полуаце-тальная структура, что необходимо учитывать при разработке реакций "подлинности" и методов количественного анализа целевых БАВ.

Впервые доказана химическая структура для большого числа БАВ -химически модифицированных декстранов.

Практическая значимость. Разработана методика исследования БАВ сложной структуры в твердой фазе ЯМР и РЖ спектральными методами. Показано, что для исследования нерастворимых или плохорастворимых БАВ (JIC, в частности), этот метод имеет существенные преимущества как по точности, так и по быстроте выполнения анализа. Разработанные методики являются необходимой предпосылкой для стандартизации JIC и промежуточных продуктов для их синтеза, выпускаемых в твердом виде. Установленные вышеупомянутыми новыми для данного класса соединений методами состав и структура БАВ должны учитываться не только при разработке методов их анализа и соответствующих стандартов, но также при изучении их биологической активности и механизма действия на живой организм.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" и на IV Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке".

Публикации. По теме диссертации опубликована статья в Журнале прикладной химии и материалы 2-х докладов на конференциях.

выводы

1. ЯМР спектроскопия высокого разрешения в твердых телах в сочетании с ИК спектроскопией и приближенными квантово-химическими расчетами являются удобным и надежным методом изучения строения модифицированных полисахаридов и являются необходимой предпосылкой для разработки стандартов на модифицированные полисахариды медицинского назначения.

2. Декстранполиальдегиды (ДПА) и продукты их химической модификации в твердом виде находятся, в основном, в гидратированной или полу-ацетальной форме, которые являются энергетически наиболее выгодными структурами.

3. Поскольку прямой переход гидратированной формы ДПА в полуаце-тальную энергетически невыгоден, химическая модификация ДПА должна протекать через образование альдегидной формы.

4. При химической модификации ДПА нуклеофилами продукт реакции стабилизируется в случае 2,4-окисленного ДПА, главным образом, в полу-ацетальной форме, а в случае 2,3-окисленного - в гидратированной.

5. Использование подхода, изложенного в п.1, позволило установить строение ряда перспективных биологически активных модифицированных полисахаридов. Разработанная методика может быть предложена как типовая.