Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез и исследование замещенных амидов карбоксиметилдекстрана

РГб од

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ - Иди 'ПЦС МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАМЕЩЕННЫХ АМИДОВ КАРБОКСИМЕТИЛДЕКСТРАНА

15.00.02 — ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

На правах рукописи

ИЛЬИНА

Татьяна Юрьевна

УДК 547.458

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена на кафедрах химической технологии лекарственных веществ и витаминов и органической химии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор ПЛССЕТ Б. В., кандидат фармацевтических наук, доцент ИОЗЕП Л. Л.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор СЕВБО Дмитрий Петрович, кандидат фармацевтических наук, доцент КОНОВАЛОВ Виктор Иванович

Ведущая организация — Институт экспериментальной медицины РАМН, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится « Зо » л^ал- 1995 г. в /4* ча-

сов Зо минут на заседании специализированного совета Д 084.63.01 по присуждению степени кандидата фармацевтических наук Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, М.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института (197376, г. Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, 4/6).

Автореферат разослан « » 1995

г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат фармацевтических наук

А. В. РУСАК

I. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Химически модифицированные полисаха-ридш нашли широкое применение в медицине, фармации, биотехнологии, пищевой, косметической промышленности.

Модификация биологически активных веществ полисахаридами (например, химическая фиксация лекарственных субстанций на поли-сахаридной матрице) язляатся актуальней задачей, т.к. позволяет ссздавато новые препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимые балансом липофильно-гидрофильных свойств. При этом сами полисахариды нередко стимулируют неспецифическую резистентность макроорганизмов к инфекциям, ингибируют рост злокачественных опухолей, могут проявлять антикоагулянтную, гипслипидемическум и другие биды активности. В случаях низкой собственной фармакологической активности полисахариды (например, декстраны) представляют особый интерес как группа неспещфичес-ких транспортных макромолекул, т.к. улучшают доставку лекарственного вещества к биомишени. 3 связи с этим актуальными представляются работы по химической модификации полисахаридов низкомолекулярными соединениями с целью создания новых и совершенствования уже известных биологически активных веществ.

Представленная к защите работа входит в качестве составной части а плановые научные исследования СПХй! "Химическая модификация микробных полисахаридов". Списанные в литературе методы химической модификации Дсксграна и других полисахаридов имеют ряд недостатков, а публикации по проблеме использования сло.шых эфиров полисахаридов для ацилирования ими биологически активных веществ носят разрозненный или патентный характер. Поэтому разработка методов получения сложных эфиров и амидов карбоксилсо-дер.пащих полисахаридов представляет собой актуальную задачу как в практическом, так и в теоретическом плане.

Цель и задачи исследования. Целью исследования били поиск и разработка путей создания потенциально биологически активных соединений, в которых низкомолскулярн^е фрагменты присоединены к природным полисахаридам химической связью, сочетающей как прочность, так и лабилонссть в определенных условиях. Для достижения посхазленной цели необходимо было решить следующие задачи: I) разработать простые и удобные способы синтеза и анализа сложных, эфиров карбоксилссдерл.ащих производных полисахаридов, пригодных для ковалентного связывания с ними низкемолекулярных

веществ; 2) исследовать ацилирушщую способность сложных эфиров карбоксиметилдекстрана (ИД) в реакциях с аминами и оценить возможности и преимущества использования их для дальнейшей модификации полисахаридов; 3) найти оптимальные условия проведения реакций для присоединения к полисахариду необходимого количества низкомолекулярных фрагментов; 4) синтезировать ряд замещенных амидов НМД на основе алифатических аминов, в том числе биологически активных и лекарственных веществ, и изучито биологическую активность некоторых из синтезированных соединений.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы предложен оригинальный, простой метод синтеза сложных эфиров карбоксиметилполисахаридов и получен ряд ранее не описанных эфиров ЩД (более 10). Установлена способность гЫД образовывать лактоны, изучены условия их образования, зависимость степени лактонизации от ряда факторов. Показана возможность и исследованы условия использования сложных эфиров и лактонов г«1Д для аци-лирования алифатических аминов в водных и органических средах. Впервые синтезирован ряд новых соединений - моно- и дизамещенных амидов КМД (более 20), а также сложные эфиры и замещенные амиды карбоксиметильнлх производных оригинальных полисахаридов - ауба-зидана и родэксмана.

Практическая значимость работы. Впервые показана возможность синтеза сложных эфиров карбоксиметилполисахаридов этерифи-кацией при кислотном автокатализе без деструкции полимера, определена область применения разработанной методики для ряда полисахаридов и спиртов. Разработана простая технологичная методика синтеза замещенных амидов КМД реакцией его сложных эфиров и лак-тонов с аминами. Предложенные схемы и методики позволили использовать некоторые микробные полисахариды в качестве полимерной матрицы для синтеза потенциально биологически активных соединений. Для некоторых из полученных образцов производных декстрана, аубазидана, родэксмана показано наличие антимикробного, противовирусного действия, антигипоксических свойств, влияния на деятельность центральной нервной систем^., низкая токсичность.

Апробация работы. Результаты исследований доложещ, на Всесоюзной научной конференции "Современные проблемы получения лекарственных препаратов" (Ленинград, 15-17 мая 1990 г.), Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных веществ" (Санкт-Петербург, 28-30 июня 1994 г.), Международной конференции "Органический синтез: история развития и современные тенденции" (Санкт-Петербург, 6-10 сентября'1994 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы шесть статей и материалы шести докладов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, библиографии. Работа изложена на Л/О страницах, содержит ЦТ- таблиц, 35" рисунков. Библиография включает источников, из них на иностранных языках.

2. Содеркание работы

Лекарственные субстанции, содержащие гидрсксильную или аминогруппу, подвергаются в организме ферментативному окислению и окислительному дезаминированию. В связи с этим их часто ацилиру-ют, превращая в сложные эфиры и замещенные амиды, способные в условиях организма гидрслизоваться с регенерацией исходного биологически активного вещества. При этом удается в широких пределах варьировать липофильностыо пролекарстза и скоростью' высвобождения исходного лекарства, что позволяет снижать скорость метаболизма, изменять растворимость в различных растворителях, др. Поэтому нами изучена возможность использования производных декс-трана в качестве ацилирующих агентов с целью превращения биологически активных спиртов и аминов в пролекарства согласно приведенной схеме химической модификации.

2.1. Синтез сложных эфиров карбоксиметилдекстрана

В плане поиска наиболее простого способа получения сложных эфиров, в которых ацильной составляющей является полисахарид, была изучена этерификация карбоксиметилдекстрана.

2.1.1. Получение карбоксиметилдекстрана (¡-ИД)

Натриевую соль 1С/Д (И) получали по известной методике алки-лированием товарного декстрана (ММ 60000+10000) монохлоруксусной кислотой в изопрошловом спирте в присутствии 30%-ного водного раствора ЛаОН. Процесс контролировали по появлению в ИК-спектрах полосы поглощения ^од- см-"1". Степень карбоксиметилиро-

вания Скм (число карбоксиметильных групп, приходящихся на моно-сахаридный фрагмент полимера) определяли с помощью кондуктомет-рического титрования, что позволяло т&к.^е контролировать отсут-

Схема химической модификации декстрана

...^Х-О . «снгсоон .У р-о "■■'}—о У ЯнОН / У^КАТИОНИТ У V__

_ ОН т ОСН^СООМА _ 0СН3С00Н

°Ч / / 0У/ или ЦЧХН / \ /

_ оен^оон

/0СН2

^МООСНХО _ («ЛИ VI

ОСИ^СОМВ^К.2-(или

17-20'С. До'

,0СНг ,ОСНг

с^ГУ н]№«/

I .л л

"но\1/ но^^

мн

,оснг

осн2соон _ оыут

IV /ОСНг

/У -

ОСН,СОО№ ОСНлСОМК^- ноосн,со ж о

уй («л« * ) V 0 СНГ

Д5 СН3>- С2Н5; СдНг,; С4Нд; С&Н11; (СН3)2СНСН2; (СН3)2СНСН2СМ2; (СН3)2СН; ССН3)3С; СШССН2; (СН^СН; СбН5СН2; СбН5СН=СНСН2.

аЖ* = й1= Н; 6Ж' = Н,кг= СН2С6Н5; в)К1 = Н,Н2= СН2СН=СН2;

гЖ* = Н,кг= СН2СЙ20Н; дЖ1= СН(СЙ2)5;

еЖ1= СН2СЫ2КСС2Н5)2; жЖ' = Н,Рг= СН2СН2С6Н40Н;

зЖ1 = Н,Кг= СК2СН2(С3Н3^о); и)Е1= Н,Иг= С^СН^С^Ю;

к)^= Н,Кг= СЫ2СН2СН2ЗСН3; ЛЖ' = Н,Иг= СН(СН2ОН)СБ(ОН)С6Н4Ю2;

мЖ1= Н,К2= СН(СН3)(С10Н15); нЖ' = й,1?= СН^С^Н^О^);

остаток ремантадина остаток канамицина

оЖ1= СН3,Ег= пЖ^Б^ С2Н&; рЖ^Б^ СН2СН=СН2;

сЖ*= -(СН2)5-; тЖ*= -(СН2)20(СН2)2-; уЖ*= -СН2СН(СбН5) (СН2)2;

фЖ*= -(СН2)2ЖСН3)(СН2)2-; хЖг= -(СН2)2ЖСН2С6Н5)ССН2)2-;

цЖ* = - (СН2) ^с СН2СН=СНС6Н5) (СН2)2-;

чжг= -ссн2)2жсн(с6н5)2)(сн2)2- .

ствиьв образцах низкомолекулярн-х примесей. При соотношении реагентов 0.5+4 моля хлоруксуснои кислоты на мономерное звено полисахарида и времени реакции 1+3 и были получены образцы КМД'^Га) с С..,. С. 15+1.67.

лМ

Карбоксиметилдекстран СШ) получали, обрабатывая водные растворы КМД(Ка+) катионитом. Контроль превращения осуществляли по исчезновению в Ид-спектрах полосы поглощения (1600 см-"1') и

появлению полосы карбоксильной группы при ~1730 см~х.

2.1.2. Зтерификация карбоксиметилдекстрана спиртами

Этерификацию карбоновых кислот спиртами обычно осуществляют в присутствии минеральных кислот, что недопустимо в случае поли-сахаридкарбонозых кислот, которые в этих условиях легко деструк-тируют. В сзязи с этим нами предложен'синтез сложных эфиров полисахаридов реакцией их карбоксиметилпроизводных со спиртами в условиях автокатализа. Съедения о та :ом методе модификации полисахаридов в литературе нами не обнаружены.

Сложные эфиры 1шД (1У) синтезировали этерификацией поликислоты избытком спирта при нагревании. Наличие сложноэфирных групп в образцах полимера определяли с помощью Ж-спектроскопии после обработчи алкоголятом На для перевода незтерифицированных кислотных групп в солевую форму, т.к. полосы поглощения карбоксильной и карбалкоксильнсй групп имеют близкие значения максимумов ("1730 см-^). В »1К-спектрах обработанных основанием образцов наблюдаются полосы как см~~. '^ак и ^^О см-?

Для качественного и количественного анализа сложных эфиров ¡ЭД (1У) нами разработана фотоколориметрическая методика, основанная на цветной гидроксамовой реакции, которая часто используется з анализе низкомолекулярных ацильных соединений, йотоколо-римегрия, а также УФ-спекгромегрия в случае этерификации 1йД спиртами, поглощающими в этой области спектра, оказались удобными и надежными методами контроля реакции этерификации. По. их результатам рассчитывали степень алкоксикарбонилметилирования 1и«1Д С£КМ (число сложноэфирных групп, приходящихся на мономерное звено полисахарида) и степень этерификации Сэ - процентную долю этерифицированных карбоксильных групп от их общего числа в образце.

Для определения оптимальных условий взаимодействия хОД со спиртами, при которых достигается наибольшее содержание сложно-

эфирных групп в полимере без его Деструкции, мы изучали зависимость степени этерификации от времени и температуры реакции. При этом использовали разные спирты - первичные, вторичные, третичные, нормального и изостроения, некоторые непредельные и ароматические С табл.1-3).

Таблица I. Влияние времени реакции на степень этерификации

карбоксиметилдекстрана этанолом (при температуре 78.3 °С;С КМД 0.84)

Время реакции, ч г акм р о1 Э '

2 0.33 39

4 0.33 39

6 0.34 41

'.Таблица 2. Результаты этерификации карбсксиметилдекс трана первичными спиртами ЮН (при температуре 60 ЬС в течение 4 ч;Сум ВД 0.62)

К спиртового остатка •т ^акм сг

СН? 0.31 28

С2И5 0.28 24

0.14 17

0.10 12

С5Н11 0.С9 II

Полученные данные свидетельствуют о том, что равновесие реакции этерификации карбоксильных групп полимера достигается в первые 2-4 ч. Степень этерификации повышается с увеличением температуры реакции, но лишь до определенного предела (~5С$). При приблизительно одинаковой температуре замена первичного спирта па вторичный а третичный резки снижает степень этерификации КцЦ. Она уменьшается такие с увеличением длины углеродной цепи радикала первичного спирта.

Предложенная методика этерификации не предусматривает внесения катализатора, источником протонов, необходимых для протекания реакции, явля.отся карбоксильные группы самого полисахарида. 3 связи с этим мы изучили зависимость степени этерификации от содержания карбоксильных (карбоксиметильных) групп в полимера (табл.4).

Как и отдалось, этерификации образцов 1ЭД с большим число!» карбоксильных групп приводит к почти прямопропорциональному увеличению количества сложных эфиров в полимере, а таю^е возрастанию Спри С„„«1). добавление минеральной кислоты не позволило

<7 * лМ А

резко повысить Сэ (не выше 6С$) и сопровождалось деполимеризацией полисахарида.

Таблица 3.

Результаты этерификации карбоксиметилдекстрана различными спиртами ИОН (время реакции 4 ч; С 0.84)

Б спиртового остатка Температура реакции, °С п °акм сэ, %

сн3 64 0.33 39

СН2СН2 78 0.35 42

СН3СН2СН2 97 0.46 55

117 0.38 45

СН2СН2СН2СН2СН2 138 0.45 54

(СН3)2СНСН2 108 0.24 29

(СН^)2СНСН2СН2 131 0.41 49

СН-ССН2 114 0.38 45

С^Н^СНгСНСН^ 100 0.25 30

С6Н5СН2 100 0.25 30

(сн3)2сн 81 0.27 32

(СН^СН 100 0.23 27

(СН3)3С 82 0.15 18

Таблица 4.

Зависимость степени этерификации карбоксиметилдекстрана от степени карбоксимегилирования (реакция с этанолом при температуре 78.3 °С в течение 4 ч)

Скм 0.15 0.42 0.57 0.81 0.92 0.97 1.27 1.67

^акм 0.02 0.17 0.24 0.40 0.48 ' 0.50 0.58 0.64

IÔ 41 42 49 52 52 46 38

Таким образом, показана возможность и предложена простая методика этерификации карбоксиметилполисахаридов спиртами без добавления минеральных кислот с сохранением структуры полимера, разработаны простые методики анализа их сложных эфиров и синтезировано более 10 ранее не описанных в литературе сложных эфиров карбоксиметилдекстрана.

2.1.3. Внутримолекулярная этерификация карбоксиметилдекстрана

В процессе работы с КМД мы обнаружили, что в некоторых случаях. сложноэфирные группы появляются в образцах еще до обработки их спиртами, и объяснили это внутримолекулярной этерификащей карбоксильных групп. Образование внутримолекулярных сложноэфир-ных связей в КМД возможно как между разными звеньями цепей полимера., так и внутри одного и того же моносахаридного фрагмента. Поскольку внутренние сложные эфиры оксикислот называют лактонами, далее мы используем этот термин применительно ко всем возможным формам.

Логично было предположить, что такие лактоны могут быть использованы как ацилирующие агенты при модификации полисахарида. Однако данных о лактонизации КВД и аналогичных соединений, а также об использовании их лактонов в литературе не имеется, поэтому нами был исследован процесс образования лактонов КМД.

Внутримолекулярную этерификацию (лактонизацию) осуществляли нагреванием порошка КМД (Ш) в вакууме или в среде инертного органического растворителя. Качественный и количественный анализ лактонов КМД (У) проводили аналогично анализу его сложных эфиров рассчитывая Сакм и степень лактонизации Сл (процентную долю эте-рифицированных карбоксильных групп от их общего числа в образце)

Как и ожидалось, лактоны КМД (У) образуются труднее и медленнее, чем его эфиры с низкомолекулярными спиртами. Содержание лактонов в КМД повышается с увеличением времени и температуры реакции независимо от условий обработки (в виде сухого порошка либо в инертном растворителе), но нагревание в среде органического растворителя при прочих равных условиях позволяет . достичь больших значений Сд (табл.5,6). В работе использовались разные реакционные среды (декалин, тетрахлорэтан, 2-гексанон, диметил-сульфоксид и др.), отличающиеся по полярности и способности растворять НМД, но степень лактонизации его образцов оказалась примерно одинаковой (22-25$ при прочих равных'условиях реакции).Наилучшие результаты получены в среде диоксана (гетерогенные условия, Сп~31%) и диметилформамида (гомогенные условия, Сл~34%).Как и в случае этерификации КМд спиртами, реакция наиболее быстро идет' в первые 4 ч, затем степень лактонизации меняется незначительно. Учитывая деструкцию полисахаридов при повышенных температурах, лактонизацию КМД проводили при температурах, не превы-

Таблица 5.

Образование лактонов при сушке образцов карбоксиметилдекстрана (4 ч при 20 °С, а60°С, бЮ1°С, В140°С; 15-20 мм рт.ст.)

Скм п °акм сл, %

0.42 0.02 5

0.57 0.03 5

0.82 0.05 6

0.97 0.06 6

0.97а 0.09 9

0.976 0.20 21

0.97в 0.30 31

Таблица б.

Зависимость степени лактонизации карбоксиметилдекстрана от температуры реакции (в диоксане, в течение 4 ч; Сщ. НМД 0.57)

Температура,°С сл.%

20 II

50 12

75 18

101 28

шающих 100 °С, поэтому максимальное содержание лактонов в образцах, не более 0.40 моль на моль ангидрозвена полимера и сильно зависит от степени карбоксиметилирования полисахарида.

Таблица 7.

Зависимость степени лактонизации карбоксиметилдек,страна от степени карбоксиметилирования (реакция в диоксане при температуре 101 °С в течение 4 ч)

^км 0.15 0.42 0.57 0.84 0.92 0.97 1.39 1.67

Оя.% 7 21 26 29 33 33 29 21

При повышении содержания карбоксиметильных групп в полимере степень лактонизации сначала возрастает почти линейно, что можно объяснить увеличением концентрации одного из реагентов (кислоты), а также усилением автокатализа. После достижения максимума (при 0^1) Сд уменьшается, т.к. уменьшается количество свободных ги-дроксилов, способных вступать в реакцию лактонизации.

Таким образом, показана возможность образования и разработаны простые методики получения лактонов НМД с внутримолекулярной этерификацией до трети карбоксильных групп полимера.

2.2. Синтез замещенных амидов карбоксиметилдекстрана

Замещенные амиды карбоксиметилполисахаридов обычно получают ацилированием соответствующих аминов полимерными кислотами (в присутствии карбодиимида и его производных или без таковых), их хлорангидридами, азидами, "активированными" эфирами. Применение алкиловых сложных эфиров карбоксиметильных производных полисахаридов для ацилирования аминов практически не описано.

Для синтеза замещенных амидов карбоксиметилдекстрана мы предложили использовать в качестве ацилирующих агентов его сложные эфиры и лактоны, полученные по разработанным методикам.

Низкомолекулярные амины ацилировали в воде или в среде органического растворителя. Полученные амиды-(У1) осаждали из реакционной массы этанолом или отделяли фильтрованием и -переосаждали из водно-щелочного раствора для удаления низкомолекулярных примесей и получения Яа+-солей полимера. Чистоту продуктов реакции (УН) от свободного и ионносвязанного амина контролировали методом тонкослойной хроматографии. Анализ амидов НМД осуществляли методами ИК-, УФ-спектроскопии, кондуктометрического титрования и элементного анализа. В ИК-спектрах соединений в форме (УП) широкая полоса поглощения карбоксилатаниона при

1600 см~* мешает обнаружению амидной группы. После обработки кислотой и выделения продуктов в Н+-форме амидную связь доказывали во всех синтезированных соединениях по наличию в ИК-спектрах полос при 1535-1590 см-*, 1640-1665 см--*-, отсутствующих в спектрах исходных веществ и характерных для "амид II" и "амид I'.' В случае дизамещенных амидов, как и ожидали, наблюдали только полосу "амид I" при 1640-1660 см""*; полоса поглощения при 1730 см~ соответствует карбоксильной группы полисахарида. Количественно амиды КМД характеризовали определением степени замещения, или аминокарбонилметилирования, Сшлкм (число аминокар-бонильных (амидных) групп, приходящихся на моносахаридный фрагмент полимера) и расчетом' степени амидирования С^ (процента превращения сложноэфирных групп полисахарида в амидные). Значения Самку рассчитывали по данным УФ-спектрометрии при помощи уравнений калибровочных прямых, по результатам кондуктометрического титрования свободных карбоксильных групп полиамида с учетом С исходного образца КМД, результатам элементного анализа.

2.2.1. Ацилирование первичных алифатических аминов сложными эфирами карбоксиметилдекстрана

Ацилирование аминов сложными эфирами (1У) и лактонами (У) КЫД изучали на примере реакции с бензиламином. Выбор модельного амина определен его хорошей растворимостью в воде и большинстве органических растворителей, возможностью качественного.и количественного анализа продуктов по наличию характерных полос поглощения в ИК- и УФ-спектрах и др. В УФ-спектрах водных растворов ^а+-солей ДГ-бензиламидов НМД (УП-б) наблюдаются полосы, поглощения с максимумами при 252, 257 нм, аналогичные полосам в спектрах ..бензиламина и Я-бензилацетамида и отсутствующие в спектрах исходного полисахарида.

В связи с тем, что вода является наилучшим, а в некоторых случаях и единственным растворителем для использованных полисахаридов и некоторых их производных, нами были предприняты попытки проведения реакций именно в водной среде. Чтобы свести до минимума возможный гидролиз исходных сложных эфиров и образующихся амидов НМД, ацилирование аминов в воде проводили в основном при температуре 17-20 °С, что немаловажно при модификации биологически активных соединений.

Подбирая условия ацилирования бензиламина в водной среде, мы изучили влияние времени реакции и соотношения реагентов на степень амидирования этиловых эфиров КМД (табл'.8). При малом избытке амина достичь 100%-ного превращения эфиров в амида при комнатной температуре не удается даже за-20 ч. Для полного и быстрого превращения сложноэфирных групп в амидные необходим более, чем пятикратный избыток амина.

Таблица 8.

Ацилирование бензиламина' этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана в водной среде (при 17-20 °С)

Количество амина, в молях на моль сложноэфирных групп Время реакции, ч сам' ^

1.2 I 51

1.2 3 56

1.2 20 65

3.1 I 74

3.1 3 98

5.3 I 100

Проведенное исследование (табл.9) показало, что достаточно хорошими ацилирующими агентами являются различные сложные зфиры и лактоны НМД. При этом увеличение числа углеродных атомов в радикале сложного эфира приводит к некоторому снижению реакционной способности его в водной среде.

Таблица 9.

Ацилирование бензилашна сложными эфирами карбоксиметилдекстрана в водной среде (при температуре 17-20 °С в течение I ч, соотношение реагентов 4.6-5.4 моля амина на моль сложноэфирных групп полисахарида)

Сложный эфир КМД (1У,У) р акм эфира КМД С ами-амкм да КМД по данным УФС Содержание азота в натриевой соли амида КМД(УП-б),% рассчитано найдено Сеш> %

метиловый 0.38 0.38 2.12 2.20 100

этиловый 0.39 0.36 2.00 2.00 92

г^опиловый 0.38 0.30 1.71 1.80 79

бутиловый 0.34 0.26 1.49 1.50 76

пентиловый 0.33 0.24 1.36 1.30 73

лактон 0.26 0.24 1.30 1.40 92

При модификации полисахаридов водонерастворимыми аминами возникает необходимость проведения реакций в неводных средах. В связи с этим мы изучили ацилирующую способность сложных эфиров ЩЦ в среде даоксана и диметилсульфоксида (ДМСО). Полученные результаты (табл.10,11) позволяют сделать вывод, что ацилирование алифатических аминов сложными эфирами КМД в неводных средах возможно, но менее■эффективно, и для обеспечения высоких степеней превращения в амиды КМД требуется увеличение соотношения реагентов, повышение температуры и времени взаимодействия. Необходимо отметить, что при ацилировании в диоксане реакция проходила как гетерогенная, а в ДМСО - как гомогенная. Ацилирушщая способность эфиров КМД в ДМСО была ниже, чем в воде, но значительно выше, чем в диоксане. Несколько неожиданным оказался факт, что в диоксане заметно эффективнее реагировал с амином пропиловый эфир КМД особенно при низких температурах. По-видимому, более гидрофобный радикал способствовал лучшей набухаемости полимера, что облегчало атаку реакционного центра нуклеофилом. Наоборот, меньшую

реакционную способность в диоксане проявили лактоны КМД, которые в наименьшей степени взаимодействуют с растворителем. При повышении температуры реакции до 100 °С количество амидных .связей в продуктах реакции начинает превышать количество сложноэфирных в исходном полимере ССам>100%). Мы показали, что в этих условиях наряду со сложноэфирными в ацилировании аминов участвуют и карбоксильные группы полисахарида.

Таблица 10.

Ацилирование бензиламина сложными эфирами карбоксиметилдекстрана в среде диоксана (при соотношении 20.1 моль амина на моль сложноэфирных групп полисахарида)

Сложный эфир НМД Температура реакции,°С Время, ч Сам» $

этиловый 17 48 35

50 6 74

100 3 117

пропиловый 17 48 67

50 6 84

лактон 17 48 27

50 6 31

Таблица II.

Ацилирование бензиламина этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана в среде ДМСО (соотношение реагентов 5.3 моля амина на моль сложно-эфирных групп полимера; С„м образца 0.96, Сакм 0.50)

Температура-реакции, °С Время реакции, ч С„„„., ами-амкм да КМД(УП) Содержание азота в натриевой соли амида КМД (УП), % рассчитано найдено

17 24 0.36 1.92 1.89 72

17 48 0.40 2.11 2.13 80

50 I 0.28 1.52 1.60 56

50 3 0.43 2.25 2.32 86

50 6 0.50 2.57 2.63 100

75 I 0.43 2.25 2.30 86

75 3 0.49 2.52 2.57 98

По разработанным методикам проаудированы некоторые простейшие первичные алифатические амины (табл.12), а также' синтезированы потенциально биологически активные производные, в котсцзых с полисахаридной матрицей связаны канамицин, 1-адамантил-1-этан-амин, I-(п-нитрофенил)-2-амино-1,3-пропандиол, 2-(р~имидазолил)-1-этанамин, 2-(п-гидроксифенил)-1-этанамин и др.

Таблица 12.

Ацилирование первичных алифатических аминов этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана

Амин Р*<а Сам» ^

амина в воде (17 °С, I ч) в ДМСО (50 °С, З.ч)

Бензиламин 9.37 100 86

Этаноламин 9.50 88 96

Аллиламин 9.69 86 84

Циклогексиламин 10.64 35 88

2.2.2. Ацилирование вторичных алифатических аминов сложными эфирами карбоксиметилдекстрана

Изучая возможность и целесообразность модификации карбоксиметилдекстрана вторичными аминами, мы полагали, что условия их ацилирования должны быть более жесткими, чем при ацилировании первичных аминов. Результаты экспериментов (табл.13) подтвердили это.

. Ацилирование эфирами КВД различных вторичных аминов иллюстрируется рисунками 1-3 и табл.14. Как видно из приведенных результатов, степень амидирования эфиров полисахарида определяется природой и свойствами амина; возрастает.с увеличением основности циклических аминов; для нециклических она, кроме того, зависит от природы радикалов у атома азота. Необходимо также сделать вывод об общей для всех испытанных вторичных аминов низкой эффективности взаимодействия со сложными эфирами карбоксиметилдекстрана в водной среде.

Таким образом, показала возможность использования полученных нами сложных эфиров и лактонов КВД для ацилирования первичных и вторичных алифатических аминов, разработаны простые, не требующие малодоступных или токсичных реагентов методики синтеза

Таблица 13.

Ацилирование метилбензиламина этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана в среде ДМСО (соотношение реагентов 5.3 моля амина на моль сложно-эфирных групп полисахарида; С образцов 0.96, С км 0.50)

Температура Время, ч с амкм амида ЩЦ (УП-о), рассчи-- Сам> $

реакции, °С танная по данным

УФС кондуктометр.титрования

17 24 0.11 О.П 22а

17 24 0.11 0.10 22

50 3 0.18 0.18 36

50 6 0.22 0.23 44

50 6 0.28 0.28 56б

75 6 0.36 0.36 72

100 6 0.49 0.48 98

Примечания: ареакция проведена в водной среде; Соотношение ре-

агентов 11.2 моля амина на моль сложноэфирных групп

С цм у/о

Сцм,/»

Рис Л. Зависимость С„„ эти-ам

лов ого эфира ШД от количе-■ ства амина (Гъ ), приходящегося- на моль сложноэфирных групп полимера, в реакциях с диэтиламином (ДМСО, 50°С, 6 ч) (I) и Я-бензилпиперази-ном .(диоксан, Ю0°С, 6 ч)(2).

Рис.2. Зависимость С„„ этилового ам

эфира КМД от времени №) в реакции с бензиламином (I), 3-фенилпирроли-дином (2), Я-бензилпиперазином (3), пиперидином (4), метилбензиламином (5) и диэтиламином (6) в среде ДМСО при температуре 50 °С.

Рис.3. Зависимость С^ этилового эфира ЩЦ от температуры (1.) реакции с бензиламином (I), Я-бен-зилпиперазином (2), пиперидином (3), метилбензил-амином (4), диаллиламином С5) и морфолином С6) в среде ДМСО (время реакции I ч для 1-3 и б ч для 4-6).

Таблица .14.

Ацилирование аминов этиловым эфиром карбоксиметилдекстрана (соотношение реагентов 5.3 моля амина на моль сложноэфирных групп полисахарида)

Амин РКа Сам' %

амина в воде (17°С, 24 ч) в ДМСО (50°С, 6 ч)

Бензиламин 9.37 100 (за I ч) 100

Метилбензиламин 9.58 22 44

Диэтиламин 10.93 5 14

Диаллиламин 9.29 - 12

З-Фенилпирролидин -и.зо - 95

Пиперидин 11.22 12 77

tf-Бензилпиперазин -9.80 23 71

Морфолин 8.36 9 35

замещенных амидов карбоксиметилполисахаридов, получен ряд ранее не описанных в литературе производных карбоксиметилдекстрана (23 моно- и дизамещенных амидов).

2.3. Исследование устойчивости декстрана в условиях эксперимента

Физические, химические свойства и биологическая активность полисахаридов часто зависят от их молекулярной массы. Поэтому при химической модификации подобных биополимеров важное значение имеет контроль степени деструкции. В связи с этим нами исследована- устойчивость декстрана к кислотно-гидролитической деструкции при модификации его по разработанной' схеме. С этой целью сравнивали молекулярно-массовое распределение полисахарида на всех стадиях синтеза его производных, используя метод гель-хроматографии. Для увеличения однородности товарного декстрана его фракционировали этанолом, отбирая три первые фракции, охарактеризованные определением молекулярной массы (ММ) и молекулярно-массового распределения (ММР). Из гомогенной фракции декстрана (ММ-150000) синтезировали КМД(Иа+) с С[Ш 0.89; лактон КВД с Сакм 0.18; этиловый и пентиловый эфиры с Сакм 0.30 и 0.28 " соответственно. Лактон и этиловый эфир КМД использовали для ацилирования бензиламина в водной среде при 17-20 °С, а также в диоксане при 100 °С (Сшлкм продуктов 0.1240.35). Кроме этого, этиловые эфиры КМД синтезировали, использовав в разработанной нами методике концентрированный водный раствор КМД вместо его сухого порошка, а также с добавлением в реакционную массу каталитических количеств минеральной кислоты.

Гель-хроматографию образцов осуществляли на колонке К-16/40 "РЕАНМ" (1.6x40 см) с сефадексом марки 6-200. Элюат собирали порциями по объему и количественно анализировали фотоколориметрическим методом по цветной реакции Сахаров с фенолом в присутствии концентрированной серной кислоты. Результаты исследования представлены на рис.4.

Как и предполагалось, существенная деструкция полимера обнаружена только в случае синтеза сложных эфиров с добавлением минеральной кислоты в качестве катализатора, а также при замене в синтезе эфиров сухого порошка КВД на его водный сироп. Деструкция полисахарида наблюдалась и в случае синтеза пентилового эфира КМД, что можно объяснить сравнительно жесткой температурной обработкой образца (138 °С). Во всех остальных случаях заметной деструкции полисахарида при его модификации не обнаружено.

Таким образом, показано, что модификация декстрана по разработанным нами схеме и методикам не сопровождается заметной его деструкцией.

V«.

V,,

Рис.4. Молекулярно-массовое распределение выделенной гомогенной фракции декстрана,(I) и синтезированных на ее основе образцов МД(Ма+) (2), КЪЩ (3), лактона КВД (4), пентилового (5) и этиловых эфиров КМД, полученных по предложенной методике (6) и с добавлением в качестве катализатора конц.^ЗО^ (7), натриевых солей Я-бензиламидов КМД, синтезированных в водной среде при температуре 17-20 °С (8) и в среде диоксана при 100 °С (9). У-объем элюата, Чсв - свободный объем колонки, мл .

2.4. Синтез замещенных амидов других карбоксиметилполисахаридов

Чтобы изучить возможность применения разработанной схемы модификации декстрана для других полисахаридов, осуществили синтез производных аубазидана (разветвленного р.—1,3— —I,о— ,оС—1,4— глюкана, продуцируемого -Aureobo.sicH.um ри11и1ап$ , штамм Ь) и родэксмана (£-1,3-|1-1,4-маннана, продуцируемого йЬосЫоги1а. гиБг-а.' ). По предложенным методикам были получены их карбокси-метильные производные в Яа.+- и Н+-форме, этиловые эфиры и ^-бен-зиламиды карбоксиметилаубазидана (КМА) и карбоксиметилродэксмана' (КМР) (табл.15,16), а также потенциально биологически активные соединения, содержащие ковалентно связанный с КМА и КМР антибиотик канамицин.

Таблица 15. Результаты этерификации карбоксиметилпроизводных полисахаридов

Полисахарид С^ Сакм Сэ,%

Декстран 0.96 0.50 52

Декстран 1.08 0.57 53

Аубазидан 0.95 0.40 42

Родэксман 1.02 0.40 39

Анализируя полученные результаты, можно отметить, что реакции модификации аубазидана и родэксмана проходят несколько труднее и медленнее, чем декстрана, что,- видимо, связано с особенностями структуры и свойств этих полисахаридов. Тем не менее, схема и методики позволяют получать производные аубазидана и родэксмана с необходимыми степенями их превращения.

Таким образом, показана возможность применения разработанной схемы сиг.теза сложных эфиров и замещенных амидов карбоксиме-тилдекстрана для других полисахаридов, отличающихся от декстрана структурой и свойствами.

2.5. Физико-химические свойства и биологическая активность синтезированных производных полисахаридов

Производные полисахаридов синтезированы из товарного декстрана, промышленных партий аубазидана и родэксмана; являются- высокомолекулярными и, как и исходные полисахариды, полидисперсными по молекулярной массе соединениями.

Сложные эфиры карбоксиметилдекстрана представляют собой белые или белые с кремовым оттенком аморфные порошки, без запаха, набухающие в воде, частично растворимые в спирте, нерастворимые в эфире.

Замещенные амиды карбоксиметилполисахаридов - натриевые соли Я- или М,М-замещенных аминокарбонилметилкарбоксиметилпроиз-водных декстрана, аубазидана, родэксмана; аморфные порошки белого или белого с желтоватым или кремовым оттенком цвета,, без запаха, растворимые в воде, нерастворимые в большинстве органических растворителей.

Таблица 16.

Ацилировакие бензиламина этиловыми эфирами карбоксиметилполисахаридов

Полисахарид Сам» ^

в воде в ДМСО

(1?°С,1 ч) (50°С,3 ч)

Декстран 100 86

Аубазидан 100 70

Родэксман 45 43

Для ряда синтезированных производных карбоксиметилдекстра-на, -аубаэидана, -родэксмана наш проведены предварительные фармакологические испытания. Острую токсичность двадцати соединений оценивали на белых нелинейных мышах массой тела 18-20 г; водные растворы веществ вводили внутрибрюшинно в дозах 500+1200 мг/кг веса, наблюдения за животными вели в течение 48 ч . Для соединений УИ-ч и УН-н ЛД5д составили соответственно 834+158 мг/кг и 2120+311 мг/кг . Для остальных препаратов при введении более 1000 мг/кг веса не отмечено гибели животных. Полученные результаты позволяют отнести практически все исследованные соединения к малогоксичным.

Противогипоксические свойства двадцати соединений изучали на модели острой гипобарической гипоксии на 260 белых нелинейных мышах при внутрибрюшинном введении водных растворов веществ за 0.5 ч до "подъема" в барокамере. Среди исследованных соединений выявлено II со слабым антигипоксическим эффектом. 5 соединений проявили умеренный аффект, обеспечивая прирост длительности жизни в условиях гипоксии и выживаемость 20-40% животных при 100%-ной гибели контроля. Натриевая соль Я-2-(п-гидроксифенил)-этил-амида КМД (УП-ж) превосходила эталонный антигипоксант гутимин как по показателю выживаемости (60%), так и по приросту длительности жизни (на 756%), и проявила таким образом выраженный анти-гипоксический эффект.

В двух сериях экспериментов изучали действие некоторых синтезированных соединений на ВДС. В опытах на 60 белых нелинейных мышах оценивали влияние декстрана, натриевой соли. КМД и трех замещенных амидов ЩЦ, проявивших наиболее выраженные антигипокси-ческие свойства (УП-б, УП-ж, УП-ч), на снотворный эффект гексе-нала. При внутрибрюшинном введении водных растворов веществ за I ч до введения гексенала регистрировали время латентного периода и продолжительность наркоза. У грех соединений УП-б, УП-ж и УП-ч выявлена способность потенцировать снотворный эффект гексенала (увеличение продолжительности сна в 2-10 раз), что доказывает наличие у них депримирующего действия на ЦНС. В опытах на 10 белых нелинейных крысах самцах оценивали влияние соединения УП-ж на.основные этологические показатели. Определение осуществляли -по специальной методике двух тестов "открытое поле" и "нор-г ковый рефлекс". Исследованное производное КМД при внутрибрюшинном введении водного раствора предупреждало снижение ориентировочной активности, эмоциональной лабильности и агрессивности

животных при повторном воздействии стрессорных факторов, вызывало некоторое уменьшение поисковой активности, оказывая влияние, сравнимое с действием транквилизаторов дневного типа. Показали также, что наиболее чувствительны к действию УП-ж животные, относящиеся к группе умеренно высокоустойчивых к стрессу.

Антимикробное действие трех производных КВД и КМР, содержащих химически связанный антибиотик канамииин, и исходного кана-мицина сульфата в опытах In vitro определяли методом двукратных серийных разведений в жидких средах. Результаты исследований показали, что все испытанные соединения проявляют антимикробное действие в том же спектре, что и исходный антибиотик. Для кова-"лентносвязанного с КМД и КМР канамицина отмечено снижение активности (в 10-40 раз), для ионносвязанного - некоторое усиление (в I.5-1.8 раза) по сравнению с канамицина сульфатом.

Антивирусное действие синтезированных адамантилэтанаминосо-держащих производных КМД изучено в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН. Показано, что исследованные вещества проявляют значительно меньшую цитотоксичность для клеток МДСК, чем ремантадин. На модели вируса гриппа А/Виктория/35/72(НЗ>/2) установлено, что декстран не подавляет репродукцию вируса, натриевая соль КМД подавляет ее в незначительной степени. Препараты с козалентносвязанным адамантилэтан-амином заметно ингибируют репродукцию вируса в клетках (до 60-70?и), а ионносвязанный КМД-адамантилэтанамин препарат проявляет вирусингибирующую активность, сравнимую с активностью ремантадина, снижая репродукцию как внеклеточного, так и внутриклеточного вируса на 78$ в дозе 25 мкг/мл .

Таким образом, в результате химической модификации декстра-на, аубазидана, родэксмана низкомолекулярными аминами, получены соединения, которые в предварительных испытаниях проявили антимикробную, противовирусную активность, антигипоксические и психотропные свойства при низкой токсичности.

Выводы

I. Разработана схема химической модификации полисахаридов низкомолекулярными спиртами и аминами, перспективность которой показана на примере модификации декстрана, аубазидана и родэксмана.

2. Предложен простой технологичный метод синтеза и методика количественного анализа сложных эфиров карбоксиметилполисахаридов. Получено более 10 ранее не описанных сложных эфиров карбоксиметилдекстрана.

3. Показана возможность образования и разработаны простые методики получения внутримолекулярных эфиров (.лактонов) карбоксиме-тилдекстрана.

4. Показана возможность использования сложных эфиров и лактонов карбоксиметилполисахаридов в качестве ацилирующих агентов для дальнейшей модификации полимеров. Исследована реакционная способность сложных эфиров и лактонов карбоксиметилдекстрана при взаимодействии с первичными и вторичными алифатическими аминами. Установлено, что ацилирование аминов эфирами КМД можно проводить как в водной, так и в неводных средах.

5. Разработаны простые, не требующие малодоступных или токсичных реагентов методики синтеза замещенных амидов карбоксиметилполисахаридов, позволяющие вводить в полимер расчетное количество низкомолекулярных фрагментов. Синтезировано. 25 различных замещенных амидов карбоксиметилпроизводных декстрана, аубазидана, родэксмана.

6. Методом гель-хроматографии доказано, что синтез производных декстрана в соответствии с предложенной схемой и по разработанным методикам не сопровождается заметной деструкцией полисахарида.

7. При проведении предварительных фармакологических испытаний среди исследованных синтезированных производных полисахаридов выявлены соединения, проявляющие антигипоксические свойства, оказывающие влияние на деятельность ЦНС, в связи с чем может быть перспективным дальнейшее изучение их как потенциальных фармакологических средств. Показано, что полученные производные полисахаридов, содержащие канамицин и адамантилэтанамин, обладают соответственно антимикробным и противовирусным действием. Установлено, что все испытанные соединения относятся к малотоксичным.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

I. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Синтез сложных эфиров карбоксиметилдекстрана //Ж.прикл.химии.-1993.-Т.6б, № 5.-C.II06-III0.

2. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Пассет Б.Б. Лактоны карбоксиметил-декстрана //М.прикл.химии.-1994.-Т.67, № 3.-С.467-469.

3. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Синтез замещенных амидов карбоксиметилдекстрана //Ж.прикл.химии.-1994.-Т.67, № 3. С.470-474.

4. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Кузнецова Т.Е., Пассет Б.В. Устойчивость декстрана в гшмических реакциях и особенности выделения целевых продуктов /Д.прикл.химии.-1994.-Т.б7, № 6. -C.I0I2-I0I6.

5. Ильина Т.Ю., Сибикина О.В., Иозеп A.A. Новый подход к химической модификации декстрана //&.орг.химии.-1994.-Т.30, № 9.

6. Иозеп A.A., Ильина Т.Ю., Пассет Б.В. Исследование ацилиру-ющей способности сложных эфиров карбоксиметилдекстрана в реакциях с первичными и вторичными алифатическими аминами //

jü.прикл.химии.-1995.-Т.68, Г» I.-С.ЮS-iog.

7. Горделянова Л.Н., Воронина И.Н., Ильина Т.Ю., Филимонова И.В. Синтез биологически активных коваленгао связанных производных полисахаридов //Современные проблемы получения лекарственных препаратов.-Тез.докл.конф.молодых ученых, 15-17 мая 1990 г.-М., 1990.-С.61.

6. Ильина Т.Ю., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Синтез сложных эфиров как способ модификации микробных полисахаридов // Химия и технология лекарственных веществ.-Материалы Всеросс.конф., 28-30 июня 1994 г.-СПб, 1994.-С.62.

9. Ильина Т.Ю., Иозеп A.A., Пассет Б.З. Синтез амидов карбоксиметилдекстрана // Там же.С.62.

10. Ильина Т.Ю., Суворова Ю.В., Стукалова И.А., Иозеп A.A., Пассет Б.В. Модификация декстрана вторичными аминами //Там же.С.63.

11. Козелецкая К.Н., Ильина Т.Ю., Иозеп A.A., Соминина A.A. Конструирование антивирусных препаратов на основе промышленных декстранов (полиглюкин) и производных адамантана //Там же.С.18.

12. Ильина Т.Ю., Сибикина О.В., Иозеп A.A. Новый подход к химической модификации декстрана //Органический синтез: история развития и современные тенденции.-Тез.докл.1-ой Международной конф.молодых ученых, 6-10 сентября 1994 г.-СПб, 1994.-С.81-82.

В заключение мы благодарим за помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы, заведующих кафедрами профессора Б.А.Ивина, профессора Н.П.Блинова, профессора Л.В.Пастушенкова, профессора Е.Е.Лесиовскую и сотрудников кафедр органической химии, микробиологии, фармакологии СПХЩ.