Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и стандартизация сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения

На правах рукописи 003177805

Галиахметова Эльвира Халитовна

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СБОРА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ

15 00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

>1 7 AHB ЭД

Пермь - 2007

003177805

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО БГМУ Росздрава)

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук,

доцент Хасанова Светлана Рашитовна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

профессор Петриченко Василий Михайлович доктор фармацевтических наук, профессор Даргаева Тамара Дарижаповна,

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «5» февраля 2008г в 13 00 ч на заседании диссертационного совета Д 208 068 01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», по адресу 614990, г Пермь, ГСП-277, ул Ленина, 48

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», по адресу 614070, г Пермь, ул Крупской, 46

Автореферат разослан «28» декабря 2007г Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208 068 01, к фарм н, доцент Е В Метелева

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ Сосудистые заболевания головного мозга представляют важнейшую медицинскую и социальную проблему в связи с высокой распространенностью и тяжелыми последствиями для здоровья населения По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно от цереброваскулярных заболеваний умирают около 5 миллионов человек и основное место среди них занимают острые нарушения мозгового кровообращения (инсульты) Их количество у нас в стране составляет около 450 тысяч в год (второе место в структуре общей смертности населения) Несмотря на большой ассортимент лекарственных препаратов, используемых при данной патологии, показатели смертности от цереброваскулярных заболеваний в России являются одни из самых высоких в мире и, в отличие от большинства экономически развитых стран, не только не снижаются, но и имеют тенденцию к увеличению Чаще инсультом заболевают 40-50-летнее работоспособное население, 56-81% из которого в последствии остаются инвалидами и нуждаются в постоянном приеме хими-опрепаратов Одним из путей решения этой острой проблемы может служить применение лекарственного растительного сырья, использование которого способствует снижению дозы синтетических препаратов, значительному уменьшению осложнений и побочных эффектов

Таким образом, создание высокоэффективных, безвредных, экономически доступных и удобных в применении лекарственных растительных средств для профилактики и комплексной терапии нарушений мозгового кровообращения является актуальным

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью диссертационной работы явилась разработка многокомпонентного сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения из лекарственного растительного сырья, разрешенного для применения в медицинской практике на территории Российской Федерации, его стандартизация и создание на основе сбора рациональной лекарственной формы

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие

задачи

разработать, теоретически и экспериментально обосновать пропись сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения,

провести фармакогностическое изучение сбора с целью его стандартизации,

провести исследования фармакологической активности сбора, разработать лекарственную форму на основе предложенной прописи и провести ее фотохимические исследования, разработать проекты нормативной документации на предлагаемый сбор и лекарственную форму НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые разработан, теоретически и экспериментально обоснован сбор, содержащий 11 видов лекарственного растительного сырья, разрешенных для применения в медицинской практике на территории РФ, для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения

С использованием современных физико-химических методов анализа изучен состав биологически активных веществ исследуемого сбора, обеспечивающих его лечебное действие, и определено количественное содержание флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, суммы дубильных соединений, эфирного масла, сапонинов, аскорбиновой кислоты, полисахаридов, каротиноидов и алкалоидов Проведено хроматографи-ческое исследование фенольных фракций сбора и предложена методика качественного анализа для флавоноидов

Разработана спектрофотометрическая методика количественного анализа сбора по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин

Установлены микродиагностические признаки анализируемого сбора Микроскопический метод предложен, как один из методов стандартизации и контроля качества компонентов прописи посредством количественной оценки проявления диагностически значимых признаков

Проведены фармакологические исследования сбора Определены ан-тиоксидантное, антиагрегационное, антикоагулянтное, антигипоксическое действие сбора, доказана его нетоксичность

Разработана рациональная лекарственная форма - жидкий экстракт (1 1) Установлены показатели его качества и содержание биологически активных веществ, подтверждающие рациональность технологического процесса получения лекарственной формы Определены сроки годности лекарственного средства

Разработаны проекты фармакопейных статей предприятия на сбор для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения и на жидкий экстракт из сбора

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Теоретические и экспериментальные исследования показали целесообразность дальнейшего фармакологического исследования предложенного сбора в качестве средства для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения

Разработаны проекты фармакопейных статей предприятия на сбор и жидкий экстракт при нарушении мозгового кровообращения Подана заявка на изобретение «Сбор при нарушении мозгового кровообращения»

Предложенная оптимальная лекарственная форма позволяет решить задачу рационального использования лекарственного растительного сырья при изготовлении сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения в заводских условиях

Результаты технологических исследований могут быть использованы при разработке нормативной и технологической документации для промышленного производства рациональной лекарственной формы - жидкого экстракта

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского государственного медицинского университета

Метод определения диагностически значимых признаков может

быть использован для стандартизации многокомпонентных растительных композиций

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ: результаты теоретического и экспериментального обоснования сбора для лечения и профилактики нарушений мозгового кровообращения, результаты фармакологических исследований сбора по выявлению специфической активности, результаты фотохимических, фармакологических и технологических исследований по созданию рациональной лекарственной формы - жидкого экстракта на основе предложенного сбора

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2003), научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования» (Уфа, 2006), научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2007), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007)

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Фармакология и фармация» Номер госрегистрации 01200507996

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание работы отражено в 11 статьях и тезисах докладов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ВЫПОЛНЕНЫ на кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии БГМУ и в лаборатории новых лекарственных средств ИОХ УНЦ РАН (г Уфа) Сотрудникам данных подразделений выражаем глубокую благодарность

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа из-

ложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 экспериментальных глав, выводов и списка литературы, 40 таблиц и 19 рисунков Список литературы включает 165 библиографических источников, из которых 23 иностранных

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом фармакогностического исследования явился сбор, разработанный для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения (НМК) Компоненты сбора разрешены к применению в медицине Все виды сырья были закуплены на аптечном складе Государственного унитарного предприятия «Башфармация» и ООО «Травы Башкирии»

Объектами фармакологических исследований служили 18 видов лекарственного растительного сырья (ЛРС)

Объектами химических и технологических исследований служили настойки на 70% этиловом спирте, полученные различными методами (мацерацией, перколяцией, методом ВНИИФ), жидкие экстракты на 40% и 70% этиловом спирте, полученные методами перколяции и ВНИИФ

Приготовление сбора, отбор проб для анализа, изучение характеристик подлинности и показателей качества осуществляли, руководствуясь общими статьями ГФ XI издания

Качественный и количественный анализ, идентификацию природных биологически активных веществ, содержащихся в объектах исследования, оценивали с использованием современных методов фотохимического анализа хроматографического, спектрофотометрического, ИК- и УФ-спектрального и др

Для идентификации компонентов в сборе использовали макро- и микроскопические методы анализа Методом микроскопического анализа проводили контроль качества всех компонентов сбора и стандартизацию

самого сбора посредством количественной оценки проявления диагностически значимых признаков (ДЗП). Микродиагностические признаки приведены на фотоснимках, полученных с помощью цифрового фотоаппарата Canon 400

Фармакологические исследования проводили на 74 белых беспородных мышах обоего пола и 20 крысах Определение острой токсичности проводили по известной методике Антиагрегационную активность исследовали в плазме крови по модифицированному методу Борна Антикоагу-лянтную активность определяли по протромбиновому времени Антиги-поксическую активность изучали на животных по продолжительности жизни при нормобарической гипоксии с гиперкапнией Антиоксидантную активность (АОА) исследуемого сбора определяли по его способности ин-гибировать аутоокисление адреналина in vitro и экспресс-методом на культуре клеток

Статистическую обработку полученных результатов проводили путем расчета средней и средней квадратичной ошибки О достоверности результатов судили, используя t-критерий Стьюдента

Теоретическое и экспериментальное обоснование компонентного состава сбора

Задачей наших исследований явилась разработка сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения с учетом поливалентности данной патологии В состав сбора должны быть включены растительные компоненты, влияющие на основные звенья этиопатогенеза и обладающие следующими видами фармакологической активности анти-оксидантной, антигипоксической, улучшающей мозговое кровообращение, антикоагулянтной, антиагрегантной, антигипертензивной, диуретической, спазмолитической, антиатеросклеротической и др

На основании информационно-литературного поиска нами были выбраны 18 видов ЛРС, обладающие различными видами фармакологиче-

ской активности листья мяты перечной (folia Menthae piperitaé), плоды шиповника (fructus Rosae), плоды боярышника (fructus Grataegí), трава полыни обыкновенной (herba Artemisiae vulgaris), корень солодки (radix Glycyrrhizaé), листья барвинка малого (folia Vincae minoris), соплодия хмеля (strobili Lupulí), трава сушеницы топяной (herba Gnaphalu uliginosí), плоды рябины (fructus Sorbí), листья подорожника большого (folia Plantaginis majoris), цветки ромашки (flores Chamomillaè), трава мелиссы обыкновенной (herba Melissae officinalis), корни одуванчика (radices Taraxaci), плоды аниса обыкновенного (fructus Anisi vulgaris), семена льна (semina Lini), плоды тмина (fructus Carvi), цветки липы (flores Tiliaé), трава донника лекарственного (herba Mehloti officinalis)

При составлении прописи сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения мы исходили из разработанных проф Никитиной Т И методологических принципов создания растительных композиций с предполагаемым новым спектром фармакологической активности Сбор составлялся с учетом необходимости влияния на отдельные звенья этиопатогенеза при НМК гипоксические синдромы с критическими состояниями неврологического генеза, нарушение трофики мозговой ткани, развитие системных функциональных и эмоционально-волевых расстройств в организме под действием суммы стрессовых ситуаций, внутричерепная гипертензия и отек мозга, синдром полиорганной недостаточности, патохимические нарушения Из выбранных 18 видов J1PC были составлены различные сочетания и определена их антиоксидантная активность После проведенных исследований была выбрана пропись, обладающая наибольшей АОА и обеспечивающая комплексное воздействие на все патогенетические звенья нарушений при НМК

При составлении сбора мы учитывали также возможность сырьевого обеспечения промышленного производства предлагаемого сбора в Республике Башкортостан, и с этой целью использовалось, преимущественно, местное сырье

В состав сбора вошли- трава донника (2 части), плоды боярышника (1 часть), плоды рябины обыкновенной (1 часть), плоды шиповника (1 часть), трава барвинка малого (1 часть), трава сушеницы топяной (1 часть), трава полыни обыкновенной (1 часть), листья подорожника большого (1 часть), листья мяты перечной (1 часть), цветки ромашки (1 часть), корень солодки (1 часть). Траву донника лекарственного, как классического антикоагулянта, обладающего также антигипоксическим и антиоксидантным действием, взяли 2 части

Фармакогностическое изучение сбора

Для внедрения в медицинскую практику новых лекарственных средств, в том числе и сбора, необходимо, проведение исследований, позволяющих разработать для них нормативную документацию

При разработке и оформлении проекта фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на сбор руководствовались ОСТом 91500 05 001-00 «Стандарты качества ЛС Основные положения».

Лекарственное растительное сырье в исследуемом сборе содержит различные группы биологически активных веществ (БАВ) Переходя в водные и водно-спиртовые извлечения, эти вещества, обладающие разнообразной биологической активностью, обусловливают суммарный эффект и лечебное действие предлагаемого нами сбора Разработанный сбор включает 11 растительных компонентов, что делает целесообразным постановку вопроса его стандартизации по комплексу доминирующих биологически активных соединений С поликомпонентностью состава связаны трудности выбора группы БАВ, позволяющей репрезентативно стандартизировать сбор Решение этой проблемы невозможно без детального изучения химического состава сбора и выбора приоритетных и специфических маркеров, по которым бы планировалось в дальнейшем проведение стандартизации

Богатый комплекс фенольных соединений обусловливает совокупное лечебное действие изучаемого сбора, а также относится к группе при-

оритетных маркеров. Этим и обоснована необходимость исследований данной группы веществ с целью установления параметров доброкачественности сбора.

Качественными реакциями и методами хроматографического анализа на бумаге и в тонком слое сорбента были выделены и идентифицированы индивидуальные фенольные соединения: флавоноиды (рутин и кверце-тин), фенолкарбоновые кислоты (кофейная и хлорогеновая). Так, при проведении круговой бумажной хроматографии лучшее разделение флавоно-идных соединений произошло в системе н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5), а при использовании ТСХ - этилапетат - уксусная кислота (8:2) (рис. 1).

Рис. 1. Схема тонкослойной хроматографии в системе этилацетат - уксусная кислота (8:2)

I - спиртовая фракция: 2 - рутин; 3 - кверцетин; 4 - лютеолин-7-гликозид-Д;

5 - апигенин; 6 - нарингенин

При проявлении хроматограмм в качестве детектора был использован 5% спиртовый раствор алюминия хлорида. Пятна, соответствующие аутентичным образцам, счищали с хроматограмм, элюировали этиловым спиртом, очищали повторной кристаллизацией метиловым и этиловым

спиртом и устанавливали их принадлежность с использованием УФ- и ИК-спектрального анализа. Так, в УФ-спектрах выделенных соединений совпали максимумы поглощения со стандартными веществами, а ИК-спектры по интенсивности и местоположению совпали с ИК-спектрами ГСО рутина и кверцетина (рис. 2).

,----. - —.-1-,-1-----Т-.-.-■-1- -.-1-.-Г

;шй 2000 3000 4000

Рис. 2. ИК-спектры ГСО рутина и соединения, выделенного из сбора 1 - выделенное соединение; 2 - ГСО рутина

I

I

На основании проведенных выше хроматографических исследований предлагается методика хроматографического анализа в тонком слое

I

сорбента в системе растворителей этилацетат-уксусная кислота (8:2) на сбор при НМК для включения в раздел «Качественные реакции» проекта ФСП на сбор.

При разработке методики количественного определения флавонои-дов снимали УФ-спектр спиртового экстракта сбора. Наблюдалось несколько максимумов поглощения при длинах волн 345 нм и 360 нм, минимумы - 253 нм и 338 нм, а также площадка при 275-282 нм (рис. 3). Ни одно значение не совпало с максимумами поглощения выделенных флаво-ноидов. Поэтому для выявления условной принадлежности полученных спектральных данных конкретным флавоноидам были сняты УФ-спектры с

| комплексообразующей добавкой. Оказалось, что максимум поглощения комплекса рутина - стандарта с 5% спиртовым раствором алюминия хло-

рида совпадает с максимумом поглощения продуктов взаимодействия флавоноидов сбора с раствором алюминия хлоридом при использовании в качестве экстрагента 96% этилового спирта и длины волны 410 нм, Б

0.7 О.в О.5 О.Ч 0,3 0,2 0.1 0.0

220 230 240 250 280 270 280 290 300 310 320 230 340 350 ЗвО 370 380 380 "300

X, НМ

Рис.3. УФ-спектры ГСО рутина, ГСО кверцетина и спиртового экстракта растительного сбора 1 - УФ спектр спиртового экстракта растительного сбора; 2 - УФ спектр ГСО кверцетина;

3 - УФ спектр ГСО рутина

Поэтому, в основу разрабатываемой методики легла дифференциальная спектрофотометрия с комплексообразующей добавкой, аналитические параметры которой позволяют использовать ее для определения содержания флавоноидов в растительных объектах, содержащих неидентичный набор флавоноидов, а, следовательно, приемлемый и для сбора. В качестве аналитической длины волны принята волна 410 нм, а экстрагента -96% этиловый спирт.

Далее были подобраны оптимальные условия проведения количественного определения флавоноидов в сборе (табл. 1). Разработанная методика была проверена с использованием метода добавок стандарта (табл.2). Метрологическая характеристика количественного содержания флавоноидов в пересчете на рутин представлены в таблице 3.

Оптимальные условия количественного определения флавоноидов в сборе

Показатели количественного определения Условия

Длина волны 410 нм

Концентрация этилового спирта 96%

Измельченность сырья 2 мм

Соотношение сырья и экстрагента 1 100

Время экстракции 30 мин

Количество комплексообразователя 3 мл

Время реакции комплексообразования 25 мин

Содержание флавоноидов, % 1,45± 0,06

Таблица 2

Содержание флавоноидов в сборе с использованием метода добавок

Содержание флавоноидов в пересчете на ГСО рутина, % Количество рутина, % Содержание флавоноидов в пересчете на рутин, %

1,453±0,03 0,5 2,053±0,11

1,363±0,02 1,0 2,435±0,09

1,458±0,03 1,5 3,079±0,13

Таблица 3

Метрологическая характеристика разработанной методики

в2 8 Р Т(Р,0 Дх е

14 1,4508 0,00047 0,0218 95 2,23 0,0486 3,34

Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают воспроизводимость разработанной методики количественного определения флавоноидов в сборе

В процессе химических исследований сбора с использованием качественных реакций были обнаружены другие группы БАВ фенолкарбоно-вые кислоты, кумарины, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, свободные органические кислоты, сапонины, полисахариды, алкалоиды и определено их количественное содержание с использованием известных методик (рис 4)

□ Аскорбиновая кислота И Органические кислоты ПКаротиноиды ОПолисахар1

ВКумарины ШФКК В Алкалоиды Е1Флавонои.ш

■ Дубильные вещества В Сапонины

0,039 0,28

Рис. 4. Количественное содержание основных групп биологически активных веществ в сборе

Для определения подлинности сбора использовали микроскопический метод. Он предлагается не только в виде качественной характеристики сбора, но и как метод стандартизации по количественной проявляемое™ диагностически значимых признаков. С помощью методики, разработанной профессором И.А. Самылиной, исследовали проявляемость диагностически значимых и незначимых признаков и общую сумму частиц каждого вида лекарственного растительного сырья в сборе (табл. 4).

Результаты проведенного исследования показали, что процент проявления ДЗП компонентов сбора незначительно снижается, что связано с количественным снижением сырья в сборе.

Проявляемость диагностически значимых признаков

Наименование сырья ДЗП сырья, % ДЗП в сборе, %

Плоды боярышника 56,6±1,3 54,1±1,3

Плоды рябины 35,9±1,1 35,8±0,9

Плоды шиповника 78,2±1,8 74,4±0,9

Листья барвинка малого 60,9±2,8 58,1±1,1

Трава сушеницы топяной 45,3±2,0 42,1±1,5

Трава полыни обыкновенной 66,2±2,2 49,6±0,9

Листья подорожника большого 53,5±1,9 48,4±1,1

Листья мяты перечной 43,3±2,7 33,8±1,2

Цветки ромашки 45,1±1,9 44,1±0,8

Корни солодки 90,1±1,7 88,8±1,7

Трава донника лекарственного 68,7±2,5 52,7±1,1

Также было проведено определение проявляемости всех диагностически значимых частиц сбора Экспериментальные данные исследования показали, что в сборе проявляемость ДЗП в среднем составила 52,98±0,71% (табл 5)

Таблица 5

Результаты статистической обработки данных проявляемости ДЗП сбора

Г Хср Б2 Б Р Т(Р,0 Ах е

14 52,98 0,486 0,697 95 2,23 1,55 2,92

Таким образом, результаты проведенных исследований подтверждают воспроизводимость методики определения проявляемости ДЗП в сборе и она может быть использована для контроля качества многокомпонентных растительных прописей

Проведенные химические и товароведческие исследования позволили предложить нормативные показатели качества сбора (табл 6)

Числовые показатели сбора

Числовые показатели Полученные результаты, % Показатели для ФСП, %

Влажность 4,65±0,21 не более 10,0

Зола общая 6,32±0,20 не более 8,0

Зола, н/р в 10% НС1 2,61±0,17 не более 4,0

Измельченность част , не прох ё=7 мм част , прох с!=0,2 мм 8,70±0,29 3,50±0,11 не более 10,0 не более 4,0

Примеси органические минеральные 0,85±0,03 0,27±0,01 не более 1,0 не более 0,5

Содержание флавоноидов 1,45±0,06 не менее 1,2

Содержание дубильных в-в 6,80±0,72 не менее 6,0

ДЗП плодов боярышника ДЗП плодов рябины ДЗП плодов шиповника ДЗП листьев барвинка малого ДЗП травы сушеницы топяной ДЗП травы полыни обыкновенной ДЗП листьев подорожника большого ДЗП листьев мяты перечной ДЗП цветков ромашки ДЗП корней солодки ДЗП травы донника лекарственного 54,1±1,3 35,8±0,9 74,4±0,9 58,1±1,1 42,1±1,5 49,6±0,9 48,4±1,1 33,8±1,2 44,1±0,8 88,8±1,7 52,7±1,1 не менее 52,0 не менее 32,0 не менее 73,0 не менее 55,0 не менее 40,0 не менее 47,0 не менее 46,0 не менее 31,0 не менее 42,0 не менее 86,0 не менее 50,0

ДЗП сбора 52,98±0,71 не менее 50,0

Фармакологические исследования сбора

Изучение острой токсичности сбора показало, что сбор, по классификации Измерова Н Ф при внутрибрюшинном введении, относится к 5 классу - практически нетоксическим веществам

Агрегацию тромбоцитов определяли по модифицированному методу Борна на богатой тромбоцитами плазме Установлено, что сбор в присутствии всех используемых индукторов агрегации (АДФ, коллагена, адреналина) влияет на ее основные параметры, снижая их в среднем от 20,6 до 54,5% в зависимости от вида индукции (Р < 0,02, Р < 0,01) Проведенные

исследования свидетельствуют о наличии у сбора антиагрегационной активности, которая выше препарата сравнения (ацетилсалициловой кислоты) (рис. 5).

Антикоагулянтную активность определяли путем подсчета времени образования фибрина в плазме в присутствии ионов кальция и тканевого тромбопластина. Анализ данных показал, что сбор достоверно снижает свертываемость крови почти на 38,6% (Р < 0,02) и его эффект выше препарата сравнения - гепарина (27,8%). Таким образом, сбор обладает высокой антикоагулянтной активностью.

Изучено влияние сбора на устойчивость к гипоксии, о чем судили по увеличению продолжительности жизни животных при однократном введении и в течение 14 дней при нормобарической гипоксии с гиперкапнией. При однократном введении внутрь сбора наблюдалось увеличение времени выживания на фоне контрольной группы на 10,6 минут и уменьшение гибели животных на 44%, однако это влияние статистически недостоверно (Р > 0,05). Поэтому, в дальнейшем, было проведено исследование животных после двухнедельного приема сбора и лекарственной формы. Оказалось, что применение настоя из сбора, жидкого экстракта и препарата сравнения (билобила) в течение 14 дней увеличивало время выживания на фоне кон-

60

50

Рис. 5. Антиагрегантная активность сбора

мин (8%) соответственно (Р < 0,05), что выше, чем у препарата сравнения -билобила 1,59 мин (7%) Таким образом, можно сделать заключение, что сбор обладает антигипоксической активностью, и тем самым улучшает мозговое кровообращение

Результаты определения антиоксидантной активности сбора по способности сбора ингибировать аутоокисление адреналина т vitro свидетельствуют о антиоксидантным действии сбора (77%), что было подтверждено при использовании экспресс-метода на культуре клеток

Таким образом, проведенные фармакологические исследования показали рациональность предлагаемой прописи, его нетоксичность и адекватность ожидаемого лечебного эффекта при нарушении мозгового кровообращения

Разработка лекарственной формы на основе сбора

Одним из перспективных направлений использования многокомпонентных растительных композиций является их перевод в галеновые и новогаленовые препараты, так как они содержат комплекс как липофиль-ных, так и гидрофильных веществ с антиоксидантными свойствами, которые оказывают нормализующее влияние на энергообеспечение клеток, как в результате доставки им промежуточных метаболитов, так и встраивания в ферментативные реакции

Были получены жидкие лекарственные формы настойки (методами мацерации, перколяции, методом ВНИИФ на 70% этиловом спирте) и жидкие экстракты (методами перколяции и ВНИИФ, используя в качестве экстрагента 40% и 70% этиловый спирт) Качественными реакциями доказано наличие в жидких экстрактах и настойках конденсированных дубильных веществ, флавоноидов и аскорбиновой кислоты и определено их количественное содержание с использованием известных методик

Наибольшее количество БАВ содержится в извлечениях, полученных методом перколяции и предпочтение было отдано жидким экстрактам,

как наиболее концентрированным извлечениям.

Для выбора оптимальной лекарственной формы была определена антиоксидантная активность исследуемых лекарственных форм. Оказалось, что настойки обладают слабой антиоксидантной активностью, а из жидких экстрактов наибольшей антиоксидантной активностью обладают экстракты, полученные на 70% и 40% этиловом спирте (рис. 6).

7,3

40,15

12,5

79.3

79,5

□ Настойка (мацерация,70%)

■ Настойка (перколяция, 70%)

□ Настойка (метод ВНИИФ, 70%)

□ Жидкий экстракт (перколяция. 40%)

■ Жидкий экстракт (метод ВНИИФ, 40%) И Жидкий экстракт (перколяция, 70%)

Рис. 6. Антиоксидантная активность в жидких лекарственных формах

В дальнейшем было проведено определение относительной биологической доступности жидких экстрактов in vitro методом диализа. Наибольшее высвобождение флавоноидов произошло из жидкого экстракта, полученного методом перколяции с использованием в качестве растворителя 40% этилового спирта. Таким образом, на основании полученных фи-тохимических, фармакологических и технологических исследований был выбран жидкий экстракт (1:1) на 40% этиловом спирте.

Исходя из требований, предъявляемых к экстрактам, были разработаны показатели качества для включения в проект ФСП на жидкий экстракт (табл. 7).

Показатели качества жидкого экстракта

Показатель качества Определение

Описание Жидкость красно-бурого цвета с характерным ароматным запахом и горько-сладковатым вкусом

Подлинность 1 1 мл препарата разводят до 10 мл 40% спиртом и прибавляют 1 мл 5% спиртового раствора алюминия хлорида, появляется желто-зеленое окрашивание 2 1 мл препарата выпаривают и обезжиривают хлороформом, остаток растворяют в 1 мл 96% спирта 0,002 мл полученного извлечения наносят на линию старта пластинки «БгШГЫ» размером 15*6 см Пластинку помещают в камеру (предварительное на-сыение не менее 2 ч) со смесью растворителей этилацетат - уксусная кислота (8 2) и хроматографи-руют восходящим способом После прохождения растворителем 12 см, хроматограмму вынимают и просматривают в УФ - свете, где доминируют полосы с Яг около 0,02 (зелено-желтое), с Яг около 0,04 (бурое), с Б1г 0,12 (бурое), с ^ 0,21 (голубое), с Яг 0,39 (желто-бурое), с 0,82 (фиолетовое), с 0,93 (желто-бурое) Хроматограмму опрыскивают 5% спиртовым раствором алюминия хлорида, помещают в сушильный шкаф на 1 - 2 мин при 105°С. После проявления пятна с около 0,02, 0,12 (рутин), 0,39 и 0,93 (кверцетин) приобретают желто-зеленую флюоресценцию

Содержание флавоноидов,% Не менее 0,6

Плотность, г/см3 Не менее 1,056

рН 6,5

Тяжелые металлы, % Не более 0,01

Сухой остаток, % Не менее 20

Срок годности 4 года

Таким образом, на основании проведенных технологических и фотохимических исследований можно рекомендовать в качестве лекарственной формы - жидкий экстракт (1 1), полученный на 40% этиловом спирте мето-

дом перколяции

Общие выводы

1 Впервые разработана, теоретически и экспериментально обоснована пропись сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения, включающего 11 видов лекарственного растительного сырья, разрешенных для применения в медицинской практике

2 Проведено комплексное фармакогностическое исследование сбора Выявлены различные группы биологически активных веществ флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, органические кислоты, сапонины, полисахариды, алкалоиды, эфирные масла, каротиноиды Выделены и идентифицированы индивидуальные фенольные соединения флавоноиды (рутин и кверцетин), фенолкарбоновые кислоты (кофейная и хлорогеновая)

3 Разработаны методики качественного анализа исследуемого сбора с использованием хроматографического метода и количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин спектрофотометрическим методом

4 Проведены фармакологические исследования сбора Установлено, что сбор относится к 5 классу - практически нетоксическим веществам Выявлена специфическая активность (антиоксидантная, антиагрегационная, антикоагулянтная, антигипоксическая) сбора

5 Предложена рациональная лекарственная форма на основе сбора - жидкий экстракт и проведена его стандартизация

6 Разработаны проекты фармакопейных статей предприятия на сбор и жидкий экстракт для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1 Хасанова, С Р Подходы к стандартизации лекарственных форм на основе растительных сборов / СР. Хасанова, Т И Плеханова, Э X Гали-ахметова // Материалы Республиканской конференции молодых ученых Республики Башкортостан «Медицинская наука-2003», посвященной Году спорта и здорового образа жизни, Дню медицинского работника -Уфа, 2003 -С 71

2 Плеханова, Т И Поиск рациональной лекарственной формы на основе растительного сырья / Т И Плеханова, С Р Хасанова, Э X Галиахме-това // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции Сборник научных трудов, вып 59 - Пятигорск, 2004 - С 110-111

3 Хасанова, С Р Экспериментальное обоснование состава растительного сбора при нарушении мозгового кровообращения / С Р Хасанова, Э X Галиахметова // Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения IV Российская научная конференция - Уфа, 2004 -С 54-55

4 Галиахметова, Э X Разработка методов фотохимического контроля при изготовлении лекарственных форм на основе лекарственного растительного сырья / С Р Хасанова, Э X Галиахметова // Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения материалы всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора JIH Березнегов-ской - Томск, 2006 -С 67-71

5 Хасанова, С Р Разработка метода стандартизации растительного сбора / С Р Хасанова, Э X Галиахметова // Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования Сборник научных трудов юбилейной конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультетаБГМУ, 2006 -Уфа, 2006 -С 177-180

6 Галиахметова, Э X Обоснование состава растительного сбора / Э X

Галиахметова, С Р Хасанова // Russia - China International scientific conference on pharmacology «Fundamental pharmacology and pharmacy -clinical practice» - Perm, 2006 -C 167-168

7 Исследования по разработке сборов из лекарственного растительного сырья / Н В Кудашкина, С Р Хасанова, Э X Галиахметова [и др ] // Человек и лекарство сборник материалов XIV Российского национального конгресса - Москва, 2007 - С 393

8 Сравнительное изучение антиоксидантной активности растительных сборов / С Р Хасанова, Т И Плеханова, Э X Галиахметова [и др ] // Вестник Воронежского государственного университета Секция «Химия Биология Фармация», вып 1 -2007г - С 78-81

9 Галиахметова, Э X Пути решения рационального использования лекарственного растительного сырья /ЭХ Галиахметова, С Р Хасанова // XI Международный симпозиум «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» - Москва - 2007 — С 174-177

10 Галиахметова, Э X Использование микроскопического анализа для определения качества растительного сбора /ЭХ Галиахметова, С Р Хасанова // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств матер Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА - Пермь, 2007 — 490 с

11 Хасанова, С Р Перспективы использования лекарственных растений в комплексной терапии нарушений мозгового кровообращения / С Р Хасанова, Э X Галиахметова, Н В Кудашкина // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств матер Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА - Пермь, 2007 - 490 с

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Сосудистые заболевания головного мозга представляют важнейшую медицинскую и социальную проблему в связи с высокой распространенностью и тяжелыми последствиями для здоровья населения. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, ежегодно от це-реброваскулярных заболеваний умирают около 5 миллионов человек и основное место среди них занимают острые нарушения мозгового кровообращения (инсульты). Их количество у нас в стране составляет около 450 тысяч в год (второе место в структуре общей смертности населения). Несмотря на большой ассортимент лекарственных препаратов, используемых при данной патологии, показатели смертности от цереброваскулярных заболеваний в России являются одни из самых высоких в мире и, в отличие от большинства экономически развитых стран, не только не снижаются, но и имеют тенденцию к увеличению (Суслина З.А., 2006). Чаще инсультом заболевают 40-50-летнее работоспособное население (Скворцова В.И., Крылов В.В., 2005), 5681% из которых в последствии остаются инвалидами и нуждаются в постоянном приеме химиопрепаратов (Верещагин Н.В., Варакин- Ю.Я., Суслина З.А., 2002).

Современные концепции эффективной интенсивной терапии острых нарушений мозгового кровообращения рассматривают инсульт как один из самых тяжелых критических состояний. При этом у больных с церебральным инсультом любого характера могут быть выявлены клинические синдромы критических состояний, определяющие собой-тяжесть течения заболевания, его исход, степень постинсультной инвалидизации.

Медикаментозные методы терапии не всегда позволяют восстановить нарушенные неврологические функции, несмотря на большой ассортимент синтетических препаратов, действие которых направлено лишь на некоторые звенья патогенеза. Этим, в определенной степени, можно объяснить вероятность повторного нарушения мозгового кровообращения с многообразием патогенетических расстройств. Поэтому проблема эффективности лечения нарушений мозгового кровообращения остается актуальной.

Одним из путей решения этой острой проблемы может служить применение лекарственного растительного сырья, использование которого способствует снижению дозы синтетических препаратов, значительному уменьшению осложнений и побочных эффектов. Низкая токсичность лекарственных растений позволяет назначать их длительными курсами (месяцы, годы), в простых и сложных комбинациях, для противорецидивного или реабилитационного лечения. Для растений характерно разнообразие химического состава, позволяющее мягко и безопасно воздействовать одновременно на многие системы организма, вовлеченные в патологический процесс. Одним из явных преимуществ фитотерапии является доступность и относительная дешевизна лекарственных растений.

Таким образом, создание высокоэффективных, безвредных, экономически доступных и удобных в применении лекарственных растительных средств для профилактики и комплексной терапии нарушений мозгового кровообращения является актуальным.

ЦЕЛЬЮ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ явилась разработка многокомпонентного сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения из лекарственного растительного сырья, разрешенного для применения в медицинской практике на территории Российской Федерации, его стандартизация и создание рациональной лекарственной формы.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие t задачи:

- разработать, теоретически и экспериментально обосновать пропись сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения;

- провести фармакогностическое изучение сбора с целью его стандартизации;

- провести исследования фармакологической активности сбора;

- разработать лекарственную форму на основе предложенной прописи и провести ее фитохимические исследования;

- разработать проекты нормативной документации на предлагаемый сбор и лекарственную форму.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые разработан, теоретически и экспериментально обоснован сбор для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения, содержащий 11 видов лекарственного растительного сырья, разрешенных для применения в медицинской практике на территории РФ.

С использованием современных физико-химических методов анализа изучен состав биологически активных веществ исследуемого сбора, обеспечивающих его лечебное действие, и определено количественное содержание флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, суммы дубильных соединений, эфирного масла, сапонинов, аскорбиновой кислоты, полисахаридов, каротиноидов и алкалоидов. Проведено хроматографическое исследование фенольных фракций сбора и предложена методика качественного анализа для флавоноидов.

Разработана спектрофотометрическая методика количественного анализа сбора по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин.

Микроскопический метод использован не только для определения подлинности сбора, но и как один из методов стандартизации сбора и контроля качества компонентов прописи посредством количественной оценки проявления диагностически значимых признаков.

Проведены фармакологические исследования сбора. Определены анти-оксидантная, антиагрегационная, антикоагулянтная, антигипоксическая активности сбора; доказана его нетоксичность.

Предложена рациональная лекарственная форма - жидкий экстракт и установлены показатели его качества, содержание биологически активных веществ, подтверждающие рациональность технологического процесса получения лекарственной формы; определены сроки годности лекарственного средства.

Разработаны проекты фармакопейных статей предприятия на сбор для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения и на лекарственную форму на его основе - жидкий экстракт.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Теоретические и экспериментальные исследования показали целесообразность дальнейшего фармакологического исследования предложенного сбора в качестве средства для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения.

Разработаны проекты ФСП на сбор и жидкий экстракт при нарушении мозгового кровообращения.

Подана заявка на изобретение «Сбор при нарушении мозгового кровообращения».

Результаты технологических исследований могут быть использованы при разработке нормативной и технологической документации для промышленного производства рациональной лекарственной формы - жидкого экстракта.

Предложенная оптимальная лекарственная форма позволяет решить задачу рационального использования лекарственного растительного сырья при изготовлении сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения в заводских условиях.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского государственного медицинского университета.

Метод определения диагностически значимых признаков может быть использован для стандартизации многокомпонентных растительных композиций.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: - результаты теоретического и экспериментального обоснования сбора для лечения и профилактики нарушений мозгового кровообращения;

- результаты фармакогностического исследования сбора с целью его стандартизации;

- результаты фармакологических исследований сбора по выявлению специфической активности;

- результаты фотохимических, фармакологических и технологических исследований по созданию рациональной лекарственной формы — жидкого экстракта на основе предложенного сбора.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2003г.); научно-практической конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета «Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования» (Уфа, 2006г.); научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2007г.); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в которых отражены основные результаты исследования.

СТРУКТУРА И ОБЪЕ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 экспериментальных глав, выводов и списка литературы, 40 таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 165 библиографических источников, из которых 23 иностранных.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана, теоретически и экспериментально обоснована пропись сбора для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения, включающего 11 видов лекарственного растительного сырья, разрешенного для применения в медицинской практике.

2. Проведено комплексное фармакогностическое исследование сбора. Выявлены различные группы биологически активных веществ: флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины, дубильные вещества, аскорбиновая кислота, органические кислоты, сапонины, полисахариды, алкалоиды, эфирные масла, каротиноиды. Выделены и идентифицированы индивидуальные фенольные соединения: флавоноиды (рутин и кверцетин), фенолкарбоновые кислоты (кофейная и хлорогеновая).

3. Разработаны, методики качественного анализа исследуемого сбора с использованием микроскопического анализа, хроматографии в тонком слое сорбента и количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин спектрофотометрическим методом.

4. Проведены фармакологические исследования сбора. Установлено, что сбор относится к 5 классу - практически нетоксическим веществам. Выявлена специфическая активность сбора (антиоксидантная, антиагрегацион-ная, антикоагулянтная, антигипоксическая).

5. Предложена рациональная лекарственная форма на основе сбора — жидкий экстракт и проведена его стандартизация.

6. Разработан проекты фармакопейных статей предприятия на сбор и жидкий экстракт для профилактики и лечения нарушений мозгового кровообращения.

135