Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и стандартизация лекарственных и лечебно-профилактических средств на основе трутневых личинок

РГБ ОД

22Ш2Ш

На правах рукописи

СОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ТРУТНЕВЫХ ЛИЧИНОК

15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

На правах рукописи

СОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ТРУТНЕВЫХ ЛИЧИНОК

15.00.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат фардацевтическнх

наук, доцент Д. С. Лазарян

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор фармацевтических наук,

профессор А.Л. Казаков •; кандидат фаршцемических наук

Ю.А. Волобусв

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова (г. Москва)

Защита состоится «//» блпрл л 2002 г. в « часов на засе-

дании диссертационного совета Д.208.069.01 по защитам диссертаций в Пятигорской государственной фармацевтической академии (357533, Пятигорск, пр. Калинина, II).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии (357533, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Автореферат разослан «¿2_» 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор х Е.В. Компанцева

Общая характеристика работы Актуальность темы.

Среди большой номенклатуры лекарственных средств определенное место занимают препараты на основе продуктов пчеловодства. Значимость этих продуктов связана с наличием в них сбалансированного комплекса биологически активных веществ, оказывающего лечебное воздействие на организм человека. Обладая высокой эффективностью, они отличаются мягкостью действия, доступностью, низкой себестоимостью, отсутствием или незначительным побочным эффектом. В последнее время внимание зарубежных ученых привлек нетрадиционный продукт пчеловодства -трутневые личинки, который, согласно литературным данным и по результатам предварительных наших исследований, близок по некоторым свойствам и составу к маточному молочку.

Известно, что на основе пчелопродуктов за рубежом производят и применяют около 400 наименований лекарственных средств. Трутневые личинки также используются в медицинской практике. Так, в США, Румынии, Франции запатентован ряд лекарственных препаратов на их основе. К сожалению, перечень отечественных препаратов на основе продуктов пчеловодства ограничивается лишь несколькими наименованиями, а препараты на основе трутневых личинок отсутствуют вовсе.

Поэтому актуальной проблемой является разработка новых эффективных лекарственных и лечебно-профилакгаческих средств на основе трутневых личинок. Перспектива использования трутневых личинок в медицине обусловлена минимальным риском развития побочных эффектов, значительной и доступной сырьевой базой, простой технологией и небольшими производственными затратами.

Цель и основные задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось теоретическое обоснование возможности и целесообразности получения лечебных средств на основе гомогената и лиофилизата трутневых личинок и их стандартизация.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получение гомогената и лиофилизата трутневых личинок.

2. Изучение физико-химических показателей исследуемых объектов нескольких пород пчел, собранных из разных краев и областей в 19992001 годах.

3. Исследование качественного и количественного состава биологически активных компонентов в изучаемые образцах трутневых личинок.

4. Стандартизация гомогената и лиофилизата трутневых личинок и определение их сроков годности.

5. Получение, стандартизация и изучение стабильности мягких лекарственных форм, содержащих трутневые личинки.

6. Проведение фармакологических исследований трутневых личинок и полученных лекарственных форм на их основе.

Поставленные задачи решались путем обобщения и критического анализа отечественной и зарубежной литературы, а также на основании собственных исследований.

Научная новизна. Впервые изучен полный химический состав трутневых личинок различных пород пчел из некоторых регионов РФ, предложены способы стандартизации гомогената и лиофилизата трутневых личинок. Впервые определены массовые доли биологически активных компонентов субстанций трутневых личинок (ферментов, нуклеиновых кислот, фосфоли-пидов, углеводов), изучена их фармакологическая активность. Впервые получены мази и лечебно-профилактические косметические средства: крем, крем-маска, содержащие трутневые личинки, установлена их противовоспалительная, ранозаживляющая и противоожоговая активность. Проведена стандартизация, определены оптимальные условия хранения и сроки годности гомогената и лиофилизата трутневых личинок и разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств на их основе.

Практическая значимость работы. Предложены оптимальные методики определения основных действующих компонентов гомогената и лиофилюата трутневых личинок.

В результате изучения физико-химических показателей, химического состава и фармакологической активности трутневых личинок обоснована возможность использования нового доступного высокоэффективного нетрадиционного продукта пчеловодства - трутневых личинок для получения лекарственных и лечебно-профилактических средств. Разработаны мягкие лекарственные формы на основе трутневых личинок, предложены критерии стандартизации гомогената и лиофилизата и предложенных лекарственных и лечебно-профилактических средств.

Установлены сроки годности и условия хранения гомогената и лиофилизата трутневых личинок и разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств на их основе.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны и утверждены технические условия: ТУ 9882-039-01962942-2001 на «Апи-лар» (гомогенат трутневых личинок), ТУ 9882-041-01962942-2001 на «Лиофилизированный апилар», ТУ 9158-042-01962942-2001 на ««Крем-маску «Виталар», ТУ 9158-043-01962942-2001 на «Крем косметический «Апилар», ТУ 9158-044-01962942-2001 на мазь «Апилар-Г».

Получены приоритетные справки на способ получения мази «Апилар-Г», обладающей противовоспалительным действием; способ получения косметической лечебно-профилактической крем-маски с трутневыми личинками и маточным молочком, обладающей противовоспалительным и ранозаживляющим действием; способ получения косметического лечебно-профилактического крема с трутневыми личинками, обладающего противовоспалительным действием.

Разработаны и направлены проекты фармакопейных статей предприятия на гомогенат трутневых личинок -«Апилар» и мазь на его основе -«Апилар-Г» для утверждения в Государственные Фармакопейный и Фар-

макологический комитеты.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных научно-практических конференциях по фармакологии, фармации и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2001 г, 2002г.). По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПягГФА (номер государственной регист- , рации 01.99.0011965) в рамках проблемы «Фармация» МНС №47 РАМН.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 59 таблиц, 7 рисунков, состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы, включающего 168 источников, в том числе 22 иностранных, и приложений.

В первой главе диссертации обобщены сведения по общей характеристике, химическому составу и применению в медицине традиционных продуктов пчеловодства. Приведены данные по химическому составу, получению, применению и биологической активности трутневых личинок.

Во второй главе представлены результаты исследования физико-хими-ческих показателей гомогената и лиофилизата трутневых личинок. Полученные данные использованы для стандартизации как сырья, так и разработанных лекарственных средств на их основе. Приведены результаты количественного определения минерального состава трутневых личинок

В третьей главе приводятся данные по содержанию основных биологически активных веществ в гомогенате и лиофилизате трутневых личинок, представлены результаты определения количественного содержания общего, истинного, водорастворимого белка, аминокислот, сульфгид-рильных групп. Изучен состав белковой фракции и ферментный состав трутневых личинок. Определены массовые доли эфирорастворимой липид-

ной фракции гомогената трутневых личинок, качественный и количественный состав органической фракции, содержание лшщцного фосфора и фос-фолипидов. Приведены результаты количественного определения нуклеиновых кислот, углеводов: Проведена стандартизация, изучена стабильность гомогената и лиофилизата трутневых личинок.

Четвертая глава посвящена изучению фармакологической активности трутневых личинок и лекарственных средств на их основе. Изучены острая, хроническая токсичность и аллергенносгь гомогената трутневых личинок и мягких лекарственных форм на их основе. Для мазей и лечебно-профилактических кремов установлены: противовоспалительное, раноза-,. живляющее и противоожоговое действие.

В пятой главе приводятся результаты исследований по разработке, стандартизации и изучению стабильности лекарственных и лечебно-профилактических средств, содержащих трутневые личинки: крема «Апи-лар», крем-маски «Виталар», мазей «Апилар-Г», «Апилар-проп». На защиту выносятся следующие положения: -результаты изучения основных показателей качества и химического состава гомогената и лиофилизата трутневых личинок;

-результаты теоретического обоснования возможности применения гомогената и лиофилизата трутневых личинок для получения мягких лекарственных форм;

-результаты фармакологического изучения гомогената и лиофилизата трутневых личинок и лекарственных средств на их основе.

Основное содержание работы Определение физико-химических показателей гомогената н лиофилизата трутневых личинок. Объектами наших исследований явились образцы трутневых личинок карпатской, среднерусской, итальянской и помесной пород, собираемые в течение 3 лет (1999-2001гг) в Ставропольском, Краснодарском краях, Ростовской и Иркутской областях. Из трутневых личинок нами был

полтонн гомогснэт я дшфилшзт,

€ иклыо выбора ифшеряев для сташшргазаши изучаемых обрзмюв трутневых личинок определены: ерганолептичеекне сяойстта. растворимость, значение рН сршш. массовую дата влзгн, обшей в етльфатаой золы,, Для всех нскпецуемых обрдашв трутаеяш; личинок значение рН среда находится в пределах 6.9-7,2. что является благоприятным условием яи применешя в такгаетых лекарственных формах. Содержите влаги в гомотш® находятся в,интервале 74.9-Ж0?4. в ляофтаишв - 2,3-3,2% д может служить олнш ш шштатеяей качества, Высокое содержание влага в трутневых лишмх.. спосо&твует врошссш брожения, ¿ншяметег бяагопршггным условием для развитая мгафофлорм. плесневых треков, и кроме того, протеканию разданных хтпгчесик превращений биологически активных компонентов. Истажшаше тгоилюашш способствует получению порошка трутневых личинок, с низкой влажностью, что имеет важное значение для сохранения в них биологически активных веществ. Лиофилизат является стабильным при хранении концентрированным сырьем, удобным для введения в лекарственные формы.

Определены массовые доли общей и сульфатной золы в гомогенате и лиофилизате трутневых личинок для оценки их доброкачественности.

Установлено, что указанные показатели незначительно отличаются в образцах в зависимости от региона и года сбора, породы пчел, что позволяет использовать их для стандартизации гомогената и лиофилизата трутневых личинок как источников получения лекарственных и лечебно-профилактических средств.

Изучение химического состава и стандартизация гомогената и лиофилизата трутневых личинок Изучение химического состава трутневых личинок с одной стороны, позволяет оценить качество объекта, с другой стороны, является предпосылкой для исследования фармакологической активности и

создания лекарственных средств на их основе. Одним из показателей качества трутневых личинок, определяющим его питательную ценность и биологическую активность, является уровень содержания белка. Для его количественного определения мы использовали метод, основанный на определении общего азота по Кьельдалю. После осаждения белковых веществ, в фильтрате и осадке определяли содержание небелкового и белкового азота соответственно. Для подтверждения содержания небелкового азота, полученного данным способом, его количество находили и как разность между общим и белковым азотом. Определение аминного азота проводили фотоколориметрическим методом, основанным на реакции образования растворимого медного комплекса.

Полученные данные представлены в табл.1.

Таблица 1

Содержание общего, небелкового и белкового азота в трутневых личинках

Образцы трутневых общий белковый небелковый шин-

личинок азот,% азот,% азот,% ныи

М-Д Кьельдаля общ.аз.-белк.аз. азот, %

1999

7,01 ±0,0 9 . 7,1210,22 6,74±0,07 6,76±0,18 6,95±0,21 5,9510,38 5,3410,07 5,8910,06 5,9 Ш,04 6,2010,09 1,0010,06 0,9610,04 1,0310,05 1,1510,07 1,0210,05 1,06 0,78 0,85 0,85 0,75 1,12 1Д5 1,06 1,04 1,16

Ставроп.край: -гомогенат -лиофилизат Краснодар.край: гомогенат Ростовская обл.: -гомогенат

Иркутская обл.: -гомогенат

2000г

Ставроп.край: -гомогенат 6,91±0,26 6,2910,10 1,0(Ш),03 0,96 1,02

лиофилизат Краснодар.край: гомогенат Ростовская обл.: -гомогенат 6,55±0,15 6,89±0,15 7,12±0,19 6,9510,22 6.1510.04 6.1610.05 6,2610,07 6,2010,09 0,9910,04 1,0110,05 1,1510,07 1,0510,04 0,74 0,90 1,01 0,83 1,06 1,06 1,04 1,11

Иркутская обл.: -гомогенат

2001г

7,1210,26 6,5510,10 6,29Ю,10 6,1510,04 0,87Ю,03 0,6910,02 0,83 0,75 1,13 1,05

Ставроп.край: -гомогенат -лиофилизат Краснодар.край: -гомогенат Ростовская обл.: -гомогенат Иркутская обл.: -гомогенат

6,93Ю,1б 7,1210,23 6,91Ю,24 6,1610,05 6,2610,07 6,2010,11 0,7710,03 0,8310,03 0,76Ю,02 0,77 0,86 0,71 1,31 1,22 1,25

Как видно го табл. 1щученм сопоставимые результат ш содфжашш азота, разниаа между общим я бслковми азотом примято ©дашдаа » образках из разшмнш рсгтояо» страны, Небеяковый азот составлял 1Ы5% от общего азота.

Бежа?» определенный то общему азоту, шздааетс« "сырым" протеином, поскольку по данным лнтб^йтуры промеров до 10% общего азота, составляет азот шб&талхяго протохогкдення. "Истинный" белок может быть рассчлтан по бешвопому адату.

Так тж. Исыро!Г протеин в определенной стеяеян харктершует содержание "истинного"' белка, доя оценки качества сырья мм определили "сырой" протеин* а для сщикн биожзгической амдааоан - содершнме "истинного" бедка, Пал^юннм&резудьтзш лредстамены в табл.2,

Таблица2

Сещжшме "сырого™ яротшна и "непшшге" бежа в трутневых

лимитах

Образцы трутневых личинок "Сырой" протеин, % "Истинный" белок,%

1999 Ставроп.край: -гомогенат -лиофилизат Краснодар.край: -гомогенат Ростовская обл.: -гомогенат Иркутская об л. :-гомогенат , 43,8110,09 42,5010,22 42,1310,07 42,2510,18 43,4410,21 37,1910,38 39,62Ю,07 36,8210,06 36,94+0,04 38,7510,09

2000г Ставроп.край: -гомогенат -лиофилизат Краснодар.край: -гомогенат Ростовская обл.: -гомогенат Иркутская обл.: -гомогенат 43,1910,26 40,9410,15 43,0610,15 44,5010,19 43,4410,22 37,1910,11 36,3110,17 36,8110,48 36,94Ю,04 38,2510,08

2001г Ставроп.край: -гомогенат -лиофилизат Краснодар.край: -гомогенат Ростовская обл.: -гомогенат Иркутская обл.: -гомогенат 44,5010,26 40,94Ю,10 43,3 liö, 16 44,50Ю,23 43,19+0,24 39,31Ю, 10 38.4410.04 38.5010.05 39,1310,07 38,7510,09

Из тай, видно. ггго содержание "сырого" протеяш в образцах трутневых личинок m рамичнш регион» отличается тезвдшго®« и. составляет 40.9-44.5?% содержание ""истинного" белка - 37.2-39.3%, Кедакстте '"истиннего"" белка в среднем на 9.5% меныш содержания, "сырого" протеши, причем прн этом прослеживается четкая взаамосмзь между количествами отделяемых беякс®. Это шиаоляег &спаэьЭйяап» уровень содержания "сырого" протеина для сшшртшцкв. тругаевш

ЛИЧИНОК. _ t

Оценку качества лехарсгяеннш. средств, содфщиящ тр>тневш личинка, наиболее приемлемо проводить, по водораствйрзшому белку. В свжзя с этим, нами выла установлена массовая доля кэдорагтворнмого белка 4етоЕШ1Сфю£стркчеекмш методом' по береговой реакции, которая составила 22,4-26js%.

Нами было определено содсршаяис сульфщфядышх групп ддя оценки активности белка. Определение проводили фотоколориметрическим методом, основанным на реакции взаимодействия реактива Эллмана со свободными SH-грухшами белков. Содержание SH-групп белка в трутневых личинках составило 4,1-4,6М/105г белка, что примерно в 3,5 раза выше, чем в маточном молочке.

Поскольку аминокислоты вносят значительный вклад в биологическую активность белоксодержапщх веществ, нами установлен аминокислотный состав гомогената трутневых личинок с помощью аминокислотного анализатора фирмы «Hitachi» (Япония). Содержание свободных и суммы свободных и связанных аминокислот приведено в табл. 3.

Полученные данные по аминокислотному составу свидетельствуют о том, что все образцы трутневых личинок содержат один и тот же набор из 20-ти аминокислот, в том числе 10 незаменимых. Отмечается высокое содержание глутаминовой кислоты, пролина, валина, аланина, тирозина, лизина, лейцина.

Таблица 3

Аминокислотный состав трутневых личинок_

Содержание (в пересчете на сухое вещество),%

АМИНОКИСЛОТЫ Старой. Кранодар.край Ростов.обл. Иркугс.обл.

край

своб сум- своб.а сумма своб. сумма своб. сумма

ма м.к ам.к. ам.к. ам.к. ам.к~ ам.к.

ам.к ам.к.

Аспарагиновая

кислота 0,04 3,52 0,03 .3,59 0,04 3,54 0,04 3,61 .

Треонин 0,87 1,56 . 0,78 1,58 0,85 1,69 0,84 1,64

Серин 0,22 1,72 0,20 1,83 0,21 1,76 0,21 1,66

Глугаминовая 6,85 '

кислота 1,02 6,27 0,91 0,99 6,73 0,95 5,99

Пролин 2,30 3,50 2,03 3,56 2,15 . 3,30 2,13 3,36

Глицин 0,54 1,77 0,48 'Í,82 0,50 1,63 0,52 1,59

Алании 0,87 2,09 0,78 2,38 0,85 2,09 0,86 1,86

Цистян 0,11 0,21 0,10 0,19 0,11 0,26 0,11 0,18

Валик 0,51 2,20 0,46 2,30 0,50 1,89 0,49 2,61

Метионин 0,16 0,79 0,15 0,64 0,15 0,82 0,15 0,72

Изолейцин 0,26 1,86 0,24 1,66 0,25 1,59 0,24 0,68

Лейцин 0,45 3,34 0,40 3,45 0,44 3,98 0,43 3,63

Тирозин 0,34 2,06 0,30 2,38 0,33 2,25 0,31 1,79

Фенил ал анин 0,18 1,69 0,16 1,76 0,17 1,62 0,17 1,45

Лизин 0,48 2,78 0,43 3,23 0,46 2,41 0,45 2,99

Гистидин 0,19 0,88 0,17 í,06 0,19 0,84 0,18 0,70

Аргинин 0,44 1,94 0,40 1,88 0,42 2,14 0,41 1,85

Таурин 0,08 - 0,08 - 0,09 - 0,08 -

Фосфосерин 0,12 - 0,12 - 0,11 - 0,12 -

Триптофан 0,02 0,40 0,02 0,41 0,02 0,35 0,02 0,47

Сумма 9,20 38,58 8,24 40,57 8,83 38,89 8,71 37,57

ам.к,%

Сумма не- 3,67 15,71 3,31 16,28 3,60 15,45 3,49 16,07

зам.ам.к.,%

Сод. незам. 39,89 40,77 40,17 40,13 40,77 39,73 40,07 42,77

ам.к. от общей

суммы ам.к.,%

Суммарное содержание всех аминокислот в гомогенате трутневых личинок составляет 37,57-40,57%. Содержание незаменимых аминокислот составляет 15,45-16,28%, или 39,73-40,77% от общего количества аминокислот, что свидетельствует о высокой питательной ценности и биологической активности трутневых личинок.

Важными компонентами субстанций трутневых личинок, отвечаю-

щими за их биологическую активность, являются ферменты. Нами установлен качественный и количественный состав основных ферментов с помощью модифицированных методик, описанных в литературе. Определена высокая активность уреазы, липаз, дегидрогеназ, фосфотаз, амилазы, катепсинов, протеаз.

Липвдная фракция вносит значительный вклад в фармакологическую активность исследуемого объекта Нами определена массовая доля эфирорастворимой липидной фракции, трутневых личинок экстракцией, которая составила 5,7-7,5%. Содержание липидного фосфора с последующим определением фосфолипидов получено фотоколориметрическим методом по реакции органического фосфора с молибдатом аммония. Содержание фосфолипидов в гомогената и лиофилизате трутневых личинок из разных краев и областей страны составило 1,2-1,7%.

Поскольку липидная фракция представлена большим многообразием органических соединений, мы сочли необходимым провести исследование качественного и количественного состава данной фракции изучаемого объекта с помощью хромато-масс-спектрометрии. Были идентифицировны и количественно определены свободные жирные кислоты (табл. 4).

Таблица 4

Количественное содержание жирных кислот в гомогенате трутневых личинок

Жирная кислота Содержание, Жирная кислота Содержание,

мкг/мг мкг/мг

1.Декановая 0,09 Б.Олеиновая 97,96

2.Додекановая 1,50 9. Стеариновая 34,23

3. Дикарбон. к-та Ю.Арахиновая 1,49

неидентиф. 4,00 П.Бегеновая 0,67

4.Тетрадеценовая 0,12 12.Лигноцери-

5.Миристиновая 16,15 новая 0,04

б.Пальмито-

олеиновая 2,81 Сумма 252,33

7. Пальмитиновая 97,21

Всего определено 12 жирных кислот, в том числе ненасыщенные (тетрадеценовая, олеиновая, пальмиголеиновая). количество которых соста-

вшю примерю 40% от общего количества кислот,

В октаве фряипш. полученной экстра ющей с&есыо хлороформ-метатол определено 117 соединений (табл,5к

Т§®ляш5

Состав органических веществ в гомогсшпе трушешх лшшш

Соединение Содержание, нг/мг Соеданеше Содержание» нг/мг

КИСЛОТЫ Мммэдгошше

1 ,Гскандпкар&&- - 31:37 СПИРТЫ

новая. 21.Арабшштол ад

2,Гексадсцсновзя 7150,74 13,70 .

3 ,Мсрвдгаяовзя . 210.66 23,Гдадвтол 774.33

4,7чвдд1штзн(}вэя 7,03 24,Ксялитод 559,76

5,Оксяметшмас- ДО.Мюнкозтод 9,97

лгашж 17,55 26,Машш>л 268,72

б.Окендшзр- Сахара

божнш 7,83 2й.Глюшзз шш

7,4ч»шш1велт- '27.Галакгофлмясгза 1979.89

карбоновая 2 8. Маннопираноза 1821,55

кислота 39,94 29.Сорбоза 1315,10

8. Пальмитиновая 3745,37 ЗО.Талоза 5284,20

9.Рибоновая 162,10 31. Фруктоза 9119,06

10. Стеариновая 2805,75 3 2. Нейдент. дасахарид 79,39

П.Себациновая 10,19 ЗЗ.Неидентиф.сахарид 88,09

12.Триоксисеба- Эфиры

циновая 71,60 34.Метилолеат 24,86

13.Янтарная 489,03 3 5 .Метилстеарат 60,34

Аминокислоты Зб.Моноглицеридолеин 35,32

14. Пролин 314,98 3 7. Этилпальмитат 215,27

15. Серин 40,45 38.Этнлолеат 586,32

16.Треонин 130,73 39.Этилстеарат 481,94

17.Фенилаланин 231,20 Алкены

Ароматические 40.1,2-диоксициклогексен 28,37

соединения Стернны

18.1,3-диокси- 6,69 41.Изопреноид 44,13

бензол 42.Стерол

19.Аминопиперидон 15,16 (копростанол) 146,69

20.Ундоценон ди- 43.Ситостерол 55,18

окситетраметилди- 44. Сигмастадиенил 42,27

оксо 20,36 Неизвестные соединения 9145,92

Всего 46299,25

Таким образом, в гомогенате трутневых дичинок содержится орта-

личесвая фракция, швдочазощая комплекс бназогическв активных вещали, играющих важную роль в биолопяесжон шшаяосш трутневых лнчш&не.

В обрмайх. тдутвевых. личначк содержание суммы нуклеиновых кислот, являющихся йдаши на 6нолол«еаш активных компонентов исследуемых объекте, определяли расчетным спосшом т садержши-по общего фосфора и спекгрофотаметротеским методом после кислотного пщхшта до нх растворимых фратентбв. Массовая дала нуклеиновых икают оказалась равной 11,1-13,4%. Опрсдедещс содержания РНК и ДНК также проводили спеЕгрофзггометрическвм мстсщом после прсдваретсльноге разделения рвбендр'кяшгвдов, Камчатке РНК в гомогсюте н лмфкшше трутневых личинок составило 2,1-2,ТКц. 8 ДНК - 8,1-8,5% Полученные данные показывают,, тябшьштъюп, нукжшавихкнедотв пыогенал н даадфщшзате прсясттэдяа ДНК, сожрадвс которой в среди»« в 3 рш превышает количество РНК,

Для определения массовых долей основных Сахаров: общих Сахаров, восстанавливающих Сахаров до инверсии, сахарозы, фруктозы использовали фотометрический метод. Полученные результаты представлены в табл. 6

Таблица 6

Результаты определения массовой доли Сахаров (%) в гомогенате и лиофи-__лизате трутневых личинок (п=7)_

Углеводы Содержание Сахаров, %

гомогенат лиофилгоат

Ставроп. край Краснод. край Ростов, область Иркутская область Ставроп. край

помесная порода итальянская порода карпатская порода среднерусская порода помесная порода

1 2 3 4 5 6

1999г

общие сахара 5,36± 0,05 4,78±0,08 5,54±0,13 5,52±0,03 5,50±0,03

восстанавливающие сахара до инверсии 2,47± 0,08 2,1 Ш,10 2,44*0,08 2,34±0,07 2,18±0,02

1 2 3 4 5 6

сахароза 2,89± 0,07 2,67±0,08 3,1010,06 3,1810,07 3,3210,08

фруктоза 12,09± 0,35 11,12Ю,35 11,48Ю,31 11,2410,37 12,2110,28

2 0 0 0 г

общие сахара 7,54± 0,24 7,38±0,11 7,7710,21 7,6310,19 7,16Ю,14

восстанавливающие сахара до инверсии 2,69± 0,06 2,73±0,07 ■ 2,5610,07 2,45Ю,08 2,1210,13

сахароза 4,85± 0,10- 4,6510,09 ■ 5,2110,10 5,1810,10 5,0410,09

фруктоза 11,71± 0,37 12,2010,39 12,7010,18 11,8910,13 10,0010,2 3

2 0 0 1 г

общие сахара 7,52± 0,19 7,54±0,07 7,8510,24 7,5910,20 6,81Ю,22

восстанавливающие сахара до инверсии 2,51+ 0,08 2,56*0,05 3,5310,04 2,4510,07 2,23+0,08

сахароза 5,01± 0,11 4,98±0,10 4,3210,07 5,1410,09 4,5810,08

фруктоза 12,09± 0,24 11,9610,30 12,06Ю,25 12,6810,23 11,6610,24

Содержание Сахаров составило: общих Сахаров - 4,8-7,9%, восста-

навливающих Сахаров до инверсии - 2,1-3,5%, сахарозы - 2,7-5,2%, фруктозы - 10,0-12,7%. Содержащиеся в гомогенате и лиофилизате трутневых личинок углеводы свидетельствуют о высокой питательной ценности изучаемых объектов.

При изучении минерального состава трутневых личинок методом атомно-абсорбционной спектрометрии определено высокое содержание биологически ценных микроэлементов: железа (4,01-4,12мг/кг), марганца (0,24-0,26мг/кг), меди (4,36-4,41мг/кг), никеля (0,02мг/кг), кобальта (0,10-0,11мг/кг), цинка (2,15-2,18мг/кг). Токсичные элементы - свинец, кадмий находятся на уровне фоновых концентраций, ртуть и мышьяк не обнаружены.

Тпши снэразом, трутневые личинки, содержат полный сбалансированный: набор жизненно необходимых шмпонентов, Установлено, что фнзнш-жимические гока затеян. н хтгаческий состав трутневых днчшкж не зависят- от порозы, пчел места и: гола сбора, н могут быть использованы ага ■ сшшртпзашн изучаемых объектов, Для оценки качества гомошша и лнйфшпшта трзтневых личинок е'ылн выбраны норны а показатели их качества: оргпижптнческие свойства, растворим ость, реакции: подлинно- ' ста: (на белене сахара, бцрптернн. фермент дешдмменазук значение рН, среды, содержание влаги, .общей н сульфатной золы, каоргстворимого белка, фруктозы н эф«форасп»р1щой лшялиой фракции.

Фармакологический оценка и сгандартщашш лекарственны!; и жчсФкмфофнлактнческнх средств* содержании гомогаш н лямшнш тушеных лячшшк Исход« го хюшчесшго состава (высокого содержания белков, аминокислот, нуклеиновых кислот, липидов, ферментов, ненасыщенных жирных кислот, стеринов и др) мы предположили наличие у трутневых личинок противовоспалительного и ранозаживляющего действия.

В связи с этим, нами были разработаны наружные лекарственные формы: крема и мази: крем "Апилар", крем-маска "Виталар", мази "Апилар-Г", "Апилар-проп".

Предварительно нами были исследованы острая и хроническая токсичность, аллергизирующие свойства. Установлено, что изучаемые объекты относятся к практически нетоксичным веществам, а также отсутствие аллергизирующих свойств у трутневых личинок в концентрациях, рекомендуемых нами в лекарственных формах.

Противовоспалительная активность мазей и кремов была изучена методом онкометрии . В качестве препарата сравнения использовалась 5% мазь бутадиона.

Влияние мазей на величину развития отека

120г1

1 2 3 4 5 6 7

• Рис.1

Примечание: .1) ц] изменение величины отека через 5 часов,щ -через 24 часа, О - через 48 часов.

2) 1 - контроль, 2-5% мазь бутадиона, 3 - основа, 4 - мазь "Апилар-Г", 5- мазь "Апилар-проп", б - крем "Апилар", 7 - крем-маска "Виталар".

3) * - значения статистически значимо отличаются от контроля,

Р<0,05.

Через 4,24,48ч от введения раствора раздражителя (рис.1) лекарственные формы с трутневыми личинками показали статистически достоверное снижение степени отека лапки крыс по сравнению с контрольной группой. По способности подавлять воспаление мази "Апилар-Г' и "Апилар-проп" превосходят 5% мазь бутадиона в среднем в 1,5-2 раза, а крема с трутневыми личинками в среднем на 8-10%.

Репаративную активность мазей изучали на модели открытых резанных ран, а также химического и термического ожога. В качестве препарата сравнения использовали 10% мазь метилурацила.

Экспериментально установлено, что мази с трутневыми личинками стимулируют репаративную регенерацию кожи при термических, химических ожогах, открытых ранах и по активности превосходят действие 10% мази метилурацила примерно в 2 раза.

Разработанные лекарственные н лечебно-профилактические средства были стандартизированы по следующим показателям: описание, подлинность (качественные реакции на сахара, белки, биоптерин), значение рН среды (4,7-5,9), термостабильность, коллоидная стабильность, массовая доля влаги (83,5-90,5), содержание водорастворимого белка (не менее 5,9%).

Были изучены условия и сроки хранения гомогената и лиофилизата тутневых личинок и разработанных лекарственных и лечебно-профилактических средств. Установлено,что срок годности гомогената при -10 - 0 °С составляет 1 год со дня получения на пасеке, лиофилизата - 2 года при температуре не выше. ЩРС, мазей и кремов - 2 года в прохладном месте.

<

Таким образом, нами теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования трутневых личинок для получения высокоэффективных мягких лекарственных и лечебно-профилактических средств.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Получены гомогенат и лиофилизат из трутневых личинок разных лет сбора, пород пчел, регионов страны и изучены их органолеп-тические свойства.

2. Проведено сравнительное изучение основных физико-химических показателей гомогената и лиофилизата трутневых личинок, собранных в период 1999-2001гг в различных областях и краях России. Определены: значения рН среды, массовые доли влаги, общей и сульфатной золы.

3. Изучен минеральный состав трутневых личинок Установлено, что трутневые личинки являются сырьем, богатым биологически ценными микроэлементами: железом, марганецем, медью, никелем, кобальтом, цинком.

4. Установлено в гомогенате и лиофилизате трутневых личинок содержание общего, истинного и водорастворимого белка. Опреде-

лена массовая доля сульфгидрильных групп белка, характеризующих его высокую биологическую активность.

5. Определен аминокислотный состав гомогената трутневых личинок, включающий набор из 20 аминокислот, в том числе 10 незаменимых. Содержание аминокислот в образцах составляет 37,6 -40,6%, в том числе 15,5 -16,3% незаменимых.

6. Изучен основной ферментный состав гомогената и лиофилизата трутневых личинок. Определена активность ферментов: уреазы, ч липаз, дегидрогеназы, амилазы, фосфотаз, катепсинов, протеаз.

7. Определено содержание дезоксирибонуклеиновой, рибонуклеиновой и суммы нуклеиновых кислот в гомогенате и лиофилизате трутневых личинок Установлено, что большая часть нуклеиновых кислот в гомогенате и лиофилизате представлена ДНК, содержание которой в среднем в 3 раза превышает количество РНК

8. Исследован с помощью метода хромато-масс-спектрометрии качественный и количественный состав липидной фракции гомогената трутневых личинок В исследуемом объекте установлено 117 органических соединений. Определены массовые доли эфи-рорастворимой липидной фракции, лшшдного фосфора и фос-фолипидов.

9. Определено содержание восстанавливающих Сахаров до инверсии, общих Сахаров, сахарозы и фруктозы в гомогенате и лиофилизате трутневых личинок с помощью химических и фотометрических методов. Основным моносахаридом в трутневых личинках является фруктоза.

10. Установлено, что физико-химические показатели, качественный и количественный состав гомогената и лиофилизата трутневых личинок не зависит от породы пчел, места и года сбора.

11. Экспериментально доказано, что трутневые личинки относятся к практически нетоксичным веществам и не обладают аллергизи-

рующими свойствами.

12. С помощью биофармацевтических исследований проведен выбор композиций для мазей и кремов, в результате чего предложены мази «Апилар-Г», «Апилар-проп», крем «Апилар» и крем-маска «Виталар», содержащие гомогенат и лиофилизат трутневых личинок.

13. Проведена стандартизация разработанных лекарственных средств, определены их сроки годности и условия хранения.

14. Установлено, что предложенные лекарственные средства обладают высокой противовоспалительной активностью, стимулируют репаративную регенерацию кожи при термических и химических ожогах, открытых ранах и по действию превосходят препараты сравнения.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Нетрадиционная пищевая добавка - личинки пчел//Мир и молодежь: проблемы гуманитарного знания: Тез. докл. город, студ. межвуз. науч. - практ. конф.(1;1998; Пятигорск) - Пятигорск: ПГЛУ, 1998. - С.97. (соавт.: Аракелян A.A., Кан H.A., Абрамен-ко И.З., Молчанов Г.И., Лазарян Д.С., Хачава М.Р.).

2. Изучение химического состава трутневого расплода пчел с целью получения лекарственных препаратов //Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы Междунар. съезда (4; 2000; Великий Новгород).- СПб., 2000,- С.81-83. (соавт.: Лазарян Д.С., Вергейчик Т.Х., Федорова Е.П., Линникова В.А.).

3. Получение и стандартизация лечебных косметических кремов на основе трутневого расплода пчел //Человек и лекарство: Тездокл. Рос. нац. конгресса (8; 2001; Москва)-М.: ООФ «Здоровье человека», 2001,- С.584. (соавт.: Лазарян ДС., Федорова Е.П., Вергей-

чик Т.Х., Линникова В. А.).

4. Количественное определение углеводов в гомогенате расплода пчел// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (56; 2001; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: ПятГФА, 2001,- С. 108-109. (соавт.: Лазарян Д.С., Красовская C.B., Криков М.В., Вертейчик Т.Х., Линникова В.А., Гуськова Г.Б.).

5. Сравнительное изучение актопротекторной активности расплода пчел// Регион, корф. по фармации, фармакологии и подготовке . кадров (56; 2001; Пятигорск): Материалы...-Пятигорск: С.218-219. ПятГФА, 2001,- С.218-219. (соавт.: Лазарян Д.С.,

Криков М.В., Кулешова С.А.).

6. Изучение противовоспалительного действия косметического крема, содержащего трутневые личинки // В III тысячелетие с богатством «Золотого Улья»: Материалы Междунар., Всерос. науч.-практ. конф. по пчеловодству и апитерапии. (3 и 9; 2001; Саратов).- Саратов, 2001,- С.135-136.

7. Изучение фармакологической активности пчелиного расплода и мазей на его основе// Пятигорск: ПятГФА, 2002. - 25с. Деп. в ВИНИТИ 24.01.2002, №137-В2002 (соавт.: Лазарян Д.С., Кулешова С. А.).

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ И ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ТРУТНЕВЫХ ЛИЧИНОК

СОТНИКОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 1б,мар7& 2002г. формат бумаги 60x84 1/16 Бумага кн.-журнальная. Печать ротапринтарная. Усл. печ.л. 1,0. Тираж¡СО зкз. Заказ № /4'УГ

Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357533, г.Пятигорск, пр. Калинина,11