Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Определение азалептина при судебно-химическом исследовании

На правах рукописи

СОКОЛОВА ОЛЬГА ИВАНОВНА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗАЛЕПТИНА ПРИ СУДЕ БИОХИМИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ

15 00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЕРМЬ-2007

003174018

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель1 кандидат фармацевтических наук,

Официальные оппоненты доктор фармацевтических наук,

Ведущая организация. ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 20 ноября 2007 г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208 068 01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской

государственной фармацевтической академии

у/

Автореферат разослан « октября 2007 г

доцент Малкова Тамара Леонидовна

профессор Хомов Юрий Александрович ГОУ ВПО ПГФА Росздрава

доктор фармацевтических наук, профессор Лазарян Джоник Седракович ГОУ ВПО ПятГФА Росздрава

Ученый секретарь диссертационного совета

Метелева Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Отравления психотропными препаратами занимают 3-4 место в рейтинге отравлений лекарственными средствами Разработка новых комплексных методик определения психотропных и сильнодействующих лекарственных препаратов в биологических объектах является одной из наиболее актуальных задач токсикологической химии

В настоящее время участились случаи отравлений азалептином, в том числе с летальным исходом Особо обращает на себя внимание использование азалептина для осуществления криминальных действий

Клозапин (азалептин) является производным пиперазино-дибензодиазепина, обладает высокой нейролептической активностью и оказывает быстро наступающее седативное действие Препарат показан при острых и хронических формах шизофрении, психозах и других пограничных состояниях сознания

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что систематические исследования по разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина в биологических объектах не проводились, в судебно-химическом отношении препарат изучен недостаточно

Следовательно, комплексное исследование по разработке И оптимизации Методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биоматериала, является актуальным

Цель и задачи Целью диссертационной работы является разработка и совершенствование методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина в биологических объектах при судебно-химическом исследовании

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- изучить условия изолирования азалептина из биообъектов, определить оптимальные условия изолирования и очистки,

- разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методики обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкоегной и высокоэффективной жидкостной хроматографии,

- определить возможность использования спектральных методов при судебно-химическом анализе азалептина,

- предложить схемы судебно-химического исследования при отравлении азалептином,

- разработать проект Новой медицинской технологии определения азалептина при судебно-химическом исследовании

Научная новизна Оптимизированы методики изолирования азалептина из биологических тканей и жидкостей на основе общих и частных методов

Показана возможность использования спектральных методов (УФ- и ИК-спектрофотометрии) для целей идентификации и количественного определения азалептина при судебно-химическом исследовании

Впервые предложен комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии

Предложены схемы судебно-химического исследования биологических объектов (кровь, моча, желчь, внутренние органы) на наличие азалептина, включающие подготовку проб для анализа, алгоритмы проведения анализа с использованием современных

инструментальных методов (спектральных, хроматографических) на предварительном и подтверждающем этапах

Определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно установить факт отравления при летальном исходе, в соответствии с разработанными схемами для использования в практической экспертной деятельности

Внесено предложение в Национальный НИИ общественного здоровья РАМН по изменению рубрикации положения клозапина (азалептина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10), с кода «Т42 Отравление противосудорожными, седативными, снотворными и противопаркинсоническими средствами Т42 4 Бензодиазепинами» на код «Т43 Отравление психотропными средствами »

Практическая значимость и внедрение результатов исследования Разработанный комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ- и ИК-спектрофотометрии позволяет достоверно установить факт отравления азалептином в практике работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы

Предлагаемые методики позволяют значительно сократить время анализа по обнаружению азалептина, уменьшить навески биологических объектов (вещественных доказательств) и тем самым повысить эффективность проведения судебно-химического исследования и снизить материальные затраты

Применение разработанных методик в практике химико-токсикологических лабораторий для диагностирования отравления

азалептином позволяет осуществлять оценку степени отравления и оказывать своевременную помощь пострадавшему

Разработанные методики изолирования азалептина из биологического материала, обнаружения и количественного определения апробированы и внедрены в практику работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Свердловской, Самарской, Оренбургской, Кировской, Челябинской, Курганской областей, Удмуртской Республики, химико-токсикологической лаборатории областного центра острых отравлений Свердловской областной клинической психиатрической больницы, в учебный процесс кафедры токсикологической химии и Регионального центра аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии, имеются акты внедрения

Апробация работы Результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г Новосибирск, 2005), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (г Сочи, 2005), Международной научно-практической конференции «Фармация и здоровье» (г Пермь, 2005), 80-й студенческой научной конференции (г Казань, 2006), 2-й Российско-Китайской научной конференции «Фундаментальная фармакология и фармация - клинической практике» (г Пермь, 2006), 61-й региональной конференции по фармации и фармакологии (г Пятигорск, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г Москва, 2007)

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 125 страницах печатного текста, состоит из введения,

обзора литературы, экспериментальной части (4-х глав), общих выводов, содержит 17 рисунков и 31 таблицу, список литературы, включающий 125 источников, из которых 27 - иностранных, приложения

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом исследований Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01 9 50 007417)

На защиту диссертации выносятся следующие положения

- Результаты теоретического обоснования и экспериментальных исследований по определению азалептина на предварительном и подтверждающем этапах судебно-химического исследования биологического материала с использованием современных физико-химических методов

- Оптимизация условий изолирования и очистки азалептина из биологических объектов (кровь, моча, желчь, печень и другие внутренние органы и ткани)

- Результаты разработки методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ - и ИК - спектрофотометр™

- Схемы судебно-химического исследования биологического материала при отравлении азалептином

- Изменение рубрикации положения азалептина (клозапина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10)

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Международное непатентованное название лекарственного средства - клозапин, торговые названия - азалептин (Россия), лепонекс (Швейцария) Фармакологическая группа -антипсихотическое (нейролептическое) средство Клозапин (азалептин) является трициклическим соединением, производным пиперазино-дибензодиазепина

Клозапин (азалептин) в терминологическом Указателе МКБ-10 должен быть отнесен к психотропным средствам с кодом «Т43 Отравление психотропными средствами, не классифицированное в других рубриках Т43 3 Фенотиазиновыми антипсихотическими и нейролептическими средствами Т43 4 Нейролептиками типа бутерофенона и тиоксантена Т43 5 Другими и неуточненными антипсихотическими и нейролептическими средствами Исключено препаратами раувольфии (Т46 5) »

Методики обнаружения и количественного определения азалептина

Тонкослойная хроматография

Нами исследована возможность использования метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) для идентификации азалептина, выделенного из биологических объектов

Для целей скрининга наряду с азалептином были исследованы психотропные лекарственные средства, встречающиеся при комбинированных отравлениях амитриптилин, аминазин, реланиум

Хроматографию в тонком слое проводили в нормально-фазовом варианте на хроматографических пластинках «Сорбфил» и в обращенно-фазовом варианте на хроматографических пластинках «Плазмахром»

В нормально-фазовом варианте хроматографирование проводили в следующих системах растворителей, наиболее часто применяемых в скрининге веществ основного характера при ненаправленном анализе (подвижные фазы I-V) I - метанол 25% раствор аммония гидроксида (100 1,5), Rfa3inenTKHa=0, 5 5 ±0,0 5, II-этилацетат метанол 25% раствор аммония гидроксида (85 10 5), Rfa3Menima=0,72±0,04, III - диоксан хлороформ ацетон 25% раствор аммония гидроксида (47 45 5 2,5), Rfa3anenTmIa=0)62±0)04, IV -толуол ацетон этанол 25% раствор аммония гидроксида (45 45 7,5 2,5), Rfasa„enTiIJ,a=0,64±0,04, V - хлороформ метанол (9 I), К4юлгатша=0,42±0,03 В качестве специальных подвижных фаз предложены следующие VI - гептан хлороформ абсолютный этанол 25% раствор аммония гидроксида (30 30 30 1), Rfa3MenTHHa=0,70±0,04, VII - гептан н-пропанол этилацетат 25% раствор аммония гидроксида (20 20 5 2), Rf„anennlHa=0,42±0,04, VIII - бензол этанол 25% раствор аммония гидроксида (50 10 0,5), К1щалептика=0,50±0,04, IX - этилацетат хлороформ 25% раствор аммония гидроксида (85 10 5), Rf1BMM„lraa=0,50±0,04, X - толуол ацетон 25% раствор аммония гидроксида (50 50 1),

Ría3aneimíHa~0,52i0,04

В обращенно-фазовом варианте хроматографирование проводили в системах растворителей XI - этанол вода 25% раствор аммония гидроксида (6 5,5 0,5), рекомендуемой для веществ основного характера, XII - этанол вода 25% раствор аммония гидроксида (6 4 6), рекомендуемой для производных бензодиазепина, XIII - этанол вода 25% раствор аммония гидроксида (8 4 0,5), рекомендуемой для производных фенотиазина

Проведенные исследования показали, что величина Rf азалептина наиболее отличается от значений других исследуемых психотропных веществ на пластинках «Сорбфил» при использовании систем I и III (рекомендованы для разделения) Системы VIII, IX целесообразно использовать для очистки, пятно азалептина располагается в средней зоне хроматографической пластинки, что позволяет отделить вещество от соэкстрактивных веществ биологической матрицы при исследовании органической фракции Потери при очистке методом тонкослойной хроматографии на модельных смесях составили 9-13%

Следует отметить, что применяемые в обращенно-фазовом варианте ТСХ системы растворителей (таблица 1) более стабильны ввиду отсутствия летучих органических растворителей, результаты ТСХ более воспроизводимы, деление веществ хорошее, колебание значений Rf азалептина-метчика и азалептина, выделенного из биологического материала, незначительны

Таблица 1

Значения Rf ряда психотропных веществ на пластинках

«Плазмахром»

Исследуемые вещества Системы растворителей

XI XII XIII

Азалептин 0,34 0,50 0,48

Амитриптилин 0,12 0,33 0,36

Аминазин 0,12 0,34 0,35

Реланиум 0,59 0,52 0,62

Азалептин, выделенный из биологического материала 0,34 0,50 0,48

Обнаружение азалептина на хроматографических пластинках проводили по собственной окраске визуально наблюдаемых пятен желтого цвета, по гашению флюоресценции в УФ-свете (при длине волны 254 нм), по окрашиванию пятен различными визуализирующими растворами

Получены следующие результаты определения цветовых характеристик и чувствительности азалептина при анализе методом тонкослойной хроматографии в УФ-свете при 254 нм - поглощение (темные пятна), чувствительность 1 мкг, пары йода - желтый цвет пятен (0,1 мкг), реактив Драгендорфа - красно-оранжевый цвет пятен (0,2 мкг), раствор калия перманганата — желтоватый цвет пятен на розоватом фоне (0,2 мкг), раствор йодплатината - серо-фиолетовый цвет пятен на красноватом фоне (0,2 мкг), реактив Эрдмана - желтый цвет пятен (2 мкг), кислота азотная концентрированная - красновато-коричневый цвет пятен (2 мкг), реактив Либермана - желто-коричневый цвет пятен (2 мкг), реактив FPN - зеленовато-желтоватый —» красновато-коричневый цвет пятен (2 мкг)

Спектральные методики анализа

Нами была изучена возможность обнаружения азалептина после изолирования из биологических объектов методом ИК-спектрофотометрии на спектрометрах «Specord 80М», «Инфралюм ФТ-02» Подготовку образцов осуществляли в соответствии с указаниями ГФХ1, формируя диск с калия бромидом

В диапазоне длин волн 4000 см-1 - 400 см"1 в ИК-спектрах азалептина (стандарта) и азалептина, выделенного из стенки желудка экстракцией в щелочную фракцию, после ТСХ-очистки, наблюдали характеристические полосы поглощения при 1604 см"1, 1560 см"1, 1468 см"1 (дуплет), 1384 см"1 (дуплет), 1284 см"1, 780 см"', в

биологическом о&ьскте наблюдался при «1800 см"1 посторонний пик примеси (рисунок 1). Мало интенсивные полосы в ИК-спектре азалептина, выделенного из биообъекта, практически не Просматриваются.

Рис. 1. ИК-спектры стандарта азалептипа (вверху) и

азалептина, выделенного из стенки желудка (внизу)

При проведении УФ-ешкгро фотометрии водных и эганолышх растворов аза л сити на наблюдали УФ-спектры, характер которых зависит ОТ значения рН среды. УФ-спекТр азалептипа в 95% этаноле гфи рН б имел максимумы абсорбции при длинах волн 230, 260 нм и гглато при длине волны 291 нм, минимум при длинах волн 225, 254, 285 нм; при рН 2 - максимум абсорбции при длине волны 245 нм и плато - 298 нм, минимум абсорбции при длине волны 230 нм (рисунок 2).

В УФ-спектре азалептипа в 0,1 M растворе кислоты хлороводородной наблюдали максимум абсорбции при длине 240±2 нм и плато при длине волны 295 нм, минимум при длине волны 228 НМ. Определено значение E1%tc;j-798 в 0,i M растворе кислоты хлороводородной при длине волны 240±2 нм.

Для построения графика использовали стандартные растворы азалептина в диапазоне концентраций 2-10 м к г/мл. абсорбция растворов измерялась при длине волны 240+2 нм на спектрофотометре «:5ресогс1 М40» в кварцевых кюветах с толщиной слоя I см, раствор сравнения — 0,1 М раствор кислоты хлороводородной. Уравнение градуировочного графика 0=0,0861С - 0,0806. Коэффициент корреляции Кг=0.9963, Чувствительность определения 0,5 м к г/мл. Линейную зависимость графика наблюдали в интервале концентраций 2-15 м кг/мл.

У Ф-спСктры &зя.лепгиш, выделенного \'<::; ;|

Рис. 2. УФ-сиектры при рН 2, рН 6 и дифференциальные спектры азалептина, выделенного из мочи, в 95% этаноле

Высокоэффективная жидкостная хроматография(БЭЖХ) Разработаны условия определения азалептина методом ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02» с УФ—детектором: колонка, заполненная модифицированным силикагелем «Силасорб С18» с размером частиц 5 мкм, длина колонки 75 мм, диаметр — 2 мм; элюент - метанол: фосфатный буфер с рН 3 (80: 20); скорость потока элюента

- 100 мкл/мин, режим элюирования - изократичеекий; объем вводимой пробы - 5 мкя; температура колонки - 35 длина волны детектирования — 240 дал, постоянная времени детекции - 0,34 сек. (рисунок 3). На хроматограмме наблюдали пик азалептина со временем удерживания 2.46 мин. В процессе хроматографирования дополнительно идентифицировали азалептин по УФ-спектру с максимумом абсорбции при длине волны 240 нм.

Для количественного определения а зал от пина, выделенного из биологического материала, применяли метод абсолютной калибровки. Для построения графика использовали стандартные растворы азалептшга в подвижной фазе в диапазоне концентраций 10-100 мкг/мл Уравнение граду ировочного графика 3=0,4035С Коэффициент корреляции К2=0,9998. Предельно обнаруживаемая концентрация азалептина методом ВЭЖХ — 0,2 мкг/мл.

Время, ним

Рис. 3. Хроматограмма элюирования азалептина

подвижной фазой метанол; фосфатный буфер с рН 3 (80: 20) после изолирования из крови

Газо'жидкостная хроматография (ГЖХ) По данным исследований нами предложены следующие условия для исследования азалептина, выделенного из биологического материала, методом ГЖХ;

- хроматограф НР-5890 фирмы «Хьюлетт-Паккард» (США) с масс-селективиым детектором серии 5972, ЭВМ-обработкой данных анализа Условия хроматографического разделения капиллярная кварцевая колонка НР-5 длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, толщиной пленки на колонке 0,25 мкм, скорость потока газа-носителя гелия 1,09 мл/мин, температуры инжектора 250 °С, детектора 280 °С, температурное программирование колонки начальная температура 70 °С в течение 2 минут, повышение температуры со скоростью 20 °С/мин до конечной 290 °С, время анализа 25 мин ,

- газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с термоионным детектором (ТИД), программное обеспечение «Хроматэк Аналитик» Условия хроматографического разделения капиллярная кварцевая колонка ZB-5 (5% Phenyl 95% Dimethylpolysiloxane) длиной 30 м, диаметром 0,32 мм, толщиной пленки на колонке 0,25 мкм, расход газовых потоков газа-носителя гелия — 30 мл/мин (скорость потока 3,1 мл/мин, деление потока 1 10), водорода - 12,0 мл/мин, воздуха -200 мл/мин, температуры испарителя 250 °С, детектора 330 °С, температурное программирование колонки начальная температура 100 °С - 2 мин, подъем температуры со скоростью 20 °С/мин до температуры 290 °С, время анализа 18 мин ,

- газовый хроматограф «Кристалл 2000М» с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), программное обеспечение «Хроматэк Аналитик» Условия хроматографического разделения капиллярная кварцевая колонка РН-5 длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, толщиной пленки на колонке 0,25 мкм, расход газовых потоков газа-носителя азота - 9,6 мл/мин (давление 110 кПа, деление потока 1 5,8), водорода - 20 мл/мин, воздуха - 200 мл/мин, температуры, испарителя 250 °С, детектора 280 °С, температурное

1Й

про1раммирование колонки; начальная температура 100 °С - 2 мин, подъем температуры со скоростью 20 °С/мин до температуры 290 ° С, время анализа 25 мин. Хроматограммы разделения смеси веществ с использованием детекторов Г1ИД и ТИД представлены на рис. 4.

Сч

I I

Л

________(

ж

4>

_и

1.

Рис, 4. Хроматограммы смеси веществ, полученные на приборах с модулями ПИД (вверху), ТИД (внизу) Газо-жидкостной хроматографией с масс-селективной

детекцией определена возможность иденгафжеации азалепгина и его

метаболита Ы-дезметилююзапина (корклоэапина), выделенных из

биологических объектов (печень, желчь). Обнаружение азалепгина и

норклозашша осуществляли по временам удерживания и

характерным масс-спектрам, снятым в режиме полного

сканирования ионов m/z (SCAN) в интервале масс 45 - 550 а е м Масс-спектральные характеристики азалептина - 243, 256, 192, 70, 227, 245, 256, 326 (данные приведены в порядке уменьшения интенсивности), время удерживания 18 20 мин Масс-спектральные характеристики норклозапина - 243, 244, 256, 192, 312, время удерживания 18 80 мин

Для количественного определения азалептина на газовом хроматографе с MC-детектором использовали режим селективного ионного мониторинга - SIM, проводили детектирование выбранных ионов m/z По наиболее интенсивному иону (target) 243 а е м проводили количественную градуировку, ионы 256, 192, 227 а ем использовали для дополнительной идентификации и определения точности калибровки

Построение градуировочного графика проводили по усредненным данным трех измерений методом абсолютной калибровки с использованием метанолышх растворов азалептина в диапазоне концентраций 2,5 - 100 мкг/мл Линейность графика наблюдалась в диапазоне от 2,5 мкг/мл до 100 мкг/мл Коэффициент корреляции составил 0,995 Чувствительность определения - 50 нг/мл В крови предел обнаружения азалептина составил 0,1 мкг/мл (извлечение из 5 мл крови, пробу реконструировали в 0,1 мл метанола), в печени - 1 мкг/мл (0,1 мг%)

Использование трех видов детекторов (ПИД, ТИД, MC) повышает достоверность определения азалептина в извлечениях из биологического материала методом ГЖХ Это подтверждено экспертными исследованиями после изолирования азалептина из биологических объектов (кровь, моча) с определением в них вещества в концентрациях от 0,01 мг% (0,1 мкг/мл) до 0,03 мг% (0,3 мкг/мл)

Изолирование азалептина из биологического материала Модельные смеси (серии) биообъектов представляли собой мелкоизмельченную печень (25 г), кровь и мочу (25 мл), в которые было добавлено 2,5 мг субстанции азалептина После приготовления модельные смеси выдерживали при комнатной температуре в течение 24 часов Содержание азалептина в модельных смесях составило для печени -100 мкг/г, для мочи и крови - 100 мкг/мл

Изолирование азалептина из биологических объектов проводили по усовершенствованным нами методикам подкисленной водой по методу Васильевой, подкисленным спиртом по методу Стаса-Отго, по методике кислотного гидролиза на группу алкалоидов опия, по модифицированной для крови методике жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ)

Выход азалептина при изолировании из модельных смесей подкисленной щавелевой кислотой по усовершенствованной методике Васильевой составил ~75% (таблица 2)

Таблица 2

Результаты определения азалептина, изолированного из ткани печени подкисленной водой по усовершенствованной методике

Метрологические характеристики

Затравлено

Метод азалептина п X 8 Я* Дх е,%

СФ- 100,0 6 79,10 7,17 2,93 7,52 9,51

метод мкг/г

ГХ/МС 100,0 6 75,70 5,30 2,16 5,56 7,35

мкг/г

Оптимизация методики включала уменьшение навески для исследования (25 г биообъекта вместо 100 г), введение процесса центрифугирования, экстракционная очистка эфиром при рН 2 (вместо применяемого в этом методе хлороформа) от

соэстрактивных веществ биоматрицы, последующую трехкратную экстракцию хлороформом при рН=9 порциями 20x15x15 мл (время каждой экстракции 15 мин)

Методика изолирования азалептина подкисленным спиртом по методу Стаса-Отто незаменима при исследовании гнилостно-измененного трупного материала, биологического материала от больных серьёзными инфекционными заболеваниями (ВИЧ, гепатит, туберкулез)

В модельных опытах с тканью печени выход азалептина составил при определении СФ-методом в УФ-области 69,3±6,9 мкг/г (е=9,95%), при определении методом ГХ/МС 71,8±7,0 мкг/г (е=9,78%) из 100 мкг/г азалептина, введенного в пробу биологического материала

Оптимизация методики изолирования азалептина спиртом, подкисленным щавелевой кислотой, по методу Стаса-Отто включала уменьшение навески для исследования (25 г биообъекта вместо 100 г), использование ацетона для вторичной операции осаждения белков (первичное осаждение проводится этанолом), экстракционная очистка от балластных веществ эфиром при рН 2 (вместо применяемого в этом методе хлороформа), последующую трехкратную экстракцию хлороформом при рН=9 порциями 20x15x15 мл (время каждой экстракции 15 мин )

В последние годы при судебно-химических исследованиях все чаще требуется проведение того или иного вида гидролиза (кислотного, щелочного, энзимного) на целевую группу веществ, например, кислотного гидролиза на группу алкалоидов опия При проведении гидролиза происходит разрушение комплекса вещества с белками и высвобождение его из клеток биоматериала При проведении изолирования по методике кислотного гидролиза на группу алкалоидов опия процент выхода азалептина составил 6580% от введенного в пробу биологического материала (таблица 3)

Таблица 3

Результаты определения азалептина методом ГХ/МС после изолирования из биологических жидкостей и ткани печени

Метрологические характеристики, Р=95% (п=6)

Метод Моча Кровь Печень

изолирования 100 мкг/мл 100 мкг/мл 100 мкг/г

Кислотный гидролиз на группу опия х = 81,39 4,31 в >1,76 х = 65,10 8=4,90 87=2,00 х = 74,56 8=4,93 87=2,01

Дх = 4,52 е =5,56% Дх = 5,14 е =7,90% Дх = 5,18 е =6,94%

ЖЖЭ х = 83,31 8=4,83 Э>1,97 Дх = 5,06 е =6,08% х = 59,95 8=3,17 87=1,29 Дх = 3,33 е =5,55%

При изолировании по методике кислотного гидролиза на группу алкалоидов опия исключили первую стадию экстракционной очистки водной фазы хлороформом при рН 1-2, далее из водной фазы при рН=9 экстрагировали смесью хлороформ н-бутанол (9 1), реэкстрагировали дважды 0,1 М раствором кислоты хлороводородной, затем экстрагировали два раза порциями смеси хлороформ н-бутанол (9 1)12х12мл (время каждой экстракции 15 мин)

Для извлечения азалептина из крови применяли вариант жидкость-жидкостной экстракции с дополнительными процессами-разбавление крови водой, ультразвуковое воздействие, осаждение в

извлечении белков 10% раствором натрия вольфрамата при рН 2 (депротеинизирующий агент), нагревание до температуры 40-50 °С, центрифугирование

Процент извлечения азалептина из мочи жидкость-жидкостной экстракцией хлороформом при рН 9 на модельных смесях составил 83%, из крови - 60% (таблица 3)

В ходе изучения влияния «фона» биологических объектов на «холостых опытах», установлено, что эндогенные вещества существенно не мешают определению азалептина, выделенного из биоматериала, по разработанным методикам

Общие выводы

1 Азалептин (производное дибензодиазепина) - нейролептик атипичного действия, характеризуется сильным антипсихотическим в сочетании с седативным и мышечно-расслабляющим действием Выявлено несоответствие положения азалептина (клозапина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10), внесено предложение по изменению рубрикации в Национальный НИИ общественного здоровья РАМН

2 Выбраны оптимальные условия обнаружения азалептина, выделенного из биологического материала, методом тонкослойной хроматографии Установлено, что наиболее чувствительными детекторами являются пары йода и йодсодержащие детекторы, чувствительность определения находится в пределах 0,1-2 мкг По результатам проведенных исследований в скрининге психотропных веществ нами рекомендовано использование систем I, III Для предварительной очистки извлечений из биологического материала с последующим проведением направленного исследования на

азалептин, включая количественное определение, предлагается использовать системы VIII и IX, а также системы ОФТСХ - XI, XII, XIII Потери при очистке методом тонкослойной хроматографии на модельных смесях составили 9-13%

3 Впервые разработан комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии Оптимальные условия определения азалептина методом ВЭЖХ выбраны при изократическом хроматографировании стандарта и исследуемых извлечений в следующих условиях элюент - метанол фосфатный буфер с рН 3 (80 20), температура колонки 35 °С, элюирование со скоростью 100 мкл/мин

4 Изучено влияние температурных параметров на разделение ряда психотропных лекарственных средств, наиболее часто встречающихся при комбинированных отравлениях, при исследовании методом капиллярной высокоэффективной газожидкостной хроматографии на хроматографах «Кристалл 2000М» с детекторами ПИД и ТИД, фирмы «Hewlett-Packard» с масс-селективным детектором При использовании в анализе трех видов детекторов (ПИД, ТИД, МС) можно достоверно идентифицировать азалептин и проводить его количественное определение Это подтверждено экспертными исследованиями после изолирования азалептина из биологических объектов (кровь, моча) с определением в них вещества в концентрациях от 0,01 мг% (0,1 мкг/мл) до 0,03 мг% (0,3 мкг/мл)

5 Установлена возможность использования газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором для определения метаболита азалептина N-дезметилклозапина (норклозапина) в

биологических объектах (печень, желчь) Для обеспечения высокой чувствительности и селективности метода, позволяющего идентифицировать следовые количества вещества, присутствующего в биологическом объекте, рекомендован режим селективного ионного мониторинга (SIM)

6 Показана возможность практического использования методов УФ- и ИК-спектрофотомегрии при судебно-химическом исследовании азалептина Выбраны оптимальные условия, предложены методики идентификации Экспериментально установлено значение удельного показателя поглощения E'°/oiCM=798 в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты при длине волны максимума абсорбции 240+2 нм Изменение абсорбции в зависимости от рН позволило получить дифференциальные спектры в этаноле для дополнительной идентификации азалептина в исследуемых извлечениях Выявлено, что для анализа азалептина возможно использование ИК-спектрофотометрии при наличии двух условий достаточно высокой степени очистки извлечений из биологического материала и содержания азалептина в объекте не менее 50 мг%

7 В методиках по изолированию азалептина из биологического материала (ткани и органы, биологические жидкости) нами рекомендовано использовать по 25 г (мл) объекта Усовершенствование отдельных этапов изолирования с использованием современного лабораторного оборудования позволяет обеспечить полноту изолирования и получить достаточный объем органической фракции из щелочной среды для проведения качественного обнаружения и последующего количественного определения Выход азалептина при изолировании из печени общими методами находится в пределах 70%, при изолировании из мочи жидкость-жидкостной экстракцией составил

83%, из крови - 60%, после использования методики солянокислого гидролиза биоматериала - от 65 до 80% от введенного в пробу в зависимости от вида объекта

8 Разработаны схемы судебно-химического исследования биологических объектов (кровь, моча, желчь, внутренние органы) на наличие азалептина, включающие использование современных физико-химических методов на предварительном и подтверждающем этапах Определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно в практической экспертной деятельности установить факт отравления при летальном исходе в соответствии с разработанными схемами

9 В связи с отсутствием утвержденных методических рекомендаций по изолированию из биологического материала и анализу азалептина при су дебно—химических исследованиях разработан проект Новой медицинской технологии

По теме диссертации опубликованы следующие работы

1 Использование систем лабораторий «TOXI-LAB» в анализе препарата азалептин /ОН Дворская, О И Соколова. Т Л Малкова, А С Бычкова // Всероссийская научно-практ конференция -Новосибирск, 2005 -С 176-178

2 Проблемы химико-токсикологического анализа препарата азалептина в связи с использованием его в немедицинских целях / Т Л Малкова, О Н Дворская, О И Соколова // II Всероссийский съезд фарм работников материалы съезда - Сочи, 2005 - С 101102

3 О судебно-химическом исследовании отравлений азалептином / О И Соколова. ТЛ Малкова, НИ Неволин // Проблемы экспертизы в медицине - Ижевск Экспертиза, 2005 - Т 5 -№3 -С 33-34

4 Возможности газо-хроматографического определения азалептина / Т Л Малкова, О И Соколова // Фармация и здоровье материалы научно-практ конференции - Пермь, 2005 - С 114.

5 Разработка методов изолирования азалептина из биологических объектов / Азир Ламиа, Т Л Малкова, О H Дворская, О И Соколова // Вестник Пермской гос фарм академии научно-практ журнал студен научного общества - Пермь, 2006 - № 1 -С 54-55

6 Немедицинское применение антипсихотических средств на примере препарата азалептина сборник тезисов Ю H Валеева, Т Л Малкова, О H Дворская, О И Соколова // 80-я Всероссийская студ научная конференция - Казань, 2006 - С 211

7 Тонкослойная хроматография при химико-токсикологическом исследовании лекарственного препарата азалептина / О И Соколова. Т Л Малкова, Ю H Валеева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сборник научных трудов Пятигорская гос фармац акад - Пятигорск, 2006 - Вып 61 -С 294-295

8 Обнаружение азалептина методом тонкослойной хроматографии / О И Соколова, Т Л Малкова // 2-я Российско-китайская научная конференция «Фундаментальная фармакология и фармация - клинической практике» материалы конференции — Пермь, 2006 -С 148-149

9 Обнаружение азалептина при судебно-химическом исследовании трупного материала / Соколова О И. ТЛ Малкова, НИ Неволин //Суд-мед экспертиза -2007 -№2 -С 35-38

10 Использование спектрометрии при анализе азалептина из биологических объектах / О И Соколова. Т Л Малкова // XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» -Москва, 2007 - С 878

Подписано в печать 11 10 2007 Формат 60*90/16 Набор компьютерный Бумага ВХИ Тираж 100 экз Уел печ л 1,75 Заказ № 186/2007

Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ПГФА 614070, г Пермь, ул Крупской, 46, тел /факс 8-901 -266-59-37

Современный этап развития судебно-медицинской экспертизы, в частности судебно-химических методов исследования, включает в себя практическую работу врача судебно-медицинского эксперта, научно-исследовательскую деятельность и выпуск нормативно-методических материалов, регламентирующих экспертную деятельность.

Отравления психотропными препаратами занимают 3-4 место в рейтинге отравлений лекарственными средствами. В последние годы, в связи со значительным ростом применения психотропных препаратов в медицинской практике для лечения психических заболеваний, участились случаи отравления азалептином.

Клозапин (азалептин) является производным пиперазино-дибензодиазепина, обладает сильной нейролептической активностью и оказывает быстро наступающее седативное действие.

Препарат показан при острых и хронических формах шизофрении, психозах и других пограничных состояниях сознания. В качестве основных побочных эффектов азалептина можно выделить сонливость, спутанность сознания, миорелаксирующее действие, обморочные состояния.

В последнее время наблюдается увеличение случаев использования азалептина с целью преднамеренного опьянения граждан для осуществления криминальных действий по отношению к ним, поэтому все чаще в заключениях экспертов и врачей-токсикологов в качестве причины отравления выступает азалептин. Клофелин, длительное время использовавшийся преступниками для «отключения» человека, теперь заменен азалептином. При одновременном приёме азалептина с этиловым спиртом наблюдается возрастание тяжести его депрессивного действия на организм человека, что используется злоумышленниками в преступных целях.

Судебно-химическое исследование азалептина представляет собой сложную аналитическую задачу в связи с тем, что необходимо изолирование небольшого количества вещества, введенного в организм, из достаточно большого объема биологического материала. Для азалептина характерна близость терапевтических и токсических концентраций, что может послужить причиной, в том числе, смертельных интоксикаций, поэтому важно исследование биожидкостей (крови, мочи) для оценки степени острого отравления азалептином, динамики заболевания и эффективности проводимых дезинтоксикационных мероприятий в клинике.

Требования, предъявляемые на современном этапе к судебно-химическому исследованию, предполагают наличие утвержденных методических рекомендаций по методам изолирования и анализа токсикологически важных веществ, в том числе азалептина, в биологическом материале [68]. Однако в судебно-химическом отношении азалептин исследован недостаточно.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что не было проведено систематических исследований по разработке методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина в биологических объектах. Опубликованные данные носят разноречивый характер, поэтому актуальным является комплексное исследование по разработке и оптимизации методик судебно-химического анализа азалептина (клозапина).

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы является разработка и совершенствование методик изолирования, обнаружения и количественного определения азалептина в биологических объектах при судебно-химическом исследовании с использованием современных физико-химических методов.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить условия изолирования азалептина из биологических объектов, определить оптимальные условия изолирования и очистки;

• разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методики обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии;

• определить возможность использования спектральных методов при судебно-химическом анализе азалептина;

• предложить схемы судебно-химического исследования при отравлении азалептином;

• разработать проект Новой медицинской технологии определения азалептина при судебно-химическом исследовании.

Научная новизна работы. Оптимизированы методики изолирования азалептина из биологических тканей и жидкостей на основе общих и частных методов.

Показана возможность использования спектральных методов (УФ- и ИК-спектрофотометрии) для целей идентификации и количественного определения азалептина при судебно-химическом исследовании.

Впервые предложен комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предложены схемы судебно-химического исследования биологических объектов (кровь, моча, желчь, внутренние органы) на наличие азалептина, включающие подготовку проб для анализа, алгоритмы проведения анализа с использованием современных инструментальных методов (спектральных, хроматографических) на предварительном и подтверждающем этапах.

Определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно установить факт отравления при летальном исходе, в соответствии с разработанными схемами для использования в практической экспертной деятельности.

Внесено предложение в Национальный НИИ общественного здоровья РАМН по изменению рубрикации положения клозапина (азалептина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10), с кода «Т42 Отравление противосудорожными, седативными, снотворными и противопаркинсоническими средствами. Т42.4 Бензодиазепинами» на код «Т43 Отравление психотропными средствами . ».

Практическая значимость. Разработанный комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ- и ИК-спектрофотометрии позволяет достоверно установить факт отравления азалептином в практике работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы.

Предлагаемые методики позволяют значительно сократить время анализа по обнаружению азалептина, уменьшить навески биологических объектов (вещественных доказательств) и тем самым повысить эффективность проведения судебно-химического исследования и снизить материальные затраты.

Применение разработанных методик в практике химико-токсикологических лабораторий для диагностирования отравления азалептином позволяет осуществлять оценку степени отравления и оказывать своевременную помощь пострадавшему.

Внедрение. Разработанные методики изолирования азалептина из биологического материала, обнаружения и количественного определения апробированы и внедрены в практику работы судебно-химических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы Свердловской, Самарской, Оренбургской, Кировской, Челябинской, Курганской областей, Удмуртской Республики, химико-токсикологической лаборатории областного центра острых отравлений Свердловской областной клинической психиатрической больницы, в учебный процесс кафедры токсикологической химии и Регионального центра аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии, имеются акты внедрения (приложение 1).

Подготовлен, направлен и принят к рассмотрению Российским центром судебно-медицинской экспертизы проект Новой медицинской технологии «Определение азалептина при судебно-химическом исследовании», вход. № 1835 от 15. 10. 2007 г. (приложение 7).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (г. Новосибирск, 2005), II Всероссийском съезде фармацевтических работников (г. Сочи, 2005), Международной научно-практической конференции «Фармация и здоровье» (г. Пермь, 2005), 80-й Всероссийской студенческой научной конференции (г. Казань, 2006), 2-й Российско-Китайской научной конференции «Фундаментальная фармакология и фармация - клинической практике» (г. Пермь, 2006), 61-й региональной конференции по фармации и фармакологии (г. Пятигорск, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе четыре статьи, из них две в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией: «Проблемы экспертизы в медицине», «Судебно-медицинская экспертиза». Основные положения, выносимые на защиту: • Результаты теоретического обоснования и экспериментальных исследований по определению азалептина на предварительном* и подтверждающем этапах судебно-химического исследования биологического материала с использованием современных физикохимических методов.

• Оптимизация условий изолирования из биологических объектов (кровь, моча, желчь, печень и другие внутренние органы и ткани) и очистки азалептина.

• Результаты разработки методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ - и ИК - спектрофотометрии.

• Схемы судебно-химического исследования биологического материала при отравлении азалептином.

• Изменение рубрикации положения азалептина (клозапина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4-х глав), общих выводов, содержит 17 рисунков и 31 таблицу, список литературы, включающий 125 источников, из которых 27 -иностранных, приложения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Азалептин (производное дибензодиазепина) - нейролептик атипичного действия, характеризуется сильным антипсихотическим в сочетании с седативным и мышечно-расслабляющим действием. Выявлено несоответствие положения азалептина (клозапина) в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем (МКБ-10), внесено предложение по изменению рубрикации в Национальный НИИ общественного здоровья РАМН.

2. Выбраны оптимальные условия обнаружения азалептина, выделенного из биологического материала, методом тонкослойной хроматографии. Установлено, что наиболее чувствительными детекторами являются пары йода и йодсодержащие детекторы, чувствительность определения находится в пределах 0,1-2 мкг. По результатам проведенных исследований в скрининге психотропных веществ нами рекомендовано использование систем I, III. Для предварительной очистки извлечений из биологического материала с последующим проведением направленного исследования на азалептин, включая количественное определение, предлагается использовать системы VIII и IX, а также системы ОФТСХ - XI, XII, XIII. Потери при очистке методом тонкослойной хроматографии на модельных смесях составили 9-13%.

3. Впервые разработан комплекс методик обнаружения и количественного определения азалептина, выделенного из биологических объектов, на основе тонкослойной, газо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Оптимальные условия определения азалептина методом ВЭЖХ выбраны при изократическом хроматографировании стандарта и исследуемых извлечений в следующих условиях: элюент -метанол: фосфатный буфер с рН 3 (80: 20), температура колонки 35 °С, элюирование со скоростью 100 мкл/мин.

4. Изучено влияние температурных параметров на разделение ряда психотропных лекарственных средств, наиболее часто встречающихся при комбинированных отравлениях, при исследовании методом капиллярной высокоэффективной газо-жидкостной хроматографии на хроматографах: «Кристалл 2000М» с детекторами ПИД и ТИД, фирмы «Hewlett-Packard» с масс-селективным детектором. При использовании в анализе трех видов детекторов (ПИД, ТИД, МС) можно достоверно идентифицировать азалептин и проводить его количественное определение. Это подтверждено экспертными исследованиями после изолирования азалептина из биологических объектов (кровь, моча) с определением в них вещества в концентрациях от 0,01 мг% (0,1 мкг/мл) до 0,03 мг% (0,3 мкг/мл).

5. Установлена возможность использования газо-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором для определения метаболита азалептина N-дезметилклозапина (норклозапина) в биологических объектах (печень, желчь). Для обеспечения высокой чувствительности и селективности метода, позволяющего идентифицировать следовые количества вещества, присутствующего в биологическом объекте, рекомендован режим селективного ионного мониторинга (SIM).

6. Показана возможность практического использования методов УФ- и ИК-спектрофотометрии при судебно-химическом исследовании азалептина. Выбраны оптимальные условия, предложены методики идентификации. Экспериментально установлено значение удельного показателя поглощения Е1%1см=798 в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты при длине волны максимума абсорбции 240+2 нм. Изменение абсорбции в зависимости от рН позволило получить дифференциальные спектры в этаноле для дополнительной идентификации азалептина в исследуемых извлечениях. Выявлено, что для анализа азалептина возможно использование ИК-спектрофотометрии при наличии двух условий: достаточно высокой степени очистки извлечений из биологического материала и содержания азалептина в объекте не менее 50 мг%.

7. В методиках по изолированию азалептина из биологического материала (ткани и органы, биологические жидкости) нами рекомендовано использовать по 25 г (мл) объекта. Усовершенствование отдельных этапов изолирования с использованием современного лабораторного оборудования позволяет обеспечить полноту изолирования и получить достаточный объем органической фракции из щелочной среды для проведения качественного обнаружения и последующего количественного определения. Выход азалептина при изолировании из печени общими методами находится в пределах 70%, при изолировании из мочи жидкость-жидкостной экстракцией составил 83%, из крови - 60%, после использования методики солянокислого гидролиза биоматериала - от 65 до 80% от введенного в пробу в зависимости от вида объекта.

8. Разработаны схемы судебно-химического исследования биологических объектов (кровь, моча, желчь, внутренние органы) на наличие азалептина, включающие использование современных физико-химических методов на предварительном и подтверждающем этапах. Определены необходимые объем и полнота судебно-химического исследования, позволяющие достоверно в практической экспертной деятельности установить факт отравления при летальном исходе в соответствии с разработанными схемами.

9. В связи с отсутствием утвержденных методических рекомендаций по изолированию из биологического материала и анализу азалептина при судебно-химических исследованиях разработан проект Новой медицинской технологии.