Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение фармакокинетики новых психотропных соединений

На правах рукописи Для служебного пользования УДК 615.214.3.015

000002 О

ДОРОФЕЕВ ВЛАДИМИР ЛЬВОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ НОВЫХ ПСИХОТРОПНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Московской медицинской академии им И.М.Сеченова и в Центре по химии лекарственных средств - Всероссийс] научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте.

Научные руководители - доктор фармацевтических нау]

член-корр. РАМН, профессор А.П.Арзамасцев; - кандидат химических наук, ст. научн. сотр. ЦХЛС-ВНИХ« В.В.Чистяков

Официальные оппоненты

- доктор фармацевтических нау: профессор А.С.Берлянд;

- кандидат химических наук, доцент В.Л.Белобородов

Ведущая организация - Научно-исследовательский

институт фармакологии РАМ1

Защита состоится " " 199й г. в {3 часов на засе,

нии Диссертационного Совета (Д 074.05.06) при Московской медицине* академии имени И.М.Сеченова (Москва, Никитский бульвар, д. 13).

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиот ММА имени И.М.Сеченова (Москва, Зубовская пл., д. 1). Автореферат разослан ча " 199 ау

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 074.05.06

кандидат фармацевтических наук,

доцент Н.П.Садчикова

Общая характеристика работы

Актуальность темы. На современном этапе проблема психических заболеваний становится все более актуальной. Число людей, страдающих клиническими формами душевных расстройств, продолжает возрастать. На планете более чем у 40 млн. жителей зафиксированы клинические формы заболеваний, более чем у 300 млн. - пограничные состояния. [ВОЗ, 1997]

Учитывая рост числа психически больных людей, трудно переоценить значимость психофармакологии. В настоящее время в Центре по химии лекарственных средств - Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом институте в лаборатории профессора В.Г.Граника синтезированы соединения, проявляющие в экспериментах на животных ноотропную активность, превосходящую активность широко известных ноотропов. Эти соединения: дигам - производное гамма-аминомасляной кислоты - и линоприд, являющийся производным амино-пиридина.

Линоприд предполагается использовать в качестве средства для коррекции основных нарушений, возникающих при болезни Альцгеймера, которая является наиболее тяжелой формой старческого слабоумия. По данным ВОЗ, болезнь Альцгеймера в 1985 году диагностировалась у 1% населения земного шара старше 70 лет. В Японии в 1987 году этой болезнью страдало около 600 тыс., а в США - более 2.5 млн. человек. Отмечено, кроме того, и снижение сроков начала данной патологии, которая все чаще поражает людей трудоспособного возраста (40-50 лет).

В рамках общей проблемы исследование фармакокинетики новых психотропных соединений является необходимой и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение фармакокинетики линоприда и дигама в рамках доклинического исследования.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Разработка методики количественного определения линоприда в сыворотке крови, амниотической жидкости, гомогенизатах органов, моче, фекалиях с использованием метода ВЭЖХ.

2. Исследование фармакокинетики линоприда при внутривенном и пе-роральном введении: исследование сыворотки крови и амниотической жидкости, распределения по органам (печень, почки, головной мозг) и выведения с мочой и фекалиями; предварительное исследование метаболизма; расчет и анализ фармакокинетических параметров.

3. Оценка качества таблеток линоприда по тесту "растворение" и сравнение полученных результатов с данными фармакокинетического исследования.

4. Разработка методики количественного определения дигама в сыворотке крови, гомогенизатах органов, моче, фекалиях с использованием метода ВЭЖХ.

5. Исследование фармакокинетики дигама при пероральном введении: исследование сыворотки крови, распределения по органам (печень, почки, головной мозг) и выведения с мочой и фекалиями; расчет и анализ фармакокинетических параметров.

Научная новизна результатов исследования. Изученные соединения являются оригинальными и обладающими высокой психотропной активностью. Фармакокинетические исследования этих веществ ранее не проводились.

Разработаны оригинальные методики количественного определения данных соединений в биообъектах с использованием метода ВЭЖХ, позволяющие проводить фармакокинетические исследования.

Впервые изучена фармакокинетика на животных с применением субстанций и лекарственных форм. Изучена кинетика препаратов в крови, распределение по органам, элиминация из организма крыс. Предложены формулы основных метаболитов линоприда. Рассчитаны фармакокинетические параметры. Проведен анализ полученных данных.

Практическое значение работы. Исследование фармакокинетики является в настоящее время обязательным этапом при разработке новых лекарственных средств, поскольку все процессы, происходящие с лекарственным веществом в организме - всасывание, распределение по органам и тканям, метаболизм и экскреция - определяют терапевтическую эффективность и безопасность лекарственного препарата. На этом этапе разрабаты-

ваются методики количественного определения препарата в биообъектах, что в дальнейшем может использоваться в клиническом анализе. Результаты, полученные в данной работе, являются необходимой основой для проведения дальнейших исследований в клинике, направленных на расширение ассортимента эффективных психотропных средств.

Внедрение в практику. Получено разрешение на проведение клинических испытаний линоприда, и соответствующие материалы по дигаму переданы в Фармакологический комитет.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995 г.), на Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики" (Москва, 1995 г.), на Всероссийском молодежном научном форуме "Интеллектуальный потенциал России - в XXI век" (С.Петербург, 1995 г.), на Всероссийском конкурсе на лучшую студенческую научную работу по естественным, техническим и гуманитарным наукам 1995 года (Москва, 1996 г.).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 7 научных работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ММА им. И.М.Сеченова "Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)", № Госрегистрации 01970007161, а также в рамках Государственной научно-технической программы 06 (ЦХЛС-ВНИХФИ) "Направленный синтез и создание базовых структур для новых лекарственных средств".

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, заключения и списка литературы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 1В рисунками. Библиографический указатель включает 109 источников, из них 24 - иностранные.

Во введении обоснованы актуальность темы диссертации, научная новизна и практическая значимость работы.

В обзоре литературы рассмотрены современные аспекты фармакологии психотропных и, в частности, ноотропных средств. Проанализированы проблемы классификации и практического применения ноотропных препаратов. Рассмотрены базовые понятия фармакокинетики, фармакокине-тические параметры и термины. Освещены основы анализа лекарственных веществ в биообъектах.

В экспериментальной части изложены методики и результаты фарма-кокинетического исследования: разработка методик количественного определения препаратов в биообъектах с использованием метода ВЭЖХ, изучение кинетики в сыворотке крови крыс, распределения по органам, метаболизма и экскреции; проводится анализ полученных данных и их сравнение с результатами фармакологических и токсикологических тестов, а также сравнение полученных результатов с литературными данными по фармакокинетике основных ноотропных средств.

На защиту выносятся: результаты фармакокинетического изучения оригинальных психотропных средств, синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ, проведенного в рамках доклинического исследования.

Проведено изучение фармакокинетики оригинальных психотропных средств - линоприда и дигама. Диссертационная работа проводилась в два этапа. На первом этапе исследований были разработаны методики количественного определения линоприда и дигама в биообъектах с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Затем было проведено фармакокинетическое исследование препаратов на крысах.

Содержание работы

* Н3РО,

Линоприд,

2-Амино-4-анилинопиридина фосфат. СпНи^С^Р Мг = 283.22

НС—NH—сн9—сн,—сн,— соон

Дигам,

5-(3-карбоксипропиламино-метилен)-2,2-диметил-4,6-диоксо-1,3-Диоксан. C„H15N06 Mr = 257.24

Субстанция линоприла: белый с кремовым оттенком кристаллический порошок, мало растворяется в воде (концентрация насыщенного раствора при 37°С - 0.0075 г/мл или 1:133), практически не растворяется в хлороформе и эфире (линоприд-основание растворяется в хлороформе, метаноле, этаноле и практически не растворяется в воде); Тпл = 187 - 192°С, имеет максимумы поглощения в ультрафиолетовом спектре при длинах волн 221 - 225 нм и 285 - 289 нм. Таблетки линоприда белого цвета с кремоватым или кремовым оттенком, содержание лекарственного вещества - 0.01 г.

Субстанция дигама: белый с желтоватым или белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок без запаха, мало и медленно растворяется в воде, мало растворяется в 95% этаноле, мало растворим в хлороформе. Температура плавления 179 - 183°С с разложением. Имеет максимумы поглощения в ультрафиолетовом спектре: в кислой среде при 232 нм и 281 нм, в щелочной - 236 нм и 258 нм. Таблетки дигама белого цвета с кремоватым оттенком, содержание лекарственного вещества - 0.2 г.

Разработка методик количественного определения дигама и линоприда с использованием метода ВЭЖХ 1. ЛИНОПРИД

В работе использовался ВЭЖХ-хроматограф - хроматографическая система Waters-501. Колонка: Силасорб Cg, 4 мкм, 150*4 мм. Элюент: смесь метанол - вода (рН 2.3) = 35:65; воду с рН 2.3 готовили путем добавления в деминерализованную воду (получена на ионообменнике Cole-Parmer Instrument Со.) конц. Н3РО4. Скорость потока 1.2 мл/мин.

Ввод пробы осуществляли с помощью инжектора ЯЬеос1упе-7125. Объем вводимой пробы 20 мкл. Детектирование: УФ-детектор \Vaters-481, длина волны 286 нм. Регистрация времени удерживания и расчет площадей под хроматографическими пиками осуществлялись с помощью интегратора ЗЫтаски С-ЯЗА.

Поскольку линоприда фосфат практически нерастворим в неполярных экстрагентах, извлечение проводили при подщелачивании биопроб раствором аммиака для перевода линоприда в форму основания. Было определено, что степень извлечения линоприда хлороформом из сыворотки крови при подщелачивании составляет около 95%, тогда как экстракция без подщелачивания не дала положительного результата - пик линоприда на хроматограмме отсутствовал.

На рисунке 1 представлены хроматограммы контрольной сыворотки и сыворотки, содержащей 80 нг линоприда, после соответствующей обработки.

5 625

а 6

Рисунок 1. Хроматограммы контрольной сыворотки (а) и сыворотки, содержащей 80 нг линоприда (б), после соответствующей обработки.

Видно, что в подобранных хроматографических условиях линоприд хорошо отделяется от эндогенных соединений, экстрагируемых хлороформом и поглощающих при длине волны 286 нм. Время удерживания линоприда около 5.6 мин.

Использование другого максимума поглощения - около 223 нм - оказалось в данных хроматографических условиях неприемлемым в силу появления большего количества посторонних пиков.

Предел детектирования линоприда-основания составил: в сыворотке крови и амниотической жидкости - 10 нг/мл, в органах - 100 нг/г, в моче -50 нг/мл, в фекалиях - 400 нг/г.

2. ДИГАМ

Для определения дигама использовался ВЭЖХ-хроматограф - хрома-тографическая система Gilson-ЗОЗ. Колонка: LiChrosorb Ci8, 10 мкм, 250*4.6 мм. Элюент: смесь метанол - вода (рН 2.3) = 30:70; воду с рН 2.3 готовили путем добавления в деминерализованную воду (получена на ионо-обменнике Cole-Parmer Instrument Со.) конц. Н3РО4. Скорость потока 1.4 мл/мин. Ввод пробы осуществляли с помощью инжектора Rheodyne-7125, объем вводимой пробы 20 мкл. Детектирование: УФ-детектор Spectroflow-773, длина волны 281 нм. Регистрация времени удерживания и расчет площадей под хроматографическими пиками осуществлялись с помощью интегратора Waters-740.

Дигам представляет собой слабую органическую кислоту, следовательно, для максимального извлечения его из биообъектов в неполярные растворители необходимо использовать подкисление для перевода дигама в кислотную форму. Действительно, было установлено, что степень извлечения препарата из биообъектов зависит от рН среды. Так, при подщела-чивании дигам не переходит в хлороформ; в нейтральной среде в хлороформ экстрагируется 60-70% соединения; при подкислении биопроб раствором НС1 степень экстракции составила 70-80% (данные для сыворотки крови).

Наиболее стабильные и "чистые" хроматограммы были получены в условиях детектирования дигама при длине волны 281 нм. На рисунке 2 представлены хроматограммы контрольной сыворотки и сыворотки, содержащей 100 нг препарата, после соответствующей обработки.

6.156

Ь 1

а

Ь

Рисунок 2. Хроматограммы контрольной сыворотки (а) и сыворотки, содержащей 100 нг дигама (б), после соответствующей обработки.

Время удерживания дигама около 6.2 мин. Предел детектирования дигама составил: в сыворотке крови 50 нг/мл, в органах - 100 нг/г, в фекалиях - 500 нг/г, в моче - 100 нг/мл.

Для количественного определения линоприда в сыворотке крови использовали вышеописанную методику.

На рисунке 3 представлены кинетические профили содержания линоприда в сыворотке крови крыс при внутривенном введении дозы 5 мг/кг и пероральном применении субстанции и таблеточной массы в дозе 10 мг/кг. В таблице 1 приведены фармакокинетические параметры.

Изучение фармакокинетики линоприда и дигама 1. Исследование сыворотки крови 1.1. ЛИНОПРИД

Рисунок 3. Содержание линоприда в сыворотке крови крыс после однократного внутривенного введения в дозе 5 мг/кг (А) и перорального применения субстанции (В) и таблеточной массы (С) в дозе 10 мг/кг (приведены усредненные концентрации с доверительными интервалами при а=0.95, п=5). Ось X - время, ч; ось У - концентрация, нг/мл.

Таблица 1. Фармакокинетические параметры, полученные при внутривенном введении линоприда в дозе 5 мг/кг и пероральном введении в дозе 10 мг/кг однократно.

Параметр Внутривен. Пероральное

введение введение

Объем распределения, л 8.06 8.22

Общий клиренс, л/ч 3.01 3.01

Период полуэлиминации, ч 1.86 1.89

Константа скорости элиминации, 1/ч 0.373 0.366

Среднее время удержания, ч 2.1 2.6

Площадь под кривой (АиСо-оо), нг*ч/мл 274.3 525.1

Кажущаяся начальная концентрация, нг/мл 159.2 -

Сшах. нг/мл - 157.3

Тщах, Ч - 1

Абс. биодоступность, % 100 95.7

Как видно, линоприд при пероральном введении субстанции достаточно быстро всасывается в системный кровоток, его концентрация достигает максимального значения через 1 час. Период полуэлиминации составил 1.9 ч, а среднее время удержания линоприда в организме крыс (MRT) составило 2.6 ч при введении субстанции per os и 2.1 ч при внутривенном введении. Элиминационные показатели при внутривенном введении практически совпадают с таковыми при пероральном применении. Значительная величина объема распределения (около 8 л) свидетельствует о быстром проникновении препарата в органы и ткани, а также о метаболизме.

Абсолютная биодоступность субстанции составила около 96%, таблеточной массы - около 67%. Данные по биодоступности коррелируют с результатами токсикологических тестов, согласно которым токсичность таблеточной массы примерно в 1.5 раза ниже токсичности субстанции.

1.2. ДИГАМ

Количественное определение дигама в сыворотке крови проводили с использованием вышеописанной методики.

На рисунке 4 приведены графики изменения концентрации дигама в крови крыс при применении субстанции препарата и таблеточной массы в эквивалентных дозах по действующему веществу (50 мг/кг). Фармакокине-тический профиль дигама при использовании субстанции практически повторяет профиль препарата при применении таблеточной массы. Таким образом, ингредиенты, использованные при изготовлении таблеток, не влияют на степень и скорость всасывания дигама. В таблице 2 приведены фармакокинетические параметры. Как видно, дигам достаточно быстро всасывается в системный кровоток, его концентрация достигает максимального значения через 1 час. Период полуэлиминации составил около 1.2 ч, среднее время удержания около 2.1 часа.

Таблица 2. Фармакокинетические параметры, полученные при перо-ральном введении субстанции дигама в дозе 50 мг/кг однократно.

Параметр Значение

Объем распределения, л 0.84

Общий клиренс, л/ч 0.48

Период полуэлиминации, ч 1.21

Константа скорости элиминации, 1/ч 0.574

Среднее время удержания, ч 2.13

Площадь под кривой (АиСо-со), мкг*ч/мл 20.85

Сшах, мкг/мл 7.5

Тщах, ч 1

Рисунок 4. Содержание дигама в сыворотке крови крыс после однократного перорального введения субстанции (А) и таблеточной массы (В) в дозе 50 мг/кг (приведены усредненные концентрации с доверительными интервалами при а=0.95, п=5). Ось X - время, ч; ось У - концентрация, мкг/мл.

По приведенным результатам изучения сыворотки крови можно сделать следующие выводы. Дигам отличается значительно меньшим объемом распределения по сравнению с линопридом. Это обусловлено как меньшей степенью проникновения дигама в органы, так и менее интенсивным его метаболизмом. Также дигам несколько быстрее выводится из организма крыс.

2. Результаты теста "растворение" для таблеток линоприда

Условия проведения теста - в соответствии с Временной фармакопейной статьей на таблетки линоприда. Высвобождение из таблеток проводили на приборе 01зБо1и1е81 ("лопастная мешалка") фирмы Рго1аЬо (Фармакопея США, XXIII издание). В качестве среды растворения использовали 0.1 н раствор НС1 в объеме 500 мл. Скорость вращения мешалки 75 об/мин. Фильтрование раствора осуществляли под вакуумом через мембранные фильтры МИЛЛРСЖЕ с диаметром пор 0.45 мкм. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-26.

В результате проведения теста обнаружено, что высвобождение составляет 101.7±4.7% (а=0.95, п=5). Это соответствует требованиям ГФ XI, согласно которым за 45 мин должно раствориться не менее 75% лекарственного вещества.

Тем не менее, как показало фармакокинетическое исследование, при пероральном введении крысам субстанции линоприда биодоступность составляет около 96%, при введении же таблеточной массы - около 67%. Это может говорить о том, что, несмотря на практически полное высвобождение линоприда из таблеток, вспомогательные вещества все же снижают степень всасывания линоприда из желудочно-кишечного тракта.

3. Распределение по органам 3.1. ЛИНОПРИД

Количественное определение линоприда в органах проводилось по описанной выше методике. На рисунке 5 и в таблице 3 представлены результаты фармакокинетического исследования распределения линоприда по таким основным органам, как печень, почки и головной мозг.

Рисунок 5. Содержание линоприда в печени (А), почках (В) и мозге (С) после перорального введения субстанции в дозе 10 мг/кг, однократно (приведены средние значения с доверительными интервалами при а=0.95, п=3). Ось X - время, ч; ось У - концентрация, мкг/г.

Как видно из рисунка и таблицы, линоприд обладает высокой троп-ностью к исследованным органам. Максимальное количество неизмененного препарата, рассчитанное на грамм органа, фиксируется уже через 30 мин в почках и мозге, через 1 ч - в печени, причем его содержание в органах существенно превышает таковое в крови.

Существенное количество неизмененного линоприда в мозге говорит о легком проникновении этого соединения через ГЭБ, что важно для средства, действующего на уровне головного мозга. Показано, что эффект препарата (увеличение степени двигательной активности) развивается через 30-40 мин после перорального введения; максимальная концентрация линоприда в головном мозге также регистрируется через 30 мин после введения per os.

Таблица 3. Фармакокинетические параметры, полученные по органам при пероральном введении субстанции линоприда в дозе 10 мг/кг однократно.

Параметр Печень Почки Гол. мозг

Период полуэлиминации, ч 1.08 2.39 1.96

Константа скорости элиминации, 1 /ч 0.641 0.290 0.354

Среднее время удержания, ч 1.8 3.2 3.1

Площадь под кривой (АиСо-со), мкг*ч/г 9.09 10.09 2.98

Сшах, мкг/г 3.4 3.9 0.8

Тщах, Ч 1 0.5 0.5

3.2. ДИГАМ

Для количественного определения дигама в органах использовалась вышеописанная методика. На рисунке бив таблице 4 представлены результаты фармакокинетического исследования распределения дигама по таким основным органам, как печень, почки и головной мозг.

0 1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 6. Содержание дигама в печени (А), почках (В) и гол. мозге (С) после однократного перорального введения субстанции в дозе 50 мг/кг (приведены средние значения с доверительными интервалами при а=0.95, п=5). Ось X - время, ч; ось У - концентрация, мкг/г.

Как видно дигам обладает определенной тропностью к исследованным органам (особенно к почкам и печени). Наличие дигама в тканях мозга свидетельствует о его проникновении через гематоэнцефалический барьер, что наиболее важно для такого класса препаратов.

Максимальное количество неизмененного препарата, рассчитанное на грамм органа, фиксируется для печени, почек и мозга через 1 час.

Содержание дигама в почках и печени существенно превышает таковое в сыворотке крови, в то же время содержание дигама в мозге ниже, чем в сыворотке крови.

Таблица 4. Фармакокинетические параметры, полученные по органам при пероральном введении субстанции дигама в дозе 50 мг/кг однократно.

Параметр Печень Почки Гол. мозг

Период полуэлиминации, ч 1.5 1.1 0.7

Константа скорости элиминации, 1/ч 0.47 0.63 0.98

Среднее время удержания, ч 1.8 1.7 1.6

Площадь под кривой (АИСо-оо), мкг+ч/г 41.8 150.6 1.6

Сшах, мкг/г 19.5 73.3 0.8

Тщах, Ч 1 1 1

Таким образом, линоприд отличается большей степенью проникновения в печень, почки и головной мозг из сыворотки крови, чем дигам. Элиминируется дигам из головного мозга значительно быстрее линоприда. Через 6 часов после введения дигам в мозге обнаружить не удается.

4. Исследование кинетики линоприда в амниотической жидкости Данное исследование может представлять собой определенный интерес, поскольку не исключено применение линоприда у беременных женщин. Для количественного определения использовалась вышеописанная методика. На рисунке 7 представлены фармакокинетические кривые содержания неизмененного линоприда в крови и амниотической жидкости после перорального введения субстанции препарата в дозе 10 мг/кг.

Рисунок 7. Содержание линоприда в сыворотке крови (А) и амниоти-ческой жидкости (В) после перорального введения субстанции препарата в дозе 10 мг/кг (приведены средние значения с доверительными интервалами при а=0.95, п=5 для сыворотки крови и п-4 для амниотической жидкости). Ось X - время, ч; ось У - концентрация, нг/мл.

Как видно из рисунка, линоприд хорошо распределяется в амниоти-ческую жидкость. Максимальные значения концентрации (около 84 нг/мл) фиксируются спустя 2-3 часа. Обращает на себя внимание тот факт, что если в первые часы после перорального введения концентрация препарата в крови существенно превосходит таковую в амниотической жидкости, то после 3 часов уровни препарата в амниотической жидкости (в расчете на мл) выше, чем в крови. Таким образом, элиминация линоприда из амниотической жидкости происходит медленнее, чем из сыворотки крови.

Следовательно, если при однократном введении линоприда кумуляции в амниотической жидкости не наблюдается, то при многократном введении может происходить накопление препарата в этой среде.

5. Выведение с мочой и фекалиями 5.1. ЛИНОПРИД

Было проведено исследование выведения неизмененного линоприда с мочой и фекалиями. Для количественного определения использовалась описанная выше методика. Показано, что за 24 ч с момента введения экс-кретируется около 0.2% вещества от введенной дозы с фекалиями, что подтверждает высокую степень всасывания из желудочно-кишечного тракта, и около 1% неизмененного соединения с мочой, что свидетельствует о его интенсивном метаболизме.

5.2. ДИГАМ

Количественное определение дигама в моче и фекалиях проводилось по описанной выше методике.

После изучения выведения дигама из организма крыс были получены следующие результаты. За 48 часов с момента введения экскретируется около 22% дозы введенного препарата в неизмененном виде. При этом с фекалиями выделяется 2%, что говорит о высокой степени всасывания из желудочно-кишечного тракта, с мочой, соответственно, 20%, что указывает на протекающие в организме крыс метаболические превращения дигама. Несмотря на то, что на хроматограммах отсутствовали значимые пики, в процессе метаболических превращений образуются метаболиты, не детек-

тируемые в подобранных условиях. По данным, полученным в Институте фармакологии при изучении фармакокинетики радиактивно-меченного дигама, в результате его метаболизма образуется ГАМК.

6. Предварительное исследование метаболизма линоприда

Поскольку результаты фармакокинетического исследования линоприда указывают на интенсивный метаболизм этого соединения, были проведены опыты, направленные на выявление и идентификацию соответствующих метаболитов. Данная часть эксперимента осуществлена совместно с аналитическим отделом ВНИХФИ (сотр. Анисимова О.С., Соловьева Н.П.).

Было проведено масс-спектрометрическое и ЯМР-исследование метаболитов линоприда, выделенных из мочи крыс после перорального введения субстанции препарата в дозе 10 мг/кг. Масс-спектрометр SSQ-710 (Finnigan MAT, USA); энергия ионизирующих электронов 70 эВ; использовался прямой ввод образца в источник; температура ионизирующей камеры 150 °С. ЯМР-спектрометр: Unity+ 400 MHz (Varian, USA); снимались ПМР-спектры.

В результате был предложен ряд химических структур, из которых наиболее вероятными являются две: пара-гидроксилиноприд и N-гидроксилиноприд. То есть линоприд подвергается окислению в организме крыс. Масс- и ЯМР-спектры указывают на то, что происходит окисление фенильного кольца в пара-положении и аминогруппы анилинового фрагмента.

ОН

Пара-гидроксилиноприд

Также в гидролизате метанольного экстракта очищенной от лино-прида мочи вновь появляется линоприд. Это говорит о том, что в процессе очистки мочи от линоприда в ней, тем не менее, остается некоторое производное линоприда, например какой-либо его конъюгат. Это конъюгиро-ванное производное экстрагируется в метанол и впоследствии, подвергаясь гидролизу в 6 н HCl, дает исходное соединение - линоприд.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики количественного определения линоприда и ди-гама в биообъектах с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ, позволяющие проводить фармакокинетические исследования.

2. Изучена кинетика изменения концентрации линоприда в сыворотке крови крыс при внутривенном и пероральном введении в дозах, соответственно, 5 и 10 мг/кг с использованием субстанции и таблеточной массы. Рассчитаны основные фармакокинетические параметры. Показано, что линоприд при пероральном введении субстанции достаточно быстро всасывается в системный кровоток и достигает максимального концентрационного значения в сыворотке крови через 1 ч. Период полуэлиминации составил около 1.9 ч. Элиминационные показатели при внутривенном введении практически совпадают с таковыми при пероральном применении. Абсолютная биодоступность субстанции линоприда - около 96%. При пероральном введении крысам таблеточной массы в дозе 10 мг/кг (в пересчете на субстанцию) биодоступность снижается до 67%.

3. В результате проведения теста "растворение" показано, что высвобождение линоприда из таблеток составляет 101.7±4.7% (а=0.95, п=5). Это

21

соответствует требованиям ГФ XI, согласно которым за 45 мин должно раствориться не менее 75% лекарственного вещества.

4. Линоприд после перорального введения быстро распределяется по органам и тканям. Максимальная концентрация неизмененного препарата фиксируется уже через 30 мин в почках и мозге, через 1 ч - в печени, причем его содержание в органах существенно превышает таковое в крови. Существенная концентрация неизмененного препарата в головном мозге свидетельствует о легком его проникновении через ГЭБ, что важно для средства, действующего на уровне головного мозга. Кумуляции препарата в исследованных органах не наблюдалось: период полуэлиминации составил, в среднем, около 2 ч из почек и мозга и около 1 ч из печени.

5. Линоприд хорошо распределяется в амниотическую жидкость. Максимальное значение концентрации после перорального введения беременным крысам дозы 10 мг/кг фиксируется спустя 2-3 ч. После 3-4 ч уровни препарата в амниотической жидкости (в расчете на мл) выше, чем в крови.

6. Линоприд в неизмененном виде с мочой и фекалиями крыс экскретиру-ется в незначительных количествах (за 24 ч около 1% введенной дозы с мочой и 0.2% с фекалиями).

7. Линоприд в организме крыс подвергается активному метаболизму, с образованием продуктов окисления, из которых наиболее вероятными являются пара-гидроксилиноприд и Х-гидроксилиноприд. Также в результате биотрансформации линоприда образуются коныогированные производные.

8. Изучена кинетика изменения концентрации дигама в сыворотке крови крыс при пероральном введении субстанции и таблеточной массы в дозе 50 мг/кг. Рассчитаны основные фармакокинетические параметры. Показано, что дигам при пероральном введении субстанции достаточно быстро всасывается в системный кровоток и достигает максимального концентрационного значения через 1 час. Период полуэлиминации составил 1.2 часа. При пероральном введении крысам таблеточной мас-

сы в дозе 50 мг/кг фармакокинетика дигама не изменяется по сравнению с применением субстанции.

9. Дигам после перорального введения быстро распределяется по органам и тканям. Максимальное количество неизмененного препарата фиксируется через 1 час в почках, печени и мозге, причем его содержание максимально в почках. Дигам проникает через ГЭБ. Кумуляцию в исследуемых органах не наблюдали. Период полуэлиминации из органов составил: 1.5 ч (печень), 1.1ч (почки), 0.7 ч (мозг).

10. Дигам в неизмененном виде с мочой и фекалиями крыс экскретируется за 48 ч в количестве 22% (20% с мочой, 2% с фекалиями).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Дорофеев В.Л. Экспериментальная фармакокинетика ОФ-6145 - оригинального отечественного потенциального препарата-активатора когнитивных функций // Интеллектуальный потенциал России - в XXI век: Тез. докл. Всероссийского молодежного научного форума. - С.-Петербург, 1995.-С. 11-12.

2. Дорофеев В.Л., Чистяков В.В. Экспериментальная фармакокинетика ВГ-94 - оригинального отечественного потенциального препарата-активатора когнитивных функций // Человек и лекарство: Тез. докл. II Российского национального конгресса. - Москва, 1995. - С. 38.

3. Дорофеев В.Л., Чистяков В.В. Экспериментальная фармакокинетика ОФ-6145 - оригинального отечественного потенциального препарата-активатора когнитивных функций II Тез. докл. Всероссийского конкурса на лучшую студенческую научную работу по естественным, техническим и гуманитарным наукам 1995 года. - Москва, 1996. - С. 26.

4. Дорофеев В.Л., Чистяков В.В., Арзамасцев А.П. Использование метода ВЭЖХ для количественного определения соединения ОФ-5858 в биообъектах // Хим.-фарм. журн. - 1997. - № 10. - С. 48 - 49.

5. Дорофеев В.Л., Чистяков В.В., Арзамасцев А.П. Количественное определение ОФ-6145 в биообъектах методом ВЭЖХ // Хим.-фарм. журн. -1997.-№5.- С. 53 - 54.

6. Дорофеев В.Л., Чистяков В.В., Арзамасцев А.П. Фармакокинетика потенциального ноотропного препарата ОФ-5858 // Хим.-фарм. журн. -1997. -№ 10. - С. 12-14.

7. Дорофеев В.Л., Чистяков В.В., Арзамасцев А.П. Фармакокинетика потенциального ноотропного препарата ОФ-6145 // Хим.-фарм. журн. -1997.-№11.-С. 3-4.