Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Контроль качества, стандартизация и химико-токсикологическое исследование фуросемида

ЭД Од ö Í

московская еддодоия АКАДЕМИЯ им. я.«и.сягчсисаа

Нэ правах рукописи

Ачиходаш

Мадина Ильясоечй

контроль кшша, с'гандартюадад и хкмико-

зшжсадкчвсш исолвдсмше ¿уросемцца

I5.C0.02 - (¿ярмэцевтическяя химия и 4'aP¡¿a агнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтичезких наук

Москва 19Э1

( , у ' /

/

Работа БЫиомнг^и а Ташкентском фармацевтическом институте

НАУЧНИЕ РУКОВОДИМЫ

кандидат (Тармецовтичесукс наук, профессор ЛД'.Ккрзмов

ОИЩИАЯЬНаС ОПИОЧЙ-ПН;

квндидгл* фармацевтических наук, грофесс.ор Б.Н.Изотов ■доктор фармацевтических наук, доцонт А.С.Берлянд

Харьковский фармацевтический шатиэтт

Защита состоится " п Х992 года в /5 час. на

заседании Специализированного совета Д-074-С5-С6 при Московской медицинской академии им. К.¡Д.Сеченова по адресу: г. Москва, Суворовский бульвар, д. 33.

С дис-оертацчей можно ознакомиться в библиотеке академии С г. Москва,' Зубовская пл., д. I).

Автореферат разослан " п О-^Ртд9Д^ГОда>

Ученый секретарь

Специализированного совета Д-074-05-06, кандидат фармацевтических наук,

доцент Н. П. Садчикова

ОБЩАЯ ШШШЛОШ РАБОТЫ

Актуальность работы. Актуальной задачей является дальнейшее псвшекге качества дег.аретз. Потребности медицинской промышленное-.ти вызывают': необходимость в разработке надежных, внсокоростных и селективных методик качественного и количественного анализа . лекарственных средств, обладающих внсокой салуретической актив-костью.

Объектов наппх исследований был лекарственный препарат ^урссемид к его лекарственные форма.

Некоторое время потребности отечественной медицины в данном диуретике полностью не удовлетворялись, так гак препарат не производился в напей стране, в существовала необходимость закушен его за границей.

В настоящее вреда выпускается отечественна! йуросеыкд, синтезированный группой химиков в филиале ЗВЖШ ш. С.Орджоникидзе.

Существующие методы оценки качества втого препарата еще •несовершенны. Эффективные методы, позволявшие определить технологические прикесл его, в настоящее время отсутствуют.

Высокая биологическая активность, появление в раде случаев побочных эффектов, сложность, спещтедчнссть и лабильность химической структуры обуславливает необходимость более глубокого изучения свойств фуроеег.гида и яредьявтает особые требования к его стандартизации л оценке качества, а таете показывает, необходимость разработки методов судебно-медицинского анализа связг с широким применением его в медицине и не индесрерентностыэ его по отношению к организму человека.

В связи с зтим, разработка эффективных методик оценки качества фуросещда, а такке разработка методов выделения, обнару-гекия и определения его из биологических объектов является актуальной проблемой.

Цель ж задачи исследования. Целью наших исследований является повышение эффективности стандартизации и методов контроля качества фуросекпда; на основании изучения ®азш:о-хлмическЕЕ и хрскатографкческих свойств препарата разработать'фтзяно-яши-ческие методики анализа Ззросешда в субсгашхпп'и лекарственных формах; разработка методов выделения фурссемида из биологических объектов, методов качественного определения этого препарата.

)рГ.*ЦИН

Цчя достихензк поставленной цели необходимо бкло решать следующие задачи: , .

- разработать унифицированную методику идентификации и одеяг-'я ¡гачеотъ футюс^.тлрд методом хроматографа в тонком слое

сорбента;

- провоста разделение примесей в дурссеглиде с помощью колоночной хрошгограйЕи;

- изучить пугк ёрэгглектзгл! для надежной идентификации лекарственного згекесгва фуросезивда л его примесей;

- изучить хрощтотеакнчезкое поведение и разработать ?летодш:и качественного и количественного анализа методом газо-жлдкоотноё а зидкостаой хроматографии высокого давления;

- провести разделение и количественного определения пршлесе! е леглрстьенних веществах серийного 2.стандартного образцов дурссемзда методам TCI, ГлХ, и КЩ;

- разработать чувствительные ж специфичные методики обнаружения фуросешэда и его метаболлта -4-хлор-5-сульфа;.юилалтрашз-лово£ кислоты в объектах хишко-тексиЕологического анализа;

разработать эффективные методы взделения и предлоаьть чувствительные методы количественного определения ©росзгада в объектах ХЕуико-такспколегичйского анализа;

- изучить у словил экстракции дтуросемида органическими растворителями в зависимости ст природы органического растворителя, рН среда, наличия электролитов;

- изучить.сохраняемость йурсоешдо з процессе гнклостнсго разложения биологического гитериала и влияние на этот цроцесс консерванта; .

- изучить ориентировочные распределение фуросегдща в органа экспериментальных гавотшх к установить пригодность разработанных методов анализа на экспертном .материале и на отравленных гквотннх;

Научная новизна работы. Впервые осуществлено скстематическо исследование, посвяцелное изучению стандартизации, контроля качества и химико-токсикологического анализа отечественного дуросеыида;

- разработана уню^ицирозанная лютодика идентификации и оценки качества фуроседада методом тонкослойной хроматографии;

- разработана ыетодша разделения лртесей в фтросемвде с . помгацкэ колоночной хроматографией;

- современными фтко-хииическши методами установлена

структура примеси Л/урооемида и их содергякие в препарате;

- предложен!! нуга фрэтментычш дуросемгда под действием электронного удара, который позволяет надежно одеЕтийизфо-чагь

. (¡уросешд; '

- изучены и рексмепдовэпн методики оценки качества фуроое-. мида методами газо-етдкостной и високоэ^Тектавной жидкостной хроматограф®;

- для качественного обнаружения фуросемлда и его метабо-. лита - 4-хлср-5-сулы*а!.:оялаяграт1ЛО]зой кяслоты, а такие дрзтпх примесей, выделенных из биологического материала, шпервые предлсяпная комплексная методика доказательства наличия зтих • веществ с помощи щдарокрЕсталлоскоггаческях реакций, методов хроматографии з тонком слое сорбента, спектроскопии в УФ-областЕ спектра, 1Ж-Сиектрофото;летрия я высокоэффективной йидкостноё хроматографии;

- подвергнута сравнительному изученню некоторые методы енализа "фурооешда и предложены для количественного определения фуросемвда при улемко-тексикологичеокдх исследованиях гитоды У^-спектройотометрм и высокоэффективной кидкостной хроматографии;

- изучена условия экстракция фуросег.яда органическими.

растворителЕ,\21 из водных растворов, а такие нянянке'на степень экстракции фуросеадда пз водных растворов электродс^-ов;

- разработана кетодака выделения фуросемвда к его метаболита -4-хлор-5-сульс7амоилат'рашловай кислоты - из объектов хилико-токспкодогического исследования;

- изучена сохраняемость <хуросеглида при гнилостном разложении биологического материала и злняиие на этот процесс кок-серванта; '

- с помощью разработанных методов изучено распределение дуросемвда в органах и биологически: жидкостях кроликов, отравленных этим препаратом. "

Практическое значение работы. Разработанные методики тонкослойной а высокоэффективной жидкостной хроматографии для анализа íypoсекзда апробированы в лаборатории ГосНИИСКДС ИЗ СССР и..получена полоактельная оценка.

Методика идентификации фуросеетда внедрена в учебный процесс

кафедра фармацевтической химии Ташкентского фармацевтического института.

Разработанные методы выделения, качественного обнаружения и количественного определения фуросемида могут быть использованы в судебно-хишческих лабораториях при решении вопросов, связанных с •отравлением этим препаратом.

Апробация работы. Результаты работы обсуждались на семинаре-совеценик судебно-медицинских якспертоь-хкшков бюро судмедэкспер ткзы Узбекистана (Ташкент, 1989), научной конференции, посвяцзнна ЭО-летйа со дня роддеиия профессора А.Ы.Цуртаэаева (Ташкент, 1990 меякафедраяьной конференции в Ташкентском фармацевтическом кнстнт те (Ташкент, 1991), межкафедрзльвой конференции в Московской меди цинской академии им. Л.М.Сеченова (Москва, 1931).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом нау иссяедозгзтсльеких работ Ташкентского фармацевтического института тематикой научных исследований секции "Фармацевтическая химия" -10.06.03 па проблеме "Фармация" Научного совета 10 "Фармакология фармация" ЖН СССР.

Дубллкации по томе. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из 5 г.пав, списка литературы и приложения.

Положения , выдвигаемые на защиту. На зздиту выносятся следующие положения:

- идентификация фуросемида и его примесей катодами: тонкослойной хроматографии, ИК-, -У&-, ДлР-спектроскопии и масс-спэктрометрик;

- количественное определение прккесей в препарате фуросемид методами газо-лздкостной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии;

я- экстракция фуросемида из водных растворов органическими раствор] телями в зависимости от рН среды;

—изолирование фуросемида и его метаболита - 4-хяор-5-сулъфа:доил-антраниловой кислоты из биологических обьекгав;

- качественное обнаружение и количественное определение фуросемцщ к его метаболита, вццеленных: из биологических объектов;

- сохраняемость фуросемида в биологическом материале;

- ориентировочное распределение фуросемида в органах отравленных

животных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность проблемы, сфорялулярованк цель и задачи исследований. 4 .

В первой тлззе приводится обзор литературы, посвященной физико-химическим свойствам фуросемида, его получению и применению в медицине, методам анализа в различные объектах, метабо- • -лизму фуросемида в организме человек и животных и токсичности»'

Вторая глава посвящена идентификации прииесей в фуросемиде методами TCI, У®, ИК-, ЯЛР-, и масс-спектроскопкс.

Б третье главе приводится результаты количественного определения примесей в фуросемиде методами газсядаостной и 'высокоэффективной жидкостной хршагографни.

В четвертой главе приводится методы "обнаружения и определения фуросадада и его метаболита ~4-хлор-5~суль$амо2лантранцловсй кислоты, пригодных для судебно-хишческсго анализа с применением микрокристеллоскспичеоких реакций, УФ- и Ж-спектрофитотлетрпи, масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В пятой главе представлены результаты по разработке оптимальных методов изолирования фуросешда из биологических объектов, счистки его от соэкстрактивянх веществ, сохраняемости его в биологическом материале л ориентировочного распределения его в-организме экспериментальных кивотных.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты и методы исследования. Объектами исследова'ния были серийные образцы фуросегада производства "Акрихин", и его образец йуросевда ВОЗ, лексрственные

форш, содержащие фуросегшд отечественного и иностранного производства /Болгария, Польша, Индия, Эстония/.

Спектры поглащения сншлали на регнстрирутадих спектрофотометрах " Sj>ecorc/ 75"/Tep:.ia ния/

Измерение оптических плотностей проводили на спектрофотометрах СФ-16 и " Secxsnef* 7)с/ - 65" в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

. Масс-спектры снимали на, приборе 1Л. - tjoS Для тонкослойной хромстографии использовали силикагель и готовые пластинки " S'fuf^^ " /ЧССР/ и щирглы "Мегк" /§ЕТ/.

Газохроштографз^еский анализ проводили па хроматографе "Кристалл-2000" с последуксей компьютерной обработкой данных. ' . Анализ исач£дуе;1Ы7. вецеств ¡сетодогл высокоэффективной нидхосл ной хроштографпк проводили па хроматографе §Р-80йСЗп а&»рш /СШ1/ и qrp?2í

/Швеция/.

Идентификация и определение доброкачественного . фуросе.ада.

'Для идентификации и контроля содержания примеси в субстанция к лекарственных форшх фуросемпдэ нами рекомендовал метод тонкослойной хроыатсграфни в сист&чзх растворитедз£:

1) ацетон - гексан - толуол (5:2:3),

2) бензол - ацетон - гексак - уксусная кислота (25:10:4:1) е другие.

В качестве детктиругацего реактива вкбрап пары пода и УФ-свет. Значения Rf фуросегаща а его примеси -4-хлор~5-сулъ-фамоилантраниловой кислоты'в выиеуказакпкх слстега;: растворителей равны С,55 'н 0,45 - для первой, 0,62 и 0,45 - для второй системы растворителей соответственно.

При хрскатографкроваюш препарата в тонком слое сорбента обнаружено пятно невдентифацирсванной примеси прв В 4 ' - 0,7. (бензол - ацетон - гексак - уксусная кислота 25:10:4:1). 'Для установления структуры данной примеси нами использованы колоночная хроматография. Б качестве элюента применена смесь растворители бензол - ацетон - гексан - уксусная кислота (25:10:4:1). Элоат отбирала фракциями по 20 мл. Обнаружение веществ в полученных фракциях проводилось методом TGX. После отгонкой растворгтелеЁ в вакууме (тейп. 50°С) был получены индивидуальные вещества, идентифицированные методами TGK и ПК-спектро сксщг.

В ИК-спектре неидентифицировалного вещества с Rf =0,7

полоса поглощения. карбонильной группы сдвигается в слабополую

область /1745 cm~V- Полоса поглощения h¡ J^ - группы проявляется

широкой полосой в об ласта 3200-3500 см-1 , в то время как - - -i для фуросемида был при' 3350"см. Эти данные, а такгб наличие в

ыаео-спектре иона с //> /z 409 предпологает наличие примеси в

фуросеяще, которое соответствует йур^урмамиду фуросемида. Это

соединение образуется, по видимому, во время синтеза фуросемида

л является результатом взаимодействия фуро сейша с фурфуриламшсь

в условиях реакции.

се.

н2мог$-ЧЛсоом-

/

и^-см^-Д

к I

-О

С целью надежной идентификации и установлэ:гдя структуры примесей представляло интерес получение и систематизация масс-спектров исследуемых веществ /Туросем:ада, 4-хлор-5-сульфамоилантрани-ловой кислоты и неидентифицирова1шых примесей/.

йзультата анализа г.-ясс- спектров фуросемида и 4-хлор-5-суль-йамоилантраниловой кислоты приведены в таблице 1. ,

Таблица 1

Основные характеристические ионы в масс-спектрах фуросемида ■ и 4-хлор-5-сульфамоилан?ранготвой кислоты

М/е, относительная интенсивность ликов ---------г

Фурссзмид

4-хлор- 5- сулыЬамоилантрани-ловая кислота

М* /330,332/ 100£ ^ -18 7312,314/ 9% М+ -28 /302,304/ 5% М* -46 7284,286/ 7% ]£* -79 /251,253/ 70л ■• . М+ -80. /250,252/ 22," М* '-120 7204,206/ 13" ЬГ1" -1В0 /150/ М* -234' /96/ 43^ М+ -249 /81/ 98/о : М+ -/84/ 40^' "

- М* /253,252/ 772 М* -18 7232,234/ 100?: М4" -44 /206,2С8/ 1С£ М+ -64 7185,188/ 17? М+ -82 /168,170/ 17.2 М+ -97 7153,155/ 1В% М+ -108 7142,144/ 15£ 'М+ -124 /126,128/ 10/1 М*'-136 7114,116/ 12а

На рисунке приведена схема основных путей фрагментации ййуросемида под действием элзктронного удара.

Cf.

игно г-п Г-

У ^ын-см.Л,/1

ci

Г

» /

QU

СО

/г 302/304

srDM

-CHD4 tfv/VNH

-снДоЛ

m2kio2s '^cûom

Г»M ъъфж -u2û

•jo

MoD О . . +

h2n 02s

ллс/

ill

/»/г 31?./з14

Основные пути фраплентацш фуроссмида • под действием электронного удара

Спектры ЯМР % регистрировали ча спектрофотометре \vH-00 фирад "Брунер" (Германия) с ребочей частотой 95 :<ц'ц при температуре Зо°С. для 2% раствороз фуросемидэ в дейтеркроэанном диыегилсульфоксиде.

В слабопольной области спектра фурпсекида при ¿Г 8,01 м.д. наблюдается триплет ЫН-группы с константой спин-спинового вэаимодейст-• вия равной 5,У Гц. При подавлении гриилегз N И-груяы :^'льтиплет ме-ткленовой группы при Ь 4,58 м.д. превращается "с ' кглет. Угнали протонов Н-б и Н-2 набжсдаатся в спектре фурэсек-,;-дз при ^ в,4ь) и 7,06 м.д., соответственно. Уширенный сигнал протонов N ¡^-груш и регистрируется при 7,31 м.д.. о спектре модельного соединения -о-еульз'Эмо11Л-4-;слор-°.ктрсн:1лсвои кислоты регистрируется сигналы протонов Н-5, N ¡^-группы и Н-2 при 5 8,22, 7,26 к В,У5 м.д., соответственно, чго тзюке подтверждает отнесение у казак: ж сигналов. ■

Сигналы протонов фурэнового ядра образует слохну.-.. слстецу типа АВХ. Сигнал протона Н-5' яредставля-:т собой Х-часгь этой системы при 5 7,52 м.д. с константой спин-спинового взаимодействия J ,-•,-» равной около I Гц. Мульгиплет протонов п-2 , 4 в области 2> 6,2-0,5 м.д. образует АЗ-часть этой системы. Лри подавлении сигнала протона ■К-51 сложный мультиплет протонов Н-3',41 существенно упрощается. Сигнал протока Н-З' в результате этого наблюдается при £ 6,42 м.д., а протона Н-41 - при ? 6,25 м.д..

йризедешые сигналы спектра фуросемида позволяет надежно идентифицировать данное соединение методом спектроскопии Е.1Р "Я.

Применение метода газо-жидкоетнсй хроматографии для анализа фуросемида

для качественного и количественного анализа фурсоешда нами предложена метод капиллярной газо-жидяостной хроматографии. Разделению подвергались метилькые производные фуросемида (или 4-хлор-5-сульфаыоиланграииловой кислоты) по карбоксильной группе:

ч СР . ММ-СМ.-О 0 «№,с_члз ^ 1 и

Н^О^-Ч^СООЦ

Получение метилового эфира фуросемида подтверждает данные Ш- и масс-спектров вещества.

Результаты исследований показали, чго в серийном образце фуро-:емида содержаться кроме самого действующего вещества примесь 4-хлор.. о-сульфамоилантраниловсй кислоты идентифицированный по времени удерживания стандарта. Суммарное содержание примесей составляет около 15% (по методу внутренней нормализации).

]1рименениё метода для анализа ^уросешада

?летод ПК, применяемый нами для анализа фурос-екида, требует обьдаательной дериватизации фуросэмида. Чтобы избежать процесса дериватизации, для количественной оценки содержания примесей нами использовался метод ЪЗЖ.

В начале нами были подобраны оптккальные условия для разделения компонентов модельной скеси (с[уросемид и 4-хлор-5-суль$йУ0илантра-ниловой кислоты) как в градиентном элюирозаник, так и в кэократи-ческом рехшг. Оптшальншя для разделения примесей в фуросемкде методом 3£лл оказались: система растворителей ацетонктрил - 0,5 н соляная кислота, время градиента 20 мин. Данные количественного определения примесей в субстанции.,, а также лекарственных формах фуроаемида приведены'в 1аблице 2. Остановлено наличие примеси 4--хлор-5-суль$амоилантраниловоБ кислоты в препарате ¿уросемид, идентифицированный по Бремени удерживания стандарта. Нами были исследованы лекарственные форг.щ (таблетки по С,04 г и 1%-нке растворы для инъекции) фуроеемеда. Результаты анализа показали, что таблетки и аыпульные растзоры содержат от 1,5 до 14,5^ примесей, причем характерной постоянной примесью является 4-хлор-5~суль$амоилантр£-ниловая кислота.

Хйетоды анализа £уросемида, выделенного из .биологического материала

Применительно к обнаружению фуроеемвда и его метаболита -4-хлор-5-сульсамоилантранилОЕОЁ кислоты в биологическом материале нами изучалось реакции микрокристаллоскопичэские, условия хрома-тографирования в тонком слое сорбента, а также У2--, ИК- и масс-спекгрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматогра^ирования.

Для обнаружения дуросемида, выделенного из биологического материала, рекомендована микрокризталлоскопические реакции: с реактивом Драгекдор;.а (микрокристаллы в вцце игольчатых кристаллов и их скопление в форме многолучевых розеток, предел обнаружения 1,75 икг, предельная концентрация 1:12500)} с реактивом медно-йодидного комплекса (ыикрокристаляы с формой пучков, состоящих Из отдельных кристаллов, срастающихся в сфероиды, предел обнару-кения-15 мкг, предельная концентрация 1:1570); с реактивом железо-

Гйблкца'2

Результаты колячестнечногч» определения ирлмосей в фуросеюадв методом к«окоэ^ектигаой жидкостной хрэматогрп|ии

Препарат

1ШИЛ.СНО

{ ^-хлор-Ь-сулъфа ; мош'-антраниловая I_кислоте . _

Немдентк^лд. примесь

; амилен лсфиц. 1 примесь

Образец БоЗ

Серия 101087

Серия 16

Табл. (Польша)

Табл.

(Болгария)

Инъекц. р. (Таллин)

Инъекц. р. (Индия)

А

ь =

^ = л

0,26 0,03 0,013

I,2а

0,90 С,05 0,022 А = 5,71

А = 1,07 Ь а 0,057 О ,ио5 б,и!

X - 0,93 0,07 0,031 Б,29

II,76 у.Й7о О«ис.3 0,71

X = 6,Со ь = и,056 л = 0,025 А = и,74

Ь = -

А = А =

Ъ г= ■'л —

А =

X = ь =

А =

1,29 0,048 0,021 4,16

X - 0,0-17

ь = 4,4* 1012

$л = 0,2-10 " А = 1,1с

X - 0,62

= 0,0-37 о>л = 0,025 А = 10,35

X =. 0,ЗО

ь =

и,1/11 А = 0,60

X = 0,40 ь = 0,03

0,013 А = 6,35

X = 2,06 & = 0,и24 Ь/= о, и 10 А = 1,24

л = г,09

Ь> = 0,и26 я\= 0,012 А = 1,07

а == 0,29 г _з ъ = 3,3 'Юг, <>> = 1,5' 10 А = 1,30

X = 0,53 ~ ^ = 1,47 Чу * Я» = 6,6* Ю-" А = 3,24

X = 0,62

= 0,006 V

1,53

Л = 1,43 _2 .<> - Л, 1С ¿О'. = 5,3' 1и "

А

1,7о

л = о,с* ь = 0,и4

А = 1,22

йодидного комплекса ( микрокристэллы с центром кристаллизации;

предел обнаружения 1,75 мкг, предельная концентрация с раствором йодида свинца а йодистом калии длинных игл, предел обнаружения 3,5 мкг, 1:62Э0).

■ 1 ,

:тбллы в виде предельная концентрация

Для обнаружения 4-хлор-Е^сулк0амоидантрзндяо£Ок кислоты рекомендован раствор иодица свища в аодистом качни (i/хкро-1фиотаязш с фор4о2 столок, срастакгдихся в дашпые веточки; предел обнаружения 14 ¡кг, предельная копцентрзцпя 1:1570).

Для обнаружегчя ftypосешда и его метаболита - 4-хлор-5-сулк^амсклаътрашиюБои кислоты в биологическом маверкале мэтсдом хроаагох-раЬик в тонком слое сорбента использозали пластинки " SifulcP uV 2-54" и пластинки, приготовленные из силь-кагеля иаркз .'ГС 5/4С. Хроштогра^ировали в системах растворителей: ацэтон-гексак-толуол /5:2:3/ к хдорсфорй-толуол-зтакол-кощектригюванкый раствор амшзака /15:5:30:2/. При этом величина Rf составляла для ссуросемида и 4-хлор-5-сульс^юялантракило-воё кислоты б ларзои системе - С,65 и 0,55, во второй- 0,55 и С.ЗС, соответственно. Дзтактирование 2ра>5атс>грамм осуществляли под УФ-ламыои гли используя пары иода.

Для идентжпккадни Фуросездка и его метаболита - 1-хлор-5-сульъамоилантранияовои кислоты, выделенных из биологического материала нами использованы методы ГС—, Ж- и масс-спектрометра.

Ьтаколъные растворы А-хлор-б-суль^аыоикантраниловой кислоты в отличие от фуросегмда имеет максимумы светопоглощения в УФ-области при длинах вате 228, 268 и 335 нм, тогда как дня туросе-ызда характерен при 225, 274 л 330 нм.

Результаты исследовании вытянек, наученных из биалогичес-'иого кзтеркаяа, содержащих куросемкц, показали, что отаЕальные растворы их имеют те ке максимумы поглощения в УФ-области, что и исследуемые ьещзства.

В масс-спектре электронного удара Фуросемида иего метаболита Я-хлор-о-сульт^амоилантракиловоц киыоты, выделенных из биологического материала присутствуют все пики ионов, характеризующие исследуемые вещества /фуросемид с л?/г : 330/332 , 312/314, 284/286 , 204/206, Э£, 81 и 4-хл0р-5-сулв;ашклаатранЕД0Б0Й кислоты с trjz : 25С/252, 232/234, 186/188, 153/155, 142/144 и др./

Результаты сравнительного изучения Ж-спектров фуросемида, выделенного из биологического материала и стандартного образна показали, что основные полосы поглощения при 331С, 2890 /2830/, 1680, 15Э5, 15SC сиГ1 и др. совпадаат.

к

Для количественного определения фуросе^ида л 4-хлор-5-суль-фймоилантракиловой укисдоты предложен УФ-шектрофотсметрнческкй метод, основанный на измерении оптической плотности этанолькых растворов при длинах волн 274. нм для фуросемида /Е^'^ 670/ и . 268 нм для 4-хлср-5-сулйг?/;ОЕлантранзглотзой кислоты : 640/.

Подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера наблвдается в пределах . концентрации «Туросемада 1-2С ккг/кд, в случае 4-хлор-5-сульфамо-"ютантраниловой кислоты - 2-16 мкг/мл. Данный метод количествен-' ного определения указанных веществ применим для анализа cieejse.ro биологического материала, после очистки их методой ТСХ от соэкс-трактивкых соединений. Б тех случаях, когда йуросемвд изолирован из загнившего биологического материал", после их очистки от соэкс-трактивннх веществ истодом ТСХ, нами рекомендуется проводить анализ методом ВЗЗЙ.

Исследования проводити на хроматографе LKB /Швеция/ с колонкой Ье^го^огЬ ЯР - 1'8 /250x4,6 мм/. В качестве элюента использовали смесь растворителей: метанол-уксусная кислота-вода •в соотношении 25:0,5:74,5. Детектирование проводили при 274 нм. Линейный диапазон при отом наблюдается от 0,03 до 5 мхг/шг. Чувствительность составила 0,СЗ мкг Ауросемида в 1 мл раствора.

Изучение условий экстракции Яуросешща из водных растворов

В качества эксграгентов бшш испытаны диэтиловый эфир, хлороформ, 1,2-дихлорэтан, бензол, тсмуол. Значение рН растворов, . из которых экстрагировали фуросемид, создавали с помощью универсальной буферной смеси. Количество экстрагированного <?уросемида определяли УФ-спектро^отометрическим методом.

Результаты исследований показали, что наибольшее количество фуросемида экстрагируется при рН 2,С-3,0 диэтиловым эфиром.

На рисунке приведена экстракция фуросемида из водных растворов в зависшонти от рН среда различными органически:.и растворителями. ^

Изучение влияния электролитов показало, что 5д-ныв и насыщенные растворы натрия хлорида и аммония сульфата повылают степень экстракшк фуросешяа из водных растворов при использовании указанных эксграгентов.

' Рис. Экстракция Фуросемида из водных растворов в зависимости от • рН среда различными органическим растворителями: 1-ДИЗТ2Л0ВЫЙ оЪир, 2-1,2-дихлорэтан, З-хяоройсрм, 4-бензсл, 5-толуол.

Выделение фуросемида и его метаболита - 4-хлор-5-сульфа-

моилантраниловой кислоты из биологического материала

Сравнительное изучение методов изолирования фуросемида из -биологического материала: этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой./метод Стаса-Отто/; водой,подкисленной органической кистотой /метод А.Васильевой/; еодой, подкисленной серной кислотой /метод В.Ф.Г.рамарекко/ показало, что с помощью указанных методов фуросемид удается выделить не более 11%. В связи с этим было необходимо разработать более эффективную методику изолирования фуросемида из биологического материала.

Нами показано, что наиболнзее количестве фуросемида удается извлечь методом водного дне тона, основанный на трехкратном настаивает® биологического материала с порциями смеси ацетона с водой /5:3/. Собранные ацетоно-ьодные извлечения высаливают -' кристаллическим натрия хлоредом до насыаения жидкости /для разделения 9аз/. Верхний ацетскоБый слой отделяют и ацетон упариваю1

Полученннй таким образом остаток подвергают очистке с помощью экстракцией оЗиром из щелочного раствора /при рВ 10,0/-. Бодный остаток подкисляют концентрированной соляной кислотой .до гР 2,0 и экстрагируют диэтклоным абиром /3x10 мл/, а$ирнке экстракты ооьедзшяют и упаривают растворитель досуха. Остаток растворяют в небольшом обьемз /С, 5-1 мл/ ацетона и подвергают '"хроматографЁ-"ческой очистке з тошном слое силикагеля марки ЛС 5/40..Для этого на стартовую линии хротатограФкческой пластинки наносят ацетоновый раствор в виде полосы, а рядом - каплю стандартных растворов Зуросещда и 4-хяор-5-сульфа?ю:таанграниловог кистоты /по 50 мкг/.' 1родатогра£пирова;ше проводят в системе растворителей хлорофсш-толуол-этанол-концентркрованкаг раствор аммиака /15:5:30:2/. Посте высушивания пластинок на воздухе метчики проявляют под УФ-лампой и раствором железа Д>/ хлорид. При этом образуются два пятна оранжевого цвета: значение первого пятна С',30 Д-хлор-б-сульФамоиладтраниловая кислота/, второго -'0,55 /фуро-■сетд/.

Элюпрованиэ фуросемида и 4-хлор-о-сулъ5амоилантраншговой кислоты по отдельности проводят этанолом. Полученные элюаты используют для идентификации и количественного определения фуро-семида и 4-хлор-5-суль^амоилантраниловой кислоты.

Результаты этих исследований представлена в табл. 3.

Таблищ 3

Определение #уросемида и 4-хлор-5-сульфамоилантраниловой кислоты, выделенных при совместном присутствии из биологического материала /добавлено но 5 мг каждого вещества/

Определено Фурссешда

мг

! Метроло- !

! гическая !

! харанте- !

! ристика !

! I

Определено 4-хлор- ! Метрооо-

&-сул1Ламоалантра- ' ------" —

лиловой кислоты

мг

аг

! гкческая ! характе-! ристика

'3,41 '3,36 2,98 '3,С5 3,27

68,2 67,2 59,6 60,1 65,4

Х'= 64,1' 5 = '4,16 1 5*= 1,86' ' = 5,17'

а =± е,о%'-

•2,42 -2,48 '2,51 ' 2,69. '2,76

'4В,4 49,б" '50,2 53,8 55,3

Х'= 51,46 '• 2 ='-2,34 • '1,31 • "= 3,65 -А = ± 7,1?:

С X Е Ь5А

ШйЖО-ТОКСИлСШОПЯЕСКОГО ШШЩСНАКИй БИОЛОШЩСлОГО МАТЕйИМ БА ФУТОСВЩЦ К EID МЕТЛБМКТ /4-П0Р-5-

■ от1Ф.:лою;АЬ1трйжоа\й КИСЛОТА/

Биологический ооьект

Изолирование смесью растворителей ацетон-ьода /5:3/

Экстракция водного раствора эфиром /при тН 10/ и выделение препаратов экстракцией эйиром /при'pH 2,0/

Отделение Мирного слоя и его упаривание досуха

I

йзделение ©уросемкда и 4-хлор-5-сулыйамоилачтранилсвой кислоты методом ТС-Х

■Насшение волко-ацетоновых вытяжек 'кристаллическим натрия хлоридом

Отделение в упаривание ацетоьа

элюата

Анализ элюата

Колаче отвеяно определение

УФ-спектроскопия

- У5-спектроскопия БЭЕХ -УФ-спек троек опия

- ИК-спектрсскопия

— Масс-спектрометрия

-Ма с с- спектроме трия

I— Микрокристаллические реакции

L Микрокристалличе ские реакции

Выделение йуросзшда и его метаболита - 4-хлор-5сульфа-моилантранпловой кислоты из биологических жидкостей

Основываясь на результатах экспериментальных данных, полу-^ченшх при экстракции ^гросемида кз водных растворов, мы выбрали диэтиловкй эт5ф з качестве экстрагента д<м выделения искомых 1 веществ из крени и мочи. Экстракция из крови или мочи проводили диэтиловым эфиром при'рЛ 2,5-3,0. Перед проведением анализа на Фгросггоэд и 4-хлор-5-суль^ачо1ыавтраниловой кислоты в полученных экстрактах подвергали их предварительной хроматогрейкческой очистке в тонком слое склккагелл марки'1С 5/40. Количественное определение выделенных из биологических жидкостей фуросемида и 4-жшр-5-су.т1Ламоилаз1ТТГ1Ниловой кислоты проводили методом спек-тро$отометрии.

Результаты этих исследовании представлены в табл. 4.

Таблица 4

Определение Фуросемида и 4-хлор-5-сульфамоилантра-' лиловой кислоты в биологических жидкостях

Исследуемое соединение, ) Найдено

прибавленное к био- ;---

зйдкоста __в КР°ВЕ ! в моче

__I i /+/ ) А /±/ } x /+/ ) а /±7~

«уросемлд 84,5 '1,65 62,3 2,83

4-хлор-5-суль^амоил-

антраниловая кислота 6С,3 4,8 • • 51,76 4,15

Сохраняемость фуросемида в биологическом матерсале

Проведенные нами эксперименты показали, что Фуросемид сохраняется в объектах биологического происхождения, подвергшемся гнилостному разложению, в течение 7 месяцев. Исследования, проведенные е биологическом материале при консервации объекта этанолом, ■ показали пролонгирование сохраняемости фуросемида до 12 месяцев.

Опыты, посвященные распределению фуросемида в органах, тканях и биологических кидкостях кроликов, отравленных этим препаратом, показали, что наибольшее количество Фуросемида можне выделить из желудка, кишечника, мочи и крови /при per os ./, из мышечной ткани в участие введения /внутрзкншечное введение/^

Общие вывода:

1. На основании изучения хроглатографического поведения йуросеыида сработана уьк^яцироваигая ыэтодкка для вденифкацш к оценки качества методом тоы:ос.-о;шой хроматографии, которая рог.омеядуется для установления подлинности к контроля качества йуросомвща.

2. Изучены условия желоночной хроматогрефяк, обеспечивающее разделение примесей в препарате фурссемиц.

3. Изучокк спектральные характеристики Фуросемида к его примеси Д-.етабаткта/- 4-хлор-5-сул1йамоклантраниловой к? слоты /УФ-, КК- и масс-спектрометрия/. Выделены и сиптоштизированы основные характеристические ионы и их относительные интексивносст необходтаые для надежной идентификации изучаемых веществ.

4. Подобраны оптимальные условия анализа сЬуросемида методом газо-яидкостнои хроматографии, базирующееся на переведении препарата в метиловое производное.

5. 1£зработана унифицированная м&тодчка анализа лекарственного. вещества £уросемида методом В32.Х, пригодная для идентификации и оценки качества препарата /в субстанции, в таблетках и ампулышх растворах/.

6. Для обнаружения фуросемида, а также его метаболита -4-хлор-5-сул1ФамоЕлаптраниловой кислоты в биологическом материале рекомендованы мккрокристаллоскопяческие реакции с реактивами: ДрагендорЬа, кедно-Водидного и келэзо-йодидного комплекса, раствором й,одида свинца в йодистом калии - дтя шуросемвда.а для 4-хлор-5-сультамоклантр2Нйлово2 кислоты - среактивом медно-йодидного комплекса и раствором кодида свинца в йодистом калик. Зти вещества могут быть идентирицироЕаны и количественно определены методами: тонкослойной хроматографией, спектроскопией,ВЗЕХ. УФ- 'и ЕК-областях, масс-спектроскопией, ВЗЕХ.

?. Изучены условия экстракции фуросешда из водных растворо1 органическими растворителями в зависимости от различных факторов. Установлено, что для экстракции Луросзмида из водных растворов 'более целесообразно использошть диэтилоеый эфир в качестве зкь-трагента при значении"рК 2,0-3,С.

8. Проведено сравнительное изучение способов изолирования фуросешда из биологического материала общепринятыми методами и

установлена низкая степень выделения его из биологического материала: по методу Б.&.Крамаренко /7а/, по методу ДА. Васильевой /2?/, по методу Стаса-Отто /11/~/. ' ' - •

5. Т&зработана методика изолирования фуросемида и 4-хлор-. 5-сульфамоилантранидовой кислоты из одной навески биологического материала при их одновременном присутствии с использованием в' .качестве гкстрагента водного ацетона. Методика позволяет выделить йуросемид в количестве 65? и 4-х.тор-5-сульфамсилантракш1овую' киетоту -

10. Т&зработаны способы изолирования фуросемида и его метаболита - 4-хяор-5-сульфаУоилантранилозоК киздоты из биологичео-лих жидкостей /крози и мочи/.

11. !&зработана оптимальная методика очистке фуросемида и 4-хлор-5-сульфа,лоилантргниловой кислоты, выделенных из биологического материала и биологических жидкостей с помощью ТСХ.

' 12. Изучены вопросы сохраняемости Фуросемида в биологичэо-кш материале. Установлено, что при хранении биологического материала Зтуросемид сохраняется до 7 месяцев и определяется после истечения этого периода около Консервация объекта этанолом пролонгирует сохраняемость фуросемида до одного года и препарат определяется в щеделах 23%.

• ' 13. Изучение ориентировочного распределения фуросемида в органах отравленных животных показало, что фуросемид в моче олре-г деляется как в натнвном, так и в виде метаболита - 4-хлор-5-суль^амошантраниловой кислоты. Наибольшее количество фуросемида мскно выделить из мочи, крови, желудка, кклечника /при ре^ о^ /, а также из мышечной ткани в участке введения /внутримышечное введение/, что должно учитываться при направлении объектов на судебно-хкмическое исследование при подозрении на отравление фуросемидом.

По теме диссертации опубликованы следящие работы: «

1. Алиходтзеза :а.И., • Ккрамов Л.Т. анализ фуросемида в ферма-цеьтическкх препаратах и биологических жидкостях //В сб. "Тезисы докладов Третьего Всесоюзного съезда судебньх медиков".- Одесса, 19^ г.- С. .272-273.

2. Аяюгоджаева ..5.11., Екракоб Л.Т. Способы обнаружения (?уро-семида //Судебно-медицинская зксрертиьа. - IS«9.~ №2.- С. 32-33.

3. .¿лиходдаеьа л.И. Очистка фуросемида, выделенного иг биологического объекта /'/В сб. "Тезисы докладов 111 научной конференции молодых ученых и специалистов Ташкентского бьрмацевтического'института".- Ташкент, 1990 г.- С.' 62. -

4. Алиходжаеьа л.И., Ккракив Л.Т. Экстракция фуросемида из згдных растворов в зависимости от рН средь; /Даргаиия.- 1990.-

к.-'С. ао-61. ■

о. «лиходжаеьг. Л.И., Икргков Л.Т., ¡Сиуеходжаев ¿.Н. Сиредеяе-кие £уроеемидэ е объектах биологического проксхсвдения ИК-спектрое коше;" //'В. сб. "Теэиск докладов научно-практической конференции пс теме: "Повышение качества лекарственного обеспечения населения и учреждений здравоохранения республики".- Ургенч,- 19Э0 г.- С.11В-1

6. 'АлиходжаеЕа -«!.И. Изолирование и обнаружение фуросемида

е печени //Е сб.' "Краткие тезисы докладов I Сьезда милодых учение цедикоз и грачей Узбекистана".- кндшан.- 1991 г.- Т.2.- С.365-3

7. ьлиходжиева М.И., Белов г..Б., Тулаганог -ч.к. Применение отдельна" хроматографических методов для оценки чистоты фурэсемкдг //Е сб. "Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственны: средств"., Ток 2, Часть I,- ±>скса,- 1991 г.- С. 30-32.

Б. Алиходааевв П. И. Применение тонкослойной хроматографии ДЛ1 оценки качества и стандартизации фуросемида // Там же.- С.

-Z£lF..1fOTzp.усаТНЛ-Я н.Цульт.СССР