Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние фуросемида на активность изосомальных ферментов ишемизированных почек крыс и процессы перекисного окисления

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ "БАШЕИРСКЙИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИЕДЙШШСКИИ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ПЕТРЕНКО Наталья Александровна

ВУ1Ш51НЖЕУ ФУРОСЕМИДА Н1А. АКТЙВНОСТ Ь ИЗОСОНАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ Р1ШЕНИ ЗИРО ВАННЫ X

ПОЧЕК КРЫС: И ПРО НЕ осы ПЕРЕКИСНОГО ОКИ С Л ЕНИЯ

диссертации на.соискание ученой степени кандидата биологических наук

14- 00 -25 - Фармакология

А в тореферат

Уфа. 1993

Работа выполнена на кафедре Фармакологии Самарского медицинского института им. Д И. Ульянова

н а у ч н ьз й р у к о в о д и т е л ь -

заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор А. А Лебедев.

Официальные оппоненты -

доктор медицинских наук профессор Р. Н. Абдуллина

доктор медицинских наук профессор в. И. Ратников

Ведущая организация -

Российский Государственный Медицинский Университет

Зашита состоится "& " марта 1993 г. в "Д5" час. на заседании специализированного совета К 084. 35. 02 ° Башкирского государственного медицинского' института. : ,>1]

Автореферат разослан "Во " ил^Ьсуея, 1993 г. — ■

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского института (450000, УФа - центр, ул. Ленина, 3), ' '■■'

Ученый секретарь

специализированного совета

доктор медицинских наук т>оФессор^Ьэ.г.Давпетов .

к-; <

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТН

Актуальность темы. Профилактика и лечение острой ишемии почек является актуальной проблемой. Ишемия почек наблюдается при многих патологических состояниях. Полное или частичное внклп-чение кровотока может быть и в хирургической практике при операциях на аорте, на почечных сосудах, во время трансплантации почки, когда острая тотальная ишемия органа возникает после удаления его у донора и переноса реципиенту и оказывает существенное влияние на результаты и исход трансплантации.Имения почек возникает при массивном гемолизе эритроцитов, при синдроме длительного раздавливания мышц, при обширных ожогах, при септических, аллергических и иммунологических реакциях С Лебедев А.А., Дубищев А. В. ,1976; Струкое Р.П.. Серов В.В., 1985 ). В свете вышеизлоаенного становится очевидной необходимость разработки эффективных методов, препятствующих повреждению почек при нарушении почечной гемодинамики. В последнее время в клинической практике для купирования постишемической острой почечной недостаточности стали широко применяться диуретики. Лаборатория Самарского медицинского института им. Л.И. Ульянова одной из первых в стране стала заниматься проблемой зачиты почек при ишемическом поражении. В результате длительной экспериментальной работы были, изучены возмохныс механизмы профилактического действия диуретических препаратов. Однако, некоторые вопросы, связанные с выяснением всех аспектов проти-воиаемического лечебного действия диуретиков, остаются пока еще не выясненными.

Одним из направлений, по которому ведется изучение механизма защитного действия диуретических средств, является выявление их эффектов на биохимические процессы в почках. Фуросе-мид относится к группе диуретиков, вызывающих максимальный диурез (Лебедев А.А., 1984). Изучению его клеточных и молекулярных механизмов действия посвящено много работ. Интерес к этому препарату обусловлен тем, что до настоящего времени фуросемид остается одним из самых эффективных диуретических средств, широко применяющихся в клинике. В частности, исследование влияния препарата на лизосомы и их фермента может привести к вн-

явлению "мишеней" для лекарственного воздействия, а изучение воздействия фуросемида на процессы перекисного окисления липи-дов позволит более обоснованно назначать его при патологических состояниях, связанных с активацией свободнорадикального окисления.

В качестве показателей для оценки степени и характера оказываемого препаратом влияния на процессы свободнорадикального окисления мы использовали характеристики "медленной вспышки" железоиндуцированной хемилюминисценции (Владимиров В.п.,Арчаков А.И., 1972; Владимиров Ю.п. и соавт., 1981) и динамику накопления вторичного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида. Из литературы известно, что практически во всех случаях изменение содержания МДА коррелирует с кинетикой образования перекисей липидов и поглощением кислорода (Панкин В.З, и соавт,, 1975; Козлов Ю.П, и соавт,, 1983), Углубленное изучение механизма защитного действия фуросемида при ишемическом повреждении почек является весьма актуальным, поскольку эффекты препаратов на процессы перекисного окисления липидов не просто отражаются на их терапевтических и токсических эффектах, но и могут служить основой фармакологического действия лекарственных средств при тех или иных патологических процессах. Способность же фармакологических препаратов оказывать влияние на стабильность мембран и активность ферментов лизосом приобретает очень важное значение в свете представлений о резко повреждащем действии на клетку лизосомальных гидролаз, лабилизация и выход которых в цитозоль наблюдается при ииемическом повреждении.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование некоторых возможных механизмов противоишеми-ческого действия фуросемида, а именно, возможность влияния его на стабильность лизосомальной мембраны и на процессы перекисного окисления липидов при острой ишемии почек. Для достижения этой цели решались следующие задачи;

1. Изучался эффект фуросемида на лизосомальнуи мембрану в условиях ивемического поранения почек в опытах in vivo;

г

2. Исследовалось влияние фуросемида на температурную чувствительность лизосомальных мембран почечной ткани крыс, при этом определялась свободная и общая активность лизосомальных ферментов;

3. Определялась принципиальная возможность влияния Фуросенида на процесс перекисного окисления липидов в модельных экспериментах;

4. Изучался эффект препарата на протекание свободноради-кальных процессов при острой иаемии почки.

Научная новизна. Изучение эффектов Фуросемида на процессы перекисного окисления липидов, а также исследование препарата на наличие у него лизосокотропных свойств позволило дополнить новыми сведениями уае имеющуюся концепции механизма защитного действия фуросемида при экспериментальной острой почечной недостаточности (Лебедев A.A., Дубицев A.B.. 1985). Впервые было изучено влияние Фуросемида на степень сохранности лизосомальных мембран при инемии почек, что определялось по соотношению свободной и общей активности маркерных ферментов лизосон. Была обнаружена способность препарата вызывать, снижение исходной активности кислой фосфатазы и ß-галактозидазы. а также оказывать стабилизирующее влияние на почечные лизосомы в процессе 'Mr.MRoft ишемии. Последнее выражалось в сохранении активности кислой фосфатазы практически на исходном уровне и снижении по птноаению к контролю абсолютных значений свободной активности ß-галактозидазы через час после переаатия почечной ножки. 8 настоящей работе впервые показана способность фуросемида снижать относительное увеличение как свободной, так и общей активности кислой фосфатазы в течение первого часа при постановке теста температурной чувствительности лизосомальных мембран. Получены приоритетные данные по изучению влияния фуросемида на процессы свободнорадикального окисления в модельных системах, которые позволяют заключить,, что препарат может угнетать яеле-зоиндуцированную хемилюминисценцию, вызванную усилением ПОЛ в биологических мембранах. Впервые показана способность Фуросемида ингибировать ПОЛ в условиях тотальной ишемии почки in vitro, а также обнаружено нивелирование этого эффекта при иже-

-т

О

мии в условиях целого организма.

Научно-практическая значимость. В результате выполненных исследований уточнены и дополнены новыми сведениями отдельные стороны механизма профилактического действия фуросемида при ишемическом поракении почек. Так, изучение влияния диуретика на активность лизосомальных ферментов в процессе ииемии позволило сделать закличение о способности фуросемида стабилизировать мембрану лизосом. Полученные данные о влиянии препарата на процессы перекисного окисления при ишемическом воздействии свидетельствуют о возмояноы ингибировании фуросемидом сво-боднорадикального окисления, усиливающегося при воздействии на почку ишемического фактора.

Внедрение. Результаты исследования внедрены в педагогический процесс и используются на кафедре фармакологии Самарского медицинского института при изучении раздела "Мочегонные средства".

Апробация работы. Материалы исследования были долонены на третьей Всероссийской" научной конференции по фармакологии почек (Барнаул, 1990), на второй Всесоюзной конференции по фармакологической коррекции гипоксических состояний. По теме диссертации опубликовано 4 работы в центральной печати.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов; введение, обзор литературы, описание методов исследования, данные собственных исследований, обсуждение результатов, выводы. Диссертация иллюстрирована 8 таблицами, П рисунками. Список литературы включает 94 источника отечественной и 84 источника зарубеяной литературы.

Работа выполнена по плану НИР Самарского медицинского института в рамках проблемы "Механизм действия диуретиков и поиск новых диуретических средств", номер госрегистрации 01.91.0044907.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе изучено влияние диуретического средства - фуросемида на состояние лизосомальной мембраны, оцениваемое по активности ферментов лизосом, и на активность про-4

текания процессов перекисного окисления липидов в почках крыс при экспериментальной почечной недостаточности.

Способность фуросемида предохранять почки от ишемического повреждения путем стабилизации лизосомальных мембран исследовалась нами в опытах in vivo на белых беспородных крысах -самцах массой 200 - 250 г. Кивотннх наркотизировали зтаминалом натрия С 60 мг/кг внутрибршинно), фиксировали на термостатированном столике в положении лежа на спине. Для предотвращения дыхательной недостаточности производили трахеотомию. Путем разреза брюшной стенки обнажали левую почку, удаляли капсулу и на почечную ножку накладывали зажим сроком на 60 или на 120 минут. Правая почка ишемии не подвергалась и служила контролем. Мивотных делили на две группы, одной из которых за 30 кинут до- ишемии вводили подкожно фуросемид в дозе 10 мг/кг. После окончания срока ишемии почки удаляли, гомогенизировали при 0 - 4 С в 0,25 М растворе сахарозы с добавлением O.OOi М ЭДТЙ ,при pH 7,4 в сотношении 1:10. В гомогенате определяли активность лизосомальных ферментов.

Нами была исследована активность лизосомальных ферментов

интактных почек крыс в опытах in vitro при воздействии на них

возрастающих концентраций фуросемида. Гомогенат готовили из

почек беспородных белых крыс обоего пола массой тела 170-200 г о

при 0 - 4 С в ледяном 0,25 К растворе сахарозы на трис МП. буфере с добавлением 0.001 М ЭДТА fpíl 7.4) в спотнояении 1:10. Получений гомогенат освобождали от неразрувенних клеток и элементов соединительной ткани путем фильтрования через нейлоновую ткань и делили на две равные части. В одной из них определяли свободную активность, в другой - после добавления тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1 У., разрушающего ли-зосомальные мембраны и высвобождающего ферменты (Короленко Т.п.,1383), определяли обцуи активность ферментов. Для оценки способности фуросеиида стабилизировать лизосомальные мембраны использовался тест температурной чувствительности лизосомальних мембран (длительная инкубация гомогенатов при 37 С), поскольку однократное измерение соотношения общей и свободной активности ферментов малоинформативно при решении вопроса о стабильности мембран-этих образований (Покровский А.п.. Ту-

тельянгВ.А., 1976). Свободней и обцую активность ферментов определяли сразу se после получения гоыогенатов. а такке через 60 и 120 минут инкубации их с равный объемом фуросемида в конечных концентрациях 10"^ 10 Коль. Контролем слукил тот же гомогенат. но без добавления диуретика.

В качестве объекта исследования били выбраны три маркерных фермента лизосои : кислая фосфатаза, р -галактозидаза, £>-глюкозидаза, отличающиеся субстратной специфичностью и локализацией внутри органелл. Оценка знзиматической активности fi -галактозидазы и р- глнжозидазн проводилась по методу ñ.ñ. Покровского и соавторов (1969), который основан на спектрофото-метрическом определении количества п-нитрофенола. освобожденного в результате ферментативной реакции гидролиза п-нитрофе-кил- /з-галактопиранозида к п-нитрофенил- /б-гликопиранозида соответственно. на спектрофотометре "Спектромом-204" при длине волны 420 ни. Активность кислой фосфатазы определялась методом Бодански (Колб В.Г., Камышников В.С..1976) по гидролизу £-гли-церофосфата, так как известно, что он очень быстро гидролизу-ется лизосомальной кислой фосфатазой и медленно больвинством других кислых фосфатаз (ядерной, митохондриальной и др.) (Л®. Дингл, 1980). Количественное содержание конечного продукта ферментативного гидролиза ^-глицерофосфата - неорганического фосфора - определяли иикроиетодом (Кочетов Г.А.. 1380).

Содержание белка в гомогенате определялось спектрофотоме-трически с использованием микробиуретового метода по оптической плотности растворов при длине волны 330 нм (Кочетов Г.О.. 1980).

Оценка стабильности лизосональных мембран производилась по показателям латентности двух ферментов :^-галактозидазы и кислой фосфатазы в контроле и в опыте (Виноградов 8.N., Урюпов Ю.Ю., 1985) как процентное соотношение свободной и общей активности. Латентное состояниеjS-глюкозидазы не определялось, поскольку как мембраносвязанный фермент она не обладает лл-тентностью (Короленко Т.п., 1983).

Принципиальная возможность Фуросемида воздействовать на процессы ПО/1 в мембранах клеток была показана нами в опытах с

суспензией желточных липопротеидов, которую готовили путем гомогенизирования яелтка куриного яйца в фосфатном буфере ( 00 мМ КН2Р04 , 105 мН КС1, рН 7.5) (Клебанов Г.И. и соавт..' 1368). и в суспензии митохондрий (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1Э72), Митохондрии выделяли из почек белых беспородных крыс

о

весом 200-220 грамм при 0-2 С методом дифференциального центрифугирования. В качестве среди выделения использовали фосфатный буфер с рН 7,5. Хемилюиинисценции инициировали добавлением ионов- двухвалентного железа в конечной концентрации -г

10 М. Определение антиокислительной активности фуросемида основывалось на эффекте торможения ПОЛ модельной системы, ко-

г 2+

торое инициировали ионами ге .

Для выяснения вопроса об эффекте фуросеыида на ПОЛ в почечной ткани при воздействии ииемического-фактора мы провели серию экспериментов с гомогенатом почек крыс, которым за 30 минут до опыта вводили фуросемид подкожно в дозе 10 мг/кг. Крыс декапитировали, почки животных быстро извлекали и использовали для создания полной ишемии в условиях изолированного

о

хранения в течение двух часов.при 20 С (Биленко М.В., 1982).

До проведения хеыилюминисцентного анализа почки хранили в сосуде Дьюара в среде жидкого азота. Для приготовления гомо-генатов брали стандартную навеску ткани почек массой 500 мг. Ткань измельчали и гомогенизировали в ледяном фосфатном буфере (20 мМ КН2Р04, 105 мМ КС 1, рН 7.4). Конечный объем пробы доводили до 10 мл. Регистрацию хемилюиинисценции проводили тотчас же после приготовления гомогената.

Кривые хемилшминисценции прописывались на специальной установке (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972), после чего регистрировались следующие параметры железоиндуцированной хемилшминисценции : интенсивность "быстрой вспышки" (I б.в.,см), скорость нарастания "медленной вспыаки" {8, отн.ед.), амплитуда "медленной вспышки" (Н,см), светосумиа "медленной вспыики" (5,см). Антиокислительную активность препарата определяли по методу Владимирова Ю.А. и соавт, (1973).

Поскольку об интенсивности протекания процессов свобод-норадикального окисления можно судить по динамике накопления вторичного продукта ПОЛ, параллельно проводилось определение

малонового диальдегида спектрофотометрически по показателю оптической плотности при длине волны 532 нм на спектрофотометре СФ-26. Чтобы исключить поглощение окраиенных комплексов веществами нелипидной природы, пробы фотометрировали также при длине волны 580 нм (Коробейникова З.Н., 1989). Концентрацию

ТБК-активных продуктов рассчитывали с учетом коэффициента мо-

s -/ -/

лярной зкстинции (1,56 10 М см ).

Мы выражаем глубокую благодарность заведующему кафедрой молекулярной фармакологии и радиобиологии 2-го М0/1ГМИ им. Н.И.Пирогова академику АМН России профессору П.В.Сергееву за предоставленную возможность выполнить данный раздел работы на кафедре и за постоянные консультации и помощь.

Для изучения влияния фуросемида на содержание Se - содержащих соединений при острой ишемии почки мы исследовали динамику изменения содержания селена через 2 часа после наложения зажима на почечную ножку левой почки крысы через 30 минут после введения Фуросемида подкояно в дозе 10 мг/кг. Селен оп-

о

ределяли в высушенных при 105 С в течение 24 часов образцах почечной ткани, взятых от контрольных животных, а также от животных с острой ишемией левой почки на фоне действия Фуросемида и без него по методике Bayfield R.F., Koaalis L.F., (1'385).

В настоящей работе представлены материалы 35 серий экспериментов по 9 опытов в каждой. Обработка полученных данных производилась методом вариационной статистики с использованием критерия t Стьюдента.• Результаты считались достоверными при Р < 0,05.

РЕЗЯЛЫЙТН ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние фуросемида на активность лизосомальных Ферментов при острой ияемни почек

Поскольку воздействие ичемического фактора вызывает л.аби-лизацию и выход в цитозоль лизосоыальных ферментов, оказываю-цих резко повреждающее действие на клетку, нами в качестве объекта исследования били выбраны лизосомы. Мы остановили свой выбор на изучении трех Ферментов лизосом, имеющих различную

В

локализации внутри органелл : fi -галактозидаза - матриксный Фермент;/3-глгакозидаза - маркер лизосомальной мембраны; кислая ФосФатаза присутствует и в мембране, и в матриксе лизосом. Как видно из таблицы 1, инъекция фуросемида приводит к понижению свободной активности кислой фосфатазы и f¡ - галактозидазн и к незначительному повышению - для р -гликозидазы. Наложение зажима на почечную ноаку сроком на 60 минут приводит к повышении свободной активности кислой фосфатазы в 1,73 раза по сравнению с контролем (с 3,81±0,20 до 6,57t0,45 нмоль/мг мин),jS-галактс-зидазн - в 1,19 и ^-гликозидазы - в 1,18 раза. Профилактическое введение фуросемида приводит к сохранению через S0 минут ияе-мии практически на исходном уровне свободной активности кислой фосфатазы. В динамике возрастания свободной активности двух других ферментов - jS-галактозидаза и^в- гликозидазы нами не было отмечено никаких существенных отличий от контрольного уровня. Изменения общей активности Ферментов, определяемой с помощью неионного детергента тритона Х-100, были сходны с таковыми для свободной активности. Инъекция Фуросемида приводила к снижению общей активности кислой фосфатазы и s-галакто-зидазы. Во время ишемии происходило резкое возрастание общий активности кислой фосфатазы в 1,5 раза через 60 минут ишемии f7,38_f_0.2.0 против 5,13±0,28 нмоль/мг мин в контроле) и в 2.0 раза через 120 минут ишемии. Общая активность fi-галактозидазн и /3-гликозидазы наоборот уменьшалась, и к 120-й минуте ишемии изменения были достоверно ниае контрольного уровня. При профилактическом введении фуросемида мы наблюдали ять незначительное повышение общей активности кислой фосфатазы через 60 минут ишемии, и значение было достоверно ниже контрольного f5,25¿0,54 против ?,38±0,23 нмоль/мг мин в контроле, Р < 0,05). На этот se момент времени общая активность fi-галактозидазы была достоверно нине и исходного, и контрольного уровней. Общая активность р -гликозидазы сохранялась на исходном уровне.

Поскольку степень повреждения лизосом,равно как и эффективность препарата можно охарактеризовать при помощи специального критерия - "латентности" лизосомальных ферментов, ми

а

рассчитали соотношения свободной и общай активности кислой фосфатазы и -галактозидазы на исходном, контрольном и опытном уровнях. Из таблицы 1 видно,что ишемия вызывала лабилиза-цию лизосоиальных ферментов, и уже через 60 минут ишемии наблюдалось возрастание показателя латентности для кислой фисфатази.

Таблица 1

ВЛИЯНИЕ ©УРОСЕМИДА НА АКТИВНОСТЬ ШОСОМАЯШХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ОСТРОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Сй + ш при п = 3 )

Время Активность фермента, нмоль/мг мин

ишемии, контроль при действии фуросемида

мин свободная общая св/об свободная обцая св/об

кислая ¡росфатаэа

0 3,81+0,13 5,13+0.29 0,74 2.34+0.54 4,75+0.54 0.62

* »

60 5.57+0.45 ?.38±0.28 0.89 3.21+0.74 5,25^0.54 0.0! р <0,05 р <0,05

р -галактозидаза

0 30,16+2,50 89,78±5,21 0,34 24,97+1,И 79,01+4,88 0,32

*

60 35,76±1,86 73,46+2,97 0,45 32,46+1,14 68,51+2,71 0,47

р <0,05 р -глюкозидаза

0 6,34+0,52 5,38+0,84 7,12+0,62 6,03+0,73

*

60 7,51+0,41 4,65^0,31 10,00+0,60 6.03+0,56

р <0,05

Примечание: * - р <0,05 по сравнению с контролем на соответствующий момент времени

Профилактическое введение фуросемида проявилось в сохранении через 60 минут после наложения зажима на почечнув ножку показателя латентности данного фермента на исходном уровне. Одна-

ко. к 120-й минуте ишемического воздействия этот показатель возрастал и был даже визе контрольного значения. Для/>-галакто-зидазн доля свободной активности от общей увеличивалась по мере увеличения срока имении. Воздействие имемического фактора на фоне действия фуросемида приводило к сохранению доли свободной активности от общей на 60-й минуте иыемии и к снижению данного показателя к 120-й минуте воздействия ишеиического фактора по сравнению с контролем. Таким образок, в результате проведенных исследований мы выявили способность фуросемида предохранять лизосомн от губительного влияния ишемии.

Влияние Фуросемида на активность лизосояальных Ферментов

почек крыс б процессе инкубации гомогенатов почечной ткани при 3? С

Для решения вопроса о том. является ли стабилизация ли-зослмальных мембран под влиянием Фуросемида первичной, или же сохранение целостности мембран лизосон вторично по отношения к другим фармакологическим эффектам препарата, мы исследовали влияние фуросемида на активность лизосомальних ферментов гомо-гената почечной ткани крыс in vitro с помощью теста температурной чувствительности лизосомальних мембран. Как видно из таблицы 2 инкубация гомогената вызывала достоверное возрастание свободной и общей активности кислой фосфатазы. Доля свободной активности от общей такке существенно возрастала в процессе инкубации, однако нам не удалось отметить какой-либо закономерности в ее изменении при увеличении конечной концентрации фуросемида. Присутствие диуретика в гомогенате при инкубации способствует минимальному возрастанию свободной активности кислой фосфатазы к 60-й минуте температурного воздействия, однако к 120-й минуте изменения активности были сходны с контролем. Колебания общей активности были незначительными и не носили статистически достоверного характера. Доля свободной активности от общей претерпевала изменения, аналогичные контрольной серии опытов: она возрастала в присутствии фуросемида. Обращает на себя внимание тот факт, что при добавлении к гомо- . генату фуросемида происходит статистически достоверное ловние-

ние свободной активности кислой фосфатазн. более выраженное для высоких концентраций препарата. Общая активноеть фермента под влиянием фуросемида также возрастала.

Таблица 2

ВЛИЯНИЕ ФУРОСЕМИДА НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ЛИ30С0И В ПРОЦЕССЕ ИНКУБАЦИИ ПРИ 3?°С (М ± ш при п = 3)

Время Активность фермента, нмоль/мг мин инку- контроль бации,

мин свободная общая с8/об свободная

при действии Фуросемида 10 К обща« св/об

0 60

0 120

кислая фосфатаза

*

.18*0,6? 11,38+0.34 0,54 7.01±0,67 13,27±0,22 0,53

*

,80±0,57 12,01+0,28 0,73 9,37±0,40 14,21±.0,37 0,66

р <0,05

р <0,05 6,6010,45 10,23+0.1?

.65 7,5710,44 12,25±0,44 0.02

.57+0,15 11,16±0,23 0,77 9.38+0,20 11.7?±0.32 0,80

р <0,05 р <0,05

р <0.05 р -галактозидаза

О 29,08±0,26 ei.85t0.63 0.47 29,00^0,18 57,57±1,05 0,50

60 33,48+0,46 66,08±0,33 0,51 33,42±0,21 56.34i0.29 0,59

р <0,05

р <0,05

0 45.81+1.02 86,92+1.04 0,53 46.90*0.58 73.75^0.88 0.59

*

120 45.25+0,77 78.52+1.16 0.58 46.94+1,48

р <0.05

,74±0,48 0.68 р <0.05

*

Примечание: * - р <0,05 по сравнению с контролем на соответствующий момент времени

При инкубации происходило увеличение свободной активности р -галактозидазы в среднем в 1,21 раза, общей активности - в 1,06 раза. Доля свободной активности от общей также возрастала. Добавлений к гомогенату фуросемида не исключило увеличения свободной активности jS-галактозидази в процессе инкубации, однако вызвало уменьшение степени нарастания общей активности фермента. Доля свободной активности от общей также увеличивалась в процессе температурного воздействия. Изучая влияние фуросемида на исходный уровень активности jS-галактозидазн, мы обнаружили, что в отличие от кислой фосфатазы, чья активность при добавлении в гомогенат препарата возрастает, для р-галак-тозидазы не было постоянных сдвигов свободной и общей активности в ответ на присутствие в пробе фуросемида; наблюдалось

лишь достоверное снижение общей активности фермента е присут-

-3

ствии высокой концентрации фуросемида С10 Моль).

2 г

Влияние фуросемида на Fe -индуцированную хемилюминисцен-цию суспензии желточных липопротеидов и митохондрий почечной ткани

Процессы ПОЛ в настоящее время рассматриваются как один из универсальных механизмов повреждения клетки, и. в первую очередь клеточных мембран (Владимиров Ю.А.. Арчакив А, И.. 1972; Сейфулла Р.Д., Борисова И,Г., 1090). .:i его активация происходит при широком круге патологических состояний организма (Афанасьев И.Б., 1904Э. Поэтому мы изучили антиокислительную активность фуросемида с использованием модельной системы, представляющей собой суспензию липопротеидов желтка куриных яиц (Клебанов Г.И. и соавт., 1908). Как видно из таблицы 3 ин-гибирующий эффект фуросемида начинает проявляться уже в кон-

"S

центрации 10 Н. хотя при действии этой концентрации препарата уменьшается лишь интенсивность "медленной вспывки" и скорость ее развития. Повышение конечной концентрации фуросемида -4

в пробе до 10 М приводило к значительному уменьшению всех показателей Рег*-индуцированной хемилюминисценции: скорость на-

растения "медленной вспышки" уменьшилась в 1,73, а интенсивность - в 1,82 раза и составила 9,5 см по сравнению с контрольным уровней 17.3 см. При повышении.концентрации препарата до 10 происходило практически полное тушение хенилюминис-ценции. Антиокислительная активность фуросемида оказалась равной 6.6- 103 Н"/.

Таблица 3

ВЛИЯНИЕ ФУРОСЕМИДА НА ПОКАЗАТЕЛИ КИНЕТИКИ ВЕ/1ЕЗОИНДУЦИРОВ АННОЙ ХШЛШНИСЦЕНЦИИ СУСПЕНЗИИ ЖЕЛТОЧНЫХ ЯИПОПРОТЕИДОВ

Концентрация Интенсивность Скорость Интенсивность Светосумыа

Фуросемида, "быстрой нарастания "медленной "медленной"

М вспышки",си "медленной вспышки", си оспыаки",сы

вспышки"

Контроль 2,50 2,60 17,3 84,57

-5

10 2,20 2,50 16,30 89,10

-4

10 2,45 1-45 9,50 58,72

-4

2-10 2,60 0,90 5,00 20.05

-4

3-10 2» 60 0,41 2,25 В. 94

-4

4-10 3.00 0,28 1,37 -

-4

5-10 3,25 0,20 1.27 -

-3

10 4,00 0,08 0,50 -

Контроль 2,1 2,30 13,4 87,68

Наблюдаемое в эксперименте тушение хемилюминисценции позволяет предположить возможность такого ингибирующего эффекта фуросемида и на биологические мембраны в условиях клетки. Для выяснения этого вопроса мы изучили влияние препарата на -индуцированную хемилгоминисценци» митохондрий по методу Владимирова Ю.А.. Йрчакова ft.И..( 1972 ). Характер изменений кривой под влиянием фуросемида близок к таковому, обнаруженному нами в суспензии липопротеидов. Однако уменьшение показателей, характеризующих "медленную вспншку" не столь значительно. Так, присутствие в пробе малых концентраций диуретика (10 6. i О-"5* М) приводит к уменьшению скорости нарастания и интенсивности "медленной вспышки" всего на 3-57. в сравнении с контрольными значениями. Пииь увеличение конечной концентрации препарата до 10 М вызывает более значимые сдвиги в показателях Fe^-индуцированной хемилюминисценци«, а наличие в пробе фуросемида в концентрации 10 М обуславливает сильный ингибирующий эффект, свидетельством чему служит снижение скорости развития "медленной вспышки" в 2,7 раза по сравнению с контролем ( с 3,8 до 1.4 отн.ед). ее интенсивности - в 2,3 раза (с 18,0 до 7.9 си), а светосумны - в 2,2 раза (с 80,25 до 38,95 см ).

Влияние Фуросемида на ПОЛ в условиях полной ишемии почки

in vitro

Полученные в модельных экспериментах данные позволяют предположить наличие у фуросемида способности ингибировать ПОЯ в почечной ткани, подверженной воздействии ишемии. Данные об изменении показателей железоиндуцированной хемилюминисценции при воздействии на орган тотальной ишемии в течение двух часов на фоне действия фуросемида и без него показали, что сам Фу-росемид до воздействия повреждающего фактора вызывает ливь некоторое статистически недостоверное снижение скорости нарастания "медленной вспышки" хемилюминисценции. В отношении остальных показателей его влияние разнохарактерно и статистически недостоверно. Примечательным является тот Факт, что полная ишемия почки вызывает снижение показателей хемилюминисценции.

Так, через 60 минут инкубации почки скорость развития вспышки уменьшилась с 19,63±1,51 в контроле до 16,66^0,83 отн.ед. Увеличение срока ишемии до 120 минут привело к дальнейшему падению этого показателя до 13.33i0.33 отн.ед. Аналогичные результаты были получены нами и при исследовании Ге2*-индуцираванной хемилюминисценции ишемизированной почки, на которую оказал влияние фуросемид. Объяснить полученные данные позволяют имеющиеся в литературе сведения о накоплении в иаемизированных органах так называемого иыемического токсина, способного оказывать эффект тушения хемилюминисценции (Владимиров Ю.А. и соавт., 1981). Поэтому для решения вопроса о влиянии фуросеми-да на процессы ПОЛ в ишемизированных почках мы изучили динамику накопления вторичного продукта перекисного окисления липи-дов - малонового диальдегида.

Воздействие ишемическо'го фактора приводит к достоверному повышению содержания МДЙ к 60-й минуте в 1,9 раза, к 120-й минуте - в 1,8 раза (соответственнно 9,76±.0,76 и 9,5*.0,53 по сравнению с 4,99±0,33 мкНоль/г ткани в контроле). Под влиянием

фуросемида изменяется динамика накопления НДА в почке при ин-о

кубации ее при 20 С. Следует отметит!- тот факт, что само по себе применение фуросемида вызывало снижение содержания в пробе спонтанного УДА с 4.99+0,33 до З.ЗЗаО.47 мкМоль/г ткани (р > 0,05). При действии ишемического фактора на фоне фуросемида происходило незначительное увеличение содержания в почке НДА: через 60 минут в 1,14 раза, а к 120-й минуте - в 1,16 раза (р > 0,05). Таким образом, несмотря на сходный характер накопления ЙДА в контрольной и опытной пробах, количество его и к 60-й, и к 120-й минуте ишемии в почке, находящейся к началу инкубации под влиянием фуросемида, оказалось достоверно ниже контрольного на соответствующий момент времени. Этот факт заслуживает особого внимания, поскольку согласно данным литературы изменение содержания МДА коррелирует с кинетикой образования перекисей липидов и поглощением кислорода (Козлов Ю.П. и соавт., 1983).

Влияние фуросемида на перекисное окисление при острой ишемии почки in vivo

Наряду с определением принципиальной возможности Фуросе-мида оказывать ингибирующее действие на процессы ПОЛ в почечной ткани, мы изучили кинетику ПОЛ в почке при создании модели острой почечной недостаточности в условиях целого организма на Фоне действия фуросемида и без него. Инъекция фуросемида вызывала достоверное снижение показателей Fe^-индуцированной хе-милюминисценции. Так, скорость нарастания "медленной вспышки" уменьшилась в 1,3 раза (с 13,26i0,9? до 10,04±1.0? усл.ед.), а ее интенсивность - в 1,2 раза (с 14,74±0,50 до 12,бб±0,35 см). Действие на почку ишемии не привело к значительному изменению показателей, характеризующих "медленную вспышку", однако на фоне действия фуросемида они были меньше контрольных на соответствующий момент времени. В связи с затруднением анализа кривых, связанного со способностью накапливающегося в ходе ишемии ткани иаемического токсина тушить хемилюминисценцию. для более полного и обоснованного заключения о действии Фуросемида мы изучили его влияние на динамику накопления НДА при тотальной ишемии почки in vivo. Полученные нами данные свидетельствуют. что в процессе ишемии происходит накопление в ткани МДА: в 1.5 раза через 60 минут (с 4.93±0.44 до 7.38±0,53 мкИоль/г ткани) и з 1,4 раза через 120 минут ишемии (с 4,64± 0,24 до 6,30±.0.33 мкКоль/г ткани). Действие на почку Фуросемида не вызывало достоверных изменений в динамике накопления ИДА под влиянием пиемии, что, по-видимому, связано с участием в патогенезе острой почечной недостаточности дополнительных к иаемическому повреждающих факторов, действие которых приводит к нивелированию наблюдаемого в опытах in vitro ингибирующего эффекта Фуросемида на процессы свободнорадикального окисления 8 почке при ишемии.

Влияние фуросеиида на содержание селена в почке при

экспериментальной почечной недостаточности

Поскольку 5е-содержащие соединения оказывают антиокси-дантное действие, а активность Зе-содержащей БЗН-пероксидазн. к примеру, снижается при ишемии и в постишемический период, что, вероятно, связано с уменьшением поступления в орган 5е-содераащих соединений (Биленко И.В.. 1989), ми изучили динамику изменения содержания селена в почке через 2 часа ииеми-ческого воздействия на фоне действия фуросёмида и без него. Результаты проведенных экспериментов оказались следующими: во время ишемии происходило снижение количества селена в почечной ткани с 12,0б±0,5? до 9.1?±0,58 мг/г ткани, р < 0,05. Профилактическое введение фуросенида и последующая острая ииемия почки вызывали аналогичное снижение уровня селена к концу 2-го часа ишемии с 12,08+0,5? в контроле до 8,74±0,74 мг/г ткани, р < 0,05. Разница между двумя опытными значениями оказалась недостоверной, что говорит об отсутствии какого-либо влияния фуросенида на содержание в ииеиизированной ткани Бе, а значит и 5е~содержащих соединений через 2 часа ииемического воздействия.

В Н В 0 Д Н

1. Фуросемид, введенный подкожно в дозе М мг/кг,способен подавлять катаболическую активность кислой фосфатазы и ^-галактозидазы лизосом интактных почек крыс, что проявляется в снижении свободной и общей активности кислой фосфатазы и свободной активности р -галактозидазы.

2. Предварительное добавление фуросёмида к гомогенату почечной ткани крыс до инкубации вызывает повышение свободной и

-4

общей активности кислой-фосфатазы в концентрациях 10 и 10 М, и понижает общую активность р -галактозидазы в концентрации

ю"-3 Н.

3. Фуросемид способен уменьшать лабилизацию лизосомальных ферментов почечник лизосом в первый час ишемии in vivo, что отражается в уменьшении показателей свободной и общей активности кислой фосфатазы и свободной активности 0-галактозидазн по сравнений с контролем.

4. Предварительное добавление в среду инкубации фуросеии-да в конечной концентрации 10 М вызывает снижение нарастания свободной активности кислой фосфатазы и общей активности р-галактозидазы при сроках инкубации 60 и 120 минут.

«2+

5. Фуросемид способен угнетать Fe -индуцированную хеми-люминисценцию модельных систем (суспензии липопротеидов желтка и суспензии митохондрий почек крыс).

6. В условиях тотальной ишемии почки in vítro фуросемид обладает способностью уменьшать накопление продукта перекисно-го окисления липидов - малонового диальдегида, то есть ингиби-ровать свободнорадикальное окисление,

7. Предварительное подкожное введение фуросемида крысам в дозе 10 мг/кг за 30 минут до опыта не вызывает достоверных изменений в накоплении малонового диальдегида и развитии хемилв-минисценции в процессе ишемии почки in vivo.

8. Предварительное введение фуросемида не восстанавливает содержание селена в почке, сниженного в результате воздействия ишемии и последующей реперфузии,

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В настоящей работе показана способность фуросемида при предварительном введении оказывать стабилизирующее влияние на лизосомальные мембраны и угнетать свободнорадикальное пере-

кисное окисление липидов, интенсификация которого наряду с ла-билизацией мембран лизосом наблюдается при ишемии почек, что, следовательно, подтверждает перспективность использования фу-росемида для предупреждения постииемической острой почечной недостаточности.

СПИСОК РАБОТ, 0П9БЛЙК0ВАНШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Петренко H.A., Додонова H.A. Изменение активности лизосомальных ферментов почек крыс при ишемии на фоне действия фуросемида // Фармакология почек : Тезисы докладов третьей Всероссийской научной конференции. - Барнаул, 1990. - С. 8t-83.

2. Лебедев A.A., Петренко Н.й. Изучение влияния Фуросемида на активность лизосомальных ферментов почек крыс. - Самара, 1991. - 8с. - Деп. в ВИНИТИ 27.09.91 N.3806-B91.

3. Механизм действия и поиск новых диуретических средств /Лебедев A.A., Симерзина /1.В., Додонова H.A. и др. - Самара, 1991. - 12с. - Деп. в ВИНИТИ 27.09.91 N 3805-В91.

4. Петренко H.A., Чукаев С.А. Оценка антиокислительной активности фуросемида хемилюминисцентным методом // Фарма-кол.коррекция гипокс. состояний : Материалы второй Всесоюзной конференции. - Гродно, 1991. - С. 460-461.