Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Контроль чувствительности штаммов вируса гриппа А к противовирусным лекарственным средствам

На правах рукописи

РОТАНОВ Марина

КОНТРОЛЬ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА А К ПРОТИВОВИРУСНЫМ ЛЕКАРСТВЕННЫМ СРЕДСТВАМ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3171132

МОСКВА 2008

003171132

Работа выполнена на кафедре фармацевтической и токсикологическом химии медицинского факультета ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» и ГУ НИИ Вирусологии им Д И Ивановского Российской академии медицинский наук

Научный руководитель Гребенникова Татьяна Владимировна

доктор биологических наук, доцент

Официальные - Нестерова Ольга Владимировна

оппоненты доктор фармацевтических наук, профессор

ММА им ИМ Сеченова

- Бикетов Сергей Федорович

кандидат биологических наук,

ГНЦПрикладной микробиологии и биотехпочогии

Ведущая организация Московский НИИ медицинской экологии (НИИМЭ) Департамента здравоохранения г. Москвы

Защита состоится 25 июня 2008 г в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212 203 13 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, г Москва ул Миклухо-Маклая, д 8, Медицинский факультет

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6 Автореферат размещен на сайте www rad pfu edu ru

Автореферат разослан «J J » мая 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212 203 13 доктор биологических наук, профессор

/ ^AiWJ Е.В. Лукашева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Грипп, в течение долгих лет продолжает оставаться одной из наиболее актуальных медицинских и социальных проблем, вследствие способности распространяться по всему миру и поражать широкий круг хозяев (WHO, 2003)

Значение химиопрофилакгики и химиотерапии в надзоре за распространением гриппозной инфекции, трудно переоценить, особенно в целях своевременной защиты населения в экстренных эпидемических ситуациях (Бектимиров Т, 2003, Ленева И А, 2004,2006)

Исследование и разработка методов анализа лекарственных средств (JIC) в биологических объектах, а также совершенствование методов оценки качества JIC для обеспечения их максимальной терапевтической эффективности и безопасности является одной из главных задач фармацевтической химии (Арзамасцев А П, 2004,2008)

На сегодняшний день, помимо вакцинации, для лечения и профилактики гриппа Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) рекомендованы 2 группы JIC блокаторы белка М2 (амантадин и римантадин) и ингибиторы нейраминидазы (занамивир и озельтамивир) (WHO, 2004) В нашей стране широкое распространение получил отечественный лекарственный препарат арбидол Долгий период применения лекарственных средств адамантанового ряда, привел к резкому падению чувствительности вируса к данной группе средств (Deyde V М, 2007, Xu X, 2007) Исследования, проведенные среди эпидемических штаммов вирусов гриппа А в Российской Федерации, также свидетельствуют о прогрессирующем увеличении в популяции числа римантадин-устойчивых штаммов (Burtseva Е 1, 2007) В начале 2008 года, по данным ВОЗ, впервые зарегистрировано значительное снижение чувствительности и к озельтамивиру среди штаммов вируса гриппа A(H1N1) (WHO, 2008)

Изучение молекулярных и генетических характеристик штаммов вируса гриппа, циркулирующих во всем мире, является основным звеном системы мониторинга как эволюционных изменений в геноме вируса, так и чувствительности к противовирусным лекарственным средствам Мутации, являющиеся маркерами устойчивости к противовирусным JIC, представляют интерес не только с точки зрения генетического признака позволяющего идентифицировать резистентный штамм, но и новой генетической особенности штамма, способной влиять на вирулентные и репродуктивные свойства вируса Среди эпидемических штаммов, циркулирующих в Российской Федерации, молекулярно-генетический анализ до сих пор не используется как метод регулярного контроля чувствительности к противовирусным лекарственным средствам Статистические показатели, анализ научной литературы, собственные наблюдения показывают, что такая информация необходима для системного контроля биологической активности противовирусных лекарственных средств и является важнейшим этапом разработки эффективной тактики борьбы, как с известными, так и новыми штаммами вируса гриппа При этом попытка создания эффективной молекулярной тест-системы для

амплификации генов, кодирующих мишени основных противогриппозных лекарственных средств, с целью идентификации маркеров резистентности, представляется своевременной и чрезвычайно актуальной Цель и задачи исследования.

Целью данной работы являлась разработка и стандартизация диагностических тестов для контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов HI и НЗ, выделенных на территории Российской Федерации (19952008г.) к основным противовирусным лекарственным средствам

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

1 Провести анализ первичной структуры генов М2, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) вируса гриппа А, подтипов HI и НЗ на основе генетической базы данных NCBI (National Centre for Biology Information) и осуществить подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования генов, кодирующих белки М2, НА и NA

2 Разработать и стандартизировать состав диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для определения первичной структуры генов М2, НА и NA вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) в целях контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов HI и НЗ к основным противовирусным лекарственным средствам

3 Секвенировать гены М2, НА и NA эпидемических штаммов гриппа А, подтипов HI и НЗ разных лет, а также ген NA из клинических образцов, полученных от пациентов, принимавших озельтамивир

4 На основе анализа полученных нуклеотидных последовательностей эпидемических штаммов гриппа А, идентифицировать в белках М2, НА и NA мутации, ответственные за устойчивость к лекарственным средствам

5 Выявить новые - потенциальные маркеры устойчивости к противовирусным лекарственным средствам

6 Охарактеризовать исследуемые эпидемические штаммы вируса гриппа А с помощью филогенетического анализа

Научная новизна.

Впервые представлена подробная молекулярно-генетическая характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа А подтипов H3N2 и H1N1, изолированных в Российской Федерации (1995-2008 г г.) На примере 42-х эпидемических штаммов проведен анализ известных и новых мутаций, связанных с резистентностью к лекарственным средствам, которые применяются в терапии гриппозной инфекции блокаторы белка М2 (амантадин и римантадин), ингибиторы нейраминидазы (занамивир и озельтамивир) и арбидол

Разработаны и апробированы эффективные ОТ-ПЦР системы для амплификации и определения нуклеотидной последовательности гена М2 белка и участков генов нейраминидазы и гемагглютинина в которых локализованы маркерные мутации устойчивости к противовирусным JIC

В результате проведенных исследований установлено, что во всех римантадин - устойчивых штаммах, вместе с основным маркером

резистентности - мутацией БЗШ в М2 белке, данную группу штаммов, характеризуют уникальные аминокислотные замены, присутствующие совместно с заменой БЗШ во всех поверхностных белках М2, нейраминидазе и гемагглютинине Структурные особенности поверхностных белков исследуемых штаммов продемонстрированы путем филогенетического анализа, где главными критерием организации отдельных филогенетических групп являлись время изоляции штамма и чувствительности к римантадину.

Впервые показано, что исследуемые штаммы не содержат изменений в гемагглютинине, которые указывают на снижение чувствительности к отечественному лекарственному препарату — арбидолу Также, впервые, на отечественных эпидемических штаммах, и клинических образцах вируса гриппа А, полученных от пациентов 1-й Инфекционной больницы г Москвы принимавших озельтамивир, проведена идентификация маркеров устойчивости к ингибиторам нейраминидазы Основной маркер устойчивости к озельтамивиру - мутация Н274У выявлена в двух эпидемических штаммах А(НШ1) 2008 года

Впервые подготовлен проект отечественной фармакопейной статьи на диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса, являющейся основой для стандартизации и оценки эффективности противовирусных лекарственных средств

Практическая значимость.

Созданные ОТ-ПЦР системы для амплификации и определения нуклеотидной последовательности генов, кодирующих синтез белков М2, нейраминидазы и гемагглютинина, используются в работе Национального центра по гриппу, (г Москва, ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского, РАМН) для проведения мониторинга чувствительности отечественных эпидемических штаммов гриппа А подтипов НЗЫ2 и НШ1 к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.

Разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для выявления маркеров устойчивости к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в геноме вирусов гриппа А

Созданные молекулярные тест-системы используются для выяснения характеристик отечественных эпидемических штаммов 2008 года в связи с подъемом резистентности к ингибиторам ЫА в рамках международного сотрудничества ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского, РАМН с Всемирной Организацией Здравоохранения

Положения, выносимые на защиту.

1 Возможность разработки и стандартизации диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для амплификации и определения нуклеотидной последовательности генов, кодирующих белки М2, нейраминидазу и гемагглютинин вируса гриппа А подтипов №N2 и НШ1 и последующей идентификации маркерных мутаций резистентности к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в целях контроля их биологической активности.

2 Возможность выявления и характеристики мутаций эпидемических штаммов гриппа А подтипов НЗЫ2 и НШ1, изолированных в Российской Федерации за период с 1995 по 2008 год и идентификация маркеров резистентности к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу

3 Возможность идентификации маркеров резистентности к ингибиторам нейраминидазы в клинических пробах 2007 года, полученных от больных в процессе применения озельтамивира

4 Сравнительный филогенетический анализ эпидемических штаммов гриппа А подтипа ЮШ и НШ1, на основании аминокислотной последовательности гемагглютинина и нейраминидазы

5 Проект ФСП на диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для выявления маркеров устойчивости к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в геноме вирусов гриппа А(НЗЫ2) и А(НШ1)

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, Белоруссия, 2007 г), Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2007 г) и на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г) В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании кафедры Фармацевтической и токсикологической химии РУДН 21 февраля 2008 г Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов Одна статья принята в печать

Объем и структура диссертации.

Материалы изложены на 152 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 222 источника, из них 43 отечественных и 179 зарубежных авторов Работа содержит 17 таблиц и 17 рисунков

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В качестве исследуемого материала были использованы эпидемические штаммы вируса гриппа А любезно предоставленные руководителем Лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа НИИ Вирусологии им Д И Ивановского РАМН, д м н Бурцевой Е И Исследуемые штаммы до начала исследования в данной лаборатории были охарактеризованы на чувствительность к римантадину

Клинические образцы от пациентов с диагнозом гриппа получавших терапию озельтамивиром, были получены от больных из 1-ой Инфекционной больницы г. Москвы Пробы поступили на исследование из Лаборатории

респираторных вирусных инфекций с апробацией лекарственных средств ГУ НИИ вирусологии им Д И Ивановского

Последовательности олигонуклеотидных праймеров подбирали при помощи программ Amplify 1 0 (Accelrys Inc, США), BioEdit 7 0 1, Pnmerselect (Lasergene, США) с использованием нуклеотидных последовательностей из банков данных GenBank (www nebí nlm nih gov) и ISD (Influenza Sequence Database, www flu lanl gov) Полимеразную цепную реакцию проводили как в тонкостенных пробирках объемом 0,2 мл, так и в среднестенных объемом 0,6 мл на амплификаторах Mastercycler classic (Eppendorf, Германия) и Терцик (ДНК-технология, Россия) Полученные фрагменты ПЦР вырезали из геля и выделяли с использованием набора для очистки ПЦР-продуктов (Fermentas, DNA Extraction Kit, Литва) Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США) Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ DNASTAR V3 12 («Lasergen Inc», США) и программы BioEdit 7 0 1 Построение филогенетических дендрограмм осуществляли на основе алгоритма "ближайшего соседа" в рамках 2-параметрической модели M Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 3 0)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Природа мишени, на которую действует лекарственное средство, во многом определяет схему контроля его биологической активности В случае если мишенью действия ЛС является бактериальная или вирусная частица, целесообразность развития новых технологий производства, усовершенствования методов контроля качества и безопасности определяется чувствительностью бактериальной/вирусной частицы к лекарственному средству Учитывая высокую частоту мутаций (особенно в вирусах), мишени лекарственных средств постоянно меняются Современный молекулярно-генетический анализ способен решить целый ряд задач фармацевтической химии - дать информацию об изменениях в структуре поверхностных белков вируса гриппа - мишенях действия лекарственных средств, а также определить чувствительность вируса к ЛС в целях мониторинга их биологической активности

1. Анализ первичной структуры генов М, НА и NA вируса гриппа A(H1N1)

и A(H3N2)

Первым этапом исследования стал подробный анализ имеющихся последовательностей генов М, НА и NA базы данных GenBank и ISD (Influenza Sequence Database) При подборе нуклеотидных последовательностей, обращали внимание на год изоляции и географическую принадлежность штамма Следует отметить, что в базе данных практически отсутствуют последовательности геномов эпидемических штаммов вирусов гриппа, выделенных на территории России и стран СНГ Диапазон времени изоляции штаммов вирусов гриппа А, последовательности которых использовались для подбора олигонуклеотидных

праймеров, совпадал с таковым у эпидемических штаммов анализируемых в работе

Анализ первичной структуры гена М проведенный на основании 40 нуклеотидных последовательностей штаммов обоих подтипов показал высокую гомологию участков, принадлежащих гену М2, что в дальнейшем позволило подобрать пары праймеров универсальные для штаммов вируса гриппа А подтипов H1N1 и H3N2

Подбор праймеров для амплификации участков гена НА и NA, проводили после получения последовательностей гена М2 32-х штаммов Для этого использовали функцию «BLAST» базы данных GenBank с помощью которой, на основании полученных последовательностей гена М2, подбирали штаммы с наиболее схожими генетическими характеристиками по белку М2 Проанализировано 40 последовательностей гемагглютинина вирусов гриппа A(H1N1) и 36 последовательностей вирусов гриппа A(H3N2) Количество отобранных последовательностей для гена нейраминидазы составило 44 и 40 для N1 и N2 соответственно Анализ нуклеотидных последовательностей отобранных штаммов, указал на высокую вариабельность генов двух поверхностных гликопротеидов и четкое разделение на два генотипа гемагглютинина (HI и НЗ) и нейраминидазы (N1 и N2) В дальнейшем нами были подобраны системы праймеров для амплификации каждого из подтипа поверхностных белков

2. Разработка и стандартизация диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для амплификации и определения первичной структуры

генов M2,HAhNA

Для синтеза на матрице вирусной РНК комплементарной ДНК (кДНК) был предложен праймер Uml2 (Hoffman Е, 2001), который является комплементарным 5'-области всех сегментов

Место посадки остальных праймеров подбирали на наиболее консервативные участки, учитывая позиции всех на сегодняшний день известных мутаций-маркеров резистентности к исследуемым противовирусным лекарственным средствам

Седьмой сегмент генома вируса гриппа кодирует два белка, матриксный (Ml) и трансмембранный (М2) Общая длинна сегмента 1027 нуклеотидных оснований (но) из которых сегменту М2 принадлежат 27 но на N-конце, (общие с Ml) и 264 н о на С-конце (Fauquet С М, 2005) Рамка считывания М2 отличается от таковой у Ml Поскольку маркерные мутации устойчивости к адамантанам находятся только в сегменте М2, была подобрана пара праймеров на каждый из сегментов гена М2 прямой (forward) на начало гена (М+1) и обратный (reverse) на конец гена (М-1027) сегмента М2, а также два внутренних праймера - MsegF_mt и MsegR_int Поскольку необходимо было получить нуклеотидные последовательности концов гена М, сиквенс проводили с внутренних праймеров Таким образом, при использовании данной системы праймеров, отдельно амплифицировали 2 отрезка сегмента М2 М+1 - Mseg R_int и Mseg F int - М-1027 (рис 1), сплайсированием которых получали

полный сегмент М2. Поскольку величина амплифицируемых участков гена М2 была невелика, лраймеры подобраны для одностадийной ПЦР.

Рис. 1. Структура седьмого сегмента генома вируса гриппа и стратегия подбора праймеровдля амплификации и секвенирования гена М2

Арбидол - резистентные мутанты имеют аминокислотные замены в положениях 27-117 гемагглютинина (Leneva I.A., 2002), следовательно, были подобраны праймеры для амплификации участка гена НА длинной 550 н.о. для штаммов вируса гриппа A(H1N1), и участка 500 н.о. для штаммов вируса гриппа A(H3N2). На каждый из участков была подобрана своя система праймеров. В качестве прямого праймера для первой амплификации обоих сегментов предложен универсальный праймер Unitail, у которого 3' конец гибридизовался с некодируемой, универсальной для всех вирусов гриппа областью, тогда как 5' конец праймера оставался негибридизованным. Как наиболее оптимальный вариант, отобраны следующие системы «полу-гнездовой» ПЦР (рисунок 2.).

1750 н.о.

-► 4-

Unitail 500_НЗ 4- 550 Н1 1 -я амплификация

10 Hl -► ■*- <- 550 Н1 2-я амплификация

36 нз 500 НЗ

Рис. 2. Стратегия подбора праймеров для амплификации и секвенирования генов гемагглютинина вирусов гриппа А подтипов НШ1 и НЗШ.

Мутации в белке нейраминидазе, придающие вирусу гриппа резистентность к занамивиру и озельтамивиру локализованы в области 119-294 аминокислоты (МсЮтш-ВгевсЫп I., 2003). Было предложено помимо этой области, амплифицировать и начальный участок гена, поэтому, величина получаемого участка гена для обоих подтипов нейраминидазы, составила порядка 1000 нуклеотидов. Стратегия подбора олигонуклеотидных праймеров представлена на рисунке 3.

В ходе оптимизации условий амплификации были проверены различные температурно-временные режимы, из которых оптимальными температурами отжига праймеров оказались: 52°С - для М2 сегмента и 50° для сегментов НА и КА.

1 1400 н.о.

-► А-

Unitail N1 1140

-► N2seg_F ч- — N2_1048 1 -я амплификация

-► ■4-

N1 32 N1 1100 - - 2-я амплификация

N2_31 N2_955

Рис. 3. Стратегия подбора праймеров для амплификации и секвенирования гена нейраминидазы вируса гриппа А подтипов НШ1 и НЗШ

Таким образом, в результате применения разработанных ОТ-ПЦР систем, при проведении электрофореза продуктов амплификации были обнаружены исследуемые сегменты генов М2, нейраминидазы и гемагглютинина как эпидемических штаммов, так и клинических образцов вируса гриппа А(Н1№) и А(НЗШ).

3. Секвенирование генов М2, НА и КА и идентификация мутаций, ответственных за устойчивость к лекарственным средствам

Для ингибиторов М2 белка - адамантанов (амантадина и римантадина) проведена идентификация аминокислотных мутаций гидрофобной области белка, в положениях: 26, 27, 30, 31, 34 (Ве^Ие Я., 1988), которые являются маркерами устойчивости к адамантанам. Анализ аминокислотных последовательностей показал, что штаммы обоих подтипов, которые методом ИФА анализа до начала исследований были охарактеризованы как резистентные (табл.1), содержат основной маркер устойчивости - мутацию БЗШ. Ни одного из других перечисленных маркеров устойчивости не было выявлено. Участки выравнивания аминокислотных последовательностей резистентных штаммов обоих подтипов вируса гриппа представлены на рисунке 4.

£ I»11 ь »пШЯI ЛИ

.'MlJB? Stattet

А/ Носиа/57/06(ВЗН2) А/Каднниград/27/0 6 (КШ) А/Рост-на-Дозу/1/06 (Н382) А/Ставрпмь/2/06 (H3N2) А/МоашаЯ£/07 (H3S2) А/москва/30/07 (В®) А/Москб а/39/07 (H3S2) А/Москва/2/07 (H3N2) А/МосЕва/17/07 (НЗН2) А/НосыиЛг/07 (ЙИ2) А/Носма/27/07(ЕШ) А/Москва/121/07 (аШ.) А/Москва/117/07 (НШ) А/Москва/15/07 (НШ! А/Лнгец1/68/00(НШ)"*

Красным обведена замена S31N - маркер устойчивости к адамантанам; штамм А/Липецк/68/00(НШ1) *** - римантадин чувствительный.

Рис. 4. Аминокислотные последовательности белка М2 римантадин-устойчивых штаммов вируса гриппа А подтипов H1N1 и H3N2

Следующим этапом работы была идентификация маркеров устойчивости к ингибиторам нейраминидазы До настоящего времени на территории Российской Федерации не проводились исследования степени развития резистентности к ингибиторам NA, на фоне лечения Поскольку данные средства представляют собой противогриппозные ЛС последнего поколения, рекомендованные ВОЗ и для лечения людей в случае заражения гриппом птиц (NISC, 2004), такого рода исследования проводятся во всем мире с большим интересом Мировой уровень резистентности к ингибиторам NA до 2008 года среди людей принимавших занамивир или озельтамивир составлял 4-8% (взрослые) и <1% (дети), однако имеются сообщения о довольно высоком показателе резистентности к озельтамивиру при лечении детей в Японии (18%) (McKimm-Breschkin J, 2003) Учитывая изложенное, большой интерес представляло исследование проб, полученных от пациентов 1-й Инфекционной больницы г Москвы, принимавших озельтамивир

Анализ последовательности участка гена кодирующего нейраминидазу исследуемых клинических образцов вируса гриппа А, не выявил наличие мутаций, ответственных за развитие резистентности к ингибиторам NA E119V, R292K, N294S - подтип N2 и H274Y, N294S - подтип N1 (McKimm-Breschin J, 2003) тогда как в последовательности нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа А, выявлено присутствие мутации H274Y в двух штаммах 2008 года А/Москва/3/08(НШ1), и А/Москва/20/08(НШ1) Наши результаты сопоставимы с актуальными данными ВОЗ о неожиданном снижении чувствительности к озельтамивиру среди штаммов A(H1N1), изолированных в начале 2008 года На сегодняшний день средний показатель резистентности среди Европейских стран составляет 20% (п=761), тогда как среди штаммов A(H3N2), снижения чувствительности к озельтамивиру не выявлено (WHO, 2008)

В амплифицируемых участках гена гемагглютинина HI и Н2 исследуемых эпидемических штаммов вируса гриппа А идентифицировали маркеры устойчивости к арбидолу 27, 42, 51, 87 и 117 Ни в одной из полученных последовательностей гемагглютинина, данные замены не найдены.

Таким образом, показано, что единственным маркером резистентности среди 14 римантадин - устойчивых штаммов, изолированных в 2006/2007 году в Российской Федерации, является мутация S31N в белке М2 Впервые на отечественных клинических образцах вируса гриппа А (2007 г) показано отсутствие маркеров устойчивости к ингибиторам NA, тогда как в двух штаммах вируса гриппа A(H1N1) 2008 года выявлено присутствие маркера резистентности к озельтамивиру - мутации H274Y Также, показано, отсутствие известных маркеров устойчивости к арбидолу, что сопоставимо с результатами вирусологических исследований, проводимых в последние годы среди отечественных штаммов (Шевченко Е С , 2005, Бурцева Е И , 2007)

4. Анализ аминокислотной последовательности белков М2, NA и НА и выявление потенциальных маркеров устойчивости к противовирусным лекарственным средствам

Помимо мутаций, являющихся на сегодняшний день маркерами устойчивости к ингибиторам белка М2, нами был проведен анализ всех аминокислотных замен в изучаемых сегментах, в том числе потенциальных -новых маркеров устойчивости к адамантанам Последовательности изученных белков штаммов A(H3N2) более консервативны по сравнению с A(H1N1), для которых характерно большое количество мутаций Следует учитывать, что штаммы A(H1N1) представлены большим интервалом времени (1995-2008г г ) В таблице 1 приведены только те аминокислотные замены в белках М2, NA и НА, которые встречающиеся одновременно с мутацией S31N в римантадин-устойчивых штаммах

При анализе аминокислотной последовательности белка М2, выявлено, что для штаммов вируса гриппа A(H3N2) мутация S31N, совместно встречается с заменой в положении 51 (изолейцин - валгин), что показано на примере 10 резистентных штаммов Для штаммов A(H1N1) замены N20S и S31N, совместны в 3 из 4 случаев

Резистентность к ЛС адамантанового ряда связанна с мутациями аминокислот в трансмембранной области М2 белка (позиции 22-46) (Belshe R 1988) Однако, видно, что мутации совместно встречающиеся с заменой в 31 положении, не находятся в данной области Нами также установлено, что мутации в положениях 35 и 36 (трансмембранная область) характерные для штаммов вируса гриппа A(H1N1) 1998-2000гг не приводят к потере чувствительности к римантадину, что было подтверждено также методом ИФА

О роли и функции С и N терминальных концов белка М2 (места локализации мутаций, совместно встречающихся с S31N) известно мало, однако ученые Pinto Н и Lamb R, в своих работах указывают на незаменимую роль самого длинного участка белка М2 - С терминального конца в функционировании канала Ими показано, что ионные каналы, с отщепленной Г" и более аминокислотой со стороны С терминального конца, после короткого периода не способны выполнять функции ионного транспорта (Lamb R, 2007) Также недавно показано, что мутация C50S, не задерживает транспорт протонов через канал (Kollerova Е, 2007)

Мутации, в исследованных штаммах присутствуют во всех сегментах белка Замены C50S/E88D и S31N также являются сопутствующими в штаммах A(H1N1), однако их присутствие, как в резистентных, так и в чувствительных штаммах не позволяет рассматривать их в качестве потенциальных маркеров резистентности.

Мутации E214G/V234M являются общими для группы штаммов A(H1N1) 2007 и 2008 года, которая включает как римантадин-устойчивые, так и римантадин-чувствительные вирусы гриппа А Отличительной характеристикой штаммов A(H1N1) выделенных в 2008 году является мутация К78Е, которая присутствует во всех 10-ти штаммах данной группы

Таблица 1.

Аминокислотные замены в последовательности М2 белка, нейрамииидазы и гемагглютннина эпидемических штаммов вируса гриппа А подтипа №N2

Штамм подтип Характеристика Мутации

штамма по Ассоциированные с В белке М2 В белке N А В белке НА

результатам резистентностью сопутствующие сопутствующие сопутствующие

ИФА анализа* к римантадину только только только

(М2 белок) мутации S31N мутации .КЗШ мутации S31N

А/Москва/19/07 H1N1 Р S31N N20S Б82Р, ¡ШОК, К217(} 1267М S36N

А/Москва/117/07 Р S31N N20S отсутствуют отсутствуют

А/Москва/124/07 Р S31N N20S 582Р, Я130К К217С? 1267М S36N

А/Москва/27/07 Р S31N отсутствуют 582Р 1Ш0К, 1267М S36N

А/Москва/57/06 H3N2 Р S31N I51V 0931^,Н15(Ж VI941 G50E.TI12V

А/Кал иниград/27/06 Р S31N I51V 177К, 093Ы,Н1501{,У1941 T112V

А/Рост-на-Дону/1/06 Р S31N 151V 177К О'ЛМ III 5СЖ,У1941 TU2V

А/Ставрополь/2/06 Р S31N I51V 177К, 093М,Н150Я,\?1941 T112V

А/Москва/26/07 Р S31N I51V отсутствуют G50E.TU2VK140I

А/Москва/30/07 Р S31N I 51V отсутствуют G50E,T112V

А/Москва/39/07 Р S31N I 51V отсутствуют G50E,TU2V К1401

А/Москва/2/07 Р S3IN I 51V отсутствуют G50E.T112V.K140I

А/Москва/17/07 Р S31N I51V отсутствуют G50E.T112VK140I

А/Москва/72/07 Р S31N I 51V отсутствуют G50ET112V,K140I

* Р - штамм, резистентный к римантадину

При анализе последовательности нейраминидазы исследуемых штаммов вируса гриппа, нами показано, что мутации в положениях 249 и 267 присутствуют в 9 штаммах вируса гриппа A(H1N1), однако, не выявлено их совместное присутствие В исследованиях ВОЗ (Monto A S, 2006), идентифицирован штамм вируса гриппа A(H1N1) с пониженной чувствительностью к занамивиру и озельтамивиру содержащий мутации G249 и 1267 Штаммы, в которых присутствовала одна из этих замен, были чувствительны к обоим JIC

Анализируя аминокислотные последовательности нейраминидазы штаммов резистентных к римантадину, выявлены антигенные дрейфы в гене нейраминидазы, присутствующие только совместно с мутацией S31N S82P/R130K/K217Q/I267M для вирусов гриппа A(H1N1) и H3N2 - I77K/D93N/ H150R/V194I для вирусов гриппа A(H3N2) Группой ученых установлено, что мутация D93N появилась в последовательности NA после замены S31N в белке М2 (Cheng Y, 2007) Следовательно, можно предположить, что и нами установлены S31N сопутствующие мутации, также являются последствием изменений в последовательности белка М2

Результаты изучения аминокислотных замен в последовательности гемагглютинина также указали на различные мутации во всех сегментах белка Мутации R43L, T47I, I57V, S69L, F71I, A80V и T133S являются общими для всех штаммов вируса гриппа A(H1N1) изолированных в период с 2000 по 2008 год Среди них штаммы с различной чувствительностью к ингибиторам белка М2, однако, три штамма из данной группы, устойчивые к римантадину, содержат дополнительную замену - S36N Мутации Т82К и Y94H являются отличительной характеристикой всех штаммов вируса гриппа A(H1N1) изолированных в 2007/2008 году. У штаммов вируса гриппа A(H3N2) наиболее часто встречаются замены G50E и K140I, которые присутствуют во всех штаммах 2007 года, устойчивых к римантадину, а также мутация I112V, которая присутствует со всех 10-ти римантадин устойчивых штаммах

Исследования изменений в поверхностных гликопротеидах римантадин-устойчивых штаммах, стали актуальными особенно в последние годы, когда стало ясно, что замена в сегменте М2, влечет за собой изменения в других сегментах вирусного генома В 2006 году стало известным, что штаммы вируса гриппа A(H3N2) с мутацией S31N в большинстве случаев содержат двойную замену S193F/D225N в последовательности гемагглютинина (Salto R, 2006), однако получение столь отдаленных участков гена не входило в задачи диссертационной работы Полученные нами данные о заменах в последовательности гемаг-иотинина исследуемых штаммов, встречающиеся только совместно с заменой S31N S36N в штаммах вируса гриппа A(H1N1) и G50E/I112V/K140I в штаммах вируса гриппа A(H3N2), также позволяют рассматривать их в качестве антигенной особенности, присущей только штаммам устойчивым к римантадину

До настоящего времени было известно, что римантадин-устойчивые штаммы, с заменой в положении 31 способны свободно циркулировать и

передаваться от человека к человеку Усиление вирулентности в подобных штаммах не было отмечено Однако данные, опубликованные в 2003 году (Shiraishi К, 2003), а также представленные на последней конференции, посвященной возможностям контроля гриппозной инфекцией (Options for the Control of Influenza VI, 2007, Канада) (Cheng Y, 2007) указывают на результаты исследований, в которых римантадин-устойчивые штаммы с мутацией S31N, способны более интенсивно размножаться в культуре клеток

Организация международной сети регистрации чувствительности к ингибиторам нейраминидазы в 1999 году (Neuraminidase Inhibitor Susceptibility Network - NISN) с целью постоянного информирования органов здравоохранения о явлениях лекарственной устойчивости и ее последствиях в результате применения ингибиторов (NISC, 2004), свидетельствует о стратегической важности данной работы Предположения ученых, о том, что NA-резистентные мутанты будут низковирулентны, что снизит возможность их свободной циркуляции, опровергнуты информацией поступившей из ВОЗ в начале 2008 года, об увеличении доли изолированных озельтамивир-устойчивых штаммов вируса гриппа А подтипа H1NI в большинстве стран Европы и США В настоящее время активно ведутся исследования свойств мутаций, возникающих при появлении резистентности к ингибиторам NA - их влиянию на вирулентность и трансмиссивность вируса, а также, исследования с целью выявления причин неожиданного снижения чувствительности к озельтамивиру среди штаммов вируса гриппа A(H1N1) Следует подчеркнуть, что все изолированные в 2008 году озельтамивир-устойчивые штаммы A(H1N1) в странах Европы, являются римантадин-чувствительными (WHO, 2008) Изучение последовательности М2 белка двух нами выявленных озельтамивир-устойчивых штаммов, также установило отсутствие аминокислотной замены в положении 31

По нашему мнению, необходимо продолжение исследований генетических характеристик поверхностных белков вируса гриппа А отечественных штаммов и формирования отечественной базы данных наиболее частых аминокислотных замен Такая информация будет необходима для организации эффективных методов защиты населения при появлении сведений об изменении вирулентных свойств циркулируемых штаммов вследствие присутствия той или иной аминокислотной замены Кроме того, информация об изменениях структур мишеней лекарственных средств, указывает пути создания новых противовирусных лекарственных средств и является важнейшим, базовым этапом систематического контроля биологической активности данных средств

5. Филогенетический анализ исследуемых штаммов

Для подтверждения наших предположений о возможном образовании отдельных филогенетических групп римантадин-устойчивых штаммов, за счет особенностей структуры поверхностных гликопротеидов, нами проведен филогенетический анализ Для этого проведено сравнение аминокислотной

последовательности гемагглютинина и неираминидазы исследуемых эпидемических штаммов и вакцинных штаммов 2007/2008гг и прошлых эпидемических сезонов (рекомендации ВОЗ) В качестве референс-штаммов для гемагглютинина А(Н1) использовали вакцинный штамм сезона 20052006/2006-2007 А/НКаледония/20/1999(НШ1), актуальный вакцинный штамм А/Соломоновы Острова/03/2006(НШ1) и ранее рекомендованный А/Пекин/262/1996 Для эпидемических штаммов А(НЗ№), в качестве референтных предложены А/Калифорния/7/2004/(НЗШ) - вакцинный штамм сезона 2005-2006 г г, А/Висконсин/67/2005(НЗШ) - вакцинный штамм 2006-2007/2007-2008г г и штамм А/Хиросима/52/2005(НЗШ), рекомендованный ВОЗ в качестве референтного, поскольку представляет большую филогенетическую группу (ВОЗ, 2007) На рисунках 5 и 6 представлен филогенетический анализ исследуемых штаммов на основании последовательности нейраминидазы

Результаты филогенетического анализа штаммов вируса гриппа А подтипа НШ1 (рис 5) демонстрируют, разделение штаммов на несколько групп, при этом, главными критерием их формирования является время изоляции и чувствительность к римантадину Видно разделение штаммов на 4 подгруппы штаммы 1995 года, штаммы 1998 года, группа штаммов 2000/1998г, близкая по структуре с эталонным штаммом А/Н Каледония/20/1999 и группа штаммов 2007/2008 года, включающая римантадин-устойчивые (2007г), римантадин-чувствительные (2008г) и озельтамивир-устойчивые (2008г) штаммы

А/МоскваЛ 6ДВ/СЫ1) А/МосигаЛ7/ОВ(т) А/Москва/15Я8(М1) А/КалининградДМЭВ^ 1) А/Москва/2ЛЮ(М) А/Москва/19ЛВГЬт А/Москва/1ЛВ(М1) 1А/МоавлСЯ8(1М1) А/Моске •ЛОЩМЧ)

- А/Новая Каледония/20ЛЭ9(К|1)

I-уповая гчаледония

—Г-А/Липец>аеаоо(М1)

1 А/Липецк/71ЛО(М1) — А/МоскваЛ7Я8(Ж)

~АУМосква/117/07(Ж)

_| А/Мо скваЛ 9,07 (Ы1)

-Г А/МоскваЛ24Я7(М1) 1-АУМосква/27Я7(Ы1)

4В_

| А/Москва/1/95(ГЧ1) 1 А/Москва/3/Э5(М) А/Москва/4/Э5(Ы1)

АЛИосква/ада(Ы1)

А/Мос>®а«Я8(М1)

А/МосквгиВ«8(т)

А/МоскваЯ®3(М1)

А/Мос>сва/11/90(Ы1)

А/Новгорад/ЗЗЯ8(Й1)

Аминокислотные замены (х100)

Штаммы выделенные синим цветом - устойчивые к римантадину, красным цветом - устойчивые к озельтамивиру

Рис. 5. Филогенетические дендрограммы, построенные на основе аминокислотных последовательностей белка NA1 исследуемых эпидемических штаммов А(НШ1)

Построение филогенетических дендрограмм на основании аминокислотной последовательности гемагглютинина показало, что референтный штамм А/Новая Каледония/20/1999(НШ1) по генетическим характеристикам наиболее близок к штаммам 2000 года, тогда как, актуальный вакцинный штамм А/Соломоновы Острова/03/2006(НШ1) вместе с римантадин-устойчивыми и римантадин-чувствительными штаммами 2007/2008 года имеет тенденцию к формированию отдельной филогенетической группы

Аминокислотные замены (х100) о

Штаммы, выделенные синим цветом - устойчивые к римантадину Рис. 6. Филогенетические дендрограммы, построенные на основе аминокислотных последовательностей белка NA2 исследуемых эпидемических штаммов А(НЗШ)

Как видно на рис 6, сравнение аминокислотной последовательности нейраминидазы подтипа N2 показало, что все римантадин-устойчивые штаммы 2007 года и римантадин-чувствительные штаммы 2006 г формируют единую структуру, не имеющую близких свойств с вакцинными штаммами как нынешнего, так и прошедших эпидемических сезонов

Наиболее близкими свойствами вакцинному штамму А/Висконсин/67/2005(НЗ№) обладали римантадин-устойчивые штаммы 2006 года Нами установлено, что штамм А/Висконсин/67/2005(НЗН2) является римантадин-устойчивым По результатам сравнения последовательности гемагглютинина штаммов вируса гриппа А(НЗК2), римантадин - устойчивыми штаммами 2006 года отдельную группу формируют, с которыми все три референтных штамма имеют наиболее близкие антигенные свойства

Результаты определения сходства антигенных характеристик отечественных эпидемических штаммов сезона 2006-2007 г г с актуальными вакцинными штаммами (представленные в документе МЗ Российской Федерации «Об итогах эпидсезона по гриппу и ОРВИ в 2006-2007 гг и прогнозе на сезон 2007-2008 гг»), сопоставимые с результатами наших исследований По нашему мнению, включение специалистами ВОЗ

римантадин-устойчивого штамма в состав противогриппозной вакцины для северного полушария в течение последних двух эпидемических сезонов, является очередным свидетельством прогрессирующего увеличения популяции данных штаммов во всем мире, в первую очередь среди штаммов вируса гриппа А подтипа НЗЫ2 Таким образом данная последовательность белка М2 все больше закрепляется на генетическом уровне штаммов обоих подтипов, приводя к изменениям в различных сегментах генома с тенденцией формирования собственных филогенетических структур

ВЫВОДЫ

1 Разработан и стандартизирован состав диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для определения первичной структуры генов М2, гемагглютинина и нейраминидазы вирусов гриппа А(НШ1) и А(НЗ№) в целях контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов Н1 и НЗ к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу

2 Все римантадин-резистентные штаммы вируса гриппа А в последовательности белка М2 содержат мутацию серин/31/аспарагин, а также, впервые выявленные сопутствующие мутации изолейцин/51/валин (у 100% штаммов А(НЗЫ2)) и аспарагин/20/серин (у 75% штаммов А(Н1Ш))

3 Впервые среди отечественных штаммов идентифицирована маркерная мутация резистентности к озельтамивиру - замена гистидин/274/тирозин в последовательности нейраминидазы эпидемических штаммов А/Москва/3/08 и А/Москва/20/08 Все штаммы являются занамивир-чувствительными

4 В римантадин-устойчивых эпидемических штаммах выявлены мутации в последовательности нейраминидазы, сопутствующие замене БЗШ 882Р/Ш30К/К217С>/1267М, в штаммах А(НШ1) и 177КЯ)93К/ Н150Я/У1941 в штаммах А(НЗ№)

5 Выявлены аминокислотные замены в последовательности гемагглютинина, сопутствующие замене 83 Ш в римантадин-устойчивых штаммах БЗбК в штаммах А(Н1№) и 050Е/1112У/К1401 в штаммах А(НЗ№) Все штаммы являются арбидол-чувствительными

6 Филогенетический анализ эпидемических штаммов с использованием последовательностей нейраминидазы и гемагглютинина показал, что актуальный вакцинный штамм А/Соломоновы Острова/03/2006(НШ1) и римантадин - устойчивые штаммы А(НШ1) 2007 г формируют отдельную филогенетическую структуру Римантадин - устойчивые штаммы 2006 года обладают наиболее близкими свойствами к актуальному вакцинному штамму А/Висконсин/67/2005(НЗЫ2)

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гребенникова Т В , Киреев Д Е, Аканина Д С, Ротанов М, Львов Д К. Молекулярно-генетический анализ вируса гриппа А // Материалы международной научно-практической конференции "Молекулярная диагностика инфекционных болезней", 17-18 мая 2007 г., Минск - С 12-13

2 Rotanov М, Grebennikova Т, Shevchenko Е Burtseva Е Detection of Rimantadine-Resistant Variants among Human Influenza A Viruses Isolated in Russia // Book of abstracts of the Conference For Young Scientists, PhD Students and Students on Molecular Biology and Genetics, 20-22 September 2007, Kyiv - P 186

3 Ротанов M, Гребенникова T В , Плетенева T В Генетический анализ эпидемических штаммов вируса гриппа А с различной чувствительностью к ремантадину // Материалы 6-й международной научной конференции студентов и молодых ученых Журнал РАСМИРБИ - 2007 - № 2(22) - С 48-49

4 Ротанов М , Гребенникова Т В , Плетенева Т В , Бурцева Е И, Шевченко ЕС Аминокислотная последовательность гена М2 белка вируса гриппа А, с различной чувствительностью к ремантадину // Сборник материалов Всероссийской научно - практической конференции "Современные проблемы судебно - химических и химико-токсикологических экспертных исследований" 31 октября -1 ноября 2007г, Москва - С 272-274

5 Ротанов М, Гребенникова Т В , Бурцева Е И, Шевченко Е С Молекулярно-генетический анализ эпидемических штаммов вируса гриппа А характеризующихся различной чувствительностью к римантадину, на основе нуклеотидной последовательности М2 белка // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия -2007 -№4 - С 369-374

6 Ротанов М, Гребенникова Т В , Бурцева Е И, Шевченко Е С Молекулярно-генетический анализ эпидемических штаммов вируса гриппа А, на основе нуклеотидной последовательности генов М2 и нейраминидазы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология — 2008 - № 2 - С 2732

7 Колобухина Л В , Меркулова Л Н, Бурцева Е И, Исаева Е И, Щелканов М Ю, Белякова Н В , Гребенникова Т В , Поликушина О.Э, Ротанов М, Малышев Н А, Львов Д К Эффективность озельтамивира (Tamiflu™) при гриппе у взрослых во время эпидемического подъема заболеваемости в России в сезоне 2006-2007 г г // Вопросы вирусологии - 2008 - № 4 - в печати

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ак - аминокислота

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ЛС - лекарственное средство

М1 - матриксный белок

М2 - трансмембранный белок

но - нуклеотидное основание

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФСП - фармакопейная статья предприятия

НА - гемагглютинин

ЫА - нейраминидаза

АМИНОКИСЛОТЫ

Краткое обозначение Название Краткое обозначение Название

А аланин Ь лейцин

II аргинин К лизин

N аспарагин М метионин

П аспарагиновая кислота Р фенилаланин

С цистеин Р пролин

Е глутаминовая кислота серин

О глутамин Т треонин

С глицин \У триптофан

Н гистидин У тирозин

I изолейцин V валин

Ротанов Марина (Сербия). Контроль чувствительности штаммов вируса гриппа А к противовирусным лекарственным средствам

В работе представлены результаты молекулярно-генетического анализа 51-го штамма вируса гриппа А, изолированных на территории Российской Федерации в период с 1995 по 2008 год Анализ проводили на основе последовательностей белка М2, нейраминидазы (NA) и гемагглютинина (НА) Разработана и стандартизована ОТ-ПЦР система для амплификации и определения последовательности исследуемых сегментов в местах локализации всех известных на сегодняшний день маркерных мутаций резистентности к лекарственным средствам, применяемым для лечения гриппа блокаторам белка М2, ингибиторам NA и арбидолу, в целях постоянного контроля их биологической активности Установлено, что во всех римантадин - устойчивых штаммах, вместе с основным маркером резистентности - мутацией S31N в белке М2, данную группу штаммов, характеризуют уникальные аминокислотные замены, присутствующие только совместно с заменой S31N во всех поверхностных белках М2, нейраминидазе и гемагглютинине Анализ последовательности нейраминидазы обоих подтипов вируса гриппа не выявил присутствие известных маркерных мутаций резистентности к арбидолу, тогда как мутация H274Y - маркер устойчивости к озельтамивиру идентифицирована в двух штаммах 2008 года Структурные особенности поверхностных белков исследуемых штаммов в сравнительном аспекте продемонстрированы путем филогенетического анализа

Rotanov Marina (Serbia). Control of the Influenza A Virus Susceptibility to Antiviral Drugs

Presented are results of molecular and genetic analysis of 51 Influenza A virus strains, isolated in the Russian Federation dunng period 1995-2008 Analysis was performed on Influenza A neuraminidase (NA), hemagglutinin (HA) and M2 protein gene sequences RT-PCR system was established and standardized in order to amplify and determine the sequence of tested gene segments, identify mutations conferring resistance to antiviral drugs used in treatment of Influenza (M2 protein blockers, NA inhibitors and Arbidol) and enable permanent monitoring of their biological activity

Analysis of registered nucleotide sequences in the M2 protein gene of rimantadine-resistant variants resulted m identification of the mam resistance-marker for M2 protein blockers S3 IN mutation Apart from this, all rimantadine-resistant variants were characterized by unique ammoacid substitutions, associated with S3 IN mutation in all surface proteins M2, neuraminidase and hemagglutinin All virus hemagglutinin - segment sequences failed to display any ammoacid substitutions known to cause resistance to arbidol, while two epidemic strains isolated in 2008 manifested H274Y mutation, known as marker conferring resistance to oseltamivir Structural features of surface proteins in tested strains were demonstrated comparatively by means of phylogenetic analysis.

Подписано в печать 20 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 438 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ш

Грипп, в течение долгих лет продолжает оставаться одной из наиболее актуальных медицинских и социальных проблем, вследствие способности распространяться по всему миру и поражать широкий круг хозяев [WHO, 2003].

Значение химиопрофилактики и химиотерапии в надзоре за распространением гриппозной инфекции, трудно переоценить, особенно в целях своевременной защиты населения в экстренных эпидемических ситуациях > [Бектимиров Т., 2003; Ленева И.А., 2004, 2006].

Исследование и разработка методов анализа лекарственных средств (JIC) в биологических объектах, а также совершенствование методов оценки качества Л С для обеспечения их максимальной терапевтической эффективности и безопасности является одной из главных задач фармацевтической химии [Арзамасцев А.П., 2004, 2008].

На сегодняшний день, помимо вакцинации, для лечения и профилактики гриппа Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) рекомендованы 2 группы ЛС: блокаторы белка М2 (амантадин и римантадин) и ингибиторы нейраминидазы (занамивир и озельтамивир) (WHO, 2004). В нашей стране широкое распространение получил отечественный лекарственный препарат арбидол. Долгий период применения лекарственных средств адамантанового ряда, привел к резкому падению чувствительности вируса к данной группе средств [Deyde V.M., 2007; Xu X., 2007]. Исследования, проведенные среди эпидемических штаммов вирусов гриппа А в Российской Федерации, также свидетельствуют о прогрессирующем увеличении в популяции числа римантадин-устойчивых штаммов [Burtseva E.I., 2007]. В начале 2008 года, по данным ВОЗ, впервые зарегистрировано значительное снижение чувствительности и к озельтамивиру среди штаммов вируса гриппа A(H1N1) [WHO, 2008].

Изучение молекулярных и генетических характеристик штаммов вируса гриппа, циркулирующих во всем мире, является основным звеном системы мониторинга как эволюционных изменений в геноме вируса, так и чувствительности к противовирусным лекарственным средствам. Мутации, являющиеся маркерами устойчивости к противовирусным ЛС, представляют интерес не только с точки зрения генетического признака позволяющего идентифицировать резистентный штамм, но и новой генетической особенности штамма, способной влиять на вирулентные и репродуктивные свойства вируса. Среди эпидемических штаммов, циркулирующих в Российской Федерации, молекулярно-генетический анализ до сих пор не используется как метод регулярного контроля чувствительности к противовирусным лекарственным средствам. Статистические показатели, анализ научной литературы, собственные наблюдения показывают, что такая информация необходима для системного контроля биологической активности противовирусных лекарственных средств и является важнейшим! этапом разработки эффективной тактики борьбы, как с известными, так и новыми штаммами вируса гриппа. При этом попытка создания эффективной молекулярной тест-системы для амплификации генов, кодирующих мишени основных противогриппозных лекарственных средств, с целью идентификации маркеров резистентности, представляется своевременной и чрезвычайно актуальной.

Цель и задачи! исследования.

Целью данной работы являлась разработка и стандартизация диагностических тестов для контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов HI и НЗ, выделенных на территории Российской Федерации (19952008г.) к основным противовирусным лекарственным средствам.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести анализ первичной структуры генов М2, гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) вируса гриппа А, подтипов HI и НЗ на основе генетической базы данных NCBI (National Centre for Biology Information) и осуществить подбор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования генов, кодирующих белки М2, НА и NA.

2. Разработать и стандартизировать состав диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для определения первичной структуры генов М2, НА и NA вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) в целях контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов HI и НЗ к основным противовирусным лекарственным средствам.

3. Секвенировать гены М2, НА и NA эпидемических штаммов гриппа А, подтипов Н1 и НЗ разных лет, а также ген NA из клинических образцов, полученных от пациентов, принимавших озельтамивир.

4. На основе анализа полученных нуклеотидных последовательностей эпидемических штаммов гриппа А, идентифицировать в белках М2, НА и NA мутации, ответственные за устойчивость к лекарственным средствам.

5. Выявить новые - потенциальные маркеры устойчивости к противовирусным лекарственным средствам.

6. Охарактеризовать исследуемые эпидемические штаммы вируса гриппа А с помощью филогенетического анализа.

Научная новизна.

Впервые представлена подробная молекулярно-генетическая характеристика эпидемических штаммов вируса гриппа А подтипов H3N2 и H1N1, изолированных в Российской Федерации (1995-2008 г.г.). На примере 42-х эпидемических штаммов проведен анализ известных и новых мутаций, связанных с резистентностью к лекарственным средствам, которые применяются в терапии гриппозной инфекции: блокаторы белка М2 (амантадин и римантадин), ингибиторы нейраминидазы (занамивир и озельтамивир) и арбидол.

Разработаны. и апробированы эффективные ОТ-ПЦР системы для амплификации и определения нуклеотидной последовательности гена М2 белка и участков генов нейраминидазы и гемагглютинина в которых локализованы маркерные мутации устойчивости к противовирусным JIC.

В результате проведенных исследований установлено, что во всех римантадин - устойчивых штаммах, вместе с основным маркером резистентности -мутацией S31N в М2 белке, данную группу штаммов, характеризуют уникальные аминокислотные замены, присутствующие совместно с заменой S31N во всех поверхностных белках: М2, нейраминидазе и гемагглютинине. Структурные особенности поверхностных белков исследуемых штаммов продемонстрированы путем филогенетического анализа, где главными критерием организации отдельных филогенетических групп являлись время изоляции штамма и чувствительности к римантадину.

Впервые показано, что исследуемые штаммы не содержат изменений в гемагглютинине, которые указывают на снижение чувствительности к отечественному лекарственному препарату - арбидолу. Также, впервые, на отечественных эпидемических штаммах, а и клинических образцах вируса гриппа А, полученных от пациентов 1-й Инфекционной больницы г. Москвы принимавших озельтамивир, проведена идентификация маркеров устойчивости к ингибиторам нейраминидазы. Основной маркер устойчивости к озельтамивиру — мутация H274Y выявлена в двух эпидемических штаммах A(H1N1) 2008 года.

Впервые подготовлен проект отечественной фармакопейной статьи па диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса, являющейся основой для стандартизации и оценки эффективности противовирусных лекарственных средств.

Практическая значимость.

Созданные ОТ-ПЦР системы для амплификации и определения ' нуклеотидной последовательности генов, кодирующих синтез белков: М2, нейраминидазы и гемагглютинина, используются в работе Национального центра по гриппу, (г. Москва, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН) для проведения мониторинга чувствительности отечественных эпидемических штаммов гриппа А подтипов H3N2 и H1N1 к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.

Разработан проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на диагностическую тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для выявления маркеров устойчивости к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в геноме вирусов гриппа А.

Созданные молекулярные тест-системы используются для выяснения характеристик отечественных эпидемических штаммов 2008 года в связи с подъемом резистентности к ингибиторам NA в рамках международного сотрудничества ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, РАМН с Всемирной Организацией Здравоохранения.

Положения, выносимые на защиту. 1. Возможность разработки и стандартизации диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для амплификации и определения нуклеотидной последовательности генов, кодирующих белки М2, нейраминидазу и гемагглютинин вируса гриппа А подтипов H3N2 и H1N1 и последующей идентификации маркерных мутаций резистентности к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в целях контроля их биологической активности.

2. Возможность выявления- и характеристики- мутаций эпидемических штаммов гриппа А подтипов H3N2 и H1N1, изолированных в Российской- Федерации за период с 1995 по 2008 год и идентификация маркеров резистентности к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.

3. Возможность идентификации маркеров резистентности к ингибиторам нейраминидазы в клинических пробах 2007 года, полученных от больных в процессе применения озельтамивира.

4. Сравнительный филогенетический анализ эпидемических штаммов гриппа А подтипа H3N2 и H1N1, на основании аминокислотной последовательности гемагглютинина и нейраминидазы.

5. Проект ФСП на диагностическую-тест-систему на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для выявления маркеров устойчивости к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу в геноме вирусов гриппа A(H3N2) и A(H1N1).

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Молекулярная диагностика инфекционных болезней» (Минск, Белоруссия, 2007 г.), на Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2007 г.). В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании кафедры Фармацевтической и токсикологической химии РУДН 21. февраля 2008 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 5 тезисов.

Объем'и структура диссертации.

Материалы изложены на 152 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 222 источника, из них 43 отечественных и 179 зарубежных авторов. Работа содержит 17 таблиц и 17 рисунков.

V выводы

1. Разработан и стандартизирован состав диагностической системы на основе ОТ-ПЦР и сиквенса для определения первичной структуры генов М2, гемагглютинина и нейраминидазы вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) в целях контроля чувствительности штаммов вируса гриппа А подтипов Н1 и НЗ к блокаторам белка М2, ингибиторам нейраминидазы и арбидолу.

2. Все римантадин-резистентные штаммы вируса гриппа А в последовательности белка М2 содержат мутацию серин/31/аспарагин, а также, впервые выявленные сопутствующие мутации: изолейцин/51/валин (у 100% штаммов A(H3N2)) и аспарагин/20/серин (у 75% штаммов A(H1N1)).

3. Впервые среди отечественных штаммов идентифицирована маркерная мутация резистентности к озельтамивиру - замена гистидин/274/тирозин в последовательности нейраминидазы эпидемических штаммов А/Москва/3/08 и А/Москва/20/08.

4. В римантадин-устойчивых эпидемических штаммах выявлены мутации в последовательности нейраминидазы, ' сопутствующие замене S31N: S82P/R130К/К217Q/I267M, в штаммах A(H1N1) и I77K/D93N/ H150R/V194I в штаммах A(H3N2).

5. Выявлены аминокислотные замены в последовательности гемагглютинина, сопутствующие замене S31N в римантадин-устойчивых штаммах: S36N в штаммах A(H1N1) и G50E/I112V/K140I в штаммах A(H3N2).

6. Филогенетический анализ эпидемических штаммов с использованием последовательностей нейраминидазы и гемагглютинина показал, что актуальный вакцинный штамм А/Соломоновы Острова/03/2006(НШ1) и римантадин - устойчивые штаммы A(H1N1) 2007 г. формируют отдельную филогенетическую структуру. Римантадин - устойчивые штаммы 2006 года обладают наиболее близкими свойствами к актуальному вакцинному штамму A/Bhckohchh/67/2005(H3N2).