Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Эпидемиологический мониторинг за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц

На правах рукописи

Шипулин Герман Александрович

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ЗА ЦИРКУЛЯЦИЕЙ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ

14 00 30 - эпидемиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

111111К11111111111П

□03166515

Москва - 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора и в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»)

Научные руководители:

академик РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор

доктор биологических наук, профессор

Покровский Валентин Иванович Обухов Игорь Леонидович

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ковалева Елена Петровна Селькова Евгения Петровна

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Российская медицинская

академия последипломного образования» Росздрава

Защита состоится 2008 г в часов на заседании

диссертационного совета Д 208 114 01 в ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (111123, Москва, ул. Новогиреевская, За)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Автореферат диссертации разослан "д?/" /72008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Горелов Александр Васильевич

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Активный эволюционный процесс в некоторых группах возбудителей инфекций в сочетании с активизацией миграционных потоков в человеческих популяциях создает предпосылки для возникновения и глобального распространения инфекционных болезней. В настоящее время значительную обеспокоенность вызывает распространение в мире эпизоотий высокопатогенного вируса гриппа птиц Впервые эта проблема привлекла всеобщее внимание в 1997 году, когда масштабная эпизоотия высокопатогенного гриппа в Гонконге была приостановлена только выбраковкой всей популяции птиц. С тех пор по всему миру неоднократно регистрировались эпизоотии гриппа у домашних и диких птиц, при которых отмечались также случаи инфицирования млекопитающих и человека Наиболее значительная эпизоотия была зарегистрирована в 2003-2004 гг в странах Юго-Восточной Азии, когда в течение нескольких месяцев было уничтожено более 100 миллионов голов домашней птицы В этот же период отмечались случаи заболевания птиц гриппом в Италии, Голландии, Бельгии и Германии За время этих вспышек было уничтожено около 50 миллионов голов домашней птицы С мая 2005 года в странах Юго-Восточной Азии началась новая эпизоотия, вызванная высокопатогенным вирусом гриппа А субтипа Н5Ш, которая затем распространилась по территории Казахстана, России, Украины, Азербайджана и ряда Европейских стран

До 1997 года считалось, что вирусы гриппа птиц не опасны для людей, так как в случае непосредственного контакта человека с инфицированной птицей регистрировались лишь редкие случаи инфицирования людей с клинической картиной конъюнктивита или легких форм ОРЗ Однако во время эпизоотий в Гонконге в 1997 г, Таиланде и Вьетнаме в 2003-2004 гг, во Вьетнаме в 2005 г было показано, что вирус гриппа птиц может вызывать у людей тяжелые формы пневмонии с летальным исходом По данным ВОЗ с декабря 2003 г. по 11 марта 2008 г в ряде стран мира (Азербайджан, Камбоджа, Китай, Джибути, Египет, Индонезия, Ирак, Лаос, Нигерия, Таиланд, Турция, Вьетнам) зарегистрировано 372 лабораторно подтвержденных случая инфицирования людей вирусом гриппа птиц А/Н5Ш, из них у 235 заболевание привело к летальному исходу

Глобальное распространение высокопатогенного вируса гриппа птиц, а также возрастание числа людей, инфицирующихся при контакте с заболевшей птицей, заставило ВОЗ в 2005 выработать план подготовки к возможной пандемии В настоящий момент, по мнению экспертов ВОЗ, мы находимся в фазе 3 пандемического процесса, что требует от каждого государства выстраивания своих собственных планов действий на случай возникновения эпидемии

Опыт борьбы с гриппом птиц, накопленный за последние 10 лет, показал, что для разработки и проведения эффективных противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий необходимо построение системы постоянного мониторинга за циркуляцией вируса гриппа, основанной на использовании лабораторных методов точной и быстрой идентификации и характеристики циркулирующих штаммов вируса гриппа А, с целью определения их генетического родства, степени патогенности и выявления мутаций резистентности к противовирусным препаратам Среди методов лабораторной диагностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) Главными преимуществами ПЦР в сравнении с методами культурального подхода являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для персонала При сравнении с серологическими методами ПЦР существенно выигрывает, поскольку позволяет выявлять вирусы гриппа на самых ранних стадиях инфекции, задолго до появления антител, что дает возможность лечащим врачам и врачам-эпидемиологам начать своевременное лечение и проведение противоэпидемических мероприятий Кроме явных диагностических преимуществ, метод ПЦР, дополненный методом секвенирования ДНК, является универсальным молекулярно-генетическим подходом к определению большинства биологических свойств вирусов гриппа птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность противовирусной терапии

В связи с вышесказанным целью исследования являлось создание системы эпидемиологического мониторинга за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц на основе разработанных нами тест-систем для молекулярной диагностики и генотипирования

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1 Разработать и стандартизовать диагностические наборы на основе ПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А и идентификации наиболее значимых субтипов вируса гриппа птиц

2 Разработать молекулярно-генетические методики для выявления маркеров патогенности, устойчивости к противовирусным препаратам, а также для установления степени родства штаммов вируса гриппа птиц

3 Провести молекулярно-генетический анализ маркеров патогенности и адаптации к организму человека штаммов вируса гриппа птиц, циркулировавших во время эпизоотии гриппа у диких и домашних птиц 2005-2007 гг в России и в странах СНГ

4 Определить генетические маркеры устойчивости к противовирусным препаратам штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц, циркулировавших в России и в странах СНГ

5 На основе разработанных молекулярно-генетических тест-систем и методик охарактеризовать эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию в очагах птичьего гриппа в России

Научная новизна

На основе разработанных нами тест-систем для диагностики и методик для генотипирования создана система эпидемиологического мониторинга на молекулярном уровне за циркуляцией высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц

Впервые в России разработаны ПЦР тест-системы для выявления и дифференциации штаммов вирусов А/Н5Ы1 и А/Н7, обладающие высокой аналитической чувствительностью (5*103 гэ/мл в варианте электрофоретической детекции, 1*103 гэ/мл в варианте флуоресцентной детекции) и 100% специфичностью

Проведен молекулярно-генетический анализ родства штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц, циркулировавших на территории России и сопредельных государств в июле 2005 г - феврале 2007 г, что позволило определить географическое положение очагов инфекции, из которых в июле 2005 г. и в феврале 2007 г происходил занос на территорию России вирусов высокопатогенного гриппа птиц, а также определить связь штаммов циркулировавших на территории России со штаммами, вызвавшими заболевания у людей и животных в ряде стран СНГ.

Разработаны молекулярно-генетические методики для оценки потенциальной патогенности и вирулентности вируса гриппа птиц для домашней птицы, млекопитающих и человека, а также для определения его устойчивости к противовирусным препаратам

Обнаружен и охарактеризован штамм вируса А/Н5Ш, имеющий мутацию, обусловливающую его устойчивость к озельтамивиру («Тамифлю»), препарату, используемому для профилактики и лечения птичьего гриппа у людей

Практическая значимость работы

В результате проведенного исследования установлено, что разработанные нами методы молекулярно-генетического мониторинга за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц позволяют1

• оценить эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию по птичьему гриппу в России и ряде стран СНГ,

• своевременно провести адекватные профилактические и противоэпидемические мероприятия, направленные на

предотвращение распространения заболеваемости птичьим гриппом в России,

• выявить эпидемиологические связи циркулирующих в России штаммов

высокопатогенного вируса гриппа со штаммами сопредельных стран Внедрение в практику

Разработаны и внедрены в ветеринарную практику и систему санэпиднадзора тест-системы «ГРИПП» (Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных № ПВР-1-3 5/01553 от 14 марта 2006 года Сертификаты соответствия за № РОСС RU ФВ01 В14500 от

13 04 2006 и за № РОСС БШФВ01В14513 от 13 04 2006) и «АмплиСенс Influenza virus Н5» (Регистрационное удостоверение № JIC-001511 от

14 04 2006, Сертификат производства МИБП № 000592, ФСП 42-0115-7239-05) для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции

На базе ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора было аттестовано производство тест-систем «ГРИПП» (аттестат №1167 выдан 1 февраля 2006 г) и сертифицировано производство тест-системы «АмплиСенс Influenza virus Н5» (сертификат №894 выдан 31 марта 2006г.) В рамках Государственного заказа тест-системы поставляются в региональные и районные ветеринарные Центры для проведения мониторинга за гриппом птиц на территории России

Результаты выполненной работы вошли в Методические Указания по лабораторной диагностике гриппа птиц у людей МУК 4 2 2136 - 06 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей» Апробация материалов диссертации Материалы диссертационной работы доложены

- на заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» и ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Москва, 2003-2007 гг ),

- на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г ),

- VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2005 г ),

- на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005 г ),

- на совместном заседании президиума РАСХН и РАМН «Итоги выполнения совместного Постановления от 14 апреля 2005 г по проблеме «Грипп А -непредсказуемый и социально опасный зооноз» (Москва, 2005 г ),

- на Международной конференции по инфекционным болезням (1СЕГО) Общества микробиологов (Атланта (США), 2006 г);

- на международной научно-практической конференции «Высокопатогенный грипп птицы актуальные аспекты эпизоотологии, эпидемиологии, диагностики и профилактики» (Судак, АР Крым (Украина), 2006 г),

- на международных семинарах-совещаниях специалистов стран СНГ по проблеме гриппа птиц (Новосибирск, 2006 и 2007 гг),

- на международной конференции «Готовность к пандемии гриппа, международная оценка» (Санкт-Петербург, 2007 г),

- на IX конгрессе Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г)

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения и приложение Диссертация иллюстрирована 54 рисунками и 47 таблицами Список литературы содержит 87 источников, в тч 81 зарубежных авторов

Содержание работы

Материалы и методы исследования. В работе использовали следующие штаммы изолятов микроорганизмов штаммы вируса гриппа А, выделенные от животных А/черноголовый хохотун/Астрахань/1421/79 (ШЗШ), А/индюк/Висконсин 1/66 (Н9Ш), А/индюк/Онтарио/6118/69 (Н8Ж), А/утка/Германия/1215/73 (Н2ЫЗ), А/утка/Чехословакия/56 (Н4К6), А/утка/Англия/56 (Н1Ш6), А/утка/Альберта/60/76 (Н12К5),

А/утка/Украина/1/63 (НЗШ), А/утка/Альберта/35/76 (НШ1), А/индюк/Массачусетс/3740/65 (Н6Ш), А/цыпленок/Германия/49 (Н10М7), А/крачка/Ю Африка/61 (Н5Ш), А/утка/вирус чумы птиц/Росток/34 (Н7Ш), А/свинья/1976/31(НБ\V1N1), А/утка/Потгсдам/1402-6/86 (Н5Ы2), штаммы вируса гриппа А, выделенные от человека. А/Кумамото/102/2002 (НЗИ2), А/Ленинград/549/80(Н2Ш), А/Киев/3304/84 (НОШ), А/Гонконг/03 (Н5Ш), А/Новая Каледония/20/99 (НШ1), А/Гонконг/1073/99 (Н9Ы2), штамм вируса гриппа В - В/Токио/53/2000, штаммы других возбудителей инфекционных болезней птиц реовирус, вирус инфекционного бронхита кур (ИБК «Чапаевский», ИБК МВА-6, ИБК Н-120, ИБК АМ, М-4), парамиксовирусы 1 и 2 типов, вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус болезни Марека, вирус

болезни Гамборо, Mycoplasma gallisepticum, штаммы аденовируса человека - 3, 5, 6, 7, 37,40 типов, штамм респираторно-синцитиального вируса «Лонг» тип А, штамм вируса парагриппа 1 (Сендай), 2 и 3 типов, штаммы бактериальных возбудителей ОРЗ человека Haemophilus influenzae тип В, Streptococcus spp, Staphylococcus aureus, Legionella pneumophila, клинические изоляты коронавирус человека групп ОС43 и Е229, респираторно-синцитиальный вирус тип А и В, вирус парагриппа тип 1-4, риновирус тип 1В и 2, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae Штаммы предоставлены ГИСК им Л А Тарасевича и ФГУ ВГНКИ

В процессе работы исследован материал от здоровых птиц

- 30 образцов - помет, трахеальные смывы, мазки из клоаки, гомогенаты внутренних органов,

- 19 образцов из ГНУ МНТЦ «Племптица» РАСХН, Омская обл, 2005 г,

- 1498 образцов из 155 птицефабрик Архангельской, Астраханской, Белгородской, Брянской, Владимирской, Вологодской, Ивановской, Калужской, Кировской Костромской, Курской, Московской, Мурманской, Нижегородской, Омской, Оренбургской, Пензенской, Пермской, Ростовской, Рязанской, Самарской, Смоленской, Тамбовской, Тверской, Тульской, Ярославской областей, Ставропольского края, Санкт-Петербурга и республик Башкортостан, Кабардино-Балкария, Карелия, Коми, Марий Эл, Мордовия, Татарстан, Чувашия, собранные за 2005 год,

- мазки из клоаки от 5 диких перелетных птиц (скворец - 2 обр, удод, каменка-плясунья, дрозд), отловленных с целью кольцевания и мониторинга в апреле 2006 г Красноярского района Астраханской области,

- образцы (трахеи и мазки из клоаки) от 20 диких перелетных птиц (лебедь-шипун - 3 обр, красноголовый нырок - 3 обр, пеганка - 3 обр, кряковая утка - 2 обр , чайка озерная - 2 обр, чайка серебристая - 2 обр , лысуха, кулик, луток, цапля белая, чирок-трескунок - по одному образцу), отстрелянных с целью мониторинга в марте 2006 г. в Наримановском, Икрянинском, Камызякском районах Астраханской области Исследован материал от людей

- мазки из носоглотки взрослых доноров - 50 образцов,

- мазки из носоглотки детей без симптомов ОРЗ - 30 образцов,

- аутопсийный материал трахеи детей с симптомами ОРЗ -10 образцов

Исследовано 209 образцов материала от больной и павшей птицы

- 183 образца помет, мазки из клоаки и внутренних органов из частных хозяйств Сибирского федерального округа и Тульской области (д Яндовка), собранный во время эпизоотии 2005 года,

- образцы из Украины, собранные во время эпизоотий в декабре 2005 года (10 образцов от домашних птиц) и апреле 2006 года (большой баклан - 5 обр., поганка малая - 2 обр., крохаль, лебедь - по одному образцу);

- образец внутренних органов (легкое, трахея, селезенка) от павших диких лебедей (Cygnus olor) в дельте реки Волга на участке Каралатской Бороздины в Астраханской области в ноябре 2005 года,

- образцы внутренних органов от кур - 2 образца, дикой утки и лебедя из Азербайджана, собранные во время эпизоотии в январе-феврале 2006 года - по одному образцу,

- два образца внутренних органов от кур из птицефабрики «Махачкалинская» и частного сектора СПК «Шовкринский» п/остров Лопатин АР Дагестан, собранные во время эпизоотии в январе 2006 г Исследовано также 10 образцов корма для птиц

Проведение ПЦР-анализа. Все использованные в работе олигонуклеотидные праймеры были синтезированы в ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора фосфорамидитным методом на синтезаторе ASM 102 (ООО «Биосет» Новосибирск) Все этапы ПЦР-анализа выполнялась с использованием базовых реагентов производства ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора

Выбор мишеней для обнаружения и типирования вирусов гриппа А, а также подбор оптимальных условий ПЦР для амплификации каждой мишени являлись предметом исследований

Подбор оптимальных условий ПЦР для проведения реакции на различных приборах являлся предметом исследований

В случае электрофоретической детекции продукты амплификации анализировались методом горизонтального электрофореза в агарозном геле с последующей регистрацией результатов системой Gel Doc 2000 («Bio-Rad», США)

В случае гибридизационно-флюоресцентной детекции для проведения анализа были использованы детекторы флуоресценции «А1а-1», («Биосан», Латвия) и «Джин», («ДНК-технология», Россия), «Rotor Gene», («Corbett Research», Австралия), «IQ-Cycler», («Bio-Rad», США) Анализ выполнялся по инструкции изготовителей оборудования

Создание защищенных количественных положительных и внутренних контрольных образцов. При конструировании вектора на основе MS2 фага и клонировании специфических фрагментов ДНК все процедуры проводили в соответствии с протоколами, описанными в руководстве «Clonmg A Laboratory Manual» (J Sambrook и соавт, 2001)

Биомассу фага MS2 наращивали путем инфицирования клеток Е coli XLlblue («Stratagene», США) Из полученной биомассы экстрагировали РНК Препарат РНК использовали для получения первой цепи кДНК с праймером Ms2rR, содержащим на 5'-конце последовательность сайта рестрикции BamHI Полученную кДНК подвергали амплификации с праймерами Ms2rR и Ms2f, содержащих на 5'-конце последовательность сайта рестрикции Ncol Полученные ампликоны подвергали рестрикции и лигировали в предварительно подготовленный вектор pET16d Затем проводили трансформацию компетентных клеток полученной плазмидой pET16d-ms2, наращивали биомассу трансформированных клеток, препаративно выделяли ДНК pET16d-ms2 и готовили вектор Количественный маркер - фрагмент ВИЧ-1 получали путем амплификации геномной ДНК, выделенной от ВИЧ-инфицированного пациента с праймерами, содержащими на 5' -концах последовательности сайтов рестрикции Амплифицированный фрагмент ВИЧ-1 клонировали в плазмиду pGEM-T Easy, а затем переклонировали в ранее полученный вектор pET16d-ms2 После клонирования и выделения плазмидной ДНК pET16d-ms2-gag готовили на ее основе вектор для клонирования специфических фрагментов вируса гриппа птиц Плазмидные конструкции, содержащие ампликоны генов MI, НА, NA, наращивали, выделяли ДНК и использовали для получения фаговых частиц. Для трансформации использовали компетентные клетки штамма Е coli B121(DE3), которые затем наращивали и использовали для выделения фаговых частиц, содержащих РНК положительных и внутренних контрольных образцов, защищенных от действия РНКаз Концентрацию фаговых частиц определяли с помощью тест-системы «Amplicor HIV Monitor» («Roche Molecular Systems», США)

Проведение молекулярно-генетического анализа штаммов высокопатогенного вируса гриппа птиц H5N1. Экстракцию РНК проводили по методике, предложенной Хомчинским (Chomc2ynski Р и соавт, 1987) Реакцию обратной транскрипции проводили с универсальным праймером Um 12 (5'-tcgttttcgtcc - 3') по методике описанной в руководстве «Cloning А Laboratory Manual» (J Sambrook и соавт, 2001) Использовали ревертазу MMLV производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора. кДНК использовали для ПЦР амплификации с целью наработки ампликонов для последующего секвенирования Для проведения генетического анализа родства методом ПЦР с

и

последующим секвенированием использовались праймеры, образующие перекрывающиеся фрагменты ДНК восьми сегментов вируса гриппа А субтипа H5N1 Анализ молекулярных маркеров патогенности вируса гриппа A/H5N1 проводился с помощью ПЦР-амплификации участков генома вируса, ассоциированных с патогенностью, с последующим секвенированием фрагментов ПЦР Анализ молекулярных маркеров резистентности вируса гриппа A/H5N1 к ремантадину проводился с помощью ПЦР-амплификации регионов гена М2 (кодирующего протеин, формирующий ионные каналы), ассоциированных с резистентностью, с последующим секвенированием фрагментов ПЦР В ПЦР для всех видов анализа использовались праймеры, приведенные в разделе 2 12 «Проведение молекулярно-генетического анализа» диссертации. Полученные в ПЦР ампликоны очищали и использовали для секвенирования Секвенирование фрагментов амплификации выполняли на базе ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора методом "cycle sequence" с набором «ABI PRISM Big Dye™ vil» («Applied Biosystems», США), согласно инструкции изготовителя с использованием капиллярного автоматического секвенатора «ABI-3100 PRISM™ Genetic Analyzer» («Applied Biosystems», США)

Выравнивание нуклеотидных последовательностей выполнялось с использованием блока программ «DNASTAR» по алгоритму «Clustal»

Таким образом, были проанализированы следующие штаммы РФ Новосибирск 2005 A/H5N1- 2 штамма, РФ Астрахань 2005 A/H5N1 - 2 штамма, РФ Тула 2005 A/H5N1 - 4 штамма, Украина АР Крым 2005 A/H5N1 - 2 штамма, Украина 2006 A/H5N1 - 4 штамма, Азербайджан 2006 A/H5N1 - 4 штамма, РФ Хабаровский край 2006 A/H5N3 - 1 штамм, РФ Краснодарский край 2007 A/H5N1 - 2 штамма, РФ Московская область 2007 A/H5N1 - 2 штамма

Полученные в результате этой работы последовательности нуклеотидов депонированы в международном банке данных «GenBank» под номерами DQ212791, DQ212792, DQ279300, DQ279301, DQ320136, DQ320137, DQ340847, DQ340848, DQ840518 - DQ840533 Анализ родства проводился с помощью программы MEGA 3 1 методом Neighbor Joining по алгоритму Kimura 2-parameter с выполнением Bootstrap Test of Phylogeny (1000 повторов) (Kumar S исоавт 2004)

Участие в системе внешнего контроля качества. С целью проведения независимой оценки эффективности работы тест-систем, лаборатория участвовала в циклах профессионального тестирования диагностических лабораторий Великобритании. Результаты тестирования представлены в таблицах 1 и 2 В зашифрованную панель для медицинских лабораторий входили образцы штаммов вируса гриппа В и А различных субтипов в концентрации от 103 до 106 бляшко-образующих единиц в мл суспензии

образца, причем в расшифровке, которая давалась после отправки результатов, для каждого образца были указаны ожидаемые значения пороговых циклов при детекции в режиме реального времени В состав панели входили вирусы гриппа А/Н5М, относящиеся к разным клайдам и субклайдам клайда 2

Таблица 1. Состав панели для профессионального тестирования медицинских диагностических лабораторий Великобритании 2006 г.

№ образца Название вируса Субтип вируса Ожидаемые результаты Ct

1 B/Flonda/7/2005 В -

2 A/Wisconsm/67/05 A/H3N2 26 0

3 A/Duck/Malaysia/F 119/3/97 A/H5N3 26 0

4 отрицательный -

5 A/Turkey/Turkey/05 A/H5N1 29 0

6 B/Malaysia/2605/04 В -

7 A/New Caledonia/20/99 A/H1N1 29 0

8 A/Indonesia/5/05 A/H5N1 36 0

9 A/Teal/Eng/06 A/H5N1 29 0

10 Отрицательный -

И A/Eng/481/06 A/H7N3 31 0

12 A/Vietnam/1194/2004 A/H5N1 32 0

Зашифрованная панель для ветеринарных лабораторий содержала образцы штаммов вируса гриппа А различных субтипов с известным титром вируса (4^2 до 31о§з в мл суспензии образца)

Таблица 2. Состав панели для профессионального тестирования ветеринарных диагностических лабораторий Великобритании 2007 г._

№ Вирус Подтип Титр вируса

1 А/ша11аг<1/Еп^06 H10N7 610§2 ЭИД50/МЛ

2 АЛеа1/Еп£/06 H8N4 81О§2 ЭИД50/МЛ

3 А/сЫскеп/Еп^Об H7N3LP Зк^ ЭИД50/мл

4 АЛеа1/Еп^06 H5N3 LP 51о£г ЭИД50/мл

5 А/та11аг(Ше1пагк/06 H5N2 LP 51og2 ЭИД50/мл

6 А/та11агс1/Ка1у/04 H7N4LP 2^з ЭИД50/мл

7 A/duck/Denmark/03 H5N7 LP 41оё2 ЭИД50/МЛ

8 А/Шгскеу/11а1у/05 H5N2 LP 81о§2 ЭИДзо/мл

9 Вирус, вызывающий болезнь Нью-Касла (ЫЕ>У)

10 АЛигскеу/Тигскеу/05 H5N1 HP Нойз ЭИД50/МЛ

Результаты работы и их обсуждение

Разработка тест-систем для обнаружения и типирования вирусов гриппа птиц. С целью подбора оптимальных параметров ПЦР и оценки аналитических характеристик разработанных методик анализа были сконструированы рекомбинантные положительные контрольные образцы. Положительные контрольные образцы РНК представляют собой бактериофаг ms2, содержащий рекомбинантную молекулу РНК, включающую синтезированный фрагмент вируса (гена Ml, НА5, НА7 или N1) гриппа А и последовательность гена gag, наличие которой позволяет определять концентрацию ПКО с использованием количественного теста «Amplicor HIV Monitor» («Roche Molecular Systems», США). Рабочий препарат готовился из фракций, которые содержали концентрированный раствор контрольного образца РНК с наименьшим содержанием остаточной ДНК.

Выбор оптимальных параметров ПЦР-анализа проводился для каждого варианта тест-системы. В тест-системе «Грипп» вариант электрофоретической детекции (EF) для выявления РНК вируса гриппа А были выбраны праймеры, инициирующие амплификацию специфического для вируса гриппа А участка гена Ml, кодирующего матричный протеин. Этот ген наиболее консервативен у всех субтипов вируса и, в то же время имеет отличающиеся от других вирусов области. Для идентификации гемагглютининов 5 и 7 типа и нейраминидазы 1 типа были выбраны праймеры, не имеющие значимой гомологии с другими субтипами. Все три реакции ПЦР выполнялись отдельно. Схема ПЦР-анализа представлена на рисунке 1.

Скрининг на грипп А

оо о

W

■I

Идентификация ВГ-А, содержащих 5 или 7 тип гемагглютинина

W

=с>

Н5

Н7

Отсутствие Отсутствие ВГ-А,

гриппа А содержащих 5 и 7

тип гемагглютинина

Рисунок 1. Схема ПЦР-анализа на основе тест-системы «ГРИПП» вариант ЕР

В процессе отработки методики были определены оптимальные параметры ПЦР, определяющие чувствительность и специфичность реакции: концентрация праймеров и М§2+ (кофактор фермента Тая-полимеразы) и

программа амплификации с оптимальной температурой отжига праймеров для разных амплификаторов (см. раздел 2.1.1.3.1.«Проведение ПЦР» диссертации).

В тест-системе «Грипп» вариант гибридизационно-флуоресцентной детекции (FL) в режиме реального времени (FRT) или детекции по конечной точке (FEP) для выявления РНК вируса гриппа А также использованы праймеры, инициирующие амплификацию специфического для вируса гриппа А участка гена М1, кодирующего матричный протеин и олигонуклеотид (зонд), конъюгированный с двумя флуоресцентными красителями - FAM (испускающий флуоресценцию) и BHQ1 (поглощающий флуоресценцию). Реакция обнаружения гена М1 проводится одновременно с детекцией внутреннего контрольного образца (ВКО), то есть в мультиплексном формате, при этом ВКО детектируется по каналу JOE. Для идентификации гемагглютининов 5 и 7 типа были выбраны праймеры и зонды, не имеющие гомологии с другими субтипами. Обе реакции идентификации гемагглютининов 5 и 7 типа проводятся в мультиплексном формате с детекцией по двум каналам (FAM и JOE соответственно). Схема данного формата ПЦР-анализа представлена на рисунке 2.

Скрининг на Грипп А

Идентификация вирусов гриппа А,

содержащих 5 или 7 тип гемагглютинина

Н5 или Н7

ВКО ■

Отсутствие ВГ-А Отсутствие ВГ-А, содержащих 5 и 7

тип гемагглютинина

Рисунок 2. Схема ПЦР-анализа на основе тест-системы «ГРИПП» вариант FL

В тест-системе «АмплиСенс Influenza virus Н5» (как для детекции во время ПЦР, так и для детекции после окончания ПЦР) для выявления РНК вируса гриппа А использованы праймеры, инициирующие амплификацию специфического для вируса гриппа А участка гена Ml, кодирующего матричный протеин и зонд, конъюгированный с двумя флуоресцентными красителями -FAM (испускающий флуоресценцию) и BHQ1 (поглощающий флуоресценцию). Реакция обнаружения гена Ml проводится одновременно с детекцией ВКО, то есть в мультиплексном формате, при этом ВКО детектируется по каналу JOE. Для идентификации гемагглютинина 5 типа и нейраминидазы первого типа были выбраны праймеры и зонды, не имеющие гомологии с другими субтипами вируса гриппа А. Обе реакции идентификации проводятся в мультиплексном

формате с детекцией по каналам FAM - НА5 и JOE - N1. Схема данного формата ПЦР-анализа представлена на рисунке 3.

Идентификация вирусов гриппа,

содержащих 5 тип гемагглютинина и/или 1 тип нейраминидазы

«-> Н5 и/или N1

вко +

Отсутствие Гриппа А

Отсутствие вирусов Гриппа, содержащих 5 и/или 1 тип нейраминидазы

Рисунок 3. Схема ПЦР-анализа с помощью тест-системы «АмплиСенс Influenza

virus Н5»

В процессе отработки методики были определены оптимальные параметры ПЦР, определяющие чувствительность и специфичность реакции: выбрана оптимальная концентрация праймеров, концентрация Mg2+, а также оптимальная температура отжига праймеров.

Программы амплификации подбирались для разных вариантов амплификаторов, имеющихся в диагностических лабораториях РФ, представлены в разделе 2.1.1.3.1.«Проведение ПЦР» настоящей диссертации. В экспериментах использовалась кДНК, полученная из рекомбинантных положительных контрольных образцов, содержащих фрагменты генов Ml (ПКО грипп А-rec), НА 5 тип (ПКО НА 5 тип-rec) и NA 1 тип (ПКО NA 1 тип-гес).

Оценка аналитических характеристик тест-систем. Аналитическая специфичность и чувствительность, а также предел детекции разработанных тест-систем оценивались при работе со штаммами вируса гриппа А различных субтипов, на клиническом материале, не содержащем вирусов гриппа, а также с гетерологичными штаммами возбудителей респираторных болезней животных и человека, перечисленными в разделе «Материалы и методы исследования». Для проведения лабораторных и Государственных испытаний были сформированы зашифрованные панели образцов, а также использовались панели для профессионального тестирования медицинских и ветеринарных лабораторий Великобритании. В результате данных испытаний не было зарегистрировано ложно-положительных, ложно-отрицательных либо сомнительных результатов.

Также, не было выявлено перекрестных реакций при применении типирующего теста для идентификации субтипов Н5, Н7 и H5N1

Оценка аналитической чувствительности тест-систем (включая все этапы -выделение РНК вируса, реакцию обратной транскрипции и ПЦР) проводилась как с использованием рекомбинантных ПКО, так и на панели образцов, представляющих собой точки разведений ВСЖ Чувствительность тест-систем на титровках ПКО исследовалась параллельно в различных вариантах биологического материала от животных и людей. Было показано, что тест-система «Грипп» выявляет и идентифицирует РНК штамма вируса ГП5-А крачкаЛО Африка/61/H5N3 в ВСЖ с инфекционным титром 8,0 lg ЭИД50/СМ3 в разведении 10 , что составляет 0,1 ЭИД50/СМ3 и РНК штамма вируса ГП7-А /утка/вирус чумы птиц/Росток/34/Н7Ш в ВСЖ с инфекционным титром 8,0 lg ЭИД50/СМ3 в разведении 10"9, что составляет 0,1 ЭИД50/см3 Аналитическая чувствительность тест-системы на рекомбинантных положительных контрольных образцах в формате электрофоретического анализа (ЭФА) составил 5*103 геномных эквивалентов вируса в 1 мл (ГЭ/мл) тестируемого образца по определению РНК вируса гриппа А и идентификации субтипов Н5 или Н7 в типирующем тесте и 1*103 ГЭ/мл в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции (FRT и FEP).

Тест-система «АмплиСенс Influenza virus Н5» выявляет и идентифицирует РНК штамма вируса гриппа А/Гонконг/03/Н5Ш в ВСЖ с инфекционным титром 8,5 lg ЭИД50/смЗ в разведении 10"6, что составляет 50 ЭИД50/СМ3 При тестировании рекомбинантных положительных контрольных образцов, содержащих либо фрагмент гена матрикс-протеина, либо фрагмент гена гемагглютинина пятого типа, либо фрагмент гена нейраминидазы первого типа, предел детекции РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа H5N1 в типирующем тесте, составил 5*103 ГЭ/мл в варианте детекции методом электрофореза и 1*103 ГЭ/мл в формате гибридизационно-флуоресцентной детекции (FRT и FEP)

Определение диагностической чувствительности тест-систем. За период с июля по апрель 2006 года на четырех базах (ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор», ФГУ «ВГНКИ» и ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора и Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории) проведена апробация тест-систем на материале от больных и павших птиц (кур, гусей, домашних и диких уток, индоуток, лебедей) в период эпизоотии гриппа птиц на территории Сибирского федерального округа, а также собранном во время вспышек в Тульской и Астраханской областях Исследованию подвергались образцы селезенки, трахей, легких и мозга, фекалии и мазки из клоаки С помощью обеих тест-систем «Грипп» и «АмплиСенс Influenza virus Н5» был исследован в общей сложности 1751 образец из частных хозяйств Сибирского федерального округа и Тульской области, из Республики Украина и Республики Азербайджан, от

диких перелетных птиц, а также со 157 птицефабрик из 8 автономных республик России и 30 областей Центра и Юга России

Образцы из Сибирского федерального округа, Тульской и Астраханской областей были параллельно протестированы в ГТЦР и традиционным методами изоляции вируса с последующим серологическим анализом Изоляция вируса проводилась на 10-дневных куриных эмбрионах (РКЭ) по стандартной методике [The National Training Course on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance] Работа проводилась в условиях лаборатории уровня BSL-3, оборудованной для работы с высокопатогенными вирусами птичьего гриппа в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская обл Серологическое типирование гемагглютинина выполнялось с помощью реакции торможения гемагглютинации эритроцитов петуха с использованием типоспецифических сывороток Серологическое типирование нейраминидазы проводилось методом ингибирования нейраминидазной активности специфическими сыворотками с фетуином В качестве диагностической панели использовали антисыворотки, предоставленные доктором Вебстером («Центр ВОЗ по экологии вируса гриппа птиц и животных», Мемфис, США) Во всех образцах от павших птиц из частных хозяйств с территории Сибирского федерального округа и из д Яндовка Тульской области была обнаружена РНК вируса гриппа А и идентифицирован субтип H5N1 (в качестве примера см. рисунок 4).

Исследован также патматериал от павших лебедей из Астраханской области (2 объединенных образца), в которых также была обнаружена РНК вируса гриппа А и идентифицирован субтип H5N1 В 7 из 10 исследованных образцов от 7 птиц из Крыма был обнаружен вирус гриппа А и идентифицирован субтип H5N1 В одном случае при тестировании трех образцов органов (печень, легкие, мозг) живой курицы, контактировавшей с павшими, вирус был обнаружен только в образце легких, в другом случае в объединенном образце от павшей утки (печень, легкие, мозг) неоднократно наблюдалось ингибирование ПЦР Таким образом, у 6 из 7 подвергшихся тестированию птиц была обнаружена РНК вируса гриппа H5N1, а результаты тестирования проб от одной павшей утки не подлежали интерпретации из-за неоднократно повторяющегося ингибирования реакции (отсутствовал сигнал амплификации ВКО)

Ни в одном из образцов, поступивших с птицефабрик от клинически здоровых птиц (1498 образцов), и в пробах от отстрелянных на территории Астраханской области перелетных птиц в марте-апреле 2006 г не была обнаружена РНК вируса гриппа А Ни один из этих образцов также не дал положительных результатов в тестах по идентификации субтипов Н5, Н7 или N1 вируса гриппа А Результаты электрофоретической детекции при

использовании тест-системы «Грипп» во всех случаях совпадали с результатами гибридизационно-флуоресцентной детекции.

а)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 ОКОК К- К+М

1-3 - мазки из клоаки птиц

4 - головной мозг

5 - легкие

6 - трахеи

7 - селезенка

8 - помет

Грипп А

А-Н5

. Ü А-Н7

То 41 "20

Рисунок 4. Выявление РНК вируса гриппа А и идентификация субтипа H5/N1 в материале из частных хозяйств Тульской области д. Яндовка.

a) с помощью тест-системы «ГРИПП» вариант ЭФА.

b) с помощью тест-системы «АмплиСенс Influenza Н5» вариант FRT.

Молекулярно-генетический анализ штаммов вируса гриппа птиц. В

настоящем исследовании проводился детальный молекулярно-генетический анализ на наличие описанных в литературе маркеров патогенности и устойчивости штаммов ВВПГП к противовирусным препаратам. Всего было изучено 23 штамма, циркулировавших во время эпизоотии 2005-2007 гг. на территории России и стран ближнего зарубежья.

Анализ маркеров патогенности. Все изученные в данной работе штаммы вирусов имели структуру гемагглютинина, по всем ключевым аминокислотам

характерную для связывания с рецепторами птиц. Все представленные на данный момент в свободном доступе последовательности гемагглютинина вируса гриппа H5N1, выделенные от инфицированных (и впоследствии умерших) людей в 2005-2006 годах, также содержат аминокислоты, характерные для «птичьих» изолятов.

Все изученные штаммы имели делецию в гене нейраминидазы (20 аминокислот в позициях 49-68), что можно считать маркером адаптации вируса к организму кур. В то же время, данные штаммы в положении 158 гемагглютинина имели аминокислоты, по которым происходит гликозилирование аминогрупп во время пост-трансляционного процессинга белка (большинство изолятов содержали Asn, а в изоляте A/swan/Astrakhan/Russia/Nov-2/2005 (H5N1) в этом положении находилась аминокислота Asp). Таким образом, наличие гликозилированного гемагглютинина снижает сродство вирусов к сиаловым рецепторам и дает им возможность эффективно реплицироваться [Baigent S.J.], компенсируя сниженную активность нейраминидазы.

Все проанализированные в данной работе изоляты по основному молекулярному маркеру патогености следует отнести к ВПВГП, так как они содержат в области сайта протеолиза гемагглютинина 6 основных аминокислот (PQGERRRKKR/GL) (см. рисунок 5).

LeuArgAsnSe rProGlnGlyGluArgArgAugLysLysArgGlyLeuPheGlyAlaX

Рисунок 5. Район сайта протеолитического расщепления молекулы гемагглютинина (PQGERRRKKR / GL) у штамма из Тулы (A/chicken/Tula/Russia/Oct-5/2005).

Известно, что аминокислотная замена 627 аминокислоты в белке РВ2 может изменять эффективность репликации вируса гриппа A H5N1 в организме мышей, в частности вирус, содержащий Lys в положении 627 приводить к системным инфекциям у мышей. Один из изолятов (A/chicken/Tula/Russia/Oct-5/2005) содержал последовательность, кодирующую Glu в 627 положении белка РВ2. Остальные содержали последовательность, кодирующую Lys. В исследованных нами изолятах вируса A/H5N1 присутствует делеция 5 аминокислот в положении 80-84 последовательности белка NS1. Этим они отличаются от изолятов H5N1 1997 года и похожи на изоляты 2003-2005 годов, в том числе выделенные от людей. Вследствие данной делеции, позиция гена NS1, соответствующая 92 аминокислоте изолята НК/156/97 сдвигается в изолятах 2005 г. на 87 положение, в котором расположен Asp. Таким образом,

исследованные нами изоляты содержат Asp в позиции гена NS1, соответствующей 92 аминокислоте изолята НК/156/97.

Изученные нами штаммы, а также все изоляты вируса A/H5N1, 2005-2007 гг. из России и других стран, имеют мотив ESKV на карбоксильном конце белка NS1, с которым специфически связываются регуляторные белки, играющие ключевую роль в организации сигнальных путей, что придает вирусам большую потенциальную способность нарушать регуляцию цитокинового ответа в организме людей.

Анализ резистентности к противовирусным препаратам.

Резистентность вирусов гриппа А к действию ремантадина может быть обусловлена появлением одной из мутаций белка М2 в положениях 26 (Leu-26-Phe), 27 (Val-27-Ala или Thr), 30 (Ala-30-Pro), 31 (Ser-31-Asn) или 34 (Gly-34-Glu), которые изменяют конфигурацию ионного канала [Abed Y.]. Результаты секвенирования последовательностей гена М2 вируса гриппа A/H5N1 у выделенных нами изолятов показали, что они не имели ни одной из указанных выше мутаций. Мутации резистентности к озельтамивиру возникают в гене NA типа 1 в положении аминокислот 119, (Glu 119 Val), 274 (His 274 Туг), 292 (Arg 292 Lys) и 294 (Asn 294 Ser). Ни одна из вышеупомянутых мутаций не была обнаружена в последовательности гена NA обследованных изолятов вируса гриппа A/H5N1 за исключением одного изолята - A/swan/Astrakhan/Russia/Nov-2/2005, в котором обнаружена мутация His 274 Туг (САС ->ТАС) (см. рисунок 6).

SerValGJ.ubet,iA3pA±aProAs пТ'

A/greb e/N ovo sib ir sk/29/2 005/H 5 N1 A/duck/Novosibirsk/5 6/2 005/H5N1 A/ duck /China/E31 9/2/200 3/H 5 N1 AJ Viet Nam/3062/2004/H5N 1 A/ chicken /Kurgan/3/200 5/H5N1 A/whooper swan/Mongolia/6/2005/H5Nl AJ Hanoi/304 08/2005/H5N1 A/goose /Guangdong/1/19 96/H5N1 A/Who op er s wan/M ongolia/3/200 5/H 5 N1 A/who op er s wan/M ongolia/4/2005/H 5 N1 A/bar-headed goose/Mongolia/ 1 / 2 00 5/H 5 N1 A/great black-headed gull/Qinghai/l/2005/H5N A/ chicken /Tula/10/20 05/H5N1 A /en nfin/Nnvnsih ir fik/4/ 2 fl H VH1N1

ntcagtcgaaCtggatgctcctaatCai

aCcagtc gaat t ggafc gc tcct oat t ai

atсagtсgaattggatgc tcctaattac

atcagtcgaattggatgctcctaattal

atcagtcgaattggatgctcctaattaf

atcagtcgaattggatgctcctaattat

atcegtcgaattggatgctcctaattat

atcagtcgaattglatgcccctaattat

atcagtcgaattggatgctcctaatta

atcegtcgaattggatgctcctaattat

atcagtcgaattggatgctcctaatta!

1atcagtcgaattggatgctcctaattat ATCAGTCGAATTGGATGCTCCTAATTA! atcaatcoaattoaatactcctaattat

GluGlvCysSerCysTycPro

:actatgaggaqtgctcctgttatccti :actatgaggagtgctcctgttatccti cactatgaggac.tgctcctgttatccti actatgaggar.tgctcctgttatccti «ctatgagga^tgctcctgttatccti cactatgaggacitgctcctgttatccti cactatgaggautgctcctgttatccti cactatgaggaatgctcctgttatccti actatgagga>;tgctcctgttatccti cactatgaggagtgctcctgttatccti actatgagga' jtgctcctgttatccti cactatgaggagtgctcctgttatccti CACTATGAGGA'JTGCTCCTGTTATCCT'

gastatgagga. tggtccttattatcgt'

А/swan/Astraldian/l/200 5/H5N1 ' A/cliickcn /Oiime.a/1/20 0Í3/I IíiH 1— A/ Hong Kong/156/97/H5N1 AJ Viet Nam-HG/207/2005/H5N 1 АУ Viet Nam-BL/014/20 05/HSN1 А/Viet Nam-DT/036/2005/H5N1

Afs wan/As trakhan/Ru ss ia/Nov-2/2005

АТСAGTC GAATTGGATGCТССTAATTAI

ГАС TATGAGGA'-- XGC ТС С TGTTATC С T"

atcagttgagttgaacgcccctaattal at с agt с ö-, aa 11 gga t gc tcct aat tat atcagtcgaattggatgctcctaatta: atcagtcgaattggatgctcctaattat

tacgaggastgctcctgttatcct-cactat icaggaatgctcctgttatcct> actatgagga-itgctcctgttatccti cactatgagga. tgctcctgttatccti

|A : CAG : CGAA : GGA':'GCTCC :'AA-í TA::

mu ид ш -U

AC A GAGGAG GC CC: G A CC ■

Рисунок 6. Секвенограмма и выровненная нуклеотидная последовательность участка гена нейраминидазы Астраханского штамма

A/swan/Astrakhan/Russia/Nov-2/2005 (выделена синим прямоугольником). Мутация His 274 Туг (САС-ТАС) обведена красным кругом

Молекулярно-генетический анализ родства штаммов высокопатогенного вируса гриппа птиц. С целью уточнения источников происхождения высокопатогенного вируса Н5Ш, вызвавшего эпизоотию гриппа птиц в 2005 году в России и странах СНГ, был проведен анализ родства всех восьми сегментов штаммов вируса из Астрахань (А/5\уап/АзггакЬап/11и551а/1ч[оу-2/2005) и Тула (А^ап/Ти1а/К.Ш51а/Ыоу-2/2005) с представленными в «ОепеВапк» последовательностями нуклеотидов. Результаты филогенетического анализа полного генома вируса показали высокую гомологию (> 99%) по всем восьми сегментам вируса с изолятами гриппа А/Н5>И, выделенными от диких перелетных водоплавающих птиц, павших на озере Кукунор, (провинция Цинхай, Китай) в мае 2005 года, что позволяет предположить, что данная разновидность вируса была занесена на территорию России именно из этого региона (пример дендрограммы, полученной в результате филогенетического анализа генов гемагглютинина представлен на рисунке 7).

27 |-A/Eп viro п m ent/Q ing ha¡/31 /2 00 5/H5N 1 /

' I I-A/chicken/C rlm e a/1 /2 0 05/

I-A/swan/ABtraktian/Russ!a/Nov-2/2 0051/2 005/H5N1

-A/chicken/Tu!a/Russ¡a/Oct-5/2005/H5N1

-A/goose/Novosibirsk/4/2 005/

-A/Ck/ST/4231/2 003/genV/

-A/Chicken/Shantou/810/05/H5N1/

-A/duck/HongKong/821/02/genZ/

-A/HongKong/2 13/0 3/genZ + /

-A/G s/HK/739.2/02/genZ + /

-A/C k/H K/YU777/02/genZ/

-A/peregrinefalcon/H K/D 0028/2004/H5N1/

-A/te al/China/2 978.1/2002/genW/

-A/G o ose/G uangdong/1/9 6/H5N1/

юр pA/c k/H K/31.4/02/g e n В/ L A/C k/H К/96.1/0 2/g en Y/

-A/SilkyCh¡cken/HongKong/SF189/01/genA/

-A/Ch¡cken/HongKong/715.5/01/genE/

-A/C hicken/H ongKong/FY 1 50/01 /genD/

5 5 I-A/C hicken/H ongKong/FY 77/01 /gene/

В 5 I

0.015 0.010 0.005 0.000

Рисунок 7. Дендрограмма, полученная в результате филогенетического анализа генов гемагглютинина. Красным цветом выделены названия штаммов, изученных в настоящей работе.

Обнаруженные во время эпизоотии 2005 - 2006 гг. на территории России, Украины и Республики Азербайджан штаммы по нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина можно однозначно отнести к клайду

2, субклайду 2, так как генетические отличия между проанализированными последовательностями гемагглютинина варьировали от 1,4% до 0,1 % и не превышали отличий между субклайдами (5,1 % - 4,0%) или между клайдами (7,7%-6,0%)

В ходе выполнения настоящей работы в феврале 2007 г на территории Московской области была зафиксирована крупная эпизоотия среди домашней птицы частных подворий С помощью разработанных методик нами был проанализирован патматериал из двух хозяйств Домодедовского и Одинцовского районов, любезно предоставленных Центральной научно-методической ветеринарной лабораторией (г Москва) в инактивированном виде В обоих образцах была обнаружена РНК вируса гриппа А и идентифицирован субтип Н5Ш Маркеры патогенности у штамма занесенного на территорию Подмосковья были характерны для всей Цинхайской группы Генетических маркеров устойчивости к препаратам адамантанового ряда и ингибиторам нейраминидазы не обнаружено Анализ генетической гомологии Подмосковного штамма и ранее изученных изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц позволил установить его наиболее близкое родство со штаммами циркулировавшими в 2006 г в Иране, Азербайджане и Адыгее Результаты анализа генетического родства представлены в таблице 3

Таблица 3. Результаты сравнительного анализа родства нуклеотидной последовательности гена нейраминидазы (1007 пн) штамма А/сЫскеп/0(1т180Уо/2007/Н5Ш из Московской области с аналогичными последовательностями других.

Название изолятов % гомологии с изолятом

A/chicken/Odintsovo/2007

A/chicken/Krasnodar/1/07 99 2

A/cygnus cygnus/Iran/754/2006 99 6

A/chicken/Azerbaidjan/Bilasuvar/2006 99 5

А/Environment/Qinghai/31/2005 99 2

A/chicken/Crimea/1/2005 99.0

A/Ucrain/06 98 7-99 1

Выводы

1. Впервые разработаны и зарегистрированы в РФ ПЦР тест-системы «ГРИПП» и «АмплиСенс Influenza virus Н5», позволяющие выявлять РНК вируса гриппа А и идентифицировать субтипы H5N1, Н5 и Н7 Тест-системы обладают 100% специфичностью и имеют аналитическую чувствительность -5*103 гэ/мл в варианте электрофоретической детекции и 1*103 гэ/мл в варианте флюоресцентной детекции

2 На основе разработанных нами молекулярно-генетических тест-систем и методик охарактеризована эпизоотия гриппа у диких и домашних птиц в России и СНГ, обусловленная генетически-близкой группой

высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, выделенных от павших диких водоплавающих птиц (2005 г.) на озере Кукунор провинции Цинхай в Китае Штаммы, вызвавшие эпизоотию у птиц в Московской области (февраль 2007 г) обнаружили наибольшую гомологию с изолятами, циркулировавшими (2006 г ) в Иране, Азербайджане и Адыгее

3 Маркеров адаптации вируса гриппа птиц к организму человека, судя по результатам секвенирования генов гемагглютинина и генов, кодирующих внутренние белки, не обнаружено

4 Изученные штаммы вируса гриппа A/H5N1 не имеют молекулярных маркеров устойчивости к ремантадину, однако среди них обнаружен вариант, имеющий мутацию резистентности к озельтамивиру (Тамифлю)

5 Мониторинг за циркуляцией вирусов птичьего гриппа на молекулярном уровне позволяет своевременно оценить эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию по птичьему гриппу A/H5N1 и провести адекватные профилактические и противоэпидемические мероприятия.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Дифференциальная диагностика гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции / Краснова Т В , Обухов И JI, Шипулин Г А , Смоленский В И , Горева И П , Панин АН // В кн Сборник научных трудов ВГНКИ, 2005 -тбб -с 135-141

2 Дифференциальная диагностика гриппа птиц методом ПЦР / Обухов, И J1, Шипулин Г А, Яцышина С Б, Яцентюк С П, Смоленский В И, Панин А Н // Ж.. Био, №4 (67) - 2006, с 14-15

3 Изоляция и молекулярная характеристика вирусов гриппа A/H5N1, выделенных во время вспышек гриппа у птиц в 2005 году в Европейской части России выделение штамма вируса с мутацией устойчивости к озельтамивиру / Яцышина С Б , Шестопалов А М, Евсеенко В А, Астахова Т С, Браславская С И, Терновой В.А., Кондратьева Т Ю, Алексеев А Ю , Золотых С И, Рассадкин Ю Н, Зайковская А В , Дурыманов А Г, Нетесов С В, Шипулин Г.А // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология -2008 -№1 -С 26-34

4 Молекулярно-генетическая характеристика вируса гриппа А (H5N1), вызвавшего эпизоотию в июле-декабре 2005 г в РФ и сопредельных странах. / Яцышина С Б, Шипулин Г.А., Астахова Т С, Браславская С.И., Кондратьева Т Ю , Обухов И Л, Панин А Н, Малеев В В , Покровский В И // Эпидемиология и инфекционные болезни - 2006 -№5 -С 23-30

5 Молекулярно-эпидемиологический анализ изолятов вируса гриппа птиц эпизоотии 2005-2006 гг на территории России и стран СНГ / Шипулин Г А, Яцышина С Б , Астахова Т С, Браславская С И, Обухов И Л, Кондратьева Т Ю, Малеев В В, Покровский В И // Материалы IX конгресса Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Санэпидмедиа -2007 -с 272-273

6 ПЦР тест-системы для диагностики гриппа птиц / Обухов, И Л, Шипулин

Г А, Яцышина С Б , Смоленский В И, Панин АН// Ветеринария - 2006 -№ 7 - С 25-30

7 Разработка и апробация ПЦР тест-систем для выявления вируса гриппа птиц / Шипулин Г А, Яцышина С Б, Подколзин А Т, Краснова ТВ., Терновой В.А., Евсеенко В А, Шестопалов А В , Обухов И Л, Нетесов С В., Панин АН// Инфекционные болезни - 2005 - Т 3, №4 - С 25-29

8 Разработка и апробация ПЦР тест-систем для выявления вируса гриппа птиц / Яцышина С Б, Шипулин Г А, Подколзин А Т, Терновой В А, Шестопалов А В , Краснова Т В , Обухов И Л, Нетесов С В, Малеев В В // Ветеринарный врач. -2005.-№4 - С 18-20

9 Шипулин Г.А. Апробация ПЦР тест-систем и проведение филогенетического анализа изолятов вируса гриппа птиц Н5Ш во время эпизоотии 2005 года / Шипулин Г А, Обухов И Л, Панин А Н //Сборник статей «Грипп птиц происхождение инфекционных биокатастроф» СПб • Росток, 2006 -с 257-269

Список сокращений

Днк дезоксирибонуклеиновая кислота

вко внутренний контрольный образец РНК

веж жидкость, содержащая вирус

гэ геномный эквивалент

жкт желудочно-кишечный тракт

кДНК комплементарная ДНК

КРС сыворотка крупного рогатого скота

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

МЭБ международное эпизоотическое бюро

OK отрицательный контрольный образец ПЦР

ОКО отрицательный контрольный образец нуклеиновых кислот экстракции

ПЦР полимеразная цепная реакция

пко положительный контрольный образец кДНК

РНК рибонуклеиновая кислота

РТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной

реакцией

ТЕ буфер Трис-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)

ТУ технические условия

ЦНС центральная нервная система

BSA бычий сывороточный альбумин

EcoRI, Hmd III, Hmfl, Msel, Xbal ферменты рестрикции ДНК

Taq Thermus aquaticus

dNTPs дезоксинуклеотидтрифосфаты

DEPC-H20 вода, обработанная диэтилпирокарбонатом

SPF (specific pathogen free) свободный от специфических патогенов

Подписано в печать 4 03.08 Тираж 100. Заказ № 12 Отпечатано в типографии. ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора

Активный эволюционный процесс в некоторых группах возбудителей инфекций в сочетании с активизацией миграционных потоков в человеческих популяциях создает предпосылки для» возникновения и глобального распространения инфекционных болезней. В настоящее время значительную обеспокоенность вызывает распространение в мире эпизоотий высоко патогенного гриппа птиц. Впервые эта проблема привлекла всеобщее внимание в 1997 году, когда масштабная эпизоотия высоко патогенного гриппа* в Гонконге была приостановлена только выбраковкой всей популяции птиц. Большинство экспертов ВОЗ считают, что эти меры, вероятно, помогли предотвратить надвигающуюся пандемию.

Начиная с 1997 г. по настоящее время по« всему миру неоднократно регистрировались эпизоотии* гриппа у домашних и диких птиц, при которых отмечались также случаи инфицирования млекопитающих и человека. Наиболее значительная эпизоотия была зарегистрирована в 2003-2004 гг. в странах Юго-Восточной Азии, где в течение нескольких месяцев были уничтожены более 100 миллионов- домашних птиц. В этот же период отмечались случаи заболевания птиц гриппом в Италии, Голландии, Бельгии и Германии. За время этих вспышек были уничтожены около 50* миллионов домашних птиц. С мая 2005 года в странах Юго-Восточной Азии началась новая эпизоотия, вызванная высоко патогенным вирусом гриппа А субтипа Н5>11, которая затем распространилась по территории Казахстана, России, Украины, Азербайджана и ряда Европейских стран.

До 1997 года считалось, что вирусы гриппа птиц не опасны для людей, так как регистрировались лишь редкие случаи инфицирования людей с клинической картиной конъюнктивита или легких форм ОРЗ в случае тесного контакта человека с инфицированной птицей. Однако во время эпизоотий в Гонконге в 1997 г., Таиланде и Вьетнаме в 2003-2004 гг., во Вьетнаме в 2005 г. было показано, что вирус гриппа птиц может вызывать у людей тяжелые формы пневмонии, приводящие1 к летальному исходу. По данным Всемирной организации здравоохранения с декабря 2003 г. по 11 марта 2008 г. в ряде стран мира (Азербайджан, Камбоджа, Китай, Джибути, Египет, Индонезия, Ирак, Лаос, Нигерия, Таиланд, Турция, Вьетнам) зарегистрировано 372 лабораторно подтвержденных случаев инфицирования людей вирусом гриппа птиц А/Н51Ч1, из них у 235 пациентов заболевание привело к летальныму исходу.

Глобальное распространение высокопатогенного вируса гриппа птиц, а также возрастание числа людей, инфицирующихся при контакте с заболевшей птицей, заставило ВОЗ в 2005 выработать план подготовки к возможной пандемии. В настоящий момент, по мнению экспертов ВОЗ, мы находимся в фазе 3 пандемического процесса, что требует от каждого государства выстраивания своих собственных планов действий на случай возникновения эпидемии.

Опыт борьбы с гриппом птиц, накопленный за последние 10 лет, показал, что для разработки и проведения эффективных противоэпизоотических и противоэпидемических мероприятий, необходимо построение системы постоянного мониторинга за циркуляцией вируса гриппа, основанной на использовании лабораторных методов точной и быстрой идентификации и характеристики циркулирующих штаммов вируса гриппа А, с целью определения их генетического родства, степени патогенности и выявления мутаций резистентности к противовирусным препаратам. Среди лабораторных методов диагностики гриппа птиц наиболее эффективным считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Главными преимуществами ПЦР в сравнении с культуральным подходом являются его более высокая чувствительность, быстрота и безопасность для персонала. По диагностической значимости ПЦР более ценный метод, чем серология, поскольку позволяет выявлять вирус на самых ранних стадиях инфекции, задолго до появления антител, что крайне важно для проведения мероприятий, направленных на раннюю карантинизацию больных животных и людей. Кроме явных диагностических преимуществ, метод ПЦР, дополненный методом секвенирования ДНК, является универсальным молекулярно-генетическим подходом к опредлению большинства биологических свойств вирусов гриппа птиц, позволяющим выявлять родство циркулирующих штаммов, предсказывать его опасность для человека и эффективность противовирусной терапии.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлось создание системы эпидемиологического мониторинга за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц на основе разработанных нами тест-систем для молекулярной диагностики и генотипирования.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать и стандартизовать диагностические наборы на основе ПЦР для обнаружения РНК вируса гриппа А и идентификации наиболее значимых субтипов вируса гриппа птиц.

2. Разработать молекулярно-генетические методики для выявления маркеров патогенности, устойчивости к противовирусным препаратам, а также для установления степени родства штаммов вируса гриппа птиц.

3. Провести молекулярно-генетический анализ маркеров патогенности и адаптации к организму человека штаммов вируса гриппа птиц, циркулировавших во время эпизоотии гриппа у диких и домашних птиц 2005-2007 гг. в России и в странах СНГ.

4. Определить генетические маркеры устойчивости к противовирусным препаратам штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц, циркулировавших в России и в странах СНГ.

5. На основе разработанных молекулярно-генетических тест-систем и методик охарактеризовать эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию в очагах птичьего гриппа в России.

Научная новизна исследования

На основе разработанных нами тест-систем для диагностики и методик для генотипирования создана система эпидемиологического мониторинга на молекулярном уровне за циркуляцией высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц.

Впервые в России разработаны ПЦР тест-системы для выявления и дифференциации штаммов вирусов А/Н5Ш и А/Н5/Н7, обладающие высокой аналитической чувствительностью (5*10 гэ/мл в варианте о электрофоретической детекции, 1*10 гэ/мл в варианте флуоресцентной детекции) и 100% специфичностью.

Проведен молекулярно-генетический анализ родства штаммов вируса высокопатогенного гриппа птиц, циркулировавших на территории России и сопредельных государств в июле 2005 г. - феврале 2007 г., что позволило определить географическое положение очагов инфекции, из которых в июле 2005 г. и в феврале 2007 г. происходил занос на территорию России вирусов высокопатогенного гриппа птиц, а также определить связь штаммов, циркулировавших на территории России, со штаммами, вызвавшими заболевания у людей и животных в ряде стран СНГ.

Разработаны молекулярно-генетические методики для оценки потенциальной патогенности и вирулентности вируса гриппа птиц для домашней птицы, млекопитающих и человека, а также для определения его к устойчивости к противовирусным препаратам.

Обнаружен и охарактеризован штамм вируса А/Н5Ш, имеющий мутацию, обусловливающую его устойчивость к озельтамивиру («Тамифлю»), препарату, используемому для профилактики и лечения птичьего гриппа у людей.

Практическая значимость работы

В результате проведенного исследования установлено, что разработанные нами методы молекулярно-генетического мониторинга за циркуляцией высокопатогенного вируса гриппа птиц позволяют:

• оценить эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию по птичьему гриппу в России и ряде стран СНГ;

• своевременно провести адекватные профилактические и противоэпидемические мероприятия, направленные* на предотвращение распространения заболеваемости птичьим гриппом в России;

• выявить эпидемиологические связи циркулирующих в России штаммов высокопатогенного вируса гриппа со штаммами сопредельных стран.

Внедрение в практику

Впервые в России разработаны и внедрены в ветеринарную практику и систему санэпиднадзора тест-системы «ГРИПП» - (Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных № ПВР-1-3.5/01553 от 14 марта 2006 года) и «АмплиСенс Influenza virus Н5» (Регистрационное удостоверение № J1C-001511 от 14.04.2006, Сертификат производства МИБП № 000592, ФСП 42-0115-7239-05) для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

На базе ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора было налажено производство тест-систем «ГРИПП» и «АмплиСенс Influenza virus Н5». В рамках Государственного заказа данные тест-системы поставляются в Центры гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора и ветеринарные Центры для проведения мониторинга за гриппом птиц на территории России.

Результаты выполненной работы вошли в Методические Указания по лабораторной диагностике гриппа птиц у людей МУК 4.2.2136< — 06 «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены:

- на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ и ФГУН ЦНИИЭ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, 2003-2007 гг.);

- на Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004 г.);

VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2005 г.); на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань, 2005 г.);

- на совместном заседании президиума РАСХН и РАМН «Итоги выполнения совместного Постановления от 14 апреля 2005 г. по проблеме «Грипп А — непредсказуемый и социально опасный зооноз» (Москва, 2005 г.); на Международной конференции по инфекционным болезням (1СЕГО) Общества микробиологов (Атланта (США), 2006 г.);

- на международной научно-практической конференции "«Высокопатогенный грипп птицы: актуальные аспекты эпизоотологии, эпидедимиологии, диагностики и профилактики» (Судак, АР Крым (Украина), 2006 г.);

- на международных семинарах-совещаниях специалистов стран СНГ по проблеме гриппа птиц (Новосибирск, 2006 и 2007 гг.); на международной конференции «Готовность к пандемии гриппа: международная оценка» (Санкт-Петербург, 2007 г.); на IX конгрессе Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).

Публикации результатов исследований

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждения, выводы, практические предложения, список литераттуры и приложения. Работа иллюстрирована 54 рисунками и 47 таблицами. Список литературы содержит 87 источников, в т.ч. 81 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработаны и зарегистрированы в РФ ПЦР тест-системы «ГРИПП» и «АмплиСенс Influenza virus Н5», позволяющие выявлять РНК вируса гриппа А и идентифицировать субтипы H5N1, Н5 и Н7. Тест-системы обладают 100% специфичностью и имеют аналитическую о чувствительность - 5*10 гэ/мл в варианте электрофоретической детекции и 1*10 гэ/мл в варианте флюоресцентной детекции.

2. На основе разработанных нами молекулярно-генетических тест-систем и методик охарактеризована эпизоотия гриппа у диких и домашних птиц в России и СНГ, обусловленная генетически-близкой группой высокопатогенных штаммов вируса гриппа A/H5N1, выделенных от павших диких водоплавающих птиц (2005 г.) на озере Кукунор провинции Цинхай в Китае. Штаммы, вызвавшие эпизоотию, у птиц в Московской области (февраль 2007 г.) обнаружили наибольшую гомологию с изолятами, циркулировавшими (2006 г.) в Иране, Азербайджане и Адыгее.

3. Маркеров адаптации вируса гриппа птиц к организму человека, судя по результатам секвенирования генов гемагглютинина и генов, кодирующих внутренние белки; не обнаружено.

4. Изученные штаммы вируса гриппа A/H5N1 не имеют молекулярных маркеров устойчивости к ремантадину, однако среди них обнаружен вариант, имеющий мутацию резистентности к озельтамивиру (Тамифлю).

5. Мониторинг за циркуляцией вирусов птичьего гриппа на молекулярном уровне позволяет своевременно оценить эпизоотологическую и эпидемиологическую ситуацию по птичьему гриппу A/H5N1 и провести адекватные профилактические и противоэпидемические мероприятия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕЕОМЕБРАЦИИ

Научные разработки и положения диссертационной работы нашли отражение в нормативных документах, внедренных в ветеринарную и медицинскую практику:

1. Инструкция на тест-систему «ГРИПП» на основе полимеразной; цепной реакции и дифференциации вирусов гриппа птиц методом ПЦР и ТУ (Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФСертификаты соответствия, за № РОСС R.OB01.B14500 и за № РОСС К.ФВО 1 .В 14513, выдан ФГУ ВГНКИ 13.04.2006 г., Регистрационное удостоверение - № 77-1-3.5-0407 за № ПВР-1-3.5/01553, выдано Департаментом ветеринарии Минсельхоз. РФ от 14.03.2006 г.).

2. . Инструкция на тест-систему «АмплиСенс Influenza virus Н5» на основе

ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для* обнаружения РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа H5N1 (Федеральная Служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Регистрационное удостоверение № JIC-001511 от 14.04.2006; Сертификат производства МИБП № 000592, ФСП 42-0115-7239-05).

3. Методические Указания по лабораторной диагностике гриппа птиц у людей «Организация и проведение лабораторной диагностики заболеваний, вызванных высоковирулентными штаммами вируса гриппа птиц типа А (ВГПА), у людей».

Тест-система «ГРИПП» была включена в Государственный заказ Минсельхоза в 2005 -2007 гг. и в количестве 2500 наборов поставлена в региональные и районные ветеринарные Центры для проведенияшониторинга за гриппом птиц, на территории РФ. Начиная с 2006 г. было произведено и поставлено для нужд Роспотребнадзора около 200 наборов «АмплиСенс Influenza Н5».