Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Конформационные различия нативной и рекомбинантной форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами

РГБ ОД

0 9 СЕН 2002

На правах рукописи

Чубарь Татьяна Анатольевна

КОНФОРМАЦИОННЫЕ РАЗЛИЧИЯ НАТИВНОЙ И РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОРМ ИЗОФЕРМЕНТА С ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ РАДИОХИМИЧЕСКИМИ И КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2002

Работа выполнена на кафедрах радиохимии и химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: кандидат химических наук М.А.Орлова доктор химических наук И.Г.Газарян

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: академик РАО, доктор фармацевтических наук В.А.Попков профессор, доктор химических наук А.В.Шишков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится 14 мая 2002 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.б.

Автореферат разослан: «/¡У » апреля 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат фармацевтических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время прямыми методами расшифровки структуры ферментов являются рентгеноструктурный анализ (РСА) и ЯМР. Оба метода исключительно трудоемки и позволяют получить данные о структуре лишь нескольких вариантов фермента и их комплексов с субстратами или эффекторами. Расшифровка структуры фермента является необходимым, но недостаточным условием понимания деталей каталитического механизма. Во многих случаях требуются серьезные исследования по кинетике действия многочисленных мутантных форм фермента. При отсутствии данных по кристаллической структуре каждого из мутантов сравнение их каталитических свойств и делаемые на этой основе выводы о роли отдельных аминокислотных остатков в катализе предполагают принципиальную неизменность сворачивания белковой глобулы вне зависимости от введенных мутаций. Однако такое предположение не всегда правомерно, особенно если речь идет об аминокислотных остатках, выполняющих структурную роль, таких, как, например, пролин и триптофан. Поэтому разработка достаточно простых и быстрых методов, позволяющих разграничить и оценить структурные и каталитические изменения, вызванные мутациями, является принципиальной для установления механизмов ферментативного катализа.

Одна из существующих проблем при исследовании ферментов и белков состоит в том, что кристаллическая структура в большинстве случаев получена для их рекомбинантных форм. Рекомбинантные белки не являются точным повторением нативных белков, поскольку их синтез, а в ряде случаев и фолдинг, происходят в условиях, далеких от природных. При получении активных белков в чужеродных организмах в большинстве случаев изменяется пост-трансляционная модификация, а при проведении рефолдинга белков из телец включения (т.е. искусственного фолдинга) принципиально возможно появление конформаций, отличающихся от нативной. Разработка и применение новых, более доступных, чем РСА и ЯМР, подходов, позволяющих сопоставлять структуру и свойства нативных и рекомбинантных форм одного и того же белка, а также выявлять структурно-функциональные различия, вносимые направленным мутагенезом, представляет и фундаментальный, и практический интерес. Цели и задачи исследования. Настоящая работа посвящена разработке методов структурно-каталитической характеристики ферментов на основе использования ионизирующей радиации, в частности для получения взаимозависимости структура-функция для нативной пероксидазы хрена и ее рекомбинантных форм. Пероксидаза хрена традиционно применяется в качестве метки в иммуноферментном анализе (ИФА). На основе метода ИФА разрабатываются и внедряются в медицинскую практику тест-

системы для определения различных веществ, таких как гормоны, онкомаркеры, аутоантитела, иммуноглобулины, лекарственные соединения и т. д. Иммуноферменгные наборы используются для целей лабораторной диагностики инфекционных, аллергических и других видов заболеваний, для осуществления лекарственного мониторинга. Так, например, для оценки функционального состояния щитовидной железы в медицине широко применяются ИФА-наборы для количественного определения тиреотропного гормона, тироксина (общего и свободного), трийодтиронина, тиреоглобулина и антител к нему.

Целью данной работы является характеристика структурно-каталитических свойств нативной и рекомбинантных форм пероксидазы хрена и исследование их конформационных различий с помощью методов радиационной инактивации и термической активации трития.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1) получение высокоочищенной активной рекомбинантной пероксидазы, сравнительное изучение каталитических и структурных свойств рекомбинантного и нативного ферментов методами радиационной инактивации и термической активации трития;

2) получение мутантных форм фермента с заменой основных каталитических и структурных аминокислотных остатков и изучение их методами химической кинетики и радиационной инактивации;

3) изучение влияния ионного микроокружения (ионы кальция и магния) на радиационную инактивацию ряда нативных пероксидаз растений (пероксидаза арахиса - ПА, пероксидаза сои - ПС, пероксидаза табака - ПТ и пероксидаза хрена - ПХ).

Научная новизна Впервые с помощью метода радиационной инактивации показано влияние способа очистки рекомбинантного фермента на его конформацию. Впервые продемонстрирована активация пероксидаз под действием радиации.

Метод термической активации трития был применен для сравнительной характеристики нативного и рекомбинантного фермента. Сравнение данных по включению трития в нативный и рекомбинантный ферменты наглядно демонстрирует различия в их доступной поверхности и, следовательно, конформации. Важным является различие, которое проявляется в доступности остатков гистидина, формирующих активный центр фермента и недоступных растворителю по расчетным данным кристаллической структуры, и остатков аргинина. Доступность гистидина в обоих случаях оказалась выше, чем расчетная.

Показано, что олигосахаридные остатки, связанные с нативным ферментом, защищают фермент от инактивации радикальными частицами продуктов радиолиза воды. Продемонстрирована схожесть механизмов

инактивации фермента в ходе реакции (лероксидом водорода и радикалами окисленного субстрата) и в процессе радиолиза. Впервые показано специфическое влияние ионов магния на радиационную стабильность, а следовательно, и структуру различных пероксидаз.

Практическая значимость работы. Показана возможность использования метода радиационной инактивации для сравнительной характеристики нативных и рекомбинантных форм ферментов. Продемонстрирована эффективность метода термической активации трития для сравнительной структурной характеристики разных форм фермента. Особенно важно, что данный метод может быть использован для установления идентичности структур рекомбинантных и нативных препаратов белков, используемых в медицинских целях. Принципиальным для медицины является также возможность применения данного метода для характеристики полипептидных гормонов, физиологическое действие которых основано на распознавании их конформации гормональными рецепторами. Также показано, что сравнительно малые дозы радиации (in vitro) могут как инактивировать, так и активировать ферменты.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на заседании кафедры химической эизимологии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова, научного семинара кафедры радиохимии Химического факультета МГУ, на международных конференциях «Биокатализ-1995» (Суздаль), «Биокатализ-1998» (Пущино), на IV международном симпозиуме «Plant Peroxidases: Biochemistry and Physiology» (Вена, Австрия, 1996) и на V международном симпозиуме «Peroxidase'99» (Колумбус, Огайо, США, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 3 тезисов докладов, а также 1 статья принята в печать,

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 127 страницах, содержит 11 таблиц и 30 рисунков. Список литературы включает 170 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы. Использовали: гемин, ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония), о-фенилендиамин, изопропил-р-D-тиогалактопиранозид, додецилсульфат натрия, трис-

оксиметиламинометан, дитиотрейтол, окисленный глутатион фирмы ''Sigma", США; бактотриптон и дрожжевой экстракт - фирмы "Difco". В работе исследованы следующие ферменты: изофермент С пероксидазы хрена ("Biozyme", Великобритания), пероксидаза сои (ПС) (RZ 1.0,

"Enzymol International Inc", Колумбус, США), пероксидаза арахиса (ПА) (любезно предоставлена проф. Р.Б. ван Хьюсти, Канада) и пероксидаза табака (ПТ) (выделена из трансгенных растений табака). Рекомбинантная пероксидаза хрена (РПХ) с удельной активностью 2000 Е/мг была получена по методу, разработанному на кафедре энзимологии Химического факультета МГУ. Исходная плазмида pSA26I с геном ПХ под контролем (ас-промотора, а также рестриктазы, лигазы и другие ферменты для проведения мутагенеза, включая набор для проведения направленного мутагенеза SculptorTM IVM System были любезно предоставлены фирмой "Amersham Biosciences" (UK).

Мутантные формы пероксидазы хрена, а именно Phe41 His, Trpl 17Phe и Pliel43Glu получены методом направленного мутагенеза одноцепочечной ДНК на кафедре химической энзимологии МГУ. Конечные конструкции секвенированы на приборе фирмы "Applied Biusystem 370А". Синтез, очистка и характеристика мутантных форм РПХ проводились аналогично РПХ дикого типа. Мутантные формы Phe221Trp, Glnl76Glu, Glnl76А1а, Ser35Lys, Ser35Ala, Glu64Ser, Glu64Pro и GInl76Glu/Ser35Lys были любезно предоставлены Dr. M.Tanaka и Prof. I.Morishima (университет Киото, Япония).

Методы физико-химической характеристики ферментов.

Содержание белка определяли спектрофотометрически по формуле 183А2ж75,8А2бо (мкг/мл), которая коррелирует с определением белка по методу Лоури. Гомогенность полученных препаратов тестировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Содержание гема находили по образованию комплекса пиридин -ге.мо-хромоген. Спектр НПХ и его вторую производную получали на спектрофотометре ;'Shimadzu 265FW". Измерения проводили при 20°С в интервале длин волн 2. = 300-750 нм.

Каталитическая активность ферментов. Измерения активности ПХ проводили на спектрофотометре "Shimadzu UV 120-02" при 25°С с различными субстратами: ABTS, KI, о-фенилендиамином, гваяколом и фенол-антипирином.

Кажущиеся константы скорости в реакции окисления ABTS и К1 для НПХ и РПХ определяли из данных по стационарной кинетике, варьируя концентрацию одного из субстратов при фиксированных концентрациях второго субстрата. Для РПХ дикого типа концентрации субстратов варьировали в пределах: 0.015-0.15 мМ ABTS, 0.5-5 мМ KI, 0.010-1 мМ Н2С>2, 0.5-80 нМ фермента. В случае окисления KI регистрировали увеличение оптической плотности на 350 нм, приняв Бз50=26000 М^см'1. Концентрацию Н2О2 определяли по поглощению при 240 нм, пользуясь

коэффициентом экстинкции, равным 43.6 М"'см"', а АВТБ и К1 - по навеске.

Константы Михаэлиса по АВТБ и пероксиду водорода рассчитывали на основе данных по зависимости начальной скорости реакции от концентрации одного субстрата при фиксированной насыщающей концентрации второго субстрата, которую представляли в двойных обратных координатах.

Термическая стабильность и инактивация в ходе реакции. Расчет операционной стабильности выполняли на основе полной кривой усиленной хемилюминесценции, полученной в оптимальных условиях: концентрации люминола, «-йодфенола и пероксида водорода составляли соответственно 1мМ, 50 мкМ и 1,8 мМ в 5 мМ Трис-НС1 буфере, рН 8,6. Измерения проводились на люминометре "\Уа11ас 1251-002", объем образца составлял 1 мл, реакция инициировалась одновременным добавлением растворов субстратов. Концентрация пероксидазы хрена составляла 10"1ПМ.

Инактивацию ферментов (при концентрациях 10~7 и 10"6 М) под действием Н2О2 проводили инкубацией в присутствии 5 мМ Н202 в трис-НС1 буфере (рН 8.0) при 25°С. Отбирали аликвоты и измеряли ферментативную активность с различными донорными субстратами.

Термическую стабильность пероксидаз изучали при инкубации НИХ и РПХ (Ю-7М) при 50 и 80°С в 0.1М фосфатном буфере, рН 8.0.

Радиационная инактивация. Облучение образцов ферментов проводили на у-источнике 137Сз с мощностью дозы Р7= 0.05 Гр-с"1. Использовали Ю^-Ю^М растворы ферментов в 0.1 М Трис-НС1, рН 7.0, или 0,25 М фосфатном буфере, рН 7,0, рН 6,0. При изучении эффектов влияния металлов использовали 0.1 М Кта-ацетатный буфер (рН 6.0), содержащий 5x10"2 М хлорид кальция или магния. Остаточную ферментативную активность измеряли через 1 ч после прекращения облучения (инкубация при ~20°С) для прохождения всех вторичных реакций.

Метод термической активации трития. Для экспериментального описания доступной растворителю поверхности молекул фермента использовали так называемый метод термической активации трития. Введение тритиевой "метки" проводили на кафедре радиохимии МГУ им. М.В. Ломоносова совместно с доц. Бадуном Г.А. В основе метода лежит термическая активация (атомизация) трития при высокой температуре на вольфрамовой спирали. Образцы использовались в виде лиофильно высушенных пленок, давление трития в реакторе составляло р = З,8х10"3мм.рт.ст., I (время обработки образцов тритием) по 15 сек, радиоактивность измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного

счетчика Марк 3 с помощью коктейля ЖС8 типа (эффективность регистрации составляла 50%).

Удаление лабильной "метки" проводили диализом. Аминокислотный анализ очищенных образцов осуществляли на приборе "Hitachi Amino Acid Analyzer" (Япония) после 72-часового кислотного гидролиза (б М HCl, 105°С). Анализ выполнен в отделе хроматографии межфакультетской лаборатории биоорганической химии МГУ под руководством д.х.н. Л.АБаратовой (для каждого случая анализ проводился трижды). Доступность аминокислот оценивали по количеству включенного трития.

Теоретический расчет доступности аминокислот растворителю проводили в программе Insight II, рассчитывая площадь, доступную растворителю (Solvent Assemble Surface Area - SASA), на основе кристаллической структуры рекомбинантной пероксидазы хрена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительное изучение нативной (НПХ) и рекомбинантной пероксидазы хрена (РПХ) методом термической активации трития и радиационной инактивации.

Попытки кристаллизации нативной пероксидазы хрена не увенчались успехом, и кристаллическая структура изоформы С пероксидазы хрена была расшифрована для рекомбинантного фермента (рис.1). В отличие от рекомбинантного негликозилированного фермента, нативный фермент имеет в своем составе 8 олигосахаридных цепей. Поэтому возникает вопрос об идентичности структур в целом и субстрат-связывающих центров в частности в рекомбинантном и нативном ферменте.

Методом стационарной кинетики в широком диапазоне концентраций субстрата ABTS было показано, что у рекомбинантной пероксидазы хрена появляется лимитирующая мономолекулярная стадия, которую можно приписать либо отщеплению окисленного субстрата, либо внутримолекулярному переносу электронов (табл.1). Кинетические данные, представленные в двойных обратных координатах (скорость реакции - концентрация субстрата), имели вид семейства параллельных прямых, описываемых следующим уравнением:

2[E]()/V = 1/1ч[Н202] + l/kj [ABTS] + 1Дч,

г де ki и кз - кажущиеся константы скорости расщепления Н2Ог и окисления ABTS, а 1<4 в случае РПХ - константа скорости мономолекулярной лимитирующей стадии, которой может являться стадия диссоциации продукта, V- скорость ферментативной реакции.

Рис. ]. Кристаллическая структура рекомбинантной пероксидазы хрена дикого типа со стороны дистальной области. Показан консервативный

остаток Тгр! 17.

Константа скорости реакции взаимодействия фермента с пероксидом водорода (к]) несколько выше у рекомбинантного фермента, что позволяет предполагать более оптимальную для расщепления пероксида водорода организацию активного центра в рекомбинантном ферменте по сравнению с нативным. Константы скорости окисления субстрата, к3, у обоих ферментов приблизительно одинаковы.

Таблица 1. Кажущиеся константы скорости окисления ABTS пероксидом водорода, катализируемого НПХ и РПХ.

Константа скорости РПХ Наши данные литературн.данные НПХ

ki/мкМ"1 с"1 4.8 5.9 3.5

kj/мкМ"1 с"' 3.0 3.7 3.5

К,/ с"1 4600 850 _

Близость спектратьных и основных каталитических свойств нативного и рекомбинантного ферментов позволяет считать препараты близкими по структуре, однако результаты, полученные при радиационной инактивации нативного и рекомбинантного фермента, впервые указали на серьезные структурные различия этих белков. На рис.2 и 3 представлены

изменения каталитической активности нативной и рекомбинантной лероксидазы хрена под действием облучения по нескольким субстратам.

Время облучения, ч

Рис.2. Инактивация нативной пероксидазы хрена (10~7 М в 0.1 М Трис-НС1 буфере, pH 8.0) под действием ионизирующего излучения. Активность измерялась по субстратам: гваякол(1), ABTS(2); фенол/антипирин(3); о-фенилендиамин(4).

Характер изменения каталитической активности под действием у-облучения оказался зависимым от выбранного субстрата, что явилось первым указанием на различия в центрах связывания использованных субстратов: иодида, гваякола, ABTS и фенола. Более того, применение различных субстратов позволило достоверно зарегистрировать существенные различия в конформации нативной и рекомбинантной формы, и в частности организации субстрат-связывающих центров. Эти различия могут означать как физическую разницу центров связывания, так и различия в механизме передачи электронов с субстрата на фермент, а именно, протяженность электронно-транспортной цепи (количество аминокислотных остатков, участвующих в переносе электрона) от железа гемина до окисляемого субстрата. С этой точки зрения, характер взаимодействия реакционного центра является наиболее сложным при окислении ABTS, упрощается для гваякола, фенола и, наконец, становится наиболее простым для иодида, который взаимодействует непосредственно с порфириновым кольцом гема.

Время облучения, ч

Рис.3. Инактивация рекомбинантной пероксидазы хрена (10"7 М в 0.1 М Трис-HCl буфере, pH 8.0) под действием ионизирующего излучения.

Активность измерялась по субстратам: йодистый калий (1); фенол/антипирин (2); гваякол (3); ABTS (4).

По радиационной стабильности, а также по термостабильности нативный фермент гораздо устойчивее рекомбинантного по ABTS и гваяколу, но обладает меньшей устойчивостью по отношению к фенол-антипирину и о-фенилендиамину, которые в нагивной ПХ, по-видимому, имеют пространственно близко расположенные субстрат-связывающие центры, что следует из рис. 2 и 3 (видно, что падение каталитической активности по этим субстратам происходит одинаково).

Еще одной особенностью дозового ответа рекомбинантного фермента по сравнению с нативным является наличие для всех субстратов небольших плато в области доз, начиная с 1-3 Гр, т.е. при дозах, которые можно считать условно малыми для реакций in vitro. Инактивация РПХ проходит через образование достаточно стабильного интермедиата. По-видимому, это состояние характеризуется высокой подвижностью конформации, позволяющей компенсировать повреждения при радиационном облучении. Можно предполагать сходство этой конформации с конформацией белка в т.н. состоянии molten globule (расплавленная глобула), которое образуется как стабильный интермедиат при искусственном фолдинге белков. Видимо, именно аналог этого состояния наблюдается на кривых дозового ответа. Различия в конформации рекомбинантного белка в исходном состоянии и состоянии

molten globule наглядно проявляются в кривых дозового ответа. Порядок падения активностей и установление их определенного соотношения в состоянии molten globule позволяет делать выводы о сложности организации того или иного субстрат-связывающего центра в молекулу пероксидазы.

Полученные данные позволяют считать, что в случае окисления ABTS цепь переноса электронов наиболее протяженная, т.к. вероятность ее повреждения при изменении конформации наибольшая. Рост соотношения активностей по фенолу и гваяколу по отношению к активности по ABTS при образовании стабильного интермедиата означает изменение конформации активного центра в сторону более открытой для окисления фенольных субстратов. Соотношение активностей по разным субстратам у стабильного интермедиата аналогично таковому для НПХ. Это позволяет предполагать, что в ходе катализа в природных условиях нативная пероксидаза частично инактивируется и механизм этой инактивации близок к механизму радиационного повреждения (радикальный механизм инактивации).

При длительном облучении происходит разворачивание и модификация аминокислотных остатков, вызывающая глобальные изменения конформации молекулы, которые, в конце концов, приводят к разрушению каталитического центра (диссоциации гема) и полной потере каталитической активности.

Дальнейшие исследования требовали более четкого понимания различий доступности аминокислотных остатков в этих двух формах ферментов.

Исследование структуры нативной пероксидазы и рекомбинантного фермента было проведено с помощью метода термической активации трития, который заключается в обработке поверхности биомолекулы атомарным тритием и анатизе распределения радиоактивности в отдельных аминокислотных остатках. За эталон сравнения были взяты данные по аминокислотному анализу исходной НПХ, которые совпали с расчетными. Атомарный тритий замещает водород в остатках на доступной поверхности белка, которая определяется его конформацией. Изменения распределения тритиевой «метки» по аминокислотным остаткам по сравнению с контрольным образцом указывают на изменение доступной поверхности и, следовательно, конформационного состояния.

На основании данных по кристаллической структуре был проведен теоретический расчет доступности растворителю аминокислотных остатков в рекомбинантном ферменте. На рис. 4 представлен профиль доступности (среднее значение доступности) аминокислотных остатков рекомбинантной пероксидазы хрена. Наибольшей доступностью характеризуются 14 из 19

остатков Arg, 19 из 26 Asn, 7 из 13 Gin, 10 из 34 Leu, 8 из 17 Pro, 11 из 23 Thr. Малодоступными являются остатки Ala, Gly, Ile, Met, Phe, Ser, Туг, Val и Lys.

Asr Aso Thr Ser Gin Pro Gly Ala Val Ile leu Туг Phe Lys His Arg Met аминокислотные остатки

Рис. 4. Теоретический расчет доступности аминокислот РПХ для растворителя.

На рис. 5 представлены результаты распределения трития в аминокислотных остатках нативной и рекомбинантной пероксидазы до и после облучения на у-источнике дозой 3 Гр. Эта доза была выбрана потому, что в случае рекомбинантного фермента она вызывает образование стабильного интермедиата, профиль субстратной специфичности которого сходен с таковым для нативного фермента.

Удельная радиоактивность гидрофобных аминокислотных остатков -валина, изолейцина и лейцина - в РПХ оказалась значительно выше, чем в НПХ. Это указывает на защитный эффект олигосахаридных цепей и гораздо более высокую гидрофобность молекулы рекомбинантной пероксидазы по сравнению с нативным ферментом. Структуру РПХ отличает плотная упаковка, которая нарушается при облучении фермента, при этом доступность большинства аминокислотных остатков увеличивается. Наиболее значительно растет доступность остатков аспарагиновой и глютаминовой кислот, что свидетельствует о большей экспонированности заряженных аминокислотных остатков и, следовательно, об уменьшении гидрофобности поверхности. Таким образом, облучение, по-видимому, приводит к разворачиванию плотной гидрофобной упаковки молекулы РПХ, ее разрыхлению и увеличению гидрофильности.

35% -

30%

25%

;ПРПХ0 '■РПХ1 □ НПХ0: ШНПХ1

20%

15%

0%

5%

rifill [j.rJI

Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Val Ile Leu Туг Phe Lys His Arg

Рис. 5. Распределение трития в аминокислотных остатках НПХ и РПХ до и после у-облучения. По оси абсцисс - аминокислотные остатки, по оси ординат - распределение радиоактивности в процентном выражении.

ПХО - тритаевая бомбардировка исходного препарата, ПXI - тритиевая бомбардировка после у-облучения.

В целом, профиль удельной радиоактивности аминокислотных остатков как в НПХ, так и в РПХ имеет некоторые различия с профилем средней доступности, рассчитанной на основании кристаллической структуры, однако большие различия наблюдаются в случае РПХ. К ним относятся более высокая, чем ожидалось, радиоактивность остатков гистидина. Приходится предположить, что доступность гистидинов (His 170, координирующий тем, His40, находящийся глубоко внутри активного центра, и His42 - каталитический гистидин) в молекуле пероксидазы хрена в растворе значительно превосходит таковую в кристалле. Другими словами, активный центр пероксидазы, включающий все три мало доступных растворителю остатка гистидина, в растворе достаточно сильно экспонирован. После облучения РПХ доступность остатков гистидина не меняется. Таким образом, разрыхление структуры и увеличение гидрофильности поверхности рекомбинантного фермента практически не меняет уже первоначально высокой экспонированности каталитического центра фермента.

В случае нативного фермента наиболее доступны замене Fia тритий остатки треонина, лейцина и пролина, что совпадает с расчетными данными по доступности этих аминокислотных остатков в

рекомбинантном ферменте. Уровень радиоактивности изолейцина, валина и лейцина оказывается намного ниже, чем в рекомбинантном ферменте, что может говорить не только о различиях фолдинга, но и об экранировании этих остатков олигосахаридными цепями. Радиоактивность гистидина в НПХ тоже значительно ниже, чем в рекомбинантном ферменте, но все же выше расчетной. Причиной меньшей экспонированности остатков гистидина в НПХ может служить как его экранирование олигосахаридной «шубой» фермента, так и имеющиеся модификации гистидина вследствие функционирования нативного фермента в растениях. Облучение НПХ приводит почти к полной недоступности этого гистидина для замены на тритий. Это .может быть следствием модификации остатка при облучении и/или «проседания» активного центра при сильных изменениях конформации, вызванных облучением. Характер изменения доступности гистидина в нативном и рекомбинантном ферменте наглядно демонстрирует принципиальные конформационные различия, существующие между двумя исходными формами фермента.

Облучение НПХ наиболее сильно влияет на доступность остатков гистидина, пролина и аргинина. Это в какой-то мере может свидетельствовать о том, что функционирование фермента в растениях уже имело определенные структурные последствия, а именно произошла радикальная модификация фермента под действием радикальных продуктов окисления природных фенольных субстратов.

В случае остатков аргинина облучение приводит к росту их доступности приблизительно в 2 раза в рекомбинантном ферменте и в 4 раза в нативном, при сравнимом уровне их радиоактивности до облучения. Сайты гликозилирования в нативном ферменте расположены вблизи 10 из 14 высокодоступных остатков аргинина (восемь сайтов Asn-X-Ser (Tlir), за исключением аминокислотных остатков 286-288), поэтому меньшую доступность аргинина в нативном ферменте можно отнести на счет экранирования их олигосахаридами. Увеличение доступности аргинина после облучения происходит за счет увеличения экспонированности малодоступных остатков аргинина - 38, 123, 183, 298 - в число которых входит и каталитический аргинин. Учитывая, что Arg38 играет существенную роль в связывании молекулы пероксида водорода и фенольных субстратов, его повышенная экспонированность должна отрицательно сказаться на катализе расщепления пероксида водорода в активном центре фермента.

Остатки Ser в рекомбинантном ферменте оказались практически недоступны даже после облучения, хотя расчетная доступность этих

остатков в РПХ достаточно высокая. В то же время в НПХ доступность серина примерно соответствует расчету и после облучения падает.

Субстратная специфичность рекомбинантного фермента отличается от субстратной специфичности нативного фермента в сторону занижения каталитической активности по фенольным субстратам, окисляющимся в полости связывания тема, в то время как каталитическая активность по ABTS, окисляющемуся по цепи переноса электронов, резко возрастает, указывая на компактность фолдинга молекулы.

Таким образом, удалось выявить аминокислотные остатки, существенно изменяющие свою доступность как в растворе по сравнению с кристаллом, так и при получении рекомбинантного фермента. Данные использованных методов наглядно демонстрируют различия конформаций натнвного и рекомбинантного фермента как на уровне молекулы, так н на уровне организации активного центра. Конформационные отличия этих форм состоят в большей гидрофобности и более плотной упаковке молекулы рекомбинантного фермента, что приводит к падению активности по фенольным субстратам и повышению активности по ABTS. Гликозилироваиие нативного фермента значительно экранирует его поверхность, выполняя защитную функцию. Следует считать, что доступность каталитического гистидина в молекуле пероксидазы значительно превосходит расчеты, сделанные на основании кристаллической структуры.

2. Сравнительное изучение мутантных форм пероксидазы хрена методом радноэнзимологии.

Как видно из предыдущей главы, метод радиационной инактивации ферментов, как и метод термической активации трития, позволяет фиксировать даже небольшие различия в конформации молекул. Поэтому дозовый ответ на облучение указывает на конформационные изменения, вносимые, в частности, даже единичной аминокислотной заменой.

В дальнейших экспериментах роль отдельных аминокислотных остатков изучалась методом радиационной инактивации мутантных форм ПХ, полученных методом генной инженерии. Выбор мутаций был проведен на основе следующих соображений. При замене Trpll7Phe молекула лишается единственного остатка триптофана, при этом выясняется его значимость как для фолдинга фермента, так и для каталитического механизма; при замене Phe221Trp появляется возможность донирования электрона на порфириновое кольцо и образование радикала на белке вблизи активного центра, что позволяет оценить вклад дополнительного радикала в стабильность фермента при

облучении; остаток Glu64 участвует в связывании структурного иона кальция, поэтому его замена на незаряженные остатки пролина - Glu64Pro и серина - GIu64Ser должна сильно повлиять на конформацию дистальной области молекулы ПХ и вызвать ее «проседание» в сторону гема; замены GInl76Glu, Glnl76Ala, Ser35Lys, Ser35Ala и Glnl76Glu/Ser35Lys изменяют электростатическое взаимодействие в окружении пропионатов гемина, которые предположительно находятся вблизи многих субстрат-связывающих центров. Мутант Phel43GIu, который имеет на входе в активный центр молекулы отрицательный заряд, позволяет продемонстрировать затруднение проникновения в активный центр продуктов радиолиза воды. Исследование мутантных форм пероксидазы проводили с двумя донорными субстратами: с гваяколом, который предположительно связывается на белке вблизи гема, и с ABTS, окисление которого происходит по цепи переноса электронов и поэтому более чувствительно к изменениям структуры всей молекулы.

На рис.6 (а-е) представлены дозовые ответы этих мутантов в сравнении с рекомбинантным ферментом.

Прежде всего, следует отметить, что существует различие дозовых ответов самого рекомбинантного фермента, полученного с использованием разных схем очистки.

При очистке рекомбинантного фермента ионообменной хроматографией, выход которой составляет чуть более 50%, образуется форма, дающая стабильно воспроизводимую активацию при облучении. Это позволяет считать такой препарат гораздо более плотно упакованным по сравнению с препаратом, полученным гель-фильтрацией. Таким образом, следует учитывать, что в разных экспериментах плотность упаковки рекомбинантной формы может изменяться. Данный пример иллюстрирует чувствительность метода радиационной инактивации к конформационным изменениям даже при смене схемы получения препаратов и показывает его перспективы для установления идентичности (или различий) ферментных препаратов, что имеет наибольшие перспективы при анализе медицинских препаратов.

На рис.6а видна активация РПХ по обоим субстратам. Уже упоминалось выше, что субстрат-связывающий центр ABTS осуществляет взаимодействие с каталитическим центром по цепи переноса электрона, и для его проявления необходимы определенный набор и расположение аминокислотных остатков, осуществляющих транспорт электрона. Любая мутация должна влиять на эту структурную взаимосвязь, что и можно наблюдать на рис.6. Достаточно близкую картину к дозовому ответу исходного РПХ мы видим для двойного мутанта GInl76GIu/Ser35Lys, где появляются два противоположно заряженных остатка и, таким образом,

нет нескомпенсированного заряда, способного создавать затруднения или преимущества для проникновения продуктов радиолиза воды.

а б

У/i ■ I ■ I .......

О 5 10 13 20 25 30 50 1СО 150 2СЮ 250 300 Э50 *С0

ДГР

-1-.-1-.-!-//'■ ......... . I . I

О' 5 10 50 100 150 20 250 300 350

ДГр

50 1С0 150 200 250 ЭТО ЭЮ

ДГр

£5120'

<г

I . I /а

О 5 10 50 110 150 2С0 250 ЗСО 350

ДГр

# 300

О 5 10

100 ЗХ 300

ДГр

о в га « m а 3D и ДГр

Рис.6. Зависимость активности фермента ([Е]=Ю"7М) от полученной дозы облучения по двум субстратам (1,3 - ABTS, 2,4 - гваякол): а - РПХ, б -Ser35Lys (1,2) и Ser35Ala (3,4), в - GlnGlu/SerLys, г - Phe221Trp (1,2) и Trpl 17Phe (3,4), д - Glu64Pro (1,2) и Glu64Ser (3,4), е - Glnl76Ala (1,2) и Glnl76Glu (3,4). Буфер трис-HCl, pH 7.0.

<

Наиболее близкий к исходной РПХ дозовый ответ по гваяколу имеют мутант Glu64Pro и двойной мутант. Полный анализ дозовых кривых позволяет предположить, что увеличение жесткости в области над активным центром значительно стабилизирует фермент по отношению к ннактивирующим факторам. Радиационная инактивация подтверждает важную структурную роль остатка пролила в ужесточении и поддержании конформации белков. Кроме того, есть основания полагать, что субстрат-связывающий центр гваякола находится вблизи 64 остатка и зависит от экспонированности остатка 176, т.к. в молекулах Glnl76Glu и Glnl76Ala полностью исчезают активация и чередующиеся изменения каталитической активности в дозовом ответе по этому субстрату, т.е. существует взаимосвязь остатков 64, 176 и гема в молекуле РПХ.

Затрагивающие конформацию изменения происходят при исчезновении единственного остатка Тгр в мутанте Trpll7Phe и при появлении лишнего Тгр в мутанте Phe221Trp. Наблюдается сильное упрощение дозового ответа с одновременной стабилизацией фермента. Кинетические и радиационные данные указывают на возможное участие остатков триптофана в каталитическом процессе как внутреннего донора электрона.

Появление полярных остатков также стабилизирует молекулу фермента, очевидно, за счет образования водородных связей и реализации более закрытой структуры в этой области молекулы.

При замене на Ala в мутантах Glnl76Ala и Ser35AIa наблюдались наибольшие колебания ферментативной активности на кривой дозового ответа, что говорит о том, что при замене на аланин остатков, занимающих больший объем, создается более «рыхлая» структура, чувствительная к внешнему воздействию. Кроме того, на дозовом ответе этих мутантов не наблюдается появления устойчивого интермедиата, что говорит о нарушении внутримолекулярных взаимодействий. Однако в большинстве мутантов интермедиат образуется, т.е существует, по крайней мере, одно промежуточное радиационно-устойчивое состояние при разворачивании молекулы РПХ и молекул, содержащих единичные мутации. При этом под действием пероксида водорода образования такого состояния не наблюдалось. Следовательно, для его образования не достаточно изменений состояния железа гема, а необходим некоторый набор точечных повреждений полипептидной цепи. Так как для бестриптофанового мутанта образования этого интермедиата не обнаружено, а есть лишь длительный лаг-период с последующей стандартной экспоненциальной инактивацией, можно предполагать, что образование интермедиата связано с модификацией единственного остатка Тф. Для мутанта Phel43Glu также не было зафиксировано образования интермедиата при наблюдающемся

повышении общей радиостабильности. Это свидетельствует о защите активного центра отрицательным зарядом от атаки продуктами радиолиза воды, гидратированным электроном и ОН радикалами.

В целом, мутации остатка 01п-176 инициируют конформационные изменения, приводящие к большей доступности центра связывания субстратов ПХ, особенно гваякола.

3. Влияние ионов кальция и магния на радиационную стабильность пероксидаз растении.

Для того чтобы понять, как может влиять на активность и стабильность фермента его ионное микроокружение, мы исследовали влияние ионов кальция и магния на радиационную стабильность пероксидазы хрена и пероксидазы табака в сравнении с пероксидазами сои и арахиса. Полученные кривые представлены на рис.7.

4 е ' обл, ч

2 I обл, ч

а (%:

100

1 обл, ч

А 1*4)7

а.

40 4-

А----

13

100 (обл, мин

Рис. 7. Изменение каталитической активности пероксидаз под действием радиации по отношению к исходной: / - в отсутствие ионов металлов; 2 - в присутствии 5-Ю"2 М хлорида кальция; 3 - в присутствии 5-10"2 М хлорида

магния. Ру= 180 Грч"1.

я

Вил кривых указывает, по крайней мере, на двухстадийность процесса радиационной инактивации в присутствии ионов металлов. На первой стадии происходит насыщение поверхности ионами металла либо адсорбционное, либо с образованием так называемых "карманов". Их образование известно для ионов кальция. Это приводит с одной стороны к увеличению общей стабильности, но с другой - к фиксации как бы измененного (неправильного) конформационного состояния, что изменяет доступность субстрат-связывающих центров и величину каталитической активности по соответствующим субстратам.

Влияние кальция наибольшим образом сказывалось на стабильности ПС и ПТ при малых дозах и не влияло на ПХ, магний сильно изменял дозовый ответ ПА и стабилизировал ПХ (рис.7). На этой же стадии существенную роль играет образующийся заряд на глобуле (pl), который изменяет возможность проникновения продуктов радиолиза воды к активному центру, то есть, величина изоэлектрической точки фермента является принципиальной характеристикой при наличии в растворе ионов металлов.

Вторая стадия связана с глубокой модификацией аминокислотных остатков, ведущих к разворачиванию и разрушению связей, удерживающих кальций в молекулах пероксидаз. На этой стадии избыток ионов металлов может вызывать значительную стабилизацию. В этих условиях ответ на вопрос о механизме изменений может дать величина Км. Ее величины для ПТ в присутствии и отсутствие ионов металлов и облучении приведены в табл. 2. При этом изменение Км по ABTS указывает на конформационные изменения, а по пероксиду водорода - на модификацию активного центра. Величина Км не меняется при облучении до 90 Гр, однако уже само добавление иона металла, маю влияя на Км по ABTS, значительно изменяет Км по Н202.

Таблица 2. Величина Км (ммоль * л"1)

1 i Без катионов с Mg2+ С Са2+

По Н202 0,22 ± 0,02 0,4 ± 0,02 0,13 + 0,02

По ABTS 1,1 ± 0,1 1,3 ±0,01 1,3 + 0,1

; D = 15 Гр (Н2о2) 0,22 ± 0,02 0,4 ± 0,02 0,13 ±0,1

1 D = 15 Гр (ABTS) 1,10 ± 0,1 1,3+0,01 1,28 ±0,05

Таким образом, влияние кальция на радиационную стабильность пероксидаз связано как с компенсацией отрицательного заряда на поверхности молекулы и увеличением доступности активного центра для

атаки активными частицами, получающимися при радиолизе воды, так и с изменением конформации белка, что может вызывать дестабилизацию при малых дозах облучения, но в случае ПТ не влияет на положение центра связывания ABTS. Влияние магния на радиационную стабильность пероксидаз, впервые показанное в данной работе, по-видимому, определяется структурой активного центра молекулы пероксидазы. В случае ПХ и ПТ магний способствует стабилизации фермента, в случае ПС - оказывает такое же влияние, как кальций, а в случае ПА - вызывает резкую дестабилизацию фермента, что говорит о важности поверхностного заряда ПА для сохранения правильной конформации активного центра.

ВЫВОДЫ

1 По данным методов радиационной инактивации и термической активации трития структура нативного и рекомбинантного изоферментов С пероксидазы хрена различается. Рекомбинантный фермент отличает большая доступная поверхность глобулы в целом и собственно активного центра. У рекомбинантного фермента наиболее экспонированы гидрофобные остатки, что объясняет повышенную гидрофобность фермента.

2. Впервые продемонстрирована более высокая по сравнению с ожидаемой доступность каталитического гистидина как в нативном, так и в рекомбинантном ферменте, что позволяет говорить об отличиях структуры фермента в кристалле и в растворе в сторону более открытого (подвижного) активного центра в растворе.

3. Показана защитная роль олигосахаридных цепей у нативного фермента. Показано экранирование остатков аргинина, находящихся вблизи сайтов гликозилирования в нативном ферменте.

4. При радиационной инактивации РПХ существует по крайней мере один устойчивый интермедиа г. Предполагается, что его образование связано с наличием в структуре триптофана-117 и является следствием его радикальной модификации.

5. Показана роль остатков 64 и 176 в дозовых ответах по гваяколу. Высказано предположение о формировании центра связывания гваякола вблизи остатка 179 и более доступного пропионага гемина.

6. Впервые демонстрируется возможность значительной стабилизации фермента к действию радикатьной инактивации введением дополнительного остатка пролина в дистальный домен (Glu64Pro).

7. Воздействие ионов металлов на радиационную стабильность разделяется на две стадии: на первой их сенсибилизирующее или радиопротекторное действие связано с величиной изоэлектрической точки фермента и способностью ионов металлов образовывать

«карманы» в структуре белка. На второй стадии - разворачивания белка - ионы металлов являются радиопротекторами, за исключением сильного дестабилизирующего действия ионов магния на пероксидазу арахиса.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Орлова М.А., Чубарь Т.А., Фечнна В.А., Газарян И.Г. Влияние ионов кальция и магния на радиационную инактивацию пероксидаз растений.// Изв. РАН, Сер. хим. - 1998. - №3. - С,522-526 [Engl.Tratis.: Russ. Chem. Bull. - 1998. - V.46. - 505-509]

2. Чубарь T.A., Орлова М.А., Газарян И.Г., Фечина В.А., Мареева Е.А., Игнатенко О.В., Савицкий П.А., Рожкова A.M., Тишков В.И. Роль остатков триптофана в радиационной чувствительности ферментов на примере пероксидазы хрена.// Изв. РАН, Сер. хим. - 1999. - №12. -С.2355-2358 [Engl. Transl.: Russ.Chem.Bull. - 1999. - V.48. - 2330-2333]

3. Игнатенко О.В., Газарян И.Г., Мареева Е.А., Чубарь Т.А., Фечина В.А., Савицкий П.А., Рожкова A.M., Тишков В.И, Каталитические свойства бестриптофанового мутанта пероксидазы хрена.// Биохимия. - 2000. -Т.65. - Вып.5. - С.685-690.

4. Cliubar'. Т.А., Orlova М.А., Gazaryan Г G., Fechina V.A., Mareeva E.A., Ignatenko О. V., Savitskiy P.A., Rojkova A.M., Tishkov V.I. Tryptophanless recombinant horseradish peroxidase: stability and catalytic properties.// Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1999. - V.262. - P.297-301.

5. Орлова M.A., Чубарь Т.А., Игнатенко О.В., Газарян И.Г. Сравнительное изучение мутантных форм пероксидазы хрена методом радиоэнзимологии.// Изв. РАН, Сер. хим., в печати.

6. Орлова М.А., Газарян И.Г., Волкова С.В., Чубарь Т.А., Изучение особенностей структуры пероксидазы хрена и пероксидазы табака методом радиационной инактивации. // Ш съезд по радиационным исследованиям. Тезисы докладов. М. - 1997. - Т.З. - С.21-22

7. Orlova М.А., Cliubar' Т.А., Mareeva Е.А., Fechina V.A., Radioenzymology of native and recombinant plant peroxidase. // International Conference "Peroxidase-99". Abstracts. Columbus, USA. - 1999. -N35

8. Orlova M.A., Gazaryan I.G., Chubar T.A., Ignatenko O.V., Fechina V.A., Radioenzymological study on peroxidase mutant fonns // International Conference "Biocatalysis-2000". Abstracts. Moscow. - 2000. - P. 138.

Чубарь Татьяна Анатольевна (Россия). Конформационные различия нативной и рекомбинантной форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами.

Сравнительное изучение нативного и рекомбинантного фермента пероксидазы хрена методами радиационной инактивации и тритиевой планиграфии продемонстрировало существенные конформационные различия между ними, а именно, большую гидрофобность и доступность поверхности рекомбинантного фермента. Показана экранирующая роль олигосахаридных цепей нативного фермента. Впервые продемонстрирована высокая доступность каталитического гистидина как в нативном, так и в рекомбинантном ферменте, что позволяет говорить о различной доступности активного центра фермента в кристалле и в растворе. Показана роль остатка 176 в дозовом ответе по гваяколу. Высказано предположение о формировании центра связывания гваякола вблизи остатков 176, 179 и более доступного пропионата гемина. Впервые демонстрируется возможность значительной стабилизации фермента к действию радикальной инактивации введением дополнительного остатка пролина в дистальный домен (Glu64Pro).

Tatyana A.Chubar (Russia). Conformational differences between native ant recombinant forms of horseradish peroxidase С showed by means of radiochemistiy and kinetics.

Comparative studies of native and recombinant horseradish peroxidase by means of radiation-induced inactivation and tritium planigraphy show significant conformational differences between the two enzymes. In particular, the surface of recombinant enzyme moleculae is more hydrophobic and more accessible for solvent. The screening effect of oligosaccharide chams in native enzyme has been demonstrated. For the first time, high accessibility of catalytic histidine both in recombinant and native enzymes has been shown, which can be interpreted as different active site accessibility in enzyme crystal and in solution. The residue 176 plays an important role in dose response measured with guaiacol as a substrate. It is proposed that the binding site for guaiacol is adjacent to residues 176, 179 and the more accessible heme propionate. The possibility of pronounced enzyme stabilization with respect to radiation-induced inactivation by introducing of additional proline reside into the distal domain (Glu64Pro) has been shown.

До настоящего времени прямыми методами расшифровки структуры ферментов являются рентгеноструктурный анализ (РСА) и ЯМР. Оба метода исключительно трудоемки и позволяют получить данные о структуре лишь нескольких вариантов фермента и их комплексов с субстратами или эффекторами. Расшифровка структуры фермента является необходимым, но недостаточным условием понимания деталей каталитического механизма. Во многих случаях требуются серьезные исследования по кинетике действия многочисленных мутантных форм фермента. При отсутствии данных по кристаллической структуре каждого из мутантов сравнение их каталитических свойств и делаемые на этой основе выводы о роли отдельных аминокислотных остатков в катализе предполагают принципиальную неизменность сворачивания белковой глобулы вне зависимости от введенных мутаций. Но очевидно, что введение замен вблизи активного центра может серьезно повлиять на его структуру. Поэтому важными для понимания каталитических эффектов мутантных форм являются методы, дающие представления о структуре молекул.

Рекомбинантные белки не являются точным повторением нативных белков, поскольку их фолдинг происходит в искусственных условиях При этом могут изменяться их физико-химические и биологические свойства. Разработка новых, более доступных, чем РСА и ЯМР, подходов, позволяющих сопоставлять структуру и свойства нативных и рекомбинантных форм одного и того же белка, а также выявлять структурно-функциональные различия, вносимые направленным мутагенезом, представляет большой фундаментальный и практический интерес.

В данной работе использован сравнительно новый экспериментальный метод исследования пространственной структуры биологических макромолекул и надмолекулярных структур - метод термической ак- "вации трития, являющийся основой метода тритиевой планиграфии. Этот метод разработан для изучения доступной поверхности и структуры исследуемого объекта и получения меченых соединений. Существует большое количество его приложений к решению широкого круга задач современной молекулярной и физико-химической биологии. К ним можно отнести новый и весьма эффективный способ получения меченных тритием препаратов. Особенно важным является применение метода для получения уникальных меченых соединений, потребность в которых в биологии, медицине и смежных областях достаточно высока. При этом метка может вводиться в готовое сложное соединение без использования предшественников.

Что особенно важно, метод термической активации трития дает возможность изучения поверхности раздела фаз газ - твердое тело, газ -жидкость и адсорбционных слоев, так как структура поверхности и ее свойства привлекают к себе серьезное внимание исследователей Это связано с тем, что малая толщина реакционного слоя (3 А) позволяет не только определить молекулярный состав поверхности, но и ориентацию молекул, например различить отдельные метиленовые группы в составе углеводорода, в разной степени удаленные от поверхности. Сегодня развит широкий спектр методов исследования поверхности, основанных как на измерении физических параметров, так и спектральных и химических с разрешающей способностью анализа от единиц до нескольких десятков ангстрем. Тритиевая планиграфия занимает в этой череде методов свое законное место.

Имеется удачный опыт применения тритиевой планиграфии для исследования строения различного рода мембран и мембранных систем, например, при изучении бислойных мембран асимметричного состава, липосом, мицеллярных структур, мембран животных и растительных клеток и т.п. При рассмотрении надмолекулярных нуклеопротеидных комплексов (фаги, вирусы, рибосома) до сих пор исследователи ограничивались изучением белковых компонентов, не анализируя включение метки в нуклеиновые кислоты. Между тем тритиевая планиграфия позволяет определить индивидуальные нуклеотиды в их последовательности, и в дальнейшем можно получить информацию об их стерической доступности, то есть о пространственной структуре молекулы нуклеиновой кислоты и экранировке ее участков другими компонентами комплекса. То, что нуклеиновые кислоты «выдерживают» условия тритиевой бомбардировки, было показано в ряде экспериментов, в которых меченая молекула РНК сохраняла свою способность к специфическим взаимодействиям, например реконструкции малой 30S субчастицы рибосомы E.coli.

Таким образом, современная тритиевая планиграфия - это общий метод исследования биочастиц неизвестной стереоструктуры. В данной диссертации показаны возможности метода для уточнения структурных деталей процессов инактивации, вызванных, в частном случае, радиационным облучением фермента с известной кристаллической структурой. Такое совокупное использование ионизирующего излучения является новым направлением, особенно учитывая, что метод радиационной инактивации является одним из наиболее чувствительных к изменению структуры биомолекул.

Объектом исследования была выбрана пероксидаза хрена, доступная в нашей лаборатории как в нативной форме, так и в рекомбинантной дегликозилированной форме. Пероксидаза хрена традиционно применяется в качестве метки в иммуноферментном анализе (ИФА) На основе метода ИФА разрабатываются и внедряются в медицинскую практику тест-системы для определения различных веществ, таких как гормоны, онкомаркеры, аутоантитела, иммуноглобулины, лекарственные соединения и т д Иммуноферментные наборы используются для целей лабораторной диагностики инфекционных, аллергических и других видов заболеваний, для осуществления лекарственного мониторинга. Так, например, для оценки функционального состояния щитовидной железы в медицине широко применяются ИФА-наборы для количественного определения тиреотропного гормона, тироксина (общего и свободного), трийодтиронина, тиреоглобулина и антител к нему Таким образом, в данной работе на примере хорошо изученного и широко используемого в медицине фермента продемонстрированы возможности применения радиохимических методов, и в частности метода термической активации трития и метода радиационной инактивации, для целей сравнительной характеристики нативных и рекомбинантных препаратов белков и определения идентичности или, наоборот, различий одного и того же препарата

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

1. По данным радиационной инактивации и термической активации трития структура нативного и рекомбинантного изоферментов С пероксидазы хрена различается. Рекомбинантный фермент отличает большая доступная поверхность глобулы в целом и собственно активного центра. У рекомбинантного фермента наиболее экспонированы гидрофобные остатки, что объясняет повышенную гидрофобность фермента.

2. Впервые продемонстрирована более высокая доступность каталитического гистидина как в нативном, так и в рекомбинантном ферменте, что позволяет говорить об отличиях структуры фермента в кристалле и в растворе в сторону более открытого активного центра в растворе.

3. Показана защитная роль олигосахаридных цепей у нативного фермента. Показано экранирование остатков аргинина, находящихся вблизи сайтов гликозилирования в нативном ферменте.

4. При радиационной инактивации рекомбинантной ПХ существует по крайней мере один устойчивый интермедиат. Предполагается, что его образование связано с наличием в структуре триптофана-117 и является следствием его радикальной модификации.

5 Показана роль остатка 176 в дозовом ответе по гваяколу Высказано предположение о формировании центра связывания гваякола вблизи остатков 176, 179 и более доступного пропионата гемина с участием в транспортной цепи электронов остатков 64 и 176.

6. Впервые демонстрируется возможность значительной стабилизации фермента к действию радикальной инактивации введением дополнительного остатка пролина в дистальный домен (01и64Рго).

7. Воздействие ионов металлов на радиационную стабильность разделяется на две стадии: на первой их сенсибилизирующее или радиопротекторное действие связано с величиной изоэлектрической точки фермента и способностью ионов металлов образовывать «карманы» в структуре белка. На второй стадии - разворачивания белка - ионы металлов являются радиопротекторами, за исключением сильного дестабилизирующего действия ионов магния на пероксидазу арахиса.