Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Комплексы физиологически активных веществ с ионами меди активных центров церулоплазмина

На правах рукописи

ВОЛКОВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

КОМПЛЕКСЫ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ИОНАМИ МЕДИ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА.

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань - 2006

•А

Работа выполнена на кафедре «Управления экономики фармации и фармацевтическойтехнологии» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородской Государственной Медицинской Академии Российского федерального агентства здравоохранения и социального развития

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, Мельникова Нина Борисовна

доктор химических наук, профессор Глебов Александр Николаевич, доктор химических наук, профессор Гармонов Сергей Юрьевич

Ведущая организация: Институт металлоорганической химии

им. Г.А. Разуваева РАН

Защита диссертации состоится 2 марта 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 в Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420029, Казань, ул. Сибирский тракт, 12, аудитория Д - 414.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «¿У» ¿¡/С-бя^оЛ 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук, доцент

Захаров В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Медьсодержащие ферменты участвуют в различных биологических процессах и необходимы для роста организма, нормального функционирования иммунной системы, метаболизма углеводов и липидов. Одним из важных ферментов плазмы крови человека является медьсодержащий белок - церулоплазмин, относящийся к классу «голубых» оксццаз. Церулоплазмин регулирует обмен меди в организме, обеспечивает эффективный транспорт меди к тканям и выведения её из организма. Кроме того, он проявляет ангиоксидантные свойства и является своего рода «функциональным депо» для безопасного хранения меди. В случае острых и хронических заболеваний отмечается высвобождение больших количеств меди, тогда как потребность организма в медьсодержащих факторах возрастает.

Недостаток ионов меди в организме может быть вызван нежелательным хелатированием ионов меди физиологически активными веществами, используемыми в терапии. Особенно этот эффект проявляется при использовании токсических противоопухолевых препаратов. В связи с этим, возникает проблема защиты медьсодержащих каталитических центров церулоплазмина и сохранения его антиоксидантных свойств.

Одним из путей защиты медьсодержащих активных центров фермента является ассоциация ионов меди с физиологически активными веществами, не проявляющими токсического действия. Требования к выбору защитных физиологически активных веществ определяются:

• термодинамикой конкурентного комплексообразования токсического противоопухолевого лекарственного вещества и выбранного защитного вещества (константы ассоциации или устойчивости комплексов),

• кинетическими особенностями ассоциации нетоксичного физиологически активного вещества с ионами меди активного центра церулоплазмина

• взаимодействием физиологически активных веществ и их медьсодержащих комплексов с липоф ильными и гидрофильными фрагментами биомембран.

К лекарственным веществам, способным защищать медьсодержащие каталитические центры ферментов, относятся полифенольные флавоноиды.

*В руководстве диссертационной работой принимала участие доктор фармацевтических наук, проф. Кононова Светлана Владимировна

Защитное действие флавоноидов связывают с их высокими антиоксидантными свойствами и способностью полифенолов образовывать хелатные комплексы с ионами металлов. Из полифенольных флавоноидов в медицинской практике наиболее широко применяется природный антиоксидант - дигидрокверцетин, не проявляющий токсического действия в терапевтических дозах.

В связи с вышеизложенным, образование комплексов физиологически активных веществ с ионами меди, способных защищать или ингибировать активные центры ЦП, является актуальной проблемой.

Целью настоящей работы является исследование защитного действия полифенольным флавоноидом — дигидрокверцетином (ДКВ), активных центров церулоплазмина (ЦП) при противоопухолевой терапии доксорубицином (ДР), а также выявление путей снижения токсического действия ДР. В задачи исследования входило:

• исследование термодинамики комплексообразования и ассоциации ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП в водном растворе, а также кинетических особенностей взаимодействия ДКВ с ЦП;

• оценка специфической активности ЦП в присутствии ДР и ДКВ;

• разработка методики анализа комплексов ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП;

• изучение характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си2+ - ионов водных растворов солей и ЦП на моделях липидных и гидрофильных фрагментов биомембран;

• разработка полимерсодержащей липосомаяьной формы препаратов ДР, ослабляющей унос ионов меди ЦП.

Научная новизна Впервые доказано образование комплексных соединений ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП. Предложен методологический подход с привлечением теории Скечарда и использованием безразмерной величины К - ответа системы, позволяющий в первом приближении количественно оце дить термодинамическую константу ассоциации ДКВ К(, с ионами меди активного центра ЦП.

Разработана к етодика анализа комплексов ДР с ионами меди, рассчитана термодинамическая константа устойчивости Кр комплексов ДР с

4

ионами меди каталитического центра при стехиометрии 1:1. Показано, что величина Кр значительно превышает (в«1000раз) величину Ка.

Впервые на основе изучения межфазного и поверхностного натяжения реакционных смесей ЦП и физиологически активных веществ оценено гидрофильно-липофильное соотношение ЦП до и после его взаимодействия с ДР и Д1Ш, а также дан анализ характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си2+ на простейших моделях биомембран.

Показано, что при комплексном взаимодействии ДР, ДКВ и ЦП в реакционной смеси концентрация наиболее токсических комплексов ДР с ионами меди минимальна. Клиническими испытаниями установлено, что сочетанная химиотерпия ДР, ЦП, ДКВ обуславливает снижение токсических явлений и улучшение показателей по гемоглобину, количеству эритроцитов и специфической активности ЦП.

Предложена липосомальная форма препаратов, снижающая токсическое действие ДР.

Практическая значимость.

Показана возможность использования ДКВ в качестве протектора Си2+ каталитического центра ЦП при терапии онкологических заболеваний ДР. Разработанные методики изучения комплексного действия лекарственных веществ позволяют прогнозировать свойства препаратов, в том числе фармацевтическую несовместимость, иммобилизацию комплексов лекарственных веществ с ионами Си2+ в липофильный и гидрофильный фрагменты мембраны. Разработана липосомальная форма доксорубицина, стабилизированная статистическими сополимерами стирола.

Результаты работы используются в испытаниях препарата церулоплазмина по фармацевтической несовместимости с доксорубицином. Экспериментальные результаты по комплексообразованию ДР и ДКВ с ионами меди использованы в учебном процессе НГМА в дисциплине фармацевтическая химия.

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах и научной новизне.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме «Molecular design and synthesis of supramolecular architectures» (Казань, 2002г), на VII сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002г), VI Всероссийской конференции молодых ученых (Саратов, 2003г), V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа «Химия и медицина», (Уфа, 2005г), International conference «From molecules towards materials» (H. Новгород, 2005r)..

По результатам исследований опубликовано 5 статей и 6 тезисов научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по свойствам фермента ЦП и методом изучения свойств атомов металла каталитических центров ферментов. Вторая глава работы посвящена экспериментальным методикам получения ЦП, его очистки, изучения свойств ЦП, ДР и его комплексов с ионами меди (И), ДКВ и его комплексов с ЦП, анализу состояния модельных мембран на основе лецитина и арахиновой кислоты, анализу специфической активности ЦП. В третьей главе диссертации представлены и обсуждены результаты исследования комплексов ДР с ионами меди солей и с ЦП, ЦП с ДКВ, представлены расчеты термодинамической константы устойчивости Кр и ассоциации Ка образующихся комплексных соединений, на примере ДКВ рассмотрены кинетические особенности его комплексообразования с «голубыми» ионами каталитического центра ЦП, рассмотрены данные по адсорбции ДР на сополимерах, выступающих в качестве компонентов липосом.

Работа изложена на 145 страницах, включая 35 рисунков, 7 таблиц и 144 ссылки.

Основное содержание работы.

В работе приводится результаты, обсуждение получения и свойств комплексов меди с ДР и ДКВ в биологических системах в водной среде.

Объекты исследования и используемые материалы.

Церулоплазмин — фсрро- О? — оксидоредуктаза КФ 1,16.3.1 был получен по следующей методике. Пул плазмы крови человека подвергали спиртовому

6

фракционированию по Кону, IV фракция была проэкстрагирована спиртово-хлороформной смесью, с последующим отделением балластного осадка. Адсорбцию ЦП осуществляли из спиртово-хлороформного раствора методом анионо-обменной хроматографии на сефадексе А-50. Очистка ЦП от денатурированных белков и липопротеидов проводилась дробным фракционированием. Оксидазную активность ЦП измеряли по методу Раввина.

Биохимические показатели очищенного ЦП представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Биохимические показатели ЦП

Показатель Ед. измерения По ФС-42-3379-97) Жидкий препарат после получения Лиофилизированный препарат

Удельная оксидазная активность Ед/мг белка Не менее 9,0 20,8±0,6 10,7±0,9

Цветность гт 1см fcj.610 Не менее 0,35 0,44±0,06 0,38±0,06

Степень очистки Е>.61о/ E>_280 Не менее 0.025 0,047±0,008 0,028±0,008

Электрофоретич еский состав: а-глобулины; Р-глобулины; альбумин % Не менее 50,0 Не более 48,0 Не более 1,0 90,7±1,3 9,3±1,8 0,2±0,03 89,8±1,6 10,1±1,1 0,1±0,03

Молекулярный состав*: полимеры -' апо-ЦП-голо-ЦП -Низкомолекуля рные примеси - % Показатель не предусмотрен ФС 2,1± 0,97 12,8±1,9 84,6± 2,3 0,5 ±0,03 20,5± 2,7 24,3±1,9 54,7± 2,3 0,5+0,001

* - данные любезно предоставлены Крайновой Т. А. (ФГУП НПО «Микроген» Ниж. предп. по производству бак. препаратов — фирма «ИмБио»)

Доксорубицин соответствовал фармакопейной статье ФС-423369-97.

Структурная формула доксорубицина (7,8,9,10 -тетрагидро-6,8,11 -тригидрокси-1 -метокси- 8(8)-С-оксиацетил-10(Б)-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-а-Ь-ликсо-гексапиранозил) окси]-нафтацен-5,12-диона гидрохлорид

Дигидрокверцетин полученный из древесины лиственницы, был предоставлен ООО "Росбиопром" (г. Саров Нижегородской области). ДКВ, был

Ме

многократно перекристаллизован из смеси спирта с водой и высушен до

постоянной массы. ДКВ соответствовал требованиям ФС42-3853-99. он

/—ОН .

^vTvAqi^ ДКВ (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-[3',4',-

ОН О дигидроксифенил]-4Н-1-бензопиран-4-он).

Концентрацию ДЬСВ определяли методом цианидинхлоридной пробы и анализом УФ-спектров в области /^шх=290нм в соответствии с калибровочным графиком.

Лецитин - 1-пальмитоил-2-олеил-5п-глицерофосфатидилхолин (99%), для получения модельных биомембран был использован в виде хлороформного раствора (SIGMA Chemical Со). Для формирования везикул использовали яичный лецитин, который очищали многократным растворением в петролейном эфире при нагревании и затем осаждали ацетоном в атмосфере аргона.

Была использована арахиновая кислота >99% чистоты (фирма «Merck»),

Ацетат меди (Щ марки чда был трижды перекристаллизован из воды.

Сополимеры стирола с N-винилпирролидоном были синтезированы в массе: [ДАК]=0,03моль/л, ЗЗЗК.

Приборы и техника эксперимента.

Электронные спектры были записаны в области 200-700нм в кварцевых кюветах на UV-Vis спектрофотометре "Specord М-40" фирмы Carl Zeiss Iena (DDR). Спектры записывались в сравнении с бидистиллированной водой.

ИК-спектры ДКВ и комплексов с Си2" были получены на ИК-спектрометре "Perkin-Elmer 180" в области 3200-500 см"1 в виде смесей с КВг.

Изотермы сжатия n=f(Sn) были получены на автоматизированной установке. Размер тефлоновой ванны 200*137><2(мм). Весы Ленгмюра, снабженные ИК-датчиком, позволяют обеспечить точность измерения поверхностного давления я, равную 0,05мН/м, погрешность определения молекулярной площади по стандарту — арахиновой кислоте — составляла не более 2-5%.

Измерение поверхностного натяжения растворов производили двумя методами: полустатическим методом максимального давления образования пузырька и методом пластинки Вильгельми.

Топографию везикул. исследовали на сканирующем зондовом микроскопе "Solver Bio NT-MDT" (Зеленоград) в неконтактном режиме.

Результаты работы и их обсуждение. 1. Комплексообразование ДР с ионами меди каталитического центра ЦП.

1.1. Характеристика реакционной смеси ДР и ЦП в воде.

Взаимодействие ДР с ионами меди ЦП было изучено в водной среде. Отмечается повышение поверхностного натяжения реакционной смеси по сравнению с раствором чистого ЦП: так, в реакционной смеси, содержащей 0,6-10"5М ЦП и 3,5-10"5М ДР поверхностное натяжение смеси повышается до бОмДж/м2 по сравнению с 50мДж/м2, характерного для чистого ЦП. Потеря поверхностной активности на межфазной границе «раствор-воздух» означает, вероятно, изменение гидрофильно-липофильного соотношения в глобулярной структуре ЦП под действием ДР.

Реакционная смесь приобретает интенсивный фиолетовый цвет. Изучение электронных спектров поглощения в видимой области показывает, что взаимодействие ДР и ЦП имеет сложный характер и зависит от концентрации и молярного соотношения компонентов, а также от времени протекания реакции (рис. 1 а-в).

□

Рис. 1 а,б. Электронные спектры смеси ДР и ЦП Сцп=5,82-10'5М, СцП:Сдр=1,5:1 б) математически обработанные спектры после вычета полосы ЦП: 1 свежеприготовленный раствор, б'-смесь через сутки.

При избытке ЦП (рис. 1а) образование комплексов сопровождается существенными изменениями формы, интенсивности и положением полос поглощения. С течением времени эти изменения становятся более заметными. Для исключения влияния ЦП в области 610нм были проанализированы математически обработанные электронные спектры поглощения после вычета полосы ЦП (рис. 1,6).

При смешении водных растворов ДР и солей меди (И) реакционная смесь также приобретает интенсивную фиолетовую окраску. На примере ацетата и сульфата меди (II) показано, что вне зависимости от молярного соотношения ДР к Си2", в области 482-500нм близок к ЗЗнм (рис.2.). Кроме того, в спектрах всех смесей наблюдается появление новой полосы в области 580нм, а также изменение формы и положения полос в области 482—500нм, аналогично спектрам смесей ЦП и ДР.

В целом следует отметить, что одинаковые изменения в видимой части спектра исходного ДР при взаимодействии с ионами Си2+ в ЦП, Си(СН3СОО)2 и СиЗОд (батохромные сдвиги, появление новой полосы в области 580нм, форма и соотношение интенсивностей полос) свидетельствуют о том, что все комплексы имеют один и тот же хромофор в этой части спектра.

Ро,,

Рис. 2 Электронные спектры реакционных смесей

ДР с Си(СН3СОО)2, Си2+=сопз^5-10'4М

№ [ДР]-105,М Отношение ДР:Си2+

1 1,75 1:0

2 1,75 1:250

3 0,875 1:500

4 0,4375 1:1000

5 0,2187 1:2000

456

656

X, нм

2' - СиЭО^+ДР ([ДР]=сопб1= 1,75-1 О М)

Следовательно, несмотря на сложную структуру каталитического центра

ЦП, характер взаимодействия ионов меди в ЦП с ДР можно оценить по

анализу изменения спектров поглощения ДР.

10

Исследование зависимости оптической плотности при длине волны 580нм (Обво) реакционной смеси ДР и значительного избытка (~100кратного) Си8С>4 от исходной концентрации ДР (С°др) показало её соответствие уравнению прямой вида:

£>580 = а + ЬЛО3 ■С°ДР> где а=0,02Ш,001, Ь=5,75210,002 (1), На основании уравнения (1), измеряя величину В580 в реакционной смеси ДР и ЦП, была рассчитана концентрация ДР, вовлеченного в комплексообразование с ионами Си2+ каталитического центра ЦП -

Интенсивная фиолетовая окраска раствора и появление в спектре новых полос, свидетельствуют об образовании координационных комплексов меди, окраска которых обуславливается изменением симметрии иона металла под влиянием поля молекул лигандов и появлением, вследствие этого, запрещенных для невозмущенного иона переходов. Эти новые полосы присуши только комплексу и являются доказательством его существования.

Формально можно предположить следующую схему образования комплекса:

ДР + Си2+ ЦП = [ Си2+ ЦП ДР] (2)

Стехиометрия комплексообразования была установлена методом изомолярных серий (метод Остросмысленского — Жоба) и составляла 1:1. В этом случае константа устойчивости комплекса Кр выражается следующим образом:

к - • • М

[др]\си2+ ■ цл] (3)'

где величины в квадратных скооках означают равновесные молярные концентрации комплекса и его компонентов.

Проводя эксперимент при большом избытке ДР, т.е. С°ДР» С°цц и, соответственно, С°др»[Си2+-ЦП-ДР], Кр рассчитано по уравнению Бенеши -Гильдебраида вида:

С°ДР-1 = 1 1 1

л 580k« + 77- 580«л. ' 0 (4),

-^580*4 Ь равн ' ь ^ЦП

580 ftw 7

где £ - показатель поглощения комплекса, I - толщина слоя кюветы

Рассчитанное значение Кр равно (4,5±0,1)-106 и

£5Жнм =(5,29+0,05)- 103л/хмоль-см..

Исследование оксидазной активности реакционной смеси ЦП и ДР при большом избытке последнего, показало снижение оксидазной активности ЦП по Раввину на 50 - 70%. Вероятно, этот факт обусловлен замещением одного из лигандов меди на ДР и образованием прочных комплексов ДР с Си2+ и их удалением из каталитического центра.

1.2. Изучение свойств комплексов Си2+,ДР на моделях биомембран.

Монослои Ленгмюра широко используются для моделирования свойств биологических мембран при взаимодействии с лекарственными веществами. Выяснение механизмов иммобилизации комплексов Си2+-ДР в мембрану, позволяет прогнозировать их биохимическое действие в организме человека.

Исследование свойств монослоев арахиновой кислоты и лецитина как моделей гидрофильного и литюфильного фрагментов биомембраны, соответственно, были выполнены на водной субфазе, содержащей ацетат меди

(И) и ДР.

Из данных изотерм сжатия монослоя арахиновой кислоты (рис. 4 а,б), следует, что в rrpt сутствии ионов меди, молекулярная площадь S0 (So.iimit) существенно уменьшается (кривая 2).

№ кривой Состав субфазы, рН 7ГС, мН/м Зо.ИгшЬ нм2/молекула

1 Вода, рН 6,0 70 0,205

2 [ Си(СНзСОО)2]=1,75-Ю"5М, рН 5,8 64 0,180

3 [ДР]=1,75-10"5М, рН 5,6 68 0,250

4 смесь [ДР]=1,75 10"5Мс [Си(СНзСОО)2]= 1,75-10"5М, рН 5,6 66 0,220

Использование раствора ДР в качестве субфазы приводит к увеличению 801,т|1 до 0,25нм2/молекула (рис.4а, кривая 3). Увеличение молекулярной площади обозначает иммобилизацию (связывание или адсорбцию) ингредиента субфазы в монослой.

Анализ изотерм сжатия монослоев лецитина подтвердил общие тенденции изменения молекулярной площади при замене субфазы (рис.5а,б). Однако, изменения в значениях Бо более существенны при введении ДР: с 0,54нм2/молекула до 0,865нм2/молекула. Комплексное соединение меди в субфазе также значительно увеличивает молекулярную площадь с 0,54нм2/молекула до 0,654нм2/молекула, но по сравнению с изменениями для ДР это значение существенно меньше.

л, мН/м л, м№м

№ кривой Состав субфазы, рН 7ГС, мН/м ^о.Птиэ нм2/молекула

1 Вода, рН 6,0 60 0,54

2 [ Си(СН3СОО),1=1,75-Ю"5М, рН 5,8 58 0,48

3 ГДР1=1,75-10"5М, рН 5,6 62 0,865

4 смесь [ДР]=1,75-10"5М с [Си(СН3СОО)21=1,75 Ю"5М, рН 5,6 65 0,654

Таким образом, результаты взаимодействия ДР, медьсодержащих комплексов с ленгмюровскими монослоями арахиновой кислоты и лецитина, как простейших моделей биомембран, свидетельствуют об изменении состояния мембран под действием ДР и его комплексов с медью. Незначительное уменьшение Бо для комплексных соединений ДР и меди, вероятно, характеризует более компактную структуру комплексов при их иммобилизации в монослой.

2. Ассоциация полифенольного флавоноида — ДКВ с ЦП 2.1. Исследование комплексообразования ДКВ с ионами меди (II) каталитического центра ЦП.

Для ДКВ в общем виде возможны следующие структуры хелатов меди:

Комплексообразование ДКВ и Си2+ в изучаемых нами условиях (водная среда, комнатная температура) подтверждается следующими данными.

При добавлении в водный раствор ацетата меди (II) ДКВ раствор приобретает слабо желтую окраску. В УФ-спектре поглощения реакционной смеси наблюдается сдвиг полосы с ?.тах=290нм до Хтах=300-3 Юнм. В концентрированных растворах выпадает коричневый осадок, в ИК-спектрах которых наблюдается появление новых полос v (см"1): 1570-1560 (vas), 1540 (Vas), 1440 (vs), 1620-1615, 1590. Элементный анализ осадка (%): Си - 9,6; С -53,9; О - 33,5; H - 3,0. В пользу катехольной структуры (тип II) свидетельствуют эксперименты по переводу твердых комплексов Cu-ДКВ в растворимые катехолятные, действием трифенилфосфина в ТГФ. Величины констант сверхтонкого взаимодействия СТВ 'Н (спектры ЭПР) трех протонов в кольце В равны а(Н1')= а(НЗ')= а(Н4'), что обусловленно наличием неспаренного электрона.

Взаимодействие ЦП с ДКВ в воде было изучено при различных молярных соотношениях ЦП:ДКВ при комнатной температуре. При большом избытке ДКВ (ЦП:ДКВ =1:25) реакционная смесь обесцвечивалась сразу же после смешения реагентов.

Исследования зависимости поверхностного натяжения от концентрации ЦП Уцп=А(Сцп) и ДКВ Удкв=Г(СДкв) (Рис. 6), а также изменения поверхностного натяжения их реакционных смесей, свидетельствуют о потере поверхностной активности ЦП в присутствии ДКВ.

— ДКВ

ЦП + ДКВ ( [ДКВ] = const = 3,27 I О М)

— ЦП

Рис. 6. Изотермы y=f(C)

На рисунке 7 приведены спектры поглощения водного раствора ЦП, ДКВ и их реакционной смеси при молярном соотношении ЦП:ДКВ=1:9,25, в области 340 - 700нм. Поскольку ДКВ в воде имеет основную полосу поглощения в области >чпах=290нм, то при выбранной концентрации ДКВ, поглощением ДКВ в анализируемой области можно пренебречь (кривая 2, рисунок 7). В исследуемой области для ЦП наиболее значимой является полоса поглощения видимой области с Хпих=610нм, относящаяся к ионам «голубой» оксидазной меди (II) (кривая 1, рисунок 7).

О

0,75

0,5-

0,25

Рис. 7. Электронные спектры ДКВ, ЦП и их смеси:

1-ЦП, С°1ш=4,45' 10"5М;

2-ДКВ, С3дкв=41,2-10"5М;

3- смесь, Сцп=4,45-10"5М, С°дкв=41,2-10"5М в начальный период смешения реагентов;

4-смесь через 3 часа.

После смешения реагентов в спектре реакционной смеси (кривая 3, рисунок 7) наблюдается уменьшение интенсивности поглощения полосы с ^тах=610нм и с течением времени (10 — 20мин) отмечается появление новой полосы в области 417нм.

Реакцию ДКВ с ЦП можно рассматривать как взаимодействие биополимера с лигандом, характеризующееся константой ассоциации Ка:

\сиЦ„-цп-дкв]

К" [Си1*„- цп\\дкв]

(5),

где [Сг4*„ • ЦП], [ ДКВ] и \Си1*а- ЦП -ДКв]- равновесные концентрации Си;*, ■ ЦП, ДКВ и комплекса, соответственно

Безразмерная величина, характеризующая ответ системы (биополимера) на образование комплекса, И., в первом приближении должна быть пропорциональной количеству образовавшегося комплекса.

Нами предложено использовать в качестве ответа системы Я степень насыщения каталитических центров ЦП дигидрокверцетином по относительному изменению оптической плотности полосы поглощения «голубых» ионов меди в области 610нм:

Г° -С

ЦП _ 610

- ГУ

^ЦП

(6),

В первоначальный период времени (3-5мин), при котором вторичные взаимодействия минимальны, предварительными исследованиями установлено строгое выполнение закона Ламберта-Бера для зависимости Вбю=^СцП).

В экспериментах с большим избытком лиганда [ДКВ]»[о4+0-ЦП]|, ассоциация описывается уравнением (7), математически соответствующим уравнению Скэчарда в виде:

^610 =

■^тах.610 ' ' ^ ДКВ 1+ % а 'СДКВ

(7).

Зависимость ответа системы ( степени насыщения каталитических центров, содержащих ионы «голубой» меди), от концентрации ДКВ представлены на рисунке 8а.

¿0,4

3

0 50 100 150 200

концентрация ДКВ, С°дкВЮ5М

^Г„=(5.4±0.2)-10

1 2 Ю-1, л/моль

Рис. 8 а, б. Графическое решение уравнения Скечарда

Обработка полученных данных в виде линейной анаморфозы типа

Л610 - •Ктах.610

-и

д610

к^дкв

(8)

в координатах Я - К/С°дКв позволяет установить величину К,, (рис. 86). Рассчитанная величина Ка=(5,4±0,02)-103 характеризует прочное комплексообразование ДКВ с ионами Си2+, поглощающими в области 610нм.

Зависимость интенсивности поглощения в области 417нм, появляющейся через 10-20минут линейна от. концентрации ДКВ, не вступившего в комплексообразование с «голубыми» оксидазными ионами Си2+:

Щ\11ш=кэфф<СДКВ-ССи2+ЦПДКвУ{9), . где СС1?» ^ дкз - концентрация ДКВ, вступившего в комплексообразование с

«голубыми» ионами Си2+, кэфф — эффективный коэффициент, равный (3, 0±0,1) • 103 л/моль. .

2.2. Кинетические особенности взаимодействия ДКВ и Си2+б1о'ЦП. Исследование кинетики насыщения «голубых» оксидазных ионов меди в каталитическом центре ЦП дигидрокверцетином показало, что кинетические кривые удовлетворительно описываются уравнением вида (рис. 9.)

Ябю =а + Ь\%т (Ю), где т - характеристическое время ( при Пв10=1 т=т„), а и Ь - эмпирические константы

время взаимодеиствия т, мин IgT мин

Рис. 9. Зависимость ответа системы R610 от времени 1 ,-Т=303К, 2. Т=293К

Характеристическое "ремя при 303К равное 36 дням (кривая 1, а=0,46) и т« равно 1055 дням при 293К (кривая 2, а=0,32).

Таким образом используя безразмерную величину И, можно дать приближенную оценку влияния температуры на насыщение ДКВ каталитических центров ЦП, содержащих «голубую» медь: при повышении температуры на 10 градусов хл уменьшается ~ в 30 раз.

2.3. Комплексное воздействие ДКВ и ДР на ЦП.

В реакционной смеси, содержащей ЦП, ДР и ДКВ, по данным спектров поглощения уменьшается О58о и резко увеличивается интенсивность поглощения в УФ области (табл. 2). Цвет реакционной смеси ДР и ЦП при добавлении ДКВ изменяется от фиолетового первоначально до красного, а затем до желтого цвета, что косвенно характеризует уменьшение концентрации комплексов ДР с Си2+.

Таблица 2.

Данные электронных спектров поглощения реакционных смесей.

Лекарственное вещество, -105М Оптическая плотность, Ц,™

Х=290нм Х=500нм Х=540нм Х=580нм >.=610нм

ДР, Сдр=1,75 - 0,5 - - -

ЦП, СцП=4,45 - - - - 0,45

ДКВ, Сдкв=3,28 0,52 - - - -

ДР+ЦП, СдР=2,91, Сцп=2,01 - 0,32 0,39 0,29 0,12

ДКВ+ЦП, Сдкв=41,2, Сцп=8,9 > 1 0,09 0,11 0,19 0,33

(ДКВ+ЦП)+ДР, Сдкв=3,28 Сцп=4,45 Сдр=1,75 > 1 - 0,05 0,05 0,15

Проведен сопоставительный анализ наблюдаемого эффекта с клиническими испытаниями лечения онкологических заболеваний комплексной терапией с использованием ДР, ДКВ и ЦП. Показано снижение токсических явлений и улучшение показателей по гемоглобину, количеству эритроцитов и специфической активности ЦП.

Усредненные результаты исследований приведены в таблице 3

Таблица 3

Усредненные результаты клинических испытаний*_

Химиотерапия

ДР ЦП (5мг/кг, через день, 10 инфузий) ДР, ЦП, дкв

нъ Уменьшение на : 10-30% Увеличение на 15-20% Увеличение на 15-30%

Количество эритроцитов Уменьшение на 10-15% Увеличение на 8-10% Увеличение на 10-15%

СпА ЦП, ед/мкг 0,08±0,002 0,12±0,002 0,12±0,002

Авторы благодарят компанию «ИнтелФарм» за проведение и финансовую поддержку клинических испытаний.

3. Защита активных центров ЦП при химиотерапии ДР комплексами лецитин-ВМС

Липосомальная форма лекарственных препаратов обеспечивает снижение токсичности противоопухолевых препаратов. Однако широкому внедрению в практику липосомальных форм препаратов препятствует низкая агрегативная устойчивость липосом. В ряде работ, в том числе и с участием диссертанта** было показано, что добавки сополимеров стирола с биологически активным звеном заметно повышают агрегативную устойчивость везикул.

Выбор сополимеров был осуществлен на основе анализа изотерм сжатия 7t=f(So) монослоёв смеси ВМС и лецитина над водной субфазой и субфазой, содержащей ДР, изотерм смачивания в =f(CBMC) и на основе данных атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Нами установлено, что малые добавки всех использованных сополимеров приводят 1) к увеличению эффективной молекулярной площади So (т.е. площади мономолекулярного слоя, деленной на число молекул лецитина) до значений 1.2 — 1.6 нм2, 2) к ярко выраженной экстремальной зависимости на изотермах смачивания (0а =ДСвмс): наиболее низкие значения угла смачивания (©=2-Зград) достигается на поверхности пленки лецитина, содержащей 0,01 — 0,1% ВМС. Рассмотренные данные указывают на иммобилизацию амфифильных сополимеров в би- и монослой лецитина. Данные, полученные методом АСМ, подтверждают высказанное предположение.

**Гусихина М.С., Семчиков Ю.Д., Гущина Ю.Ю., Волков А.А., Мельникова Н.Б.// Высокомолекулярные соединения А. 2005. Т.47.,С1220-1224

41Ш

О ткт 105 ткт г.1 ткш

Рис. 10. Микрофотографии везикул лецитина (а) и смеси лецитина с мае. 2% сополимера стирол -ВП (90%) (б).

Из рис. 10 видно, что в отсутствие сополимеров наблюдаются следы слияния везикул: В присутствии малого количества сополимера, близкого к тому, что соответствует минимуму на кривых зависимости углов смачивания от состава смеси сополимер — ПАВ, следы слияния везикул уменьшаются или исчезают. Можно полагать, что в данном случае фрагменты ламелей лецитина армированы цепями амфифильных ионогенных сополимеров и стабилизируют везикулы.

Таким образом, малые добавки амфифильных сополимеров оказывают глубокое воздействие на моно- и бислои лецитина, изменяя энергетическое состояние поверхности и, следовательно, ее смачиваемость, а также увеличивая агрегативную устойчивость везикул.

Исследование адсорбции ДР на поверхности тонкой пленки Ст-ЫВПД было проведено на основе анализа изотерм поверхностного натяжения у=Г(Сдр) в растворе до — и после адсорбции, а также изотерм смачивания ©а=Г(СдР). Расчет величины адсорбции Гтах ДР на границе раздела «водный раствор — воздух» был выполнен по уравнению Шишковского: Гтах=1,31 ■ 10"имоль/см2

Адсорбция на границе раздела «твердое тело - раствор», была рассчитана по уравнению Гиббса-Юнга:

= (14)' 4,0.10-моль/см2.

Учитывая тот факт, что тонкая пленка Ст-КВПД однородная и

гладкая (без пор), полученные высокие значения эффективной адсорбции

21

свидетельствуют о возможности использования данного сополимера в качестве

армирующего компонента липидной оболочки для приготовления липосом.

Выводы

1. Доказана способность ионов меди (II) каталитического центра церулоплазмина образовывать устойчивые комплексы с доксорубицином и дигидрокверцетином.

2. Разработана спектрофотоколориметрическая методика количественного определения доксорубицина, вовлеченного в комплекс с ионами меди фермента, используя уравнение калибровочной прямой О58о = а + ЬС-103, где а = 0,021±0,001; Ь = 5,752±0,002. Методом изомолярных серий установлен состав образующихся комплексов доксорубицина (1:1) и рассчитаны константа устойчивости Кр= (4,5+0,1)-106 и с580 = (5,29±0,05)-103 л/моль-см.

3. Взаимодействие доксорубицина и его Си2+ комплексов с монослоями арахиновой кислоты и лецитина — моделей гидрофильного и липофильного фрагментов биомембраны — существенно изменяет свойства монослоев: молекулярная площадь Бо арахиновой кислоты в монослое увеличивается на 7-10%, Бо лецитина на 40-60%. Высказано предположение, что иммобилизация в монослои комплексных соединений сопровождается меньшим разрыхлением мембраны, чем при иммобилизации доксорубицина.

4. На основе анализа изотерм поверхностного натяжения растворов церулоплазмина, дигидрокверцетина и их смесей показано снижение поверхностной активности церулоплазмина и, соответственно, изменение гидрофильно-липофильного соотношения в его макромолекуле.

5. Предложен методологический подход к оценке взаимодействия церулоплазмина с дигидрокверцетином, в соответствии с теорией Скечарда. Количественной мерой активности церулоплазмина является безразмерная величина Я (ответ системы), определяемая как относительное изменение оптической плотности полосы с А.тах =610 нм, характерной для «голубых» оксидазных иочов меди (II). Рассчитанная константа ассоциации дигидрокверцсрина с «голубыми» ионами меди церулоплазмина, равна Ка=(5,4±0,2)-103.

6. Кинетические кривые насыщения «голубых» оксидазных ионов меди в каталитическом центре церулоплазмина Нею = í(t) удовлетворительно описываются уравнение вида -a + Mgr. Установлено, что при повышении температуры на 10 градусов, т» уменьшается в 30 раз.

7. Выявлено ингибирование комплексообразования доксорубицина с ионами меди каталитического центра в присутствии дитидрокверцетина, что является основой комплексной химиотерапии онкологических заболеваний дигидрокверцетином, церулоплазмином и доксорубицином.

8. Предложено использовать комплексы на основе сополимеров стирола с N-винилпироллвдоном, 4-винилпиридином и лецитином как компонентов лекарственных форм препарата доксорубицина, защищающих активные центры церулоплазмина.

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1. Мельникова Н.Б., Волков A.A., Кононова C.B., Крайнова Т.А., Ефремова JI.M., Анастасиев В.В. Комплексы доксорубицина с ионами меди каталитического центра церулоплазмина. // Химико-фармацевтический журнал. 2006, № 1, стр. 55-60

2. Гусихина М.С., Семчиков Ю.Д., Гущина Ю.Ю., Волков A.A., Мельникова Н.Б. Влияние амфифильных сополимеров на свойства ламеллярных и везикулярных структур лецитина. // Высокомолекулярные соединения. 2005, А, т. 47, № 7, стр. 1-5

3. Мельникова Н.Б., Волков A.A., Куликов М.В., Гуляев И.В. Взаимодействие доксорубицина и ионов меди (II) с моделями биомембранных структур. // Известия ВУЗов. Серия «Химия и химическая технология», 2004, том 47, вып. 9, с. 22-26.

4. Волков A.A., Гусихина М.С., Семчиков Ю.Д., Кононова C.B., Мельникова Н.Б. Особенности адсорбции доксорубицина на поверхности полимеров, содержащих физиологически активное звено. // Известия ВУЗов. Серия «Химия и химическая технология», 2005, том 47, вып. 9, с. 57-61.

5. Melnikova N., Volkov A., Ioffe I., Kulikov M. The artificial membranes as model of interaction of medicine with biosystems and presence ion metal.//

Abstracts of II International symposium «Molecular design and synthesis of supramolecular architectures». August 27-31, 2002. Kazan, Russia, P. 31.

6. Волков A.A., Куликов M.B., Гусихина M.C. Исследование токсического действия онкологического препарата «доксорубицина» на моделях биосистем физико-химическими методами. // Тезисы докладов IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы химии и химической технологии», 23-25 июня 2003, Саратов, С. 54.

7. Гусихина М.С., Волков А.А. Межфазная энергия Гиббса на границе раздела модельной биосистемы и раствора антибиотика как критерий биосовместимости и проникновения лекарства через мембрану. // Тезисы доклада 7-ой Нижегородской сессии молодых ученых «Голубая Ока», 2530 апреля 2002 г.

8. Волков А.А., Гусихина М.С. Взаимодействие противоопухолевого антибиотика антрахинонового типа с ионами меди в системах, моделирующих биологические среды. // Тезисы доклада 7-ой Нижегородской сессии молодых ученых «Голубая Ока», 25-30 апреля 2002г.

9. Волков А.А., Кононова С.В., Мельникова Н.Б. Комплексы физиологически активных веществ с ионами меди каталитического центра церулоплазмина // V Всероссийский научный семинар и молодежная научная школа «Химия и медицина». Уфа, 5-8 сентября 2005 г.

10. Melnikova N.. Volkov A., Kononova S. Complexes of physiologically active compounds with Cu2+ - ions of active centre of ceruloplasmin // International conference "From molecules towards materials", September 3-11, 2005, N.Novgorod, Russia.

Подписано в печать 20.01.2006 г. Заказ № 08, тир. 100 экз.

ООО «Стимул-СТ» 603155, г. Н.Новгород, ул. Трудовая, 6 тел. 36-86-40

Актуальность темы

Медьсодержащие ферменты участвуют в различных биологических процессах и необходимы для роста организма, нормального функционирования иммунной системы, метаболизма углеводов и липидов. Одним из важных ферментов плазмы крови человека является медьсодержащий белок - церулоплазмин, относящийся к классу «голубых» оксидаз. Церулоплазмин регулирует обмен меди в организме, обеспечивает эффективный транспорт меди к тканям и выведения её из организма. Кроме того, он проявляет антиоксидантные свойства и является своего рода «функциональным депо» для безопасного хранения меди. В случае острых и хронических заболеваний отмечается высвобождение больших количеств меди, тогда как потребность организма в медьсодержащих факторах возрастает.

Недостаток ионов меди в организме может быть вызван нежелательным хелатированием ионов меди физиологически активными веществами, используемыми в терапии. Особенно этот эффект проявляется при использовании токсических противоопухолевых препаратов. В связи с этим, возникает проблема защиты медьсодержащих каталитических центров церулоплазмина и сохранения его антиоксидантных свойств.

Одним из путей защиты медьсодержащих активных центров фермента является ассоциация ионов меди с физиологически активными веществами, не проявляющими токсического действия. Требования к выбору защитных физиологически активных веществ определяются:

• термодинамикой конкурентного комплексообразования токсического противоопухолевого лекарственного вещества и выбранного защитного вещества (константы ассоциации или устойчивости комплексов),

• кинетическими особенностями ассоциации нетоксичного физиологически активного вещества с ионами меди активного центра церулоплазмина,

• взаимодействием физиологически активных веществ и их медьсодержащих комплексов с липофильными и гидрофильными фрагментами биомембран.

К ' лекарственным веществам, способным защищать медьсодержащие каталитические центры ферментов, относятся полифенольные флавоноиды.

Защитное действие флавоноидов связывают с их высокими антиоксидантными свойствами и способностью полифенолов образовывать хелатные комплексы с ионами металлов. Из полифенольных флавоноидов в медицинской практике наиболее широко применяется природный антиоксидант - дигидрокверцетин, не проявляющий токсического действия в терапевтических дозах.

В связи с вышеизложенным, образование комплексов физиологически активных веществ с ионами меди, способных защищать или ингибировать активные центры ЦП, является актуальной проблемой.

Целью настоящей работы является исследование защитного действия полифенольным флавоноидом - дигидрокверцетином (ДКВ), активных центров церулоплазмина (ЦП) при противоопухолевой терапии доксорубицином (ДР), а также выявление путей снижения токсического действия ДР.

В задачи исследования входило:

• исследование термодинамики комплексообразования и ассоциации ДР и ДКВ'с ионами меди каталитического центра ЦП в водном растворе, а также кинетических особенностей взаимодействия ДКВ с ЦП;

• оценка специфической активности ЦП в присутствии ДР и ДКВ;

• разработка методики анализа комплексов ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП;

• изучение характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си2+ -ионов водных растворов солей и ЦП на моделях липидных и гидрофильных фрагментов биомембран;

• разработка полимерсодержащей липосомальной формы препаратов ДР, ослабляющей унос ионов меди ЦП.

Научная новизна

Впервые доказано образование комплексных соединений ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП. Предложен методологический подход с привлечением теории Скечарда и использованием безразмерной величины Я - ответа системы, позволяющий в первом приближении количественно оценить термодинамическую константу ассоциации ДКВ Ка с ионами меди активного центра ЦП.

Разработана методика анализа комплексов ДР с ионами меди, рассчитана термодинамическая константа устойчивости Кр комплексов ДР с ионами меди каталитического центра при стехиометрии 1:1. Показано, что величина Кр значительно превышает (в«1000раз) величину Ка.

Впервые на основе изучения межфазного и поверхностного натяжения реакционных смесей ЦП и физиологически активных веществ оценено гидрофильно-липофильное соотношение ЦП до и после его взаимодействия с ДР и ДКВ, а также дан анализ характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си на простейших моделях биомембран.

Показано, что при комплексном взаимодействии ДР, ДКВ и ЦП в реакционной смеси концентрация наиболее токсических комплексов ДР с ионами меди минимальна. Клиническими испытаниями установлено, что сочетанная химиотерпия ДР, ЦП, ДКВ обуславливает снижение токсических явлений и улучшение показателей по гемоглобину, количеству эритроцитов и специфической активности ЦП.

Предложена липосомальная форма препаратов, снижающая токсическое действие ДР.

Практическая значимость.

Показана возможность использования ДКВ в качестве протектора Си2+ каталитического центра ЦП при терапии онкологических заболеваний ДР. Разработанные методики изучения комплексного действия лекарственных веществ позволяют прогнозировать свойства препаратов, в том числе фармацевтическую несовместимость, иммобилизацию комплексов лекарственных веществ с ионами Си2+ в липофильный и гидрофильный фрагменты мембраны. Разработана липосомальная форма доксорубицина, стабилизированная статистическими сополимерами стирола.

Результаты работы используются в испытаниях препарата церулоплазмина по фармацевтической несовместимости с доксорубицином. Экспериментальные результаты по комплексообразованию ДР и ДКВ с ионами меди использованы в учебном процессе НГМА в дисциплине фармацевтическая химия.

Апробация работы.

Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме «Molecular design and synthesis of supramolecular architectures» (Казань, 2002г), на VII сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002г), VI Всероссийской конференции молодых ученых (Саратов, 2003 г), V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа «Химия и медицина» (Уфа, 2005г), International conference «From molecules towards materials» (H. Новгород, 2005r).

По результатам исследований опубликовано 4 статьи и 6 тезисов научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по свойствам медьсодержащего фермента ЦП и методам изучения свойств коллоидных ферментных систем. Вторая глава работы посвящена методу получения ЦП, его фармацевтическому анализу, анализу специфической активности церулоплазмина, экспериментальным методикам изучения свойств церулоплазмина, доксорубицина и его комплексов с ионами меди (II),

Выводы

1. Доказана способность ионов меди (II) каталитического центра церулоплазмина образовывать устойчивые комплексы с доксорубицином и дигидрокверцетином.

2. Разработана спектрофотоколориметрическая методика количественного определения доксорубицина, вовлеченного в комплекс с ионами меди фермента, используя уравнение калибровочной прямой D58o = а + ЬС-103, где а = 0,021+0,001; b = 5,752±0,002. Методом изомолярных серий установлен состав образующихся комплексов доксорубицина (1:1) и рассчитаны константа устойчивости Кр= (4,5±0,1)-106 и е580 = (5,29±0,05)-103 л/моль-см.

3. Взаимодействие доксорубицина и его Си комплексов с монослоями арахиновой кислоты и лецитина - моделей гидрофильного и липофильного фрагментов биомембраны - существенно изменяет свойства монослоев: молекулярная площадь So арахиновой кислоты в монослое увеличивается на 7-10%, S0 лецитина на 40-60%. Высказано предположение, что иммобилизация в монослои комплексных соединений сопровождается меньшим разрыхлением мембраны, чем при иммобилизации доксорубицина.

4. На основе анализа изотерм поверхностного натяжения растворов церулоплазмина, дигидрокверцетина и их смесей показано снижение поверхностной активности церулоплазмина и, соответственно, изменение гидрофильно-липофильного соотношения в его макромолекуле.

5. Предложен методологический подход к оценке взаимодействия церулоплазмина с дигидрокверцетином, в соответствии с теорией Скечарда. Количественной мерой активности церулоплазмина является безразмерная величина R (ответ системы), определяемая как относительное изменение оптической плотности полосы с А,тах = 610 нм, характерной для «голубых» оксидазных ионов меди (II).

Рассчитанная константа ассоциации дигидрокверцерина с «голубыми» ионами меди церулоплазмина, равна Ка=(5,4±0,2)-103.

6. Кинетические кривые насыщения «голубых» оксидазных ионов меди в каталитическом центре церулоплазмина Лею = Дт) удовлетворительно описываются уравнение вида Яш=а + Ь^т. Установлено, что при повышении температуры на 10 градусов, Та> уменьшается в 30 раз.

7. Выявлено ингибирование комплексообразования доксорубицина с ионами меди каталитического центра в присутствии дигидрокверцетина, что является основой комплексной химиотерапии онкологических заболеваний дигидрокверцетином, церулоплазмином и доксорубицином.

8. Предложено использовать комплексы на основе сополимеров стирола с К-винилпироллидоном, 4-винилпиридином и лецитином как компонентов лекарственных форм препарата доксорубицина, защищающих активные центры церулоплазмина.