Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение химического состава и биологических свойств густого экстракта и шрота травы тысячелистника обыкновенного

РГБ ОД 2 2АПР2С02

На правах рукописи

Суриина Наталья Тихоновна

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГУСТОГО ЭКСТРАКТА И ШРОТА ТРАВЫ ТЫСЯЧЕЛИСТНИКА ОБЫКНОВЕННОГО

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск-2002

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

С'КТОр б И ОIО Г И Ч с С КИ X Н^уК Профессор ^.Ai HEJíb'í

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор Б.Я. Яц;с

доктор фармацевтических наук, зав. кафедрой аналитической и токсикологической химии Курского госу-дарстпенного медицинского университета, профессор А.С. Квач

доктор фармацевтических наук, зав. кафедрой фармакогнозии с курсом ботаники Ярославской медицинской академии, профессор Н.С. Фурса

Ведущая организация:

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Защита состоится « » 2002 г. в «_ /3 » часов

на заседании диссертационного совета К 20S.039.01 в Курском государственном медицинском университете (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курского го\ сударственного медицинского университета.

Автореферат разослан »2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент ^j-, Е.Н. Пашин

• //./ Itbt^oiu&híLk,

ОБЩАЯ ХАРАСТЕРИСТИКЛ РАБОТЫ

Актуальность темы. В современном арсенале лекарственных средств препараты растительного происхождения (фитопрепараты) составляют 30-40%, а в некоторых группах достигают 70%. Применение лекарственных растительных средств в современной медицине не только остается стабильным, но имеет тенденцию к увеличению (Ладынина Е.А. и др., 1990; Пастушенков Л.В. и др., 1990; Сергеев A.B. и др., 1995; Пашинский В.Г., 1995; Макарова В.Г., 2000).

В практической медицине растения семейства Asteraceae широко используются при различных формах патологий. Так, арника горная применяется в качестве средства, улучшающего работу сердца: при стенокардии, миокардитах, гипертонической болезни, гардносклерозе, реже седативное; наружно -при гематомах, противовоспалительное, при заболеваниях полости рта и десен (Чекман И.С., 1981); полынь - как горечь, возбуждающая аппетит, усиливающая деятельность пищеварительных органов; василек синий - используется как диуретическое при отеках почечного и сердечного происхождения, при радикулитах, полиартритах, болезни печени, как сокогонное (Блинков ИЛ., 1983); девясил высокий применяют в качестве отхаркивающего и дезинфицирующего средства при заболеваниях дыхательных путей, гриппе (Соколов С.Я., Замотаев И.П., 1984); ромашка аптечная оказывает седативное влияние на нервную систему, обладает противовоспалительным, антисептическим, кровоостанавливающим, болеутоляющим, ветрогонным, желчегонным и противоаллергическим свойствами и используется в качестве потогонного, спазмолитического, антисептического н вяжущего средства (Гаммерман А.Ф. и др., 1983; Любарцева Л.Н., Соколова В.Е., 1985); мать-и-мачеха применяется как отхаркивающее средство, а также входит в состав грудных и потогонных чаев (Вол-кинд И .В. и др., 1976; Машковский М.Д., 2000).

.Перспективным источником для получения фитопрепаратов может служить тысячелистник обыкновенный (семейство Asteraceae), содержащий широкую гамму биологически активных веществ (Ковалева Н.Г., 1971; Яковлев Р.П., Блинова К.Ф., 1999). Запасы тысячелистника обыкновенного в Российской Федерации в настоящее время превышают потребность отечественной медицинской промышленности, поэтому значительная часть его как сырье экспортируется за рубеж (Боряев В.Е.., 1991).

В эмпирической медицине тысячелистник обыкновенный применяется для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, гепатита, астенических состояний, неврозов и истерий, респираторных инфекций, гриппа, вирусных инфекций, бронхиальной астмы и других (Николаева В.Г., 1986; Соколов СЛ., 1993). Отдельные химические компоненты, содержащиеся в тысячелистнике обыкновенном, индивидуально оказывают широкий спектр фармакологического действия (Бабаскин B.C., 1992:; Козлов В.А. и др., 1997; Прокопенко Л.Г., Шишкова И.В., 2000; Егоров В.А. и др., 2000). Однако, в отечественной офици-налытой медицине используются только трава, цветки и жидкий экстракт тысячелистника обыкновенного как гемостатические средства. С учетом данных о

химическом составе и биологической активности тысячелистника обьгшовен-ного такое узкое применение его следует считать явно не рациональным.

Исходя из вышеизложенного, актуальной задачей является выявление возможных-путей рационального использования сырья тысячелистника обык-.• новенного за счет создания на его основе новых препаратов с различными видами активности.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении возможности расширения области применения травы тысячелистника обыкно венного за счет выявления новых видов биологической активности (анальгетиче-ской, антимикробной, антиноцицептивной, противовоспалительной, прогек-тивной и.иммуномодулирующей) и создание с учетом этого новых фитопрепаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести аналитический обзор данных литературы по современному состоянию фотохимических и фармакологических исследований тысячелист-

, ,Ш1,ка обыкновенного и групп биологически активных веществ, содержащихся в .. этом растении;

- разработать оптимальные условия экстракции биологически активных веществ и способ получения фармакологических средств из травы и шрота тысячелистника обыкновенного;

. - „ . . - изучить качественный и количественный состав биологически активных веществ фармакологических средств;

-, провести в эксперименте исследование по выявлению в полученных фармакологических средствах анальгетической, антимикробной, антиноцицептивной, противовоспалительной, иммуномодулирующей и протективной активностей;

- разработать проект ФС на предлагаемое фармакологическое средство.

Научная новизна. Определены огггамапыше условия экстракции биологически аетивных веществ и спссоб получения фармакологических средств: липофильного комплекса из травы под условным названием «Ахилон» и гидрофильного комплекса из шрота тысячелистника обыкновенного под условным

, названием «Ахипол».

Проведено качественное и количественное изучение биологически активных веществ «Ахилона» и «Ахипола» (сесквигерпеиовые лактоны: матрикарин, аустриции, ханфиллин, растительные пигменты: каротиноиды и хлорофиллы, а также производные бензо-а-пирона: умбеллисерон, скополетин, кумарин, ци-< хорин, производные фенил-бензо-у-пирона: гиперозид, кверцетин, рутин, али-генин, лютеолин, дубильные вещества гидролизуемой и конденсированной групп, углеводы).

Обоснована возможность УФ-спекгрофотометричес.кого определен!« количественного содержания хамазулена в эфирном масле «Ахилона» по удельному показателю поглощения при длине волны 358 нм.

Установлена антимикробная активность «Ахилона» в отношении Proteus vulgaris АТСС 4636, Candida albicans NCTC 2625, Escherichia coli ATCC 25922,

Staphylococcus aureus 209-p, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 1313; прогивоноспапительная активность на моделях острого асептического воспаления, анафнлактоидной реакции и медикаментозного гепатита; аиальгетическая активность на модели «уксусных корч»; антшгоцицеп-тивная активность на модели формалиновой болевой реакции; влияние препаратов «Ахилон» и «Ахипол» та развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) к тимус-зависимому антигену (ЭБ) у здоровых животных, при применении антибиотика, а также при развитии стафилококковой инфекции; а также влияние этих средств на неспеца фическую резистентность организма в аналогичных условиях; протективное действие «Ахилона» и «Ахипола» при заражении мышей живой культурой золотистого стафилококка.

Получен патент на изобретение № 2177328 на «Средство, обладающее противовоспалительной, анальгегической и антиноцицептивной активностью» от 27.12.2001 г.

Практическая значимость. Предложены новые фитопрепараты тысячелистника обыкновенного для использования в медицинской практике как в виде отдельных средств, так и в пиде субстанций для создания препаратов с заданной фармакологической активностью.

Показана возможность боле« широкого применения травы тысячелистника обыкновенного в научной медицине, а именно в качестве антимикробного, противовоспалительного, анальгетического, а также иммуномодулирующего и протективного средства при стафилококковой инфекции.

Экспериментально обосновывается возможность применения препаратов тысячелистника обыкновенного совместно с антибиотиками при состояниях, сопровождающихся угнетением показателей гуморального иммунитета и факторов неспецифической резистентности организма.

Методика количественного УФ-спектрофотометрического определения хамЕзулена в эфирном масле включена в проект ФС на «Ахилон» и в проект дополнения к фармакопейной статье «Трава тысячелистника обыкновенного», так как позволит повысить качество заготавливаемого сырья.

Внедрение в практику. ¡Получен патент на изобретение № 2177328 на «Средство, обладающее противовоспалительной, анальгегической и антиноцицептивной активностью» от 27.12.2001 г.

Спектрофотомгтрическая методика количественного определения хама-зулена в эфирном масле, полученном из «Ахилона», апробирована в: KAJI ОГУП «Фармация» г. Курска (акт об апробации от 10.05.2001 г.); ГУЗ ЦСККЛС Рязанской области (акт об апробации от 07.05.2001 г.).

Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Ярославской медицинской академии (акт от 05.05.2001 г.), а также в научно-исследовательский процесс испытательного фармацевтического центра «Фармакон» при Курском государственном медицинском университете (акт внедрения № 56 от 07.06.2001.) п рекомендованы для включения в ГФ.

Разработанная методика получения фармакологического средства тысячелистника обыкновенного, обладающего анальгегической, противовоспалительной и антиноцицептивной активностью внедрена в учебный процесс: ка-

федры фармакогнозии Ярославской медицинской академии (акт от 12.06.2001 г.); кафедры медико-биологических дасциддвд Тульского уннверси-тета (акт от 29.10.2001 г.); кафедры фармакогнозии и ботаники РГМУ им. акад. И.П. Павлова (акт о внедрении от 29.10.2Q01 г.).

Разработаны и подготовлены к рассмотрению: проект ФС на «Ахилэн»; проект дополнения к фармакопейной статье «Трава тысячелистника обыкновенного».

Основные положения, выносимые на защиту:

- способы получения липофильного из травы и гидрофильного комплексов биологически активных веществ из шрота тысячелистника обыыювен-ного под условным названием «Ахилон» и «Ахипол»;

- экспериментальные данные по изучению качественного и количественного состава биологически активных веществ «Ахилона» и «Ахипола»;

- результаты фармакологического скрининга изучаемых препаратов тысячелистника обыкновенного (антиаллергическая, антимикробная, антиноци-цеотивная, иммуностимулирующая, протективная и противовоспалительная активность).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на итоговых научных конференциях молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы медицины и фармации» (Курск, 1999, 2001); на V национальном съезде «Достижения современной фармации и перспективы их развития в новом тысячелетии» (Харьков, 1999); на 12-й международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2000); на VIII российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001); на 4-ом конгрессе российской ассоциации аллергологов и иммунологов «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии (Москва, 2.001).

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 219.013.41).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 44 таблицы и 3 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 306 источников, из них 68 на иностранных языках и оформлен согласно ГОСТ 7.1-84, ГОСТ 7.12-77 (СТ СЭВ 2012-79), ГОСТ 7.11-78 (СТ СЭВ 2021-79).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.

Обзор литературы представлен в первой главе и включает краткую ботаническую характеристику тысячелистника обыкновенного, сведения о его хи-

мическом составе и применении в научной и народной медицине, а также данные о лечебных свойствах биологически активных веществ, обнаруженных в тысячелистнике обыкновенном.

Во второй главе «Материалы и методы исследования» приводятся фотохимические и биологические методы, используемые в работе.

Объектом изучения служила надземная часть тысячелистника обыкновенного, отвечающая требованиям ГФ XI издания. Сбор сырья для изучения был проведен в течение 4 вегетационных периодов в различных районах Курской области. Заготовка сырья проводилась в мае-июне в период цветения растений. Собранное сырье подвергали воздушной сушке в естественных условиях, без доступа прямых солнечных лучей. Для исследования использовали воздушно-сухое сырье.

1. Получение фармакологических средств из тысячелистника обыкновенного

В результате проведенных исследований из травы тысячелистника обы-новенного получили сумму липофильных веществ («Ахилон») и из шрота травы тысячелистника обыкновенного - водорастворимый полисахаридный комплекс («Ахипол»).

Исследовали влияние природы экстрагента, степени измельчения сырья, соотношения фаз твердое тело - жидкость, продолжительность процесса и кратность экстракции на выход биологически активных веществ. Установили, что в качестве экстрагента при получении «Ахипона» целесообразно использовать ацетон, потому что полиены в растительной клетке связаны с липопротеи-дами, полное извлечение которых возможно только при использовании растворителей определенной полярности. Спирт и спирто-водные смеси практически не извлекают лолиенов из растительного сырья; измельченность сырья 2-3 мм, экстракция трехкратная при соотношении фаз 1:10-1:12, время экспозиции 5-6 часов.

Для получения «Ахипола» в качестве экстрагента использовали очищенную воду; измельченность сырья 2-3 мм; экстракция трехкратная при соотношении фаз 1:10-1:12; время экспозиции - 2 часа.

2. Изучение химического состава «Ахилопа» 2.1. Сесквитерпеновые лактоны

Методами тонкослойной хроматографии в системах растворителей: хлороформ-метанол (1:1), петролейный эфир-диэтиловый эфир (5:2), бензол-ацетон (9:1), петролейный эфир-толуол-метанол-воды (8:2:8:2), а также ИК-спектроскопией установили, что в «Ахилоне» содержится не менее 7 сескви-терпеновых лактонов. Методом колоночной хроматографии на силикагеле выделено три сесквитерпеновых лаптопа. Смесью петролейный эфир-ацетон (9:1) вымыли вещество 1, смесью петролейный эфир-ацетон (8:2) - вещество 2, а смесью петролейный эфир-ацетон (1:9)- вещество 3.

Идентификацию выделенных сесквитерпеновых лактонов осуществляли прямым сравнением физико-химических свойств, ИК-спектров и результатов хроматографического анализа с достоверными образцами (таблица 1).

Таблица 1

Результаты хроматографического анализа и фцзико-химическце свойства

сесквитерпеновых лактоиов, выделенных из «Ахилона»

Вещество и его Величина Яг в системах Общая т °г

шифр растворителей формула

I II III

Вещество I 0,28 0,49 0,52 СрНгЛ 194- +22,8

(матрикарин) 0,28 0,49 0,52 195

Вещество 2 0,23 0,46 0,48 с15н18о4 * 150-152 +14,1

(аустрицин) 0,23 0,46 0,48 Н20

Вещество 3 0,19 0,37 0,40 СиН2оО} 190 +154,1

(ханфиллин) 0,19 0,37 0,40

* Примечание: системы I - бензол, П-бензол-ацетон (95:5), 1П-бензол-этилацетат(9:1)

По результатам проведенных исследований установили, что вещество 1 - матрикарин, вещество 2 - аустрицин, вещество 3 - ханфиллин.

Количественное определение хамазулена в эфирном масле «Ахилона» и травы тысячелистника обыкновенного

В литературе описан фотоколориметрический метод определения хама-зулена в эфирном масле ромашки аптечной и тысячелистника обыкновенного (Киселева Е.Я. и др., 1969; Устюжанин А.А. и др., 1987). В условиях перегонки с водяным паром из сесквитерпеновых лаптопов в результате дегидратации, дегидрирования и декарбоксилирования образуется хамазулен (1,4-диметил-7-этилазулен), обуславливающий синее окрашивание эфирного масла. По количественному содержанию хамазулена судят о содержании проазуленовых соединений в сырье тысячелистника обыкновенного.

Количество хамазулена в эфирном масле определяют по калибровочному графику, для построения которого используют раствор 2,6-дихлорфенолиндо-фенолята натрия в фосфатном буфере (Киселева Е.Я. и др., 1969). К недостаткам существующего метода следует отнести трудоемкость, длительность исполнения и низкую чувствительность. Метод позволяет достаточно точно определять количество хамазулена лишь с высоким его содержанием в эфирном масле. При низком содержании хамазулена в эфирном масле - результаты малодостоверны. Имеются сведения о возможности определения хамазулена в эфирном масле тысячелистника обыкновенного и азиатского методом ГЖХ, а также спектрофотометрически при длине волны 285 нм и 604 нм (Калинкина Г.И., 1995; Палей Р.В. и др., 1997; Коновалов Д.А., 2000). Однако, эфирное масло тысячелистника обыкновенного представляет собой смесь углеводородов, терпенов и терпенондов, азуленов, кетоное и других соединений. Некоторые из них имеют полосы поглощения в УФ области при 225-260, 280-300 нм, что затрудняет использование этих областей при количественном определении хамазулена. В УФ-спекгре хамазулена имеются полосы поглощения при 235-250, 280-290 и 350-360 нм. В условиях нашего опыта целесообразно использовать максимум при 358 им в качестве аналитической волны для определения хамазулена в препарате «Ахилон» и эфирном масле тысячелистника обыкновенного.

Эфирное масло, освобожденное от хамазулена, не имеет полосы поглощения при 350-360 нм, что является доказательством того, что другие компоненты эфирного масла не поглощают свет при этой длине волны.

В связи с этим нами разработана методика количественного определения : хамазулена в «Ахилоне» и эфирном масле тысячелистника обыкновенного спектрофотометрическим методом по удельному показателю поглощения Е1%1См при длине полны 358 нм. Хамазулен выделяли из эфирного масла тысячелистника обыкновенного методом колоночной хроматографии. Его подлинность подтверждали хроматографически (в системе бензол-этанол-уксусная кислота 45:3,5:4 =0,78; в системе бензол-этанол 9:1 Кг =0,73 в системе петролейный эфир 11г =0,70), спектрофотометрическн (максимум поглощения при 235-250, 280-290, 350-360 нм), а также по температуре плавления пикрата хамазулена. Установили, что удельный показатель поглощения хамазулена 637±1,5. Рабочие концентрации растворов, при которых соблюдается подчинение закону Лам-берта-Бера, находятся в пределах 0,2-20 мкг/мл; количественное содержание хамазулена в эфирном масле «Ахилона» находится в пределах 6,15-6,61%.

2.2. Каротиноиды

Наличие каротиноидов в «Ахилоне» определяли методом хроматографии в тонком слое сорбента в различных системах растворителей: петролейный эфир-бензол-метанол 81:15:4, ацетон-петролейный эфир 9:1, гексан-диэтило-вый эфир 3:7.

Разделение суммы каротиноидов проводили методом колоночной хроматографии, используя колонку с оксидом магния. В качестве проявителей применяли петролейный эфир и бензол. Элюаты анализировали методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол».

Идентификацию каротиноидоз осуществляли по УФ-спектрам поглоще-' ния, по окраске на адсорбенте и в растворах, по расположению зон на хромато-граммах, при хроматографировании смешанных проб, выделенных каротиноидов, с достоверными образцами. При этом в средстве «Ахилон» обнаружено не менее шести каротиноидов, три из которых идентифицированы как а- каротин, р- каротин и у-каротин.

Для количественного определения пигментов использовали методику, позволяющую определять каротиноиды и хлорофиллы при их совместном присутствии. (Лигвиненко В.И. и др., 1997). Количество каротиноидов в «Ахилоне» 33,09 мг/100 г, а количество хлорофиллов - 240,82 мг/100г.

2.3. Кумарины

Присутствие кумаринов в «Ахилоне» определяли качественными реакциями. Качественный состав кумаринов определяли хроматографнрованием ацетонового раствора исследуемого средства в различных системах растворителей на бумаге, предварительно импрегнпро ванной смесью формамид-ацетон в соотношении 1:3. Пятна кумаринов на хроматограммах обнаруживали в УФ-свете до и после обработки 10% раствором гидроксида натрия. Установили, что в средстве «Ахилон» содержится не менее 4-х веществ, производных кумарина.

Сумму кумаринов разделяли методом колоночной хроматографии на си-ликагеле. Колонку последовательно промыва:™ бензолом, смесью бензола и

хлороформа 1:1. Из бензольных элюатов получили кумарин и цихорин, из бензольно-хлороформных - убелииферон II скололетин (таблица 2).

■ ' • ' Таблица 2 Результаты хроматогрзфического анализа и физико-химические свойства _ кумаринов, выделенных из «Ахилона»_

Вещества Величина Я(в системах растворителей Флюоресценция в УФ-свеге Общая формула т °г ■•пл.»

I II Ш До проявления После проявления .

Кумарин 0,89 0,75 0,11 - Желто-зеленая СзНбОа 67-68

Цихорин 0,15 0,13 0,36 Бледно-розово-голубая Желтая С|8Н1бОю 212-215

Умбеллиферон 0,35 0,32 0,88 Голуби Ярко-голубая ОДА 232-238

Скополетин 0,20 0,20 0,42 Голубая Голубовато-зеленая С10Н1О4 269-270

*Примечаиис: систем растворителей: I - хлорофсрм/формамид, 25%;

II - петролейный эфир/форыампд, 25%; III - бешол (2:1)/формамнд, 25%.

Количественное определение кумаринов проводили хромато-спектрофотометрическим методом, проведя предварительную очистку кумари-новых соединений от баластных веществ (Ермакова А.И. и др., 1972; Георгиевский В.П. и др., 1990). Установлено, что в «Ахилоне» содержится 0,85% кумаринов (кумарина 0,12%, цихорина 0,29%, умбеллиферона 0,10%, скополетина 0,34%).

2.4. Флавоноиды

Присутствие флавоноидов в «Ахилоне» определяли качественными реакциями (Синода, цианидиновая по Брианту, Вильсона-Таубека и др.), а также хроматографически с достоверными образцами в различных системах растворителей: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2), бензол-метанол (8:2), уксусная кислота. В результате исследования установили наличие не менее шести веществ, производных бензо-у-пирона, из них пять идентифицировали как га-перозид, кверцетин, рутин, лютеолин, апигешш.

Количественно флавоноиды определяли спекрофотрметрически (ГФ X) в пересчете на кверцетин. Установлено, что содержание флавоноидов в «Ахилоне» составляло 5,07%.

2.5. Дубильные вещества

Обнаружение дубильных веществ проводили качественными реакциями (с 1% раствором железа (III) хлорида, с железо-аммонийными квасцами, с бромной водой, с 1% раствором ванилина в кислоте хлористоводородной концентрированной, с 1 % раствором желатина и др).

Наличие галловой и эллаговой кислот в продуктах кислотного гидролиза средства «Ахилон» определяли хроматографически с достоверными образцами.

Присутствие катехинов определяли качественными реакциями и хроматографией в тонком слое сорбента. При смачивании сосновой палочки исследуемым экстрактом, а затем после высушивания - концентрированной хлористоводородной кислотой, палочка окрасилась в красный цвет, что характерно для катехинов.

Хроматографическнй анализ раствора средства «Ахилон» на пластинках «Силуфол» в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода 40:12:28 с последующей обработкой парами аммиака, раствором 1% ванилина в концентрированной хлористоводородной кислоте подтверждает наличие катехинов. Катехины проявлялись на хроматограммах в виде красно-оранжевых пятен.

Установлено, что «Ахилон» содержит гидролизуемые (галловую и элла-говую кислоты) и конденсированные дубильные вещества (олигомеры и полимеры катехинов) Их количество, определенное методом перманганатометрии (ГФ XI), в «Ахилоне» составляет 19,70%.

При определении срока хранения «Ахилона» установлено, что «Ахилон» стабилен в течение 2-х лет; по истечении этого срока происходит незначительное количественное уменьшение содержания биологически активных веществ.

3. Изучение химического состава «Ахипола»

Для идентификации и количественного определения моносахаридов в «Ахиполе» применяли кислотный гидролиз, в процессе которого расщепляются гликозидные связи. Для определения условий гидролиза применяли серную кислоту различной концентрации и определяли время полного гидролиза с помощью хроматографии на бумаге нейтрализованных проб через 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 часов.

Выявлено, что полнота гидролиза полисахаридного комплекса травы тысячелистника обыкновенного достигается через 8 часов 10% серной кислотой.

Мономерный состав полисахаридного комплекса представлен ксилозой, глюкозой, арабинозой, рамнозой, галактозой и глюкуроновой кислотой.

Количественное определение моносахаридов проводили денситометри-чески после хроматографии в тонком слое сорбента нейтрализованного гидро-лизата «Ахипола» (система растворителей: н-бутанол-уксуная кислота-вода 3:1:1). Установлено, что преобладающим моносахаридом является глюкоза (47,1±2,4%); количество арабинозы 10,8±0,6%, галактозы 21,3±1,8%, рамнозы 11±0,7%, ксилозы 0,3±0,1%, глюкуроновой кислоты 1,5±0,1%.

4. Изучение биологической активности «Ахилона» и «Ахипола» 4.1. Исследование анальгетической активности «Ахилона» Аиальгетнческую активность фармакологического средства «Ахилон» проводили на мышах с использованием модели «уксусных корчей» и модели формалиновой болевой реакции (таблица 3). Обезболивающее действие исследуемого средства оценивали с учетом его антиноцицептивного влияния на компоненты механизма формирования болевой реакции, вЕ>оываемой действием химического раздражителя - на модели формалиновой болевой реакции (ФБР) (\Vheeler-Aceto Н., 1991). При ФБР активируется эндогенная опиоидная

система, изменяющая перцепцию боли. I фаза ФБР связана с прямой стимуляцией нервных окончаний и определяет центральный компонент формирования болевой реакции. Во II фазе наблюдается сенситизация ноцицепторов эндогенными продуктами воспаления - гистамином, серотонином, простагландинами и другими, что опосредует периферический компонент механизма ФБР.

В генезе развития модели «уксусных корчей» основная роль принадлежит эндогенным киникам, образующимся при снижении рН среды (Гацура В.В., 19^4).' Установлено, что «Ахилон» обладает высокой анальгетической активностью при кининовой болевой реакции, подавляя болевое реагирование на 62% (Р<0,01), то есть на уровне действия анальгина (44%), а также достоверной антиноцицеитивной активностью в обеих фазах ФБР: подавляет I фазу на 40%, II фазу на 48% (Р<0,01) (таблица 3). Полученные данные позволяют предположить, что «Ахилон» действует на центральный компонент формирования боли и снижает чувствительность болевых рецепторов к действию медиаторов воспаления, что коррелирует с его активностью при кининовой болевой реакции.

Таблица 3

Исследование анальгетической активности «Ахилона»_

Условия опыта Доза Число «уксусных корчей» Число реагирований при ФБР

ВI фаз)' Во II фазу

М±ст % М±сг % М±ст %

Масло 0,25 мл 0 - 0 - 0 -

Масло+ флогоген 0,25 ли 31,8±1,6 100 4,7±0,7 100 7,5±0,8 100

«Ахилон»+ флогоген 3,0 мг/кг 12,2±1,2 38* 2,8±0,8 60* 4,0±0,9 52*

Анальгин + флогоген 5,5 Ш'/кг 17,8±1,3 56* 0,6±0,8 12* 2,0±0,9 27*

4.2. Исследование противовоспалительной активности «Ахилона» Воспаление, как универсальный патологический процесс, отягощенный циркуляторной гемической гипоксией и болью, сопровождает практически все заболевания. Между тем, многие противовоспалительные средства (производные пиразолона, кортикостероиды, салицштаты) наряду со снижением воспалительного отека угнетают иммуногенез, снижая при этом положительное значение воспаления как защитного механизма (Алехин Е.К., Лазарева Д.Н., 1985; Чернышев В.А., Гусев Е.В., 2001).

Учитывая важность этого, первая серия опытов была посвящена исследованию противовоспалительных свойств «Ахилона» на модели острого асептического воспаления, вызываемого введением в подушечку правой задней лапки мыши 0,05 мл 3,5% раствора формалина. Во второй серии опытов исследовали противовоспалительную активность «Ахилона» на модели анафилактоидной реакции, вызываемой введением 0,05 мл декстрана в подушечку правой задней лапки мыши (Николаев А.И., Черемнев B.C., 1983).

Установлено, что «Ахилон;> обладает противовоспалительным действием на модели острого асептического воспаления (снижает интенсивность отека на 32,74% (таблица 4)) и на модели анафипактоидного воспаления (способствуя снижению отека лапок мышеи после введения декстрана на 79,44% (таблица 4)). Противовоспалительное действие настоя тысячелистника на обеих моделях менее выражено.

Таблица 4

Исследование противовоспалительной активности «Ахилона» на модели

острого асептического воспаления и анафилактоидной реакции

Острое асептическое Анафилактоидное

Условия опыта, Доза воспаление воспаление

соединение Шггенсив-носп. отека,% ИР Интенсивность отека, % ИР

Масло 0,25 мп 0 - 0 0

Масло+флогоген 0,25 мл 100 87,35 100 16,41

«Ахигот>+флогоген 3,0 мг/кг 67,26 58,75* 20,56 3,37*

Физ. раствор +флогоген 0,4 мл 100 91,62 100 20,50

Настой тысячелист- 0,4 мл 90,23 82,67 80,05 16,41

ника +флогоген

В третьей серии опытов, проведенных на кроликах породы шиншилла, изучали противовоспалительную наивность «Ахилона» на модели медикаментозного гепатита, вызываемого введением тетрациклина гидрохлорида (Скакун В.П., Высоцкий И.Ю., 1982). О противовоспалительном действии «Ахилона» судили, определяя биохимические и гематологические показатели, исследования которых проводили до и после заключительного введения тетрациклина.

В группе животкых с экспериментальным гепатитом наблюдалось достоверное повышение лейкоцитов, что характеризует развитие острого воспалительного процесса, а также повышалась активность АлАТ и АсАТ в сыворотке крови, что указывает на цитолиз гепатоцитов. Введение тетрациклина в той же дозе на фоне применения «Ахилона» не приводило к столь выраженному изменению активности АлАТ и АсАТ, что свидетельствует о существенном противовоспалительном действии «Ахилона».

Полученные результаты позволяют заключить, что предлагаемый нами препарат «Ахилон» обладает стабильной противовоспалительной активностью не зависимо от причины ее возникновения.

4.3. Определение антимикробной активности «Ахилона»

Анализ данных литературы: о применении тысячелистника обыкновенного в народной медицине для лечения различных инфекционных заболеваний (Акопов Н.Э., 1986), а также наличие бактерицидных и бактериостатичсских свойств отдельных химических соединений в составе тысячелистника (Ибрагимов Д.Т., 1981; Любзрцева Л.А., 1985) предполагает, наличие антимикробной активности в препаратах, получечных на основе тысячелистника обыкновенного. ■ "

Выявление антимикробных свойств препаратов тысячелистника обыкновенного проводили совместно с кафедрой микробиологии КГМУ методом диффузии в слой агара и методом серийных разведений. Установлена антимикробная активность «Ахилона» в отношении: Proteus vulgaris АТСС 4636; Candida albicans NCTC 2625; Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus aureus 209-p; Bacillus subtilis ATCC 6633; Pseudomonas aemginosa ATCC 1313.

4.4. Изучение иммуномодулирующей активности фармакологических средств из тысячелистника обыкновенного 4.4.1. Влияние «Ахилона» и «Ахипола» на развитие ГИОу животных,

получавших антибиотик Важнейшим компонентом комплексной терапии инфекционных заболеваний являются антибиотики. Вместе с тем, большинство известных антибиотиков в терапевтических дозах вызывает выраженную супрессию различных звеньев иммунной системы, что существенно уменьшает эффективность анти-биотикотерапии и делает актуальной задачу поиска путей преодоления или значительного ослабления иммуносупрессирующего действия антибиотиков (Навашин С.М., 1997; Хмелевская И.Г., 2000; Егоров A.M. и др., 2001). Решение этой задачи можно найти на пути сочетанкого применения антибиотиков и иммуномодуляторов различной химической природы. В этой связи было изучено влияния «Ахилона» и «Ахипола» на развитие гуморального иммунного ответа у животных в условиях иммуносупрессии, индуцированной введением антибиотика гентамицина в дозе 5,0 мг/кг в течение 5 дней. Интенсивность развития гуморального иммунного ответа оценивали на 5-й день после иммунизации по количеству антителобразующих и розеткообразуюших клеток (Зауэр X., 1987) (рис. 1).

60 50 40 30 20 10 о

JL

У

Рис. 1. Влияние препаратов на количество АОК при медикаментозной иммуносупрессии, обусловленной гентамицином.

По оси абсцисс - группы животных

По оси ординат - количество АОК на селезенку, 103.

1 - Контроль; 2 - Животные, получавшие «Ахилон»; 3 - Животные, получавшие «Ахипол»; 4 _ Животные, получавшие генгашщин; 5 - Животные, получавшие геотамицин и «Ахилон»; 6 - Животные, получавшие генташщин и к Ахипол».

Установлено, что «Ахилон» и «Ахипол» повышают количество АОК по сравнению с только иммунизированными животными. При этом «Ахипол» увеличивал количество АОК в 2,1 раза; применение антибиотика снижает количе-

ство антителообразующих клеток в 4,5 раза по сравнению с контролем. Введение препаратов тысячелистника в условиях вддого опыта значительно снижает иммулосупрессорное действие а|Щ1б$ртик;& так «Ахипол» повышал количество ДОК в 2,4 раза, по срарнению с иммунизированными животными, получавшими антибиотик. Направле^ррсть действия препарата на уровень РОК аналогична: при щтоюшйщмуносупр.ессии «Ахилон» увеличивал количество РОК в 2,3 раза, а «Ахипол» - в 2,7 раза.

4.4.2. Влияние «.4х\июна» и с.Лхипола» на развитие ГИО у животных

при эксперимента}. !, ной стафилококковой инфекции Борьба со стаф(1лркоккрврй инфекцией прододжает оставаться актуальной проблемой и в настоящее: время (К. I^agajpi е$ al., 1997). При развитии стафилококковой инфекции млгробныр тела оказьшают, в основном, супрессивное действие на иммунную систему организма (Маянский А.Н. и др., 1997; Снимщикова И.А., 2001). В этой связи в комплексную терапию наряду с антибиотиками включают иммунокорригирующие средства (Цемагилова А.Ф. и др., 1996; Утещев Б.Ц-и др., 1996).

Иммунотропное вщдаие сочетанного применения антибиотиков и фармакологических средств, подобных «Ахилону» и «Ахиполу», при стафилококковой инфекции не изучено. В серии опытов, проведенных на мышах-гибридах (СБА х 57ВЬ'6) исследовали иммунрмодулирующее действие сочетанного применения фармакологических средств из тысячелистника и антибиотика ген-тамицина при стафилококковой инфекции (рис. 2).

60 so

40 30 20 10 о

я Н н а н н я

9 10 11 12

Рис. 2. Влияние препаратов тысячелистника на количество АОК при стафилококковой инфекции.

По оси абсцисс - групща животных.

По оси ординат - количество АОК иа селезенку, 103.

1 - Контроль; 2 - Животные, получавшие «Ахилон»; 3 - Животные, получавшие «Ахипол» в дозе 1,0 мг/кг; 4 - Жщдотные, получавщце «Ахипол» в дозе 5,0 мг/кг; 5 - Животные, шфщщродаиные стафилококком; б - Животные, инфицированные стафилококком и получавшие «Ахилон», 7 - Животные, инфицированные стафилококком и получавшие «Ахипол» в дозе 1,0 мг/кг; 8 - Животные, инфицированные стафилококком и получавшие «Ахипол» в дозе 5,0 мг/кг; 9 - Животные, инфицированные стафилококком и получавшие гентамищш; 10 - Животные, шгфщшроашшы? стафилококком, получавшие гентамицин и «Ахилою>; 11 - Животные, инфицщюванные стафилококком, получавшие геитамицин и «Ахипол» в дозе 1,0 мг/кг; 12 - Животные, инфицированные стафилококком, получавшие гентамицин и «Ахипол» в дозе 5,0 мг/кг.

Установлено, что инфицирование мышей стафилококком приводит к угнетению иммунного ответа к эритроцитам барана: число А.ОК уменьшается в 1,6 раза по сравнению с контрольными животными. Введение гентамицина усугубляет выраженность иммунносупрессии. Сочетанное применение гентамицина с «Ахиполом» или «Ахилоном» достоверно дозозависимо повышает интенсивность иммунного ответа. Направленность действия препарата на уровень РОК аналогична.

«Ахипол» проявляет несколько более выраженную иммуностимулирующую активность по сравнению с «Ахилоном». Это свидетельство того, что им-, мунотропное действие возможно обусловлено более сложным химическим составом «Ахипола». Полученные результаты экспериментально обосновывают целесообразность доклинических испытаний препаратов тысячелистника в качестве иммунокорректорных средств.

4.4.3. Влияние «Ахилот» и «Ахипола» на факторы не специфической защиты организма

Факторы неспецифической защиты организма являются неотъемлемым компонентом формирования иммунного ответ;., а таюке участвуют в эффек-торных функциях иммунной системы (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974; Кашкин К.П., 1984; Петров Р.В., 1997). Поэтому следующая серия опытов была посвящена изучению влияния «Ахилона» и «Ахипола» на некоторые факторы естественного иммунитета у интактных животных и на фоне применения антибиотиков. Исследования проводили на крысгсс Вистар. Животным опытных групп вводили препарат «Ахилон» или «Аллпол» внугрибрюшинно в дозе 3,0 мг/кг изолированно или в сочетании с гентамицином (таблица 5).

Установлено, что прием «Ахилона» повышает уровень лизоцима и [1-ли-зинов, активность комплемента. Аналогичные изменения наблюдаются и при введении «Ахипола». Кроме того, введение «Ахипола» и «Ахилона» достоверно увеличивало показатели фагоцитоза (р< 0,05).

Оба фармакологических средства в условиях антибиотикотерапии повышают уровень лизоцима, ß-лизинов и активность комплемента по сравнению с группами, получавшими только антибиотик. Однако, по сравнению с контролем эти показатели остаются сниженными.

4.4.4. Изучение протективных свойств «Ахилона» и «Ахипола» .^„.Учитывая приведенные выше данные об антимикробном и стимулирующем действии «Ахилона» и «Ахипола» на развитие ГИО при стафилококковой инфекции, а также способность этих препаратов повышать активность, факторов неспецифической резистентности организма, целью настоящей" серии опытов являлось изучение влияния препаратов тысячелистника обыкновенного на выживаемость и продолжительность жизни мышей при заражении их летальной (4,8х109 микробных тел) и сублетальнон (2,4х109 микробных тел) дозами золотистого стафилококка.

Опыты проводили на мышах линии ICR. «Ахилон» и «Ахшюл» живогные получали per os в дозе 3,0 мг/кг. Одна часть живот пых получала исследуемые препараты в течение 5 дней с интервалом 24 часа до инфицирования, другая -по такой же схеме, но после инфицирования. Контрольные животные получали

воду очищенную в цозе 0,4 мл ч олирковое масло в дозе 0,25 мл, в качестве препарата сравнения использовали официальный препарат - настой тысячелистника обыкновенного в дозе 0,4 ил.

Наблюдение за животными проронили в течение 10 дней, определяя выживаемость в % и среднюю продолжительность жизни в днях (таблица 6).

Таблица 6

Протегрирное действие «Лондона» и «Ахипола»,

введенных после инфицирования золотистым стафилококком

№ п/п Условия опыта Легачшая и сублегальная дозы стафилококка, миьр тел' Количество иыифвщих мышей Средняя продолжительность жизни, дай

Абсолютное %

1. Инфицирование + вода 4,£*10* 0 0 <4,0

2,4* 10й 16 40 <6,5

2. Ма~ю оливковое ■+ инфицирование 4,Я*10* 0 0 <4,0

2,4*10* 16 40 <6,5

3. Настой тысячелистника + инфицирование 4,»* 10* 19 48 <6,4

2,4*10* 23 58 <7,0

4. «Аотлон»+ инфицирование 4,8*10" 22 55 <7,2

2,4*10' 29 73 <8,2

5. «Ахппол» + инфицирование 4,8*10* 24 60 <7,3

2,4*10* 32 80 <8,6

*- Р<0,05 н*=40

Установлено, что применение «Ахилона» и «Ахипола» до инфицирования сублетапятой дозой стафилр^ода увеличивет средщою продолжитель-норть жизни животных в 1,3 раза, а выживаемрсть - в 1,9-2,0 раза по сравнению с контролем. Настой тысячелистника, применяемый в качестве препарата сравнения, увеличивал количество выживших животных лишь в 1,3 раза.

Применение «Ахилона» и «Ахицрда» после инфицирования животных сублетальной дозой стафилококка повышает среднюю продолжительность их жизни в 1,3 раза, а выживаемость - в 1,8-2,0 раза по сравнению с контролем.

В условиях нашегр опыта выраженность протективного действия у «Ахилона» и «Ахипо.га» была значительно выше при назначении препаратов до инфйдирования мышей, чем после. По-видимому, более эффективное действие препаратов, используемых профилактически, объясняется активизацией под их влиярцем иммунной системы и Елшшикробного действия, а в случае назначения «Ахилона» и «Ахипола» после инфицирования их эффект реализуется в основном за счет антимикробной активности препаратов.

/

Таблица 5

Влияние «Ахилона» и «Ахнпола» на актнвностьнеспецнфических факторов защиты организма у здоровых животных и при приеме антибиотика

№ п/'п Условия опыта (3-лизины, % Комплемент, ед. Лизоцим, мкг/мл Показатели фагоцитоза

Фагоцитарная активность, % Фагоцитарная интенсивность Завершенность фагоцитоза, %

Здоровые животные

1. Контроль | 51,0±2,7 52,8±2,7 33,1±2,5 37,9±2,5 2,9±0,3 21,8±4,1

2. «Ахилон» 1 58,2±3,1* 65,6±4,8* 45,8±3,2* 48,8±4,3* 3,0±0,2 35,1±3,8

3. «Ахипол» 1 60,2±5,0* 1 71,3±4,1* 48,9±1,5* 47,1±3,5* 3,6±0,4 41,8±4,0

Животные; получавшие антибиотик

4. Антибиотик 30,1±3,6 13,2±0,4 28,4±1,8 26.4±1,8 4,1 ±0,4 28,3±5,2

5. Антибиотик + «Ахилон» 54,1±3,2 18,4±1,3 43.5±1,7 42,5±4,1 6,3±0,2 44,2±4,8

6. Антибиотик + «Ахипол» 59,3±4,1 21,3±5,3 47,8±2,8 41,2±5,0 б,5±0,5 40.1±3,2

выводы

1. Разработан способ получения из травы суммарного препарата липофильных биологически активных врществ «Ахилон», а из шрота тысячелистника обыкновенного водорастворимого полисахэридного комплекса «Ахипол».

2. Изучен химический состав «Ахилона». Выделены и идентифицированы по-дирны: соединения терпенового ряда (а-, р-, у-каротины), сесквитерпеновые лактоны (матрикарин, аустрицин, ханфиллин); производные бензо-а-пирона (умбеллиферон, скополстин, кумарин, цихорин), производные фенил-бензо-у-пирона (гиперозид, кверцетин, рутин, апигенин, лютеолин), дубильные вещества гидролизуемой и конденсированной групп. Цихорин и ханфиллин для тысячелистника обыкновенного описаны впервые.

3. Установлено количественное содержание биологически активных веществ в «Ахидоне»: каротиновдов - 33,09 мг/100 г; хлорофиллов - 240,85 мг/ЮОг; се-сквитерпеновых лактонов - 0,43%; эфирного масла - 6,72%; хамазулена в эфирном масле - 6,33%; кумаринов - 0,85%; флавоновдов - 5,07%; дубильных веществ -19,63%.

4. Обоснована возможность УФ-спектрофотометрического определения количественного содержания хамазулена в эфирном масле «Ахилона» при длине волны 358 нм.

5. Изучен химический состав полисахаридного комплекса, полученного из шрота трзвы тысячелистника обыкновенного («Ахипола»). Установлено, что водорастворимый полисахаридный комплекс представлен D-глюкозой (47,1 ±2,4%), D-ксилозой (0,3±0,03%), L-рамнозой (11,4±0,7%), L-арабинозой (10,8±0,6%), , D-галактозон (21,3±1,8%) и глюкуроновой кислотой (1,5±0,03%).

6. В эксперименте на различных моделях показано, что «Ахилон» обладает анальгетической, противовоспалительной, антиноцицептивной и антимикробной активностью.

7. «Ахилон» и «Ахипол» проявляют иммуностимулирующую активность у здоровых животных и на фоне иммуносупрессии, обусловленной введением антибиотика или развитием стафилококковой инфекции. В условиях наших опытов «Ахипол» как иммуностимулятор более активен, чем «Ахилон».

8. «Ахилон» и «Ахипол» повышают активность комплемента, уровень лизоци-ма, р-лизина и показателей фагоцитоза при изолированном и сочетанием с антибиотиком введении.

9. «Ахипол» и «Ахилон», введенные per os до или после инфицирования, обладают протективным действием при острой форме стафилококковой инфекции инфекции, снижая количество павших животных и увеличивая их среднюю продолжительность жизни. При этом протективное действие «Ахилона» и «Ахипола» более выражено, чем действие официналыюго препарата -травы тысячелистника обыкновенного.

10. По результатам проведенных фотохимических и фармакологических исследований, разработан и подготовлен к рассмотрению проект ФС «Экстракт

тысячелистника обыкновенного густой («Ахилон») и проект дополнения к фармакопейной статье «Трава тысячелистника».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сурнина, Н.Т. Изучение противовоспалительной и антиаллергической активности густого экстракта тысячелистника обыкновенного / Н.Т. Сурнина, Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Е.В. Королева // Человек и его здоровье. - Выпуск 2. -Курск, 1999.-С.349-351.

2. Сурнина, Н.Т. Исследование анальгетической активности густого экстракта тысячелистника обыкновенного / Н.Т. Сурнина, Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Е.В. Королева // Актуальные вопросы дерматовенерологии. - Выпуск И. -Курск, 1999.-С.95-97.

3. Чалый, Г.А. Состав и фармакологическая активность густого экстракта тысячелистника обыкновенного / Г.А. Чалый, Н.Т. Сурнина, Е.В. Королева,

B.Я. Яцюк // Достижения современной фармации и перспективы ее развития в новом тысячелетии. - Харьков, 1999. - С. 338-339.

4. Чалый, Г.А, Иммунокорригирующее действие экстракта тысячелистника обыкновенного при антибиотикоиммуносупрессии / Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Л.П. Чалая, Н.Т. Тузикова // Актуальные проблемы медицины и фармации. Материалы 65-ой конференции молодых ученых и студентов КГМУ. - Курск, 2000 г. - С. 62-63.

5. Чалый, Г.А. Исследование гепатопротекторного действия экстракта тысячелистника / Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Н.Т. Сурнина, Л.А. Попова // Материалы 12-й международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии». - Санкт-Петербург, 2000.-

C. 124-125.

6. Чалый, Г.А. Препарат тысячелистника для коррекции иммунодепрес-сивного действия антибиотиков / Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Н.Т. Сурнина, Л.А. Попова // Материалы 12-й международной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии». - Санкт-Петербург, 2000. - С. 125-126.

7. Чалый, Г.А. Перспективы использования густого экстракта тысячелистника обыкновенного в медицине / Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Н.Т. Сурнина, O.A. Елецкая // Актуальные вопросы дерматовенерологии. - Выпуск 1П. -Курск, 2000. - С. 150-151.

8.Чалый, Г.А. Иммунокорригирующее действие фармакологического средства «Ахипол» / Г.А. Чалый, В.Я. Яцюк, Н.Т. Сурнина // Человек и его здоровье. - Выпуск 3. - Курск, 2000. - С. 209-210.

9. Сурнина, Н.Т. Исследование процесса экстракции биологически активных веществ из травы тысячелистника обыкновенного / Н.Т. Сурнина, К.К. Абдраимова, Л.М. Севальнева И Актуальные проблемы медицины и фармации. ¡Материалы 66-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых.- Курск, 2001. - С. 345-346.

10. Чалый, Г.А. Полисахариднын комплекс тысячелистника обыкновенного как иммунокорригирующее средство / Г.А. Чалый, Н.Т. Сурнина, В.Я. Яцюк // Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофарма-кологии. - Том II. - Москва, 2001. - С. 303.