Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследования по стандартизации клопогона кистевидного (Cimicifuga racemosa L. Nutt.), табака настоящего (Nicotiana tabacum L.) и препаратов на их основе

На правах рукописи

Обольский Дмитрий Маркович

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ КЛОПОДША КИСТЕВИДНОГО (<CIMICIFUGA RACEMOSA L. NUTT.), ТАБАКА НАСТОЯЩЕГО (NICOTIANA TABACUML.) И ПРЕПАРАТОВ НА ИХ ОСНОВЕ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

G03453GG3

Москва-2009 г

003459063

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Сокольская Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор, академик РАЕН Патудин Александр Васильевич

Доктор фармацевтических наук Лякина Марина Николавена

Ведущая организация: Научно-исследовательский Институт Фармации ММА И.М. Сеченова

Защита состоится «д 2009 г в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, г.Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан « £» р 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук А.И.Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Табакокурение занимает первое место в мире среди предотвратимых причин смертности, однако от 3,5 до 5,4 миллионов человек ежегодно умирают в результате проблем со здоровьем, вызванных курением. Основными причинами смерти курильщиков являются поражение дыхательной и сердечно-сосудистой систем, а также развитие злокачественных опухолей. Распространение табачной эпидемии является глобальной проблемой, которая имеет серьезные последствия для здоровья людей и требует широкого международного сотрудничества и участия всех стран в эффективных ответных мерах. В 2003 году Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) приняла документ «Рамочная Конвенция по борьбе против табака», который к настоящему моменту был подписан 167 странами и Европейским Сообществом, в том числе и Российской Федерацией (РФ).

Среди других экономических и политических мер регулирования конвенция также предусматривает поддержку научно-технических исследований и разработку новых эффективных лекарственных средств, направленных на борьбу с курением. В настоящее время в РФ зарегистрировано 3 лекарственных препарата никотинозаместительной терапии (2 из которых зарубежного производства), а также 4 отечественных комплексных гомеопатических препарата, применяемых для облегчения отвыкания от курения.

Ввиду чрезвычайно узкого и ограниченного ассортимента импортных и отечественных препаратов этой группы и многочисленных опасностей, которые несет табакокурение, актуальным является разработка лекарственных препаратов применяемых для лечения никотиновой зависимости.

Российской компанией ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» разработан комплексный гомеопатический лекарственный препарат Никомель, применяемый для снижения влечения к табакокурению, уменьшения раздражительности и дискомфорта. В состав препарата входит 4 активных компонента на основе матричных настоек: Nux vomica (чилибуха рвотная) С30; Tabacum

(табак настоящий) С50; Cimicifuga (клопогон кистевидный) С24; Staphisagria (живокость аптечная) СЗО.

Для эффективного и безопасного применения лекарственных средств (JIC) первостепенное значение имеет их качество. В случае с гомеопатическим лекарственным средством основное внимание придается контролю качества исходных матричных настоек и видов сырья, из которого они были получены. Однако стандартами, регламентирующими показатели качества вышеуказанных настоек, являются монографии зарубежных фармакопей. Российская нормативная документация на лекарственное растительное сырье (JIPC) и соответствующие матричные настойки отсутствует. К настоящему времени разработана лишь ВФС 42-2190-93 «Листья табака настоящего», регламентирующая качество сырья табака настоящего для приготовления одной матричной настойки из состава препарата Никомель.

Более того, препараты на основе сырья табака настоящего и клопогона кистевидного помимо препарата Никомель являются активными компонентами и других лекарственных средств, зарегистрированных в РФ. Так матричная настойка табака настоящего также входит в состав комплексных гомеопатических препаратов Табакум, Табакум-плюс и Никостен. Сырье клопогона кистевидного используется в производстве JIC, применяемых для лечения симптомов менопаузы (Климадинон, Климактоплан Н), а также для получения различных биологически активных добавок к пище.

В этой связи считаем актуальным проведение фитохимического и фармакогностического изучения, стандартизации с последующей разработкой проектов нормативной документации (НД) на сырье клопогона кистевидного и табака настоящего, а также НД на настойки гомеопатические матричные (НГМ), приготовленные на их основе.

Цель и задачи исследования

Целью настоящих исследований является изучение химического состава БАВ и разработка современных методик стандартизации качества JIPC клопогона кистевидного (Cimicifuga racemosa L. Nutt., семейство лютиковые - Ranunculaceae), табака

настоящего (Мсойапа 1аЪасит Ь., семейство пасленовые - Бокпасеае) и НГМ на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить компонентный состав биологически активных веществ (БАВ) свежесобранного лекарственного растительного сырья клопогона кистевидного и высушенного лекарственного растительного сырья табака настоящего;

• разработать методики качественного и количественного анализа БАВ в исследуемых видах сырья;

• отработать способ получения гомеопатических матричных настоек на основе изучаемых растений;

• исследовать химический состав настоек гомеопатических матричных, полученных из изучаемых видов сырья;

• разработать методики качественного и количественного анализа БАВ в матричных настойках клопогона кистевидного и табака настоящего;

• разработать и оформить нормативные документы на исследуемые виды растительного сырья и НГМ.

Научная новнзна работы

На основании микроскопического анализа ЛРС табака настоящего и клопогона кистевидного выявлены диагностически значимые признаки в анатомическом строении для каждого из них. Разработаны условия анализа БАВ в сырье и НГМ клопогона кистевидного и табака настоящего с помощью физико-химических методов: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрофотометрия (СФ).

Изучен качественный состав основных групп БАВ (фенольные соединения, тритерпеновые гликозиды, алкалоиды) в ЛРС и НГМ табака настоящего и клопогона кистевидного, интродуцированных в РФ, в соответствии с установленными за рубежом требованиями к качеству НГМ.

Изучен качественный и количественный состав аминокислот в НГМ табака настоящего и клопогона кистевидного в сравнении с аналогичными настойками производства Германии.

С учетом современных требований к растительному сырью и НГМ разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в сырье табака настоящего и клопогона кистевидного и в НГМ на их основе.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработан:

• проект новой ФС «Табака настоящего листья» взамен ВФС 422190-93.

Впервые разработаны:

• проект ФС «Клопогона кистевидного корневища с корнями»

• проект ФС «Nicotiana tabacum (Tabacum) Настойка гомеопатическая матричная»

• проект ФС «Cimicifuga racemosa (Cimicifuga) Настойка гомеопатическая матричная»

Основные положения, выносимые на защиту

1. Анализ номенклатуры лекарственных средств для коррекции нарушений при алкоголизме, токсико- и наркоманиях на фармацевтическом рынке Российской Федерации.

2. Результаты фармакогностического исследования и стандартизации качества сырья клопогона кистевидного и табака настоящего.

3. Результаты изучения химического состава БАВ и разработки методик стандартизации НГМ клопогона кистевидного и табака настоящего.

Апробация работы

Основные результаты экспериментальных исследований доложены на международной научно-практической конференции «Натуральные продукты для фармацевтической, косметической и агрохимической промышленности» (Афины, 2008), XIX Московской Международной Гомеопатической Конференции (Москва, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 162 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 109 источников, в том числе 63 иностранных, приложений. Работа содержит 37 рисунков и 36 таблиц.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе дана характеристика номенклатуры лекарственных средств, применяемых для лечения никотиновой зависимости; отражены особенности технологии производства комплексных гомеопатических препаратов. На основании данных литературы показано широкое использование НГМ клопогона и табака в гомеопатических препаратах. Обоснована рациональность разработки методик контроля качества ЛРС и НГМ клопогона кистевидного и табака настоящего.

Во второй главе «Объекты и методы исследования» приведена информация об объектах изучения, методах и приборах, используемых в экспериментах.

Третья глава посвящена фармакогностическому и фитохимическому исследованию сырья табака настоящего, установлению норм и показателей качества, позволяющих идентифицировать данное сырье и достоверно контролировать его качество. Также в главе 3 изложены результаты стандартизации НГМ на основе данного сырья.

В четвертой главе представлены результаты анализа состава биологически активных веществ и результаты фармакогностического изучения сырья клопогона кистевидного, а также данные по разработке номенклатуры и норм показателей качества сырья и НГМ клопогона.

В пятой главе представлены материалы по усовершенствованию технологии приготовления комплекса гомеопатических разведений, используемых в получении препарата Никомель.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Фармакогностическое изучение и стандартизация ЛРС табака настоящего и НГМ на его основе.

Российским нормативным документом (НД), регламентирующим качество листьев табака настоящего, в настоящее время является ВФС 42-2190-93. Однако в ВФС не приводятся макро-и микроскопические признаки измельченных листьев, отсутствуют качественные реакции на основные группы БАВ и метод количественного определения БАВ.

Целью проведенного исследования являлась разработка методов контроля качества сырья табака настоящего для последующего включения в НД, соответствующий международным требованиям.

Объектами исследования служили образцы высушенных листьев табака настоящего, заготовленные после цветения в Московской области, а также НГМ, приготовленная на основе данного сырья, по методу 4 ОФС 42-0027-05.

Исследование морфологических и микроскопических признаков сырья Шсойапа /аЬасит Ь.

Морфолого-анатомическое изучение ЛРС проводили в соответствии со статьей ГФ XI «Методы анализа лекарственного растительного сырья», раздел «Листья».

На основании изучения морфологических характеристик сырья 5 опытных партий нами составлено описание внешних признаков цельных и измельченных высушенных листьев табака настоящего.

При микроскопическом исследовании выявлены диагностические признаки в анатомическом строении листьев: клетки

Фрагмент мезофилла листа (ув. х 600). Нижняя сторона листа (ув. х 450).

Рис. 1. Диагностические признаки в анатомическом строении листьев табака настоящего. 1-идиобласты с кристаллическим песком оксалата кальция; 2 -жилки мезофилла листа; 3- волоски на нижней стороне листа.

Верхняя эпидерма листа. Видны клетки эпидермиса со слегка извилистыми стенками (ув. х 1800).

Нижняя эпидерма листа. Видны извилистые клетки эпидермиса и устьице (ув. х 1800).

эпидермиса на верхней стороне со слегка извилистыми, на нижней с более извилистыми стенками, в углах клеток имеются узелковые утолщения, устьица (аномоцитный тип) с обеих сторон листа, на нижней стороне они присутствуют в большем количестве, наличие в мезофиле многочисленных идиобластов с кристаллическим песком оксалата кальция, обильное опушение, особенно крупных жилок с нижней стороны листа, представлено простыми и железистыми трихомами различных типов. Диагностические признаки анатомического строения листа табака представлены на рис. 1 и 2.

Также была проведена разработка норм числовых показателей для изучаемого сырья (влажность, зола, измельченность, допустимые примеси, содержание суммы алкалоидов в пересчете на никотин).

Рис. 2 - Типы трихом листа табака настоящего (ув. х 450).

1 - Головчатые волоски на многоклеточной ножке с многоклеточной головкой.

2 - Головчатый волосок на многоклеточной ножке с многоклеточной головкой, клетки которой имеют коричневое содержимое.

3 - Головчатый волосок на многоклеточной ножке с многоклеточной головкой и бочковидной базальной клеткой.

4 - Простые многоклеточные волоски.

5 - Головчатые волоски на одноклеточной ножке с многоклеточной головкой.

6 - Ветвистые головчатые волоски.

7 - Головчатый волосок на многоклеточной ножке, со спавшимися клетками, с многоклеточной головкой, клетки которой имеют коричневое содержимое.

Фитохимическое изучение ЛРС и НГМ табака настоящего. Для ЛРС и НГМ табака были проведены качественные реакции на основные группы БАВ, указавшие на наличие фенольных веществ, алкалоидов и аминокислот в сырье и настойке.

В дальнейшем нами был изучен компонентный состав фенольных соединений в сырье и НГМ табака настоящего с помощью метода ВЭЖХ. Вещества фенольного характера извлекали из сырья 70 % спиртом этиловым.

Параллельно готовили серию растворов стандартных образцов галловой кислоты, хлорогенновой кислоты, кофейной кислоты, изоферуловой кислоты, лютеолин-7-гликозида, гиперозида, цикориевой кислоты, дигидрокверцетина, коричной кислоты, гесперидина, кверцетина, нарингенина, апигенина в спирте этиловом 70 %.

По 20 мкл извлечения из ЛРС, разведения НГМ и растворов сравнения вводили в хроматограф «Agilent 1100» и анализировали при скорости подачи элюента 1,0 мл/мин, подвижная фаза: метанол-

вода-фосфорная кислота концентрированная-тетрагидрофуран (370:570:5:60). Колонка LUNA С 18(2) 5цм, размером 150 х 4.6 мм.

Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора Agilent 1200 модели SL при длине волны 254 нм.

Оценка хроматограммы проводилась по временам удерживания и площадям пиков в автоматическом режиме. Результаты экспериментов представлены на рис. 3,4, 5.

На основании полученных данных в извлечении из листьев табака настоящего и НГМ обнаружены галловая, хлорогеновая, кофейная кислоты, а также лютеолин-7-гликозид. В целом хроматограммы настойки и извлечения показывают похожее распределение пиков, что говорит о сходстве качественного фитохимического состава фенольных соединений.

В связи с тем, что предварительное тестирование показало наличие БАВ алкалоидной природы, нами было проведено изучение алкалоидного состава листьев табака настоящего методами ТСХ, ВЭЖХ и СФ. При разработке методик анализа был использован стандартный образец никотина (Sigma, Pestanal, кат. № 36733).

Нами разработана методика ТСХ, показывающая наличие никотина в алкалоидной фракции сырья и НГМ табака настоящего. При хроматографировании в разработанных условиях (система растворителей: ацетон - вода - аммиака раствор концентрированный (90:7:3), неподвижная фаза: пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА») и последующей обработке реактивом Драгендорфа на хроматограмме испытуемого раствора и НГМ табака обнаруживается зона с Rf около 0,75 красно-оранжевого цвета на желтом фоне на уровне зоны стандартного раствора никотина. В некоторых сериях наблюдается наличие других зон адсорбции оранжевого цвета.

Наличие никотина в алкалоидной фракции листьев табака было подтверждено качественно и количественно проведенными исследованиями с помощью методов ВЭЖХ и СФ.

При анализе методом ВЭЖХ по 20 мкл извлечения из сырья табака и раствора сравнения никотина вводили в хроматограф «Agilent 1100» и анализировали при использовании в качестве подвижной фазы системы растворителей ацетонитрил-вода-ТФУ (2:98:0,1), колонка LUNA 5u С18(2). Детектирование проводилось на УФ детекторе при длине волны 259 нм.

3 4 2 5 6 8 л 3 12 м 13 А

1 ' ' ' ' А ' 1 ' ' а ' ' ■ ' Л ' ' ' ' А ■ '

Рис. 3. Хроматограмма смеси стандартов при исследовании качественного состава фенольных соединений в ЛРС и НГМ табака настоящего и клопогона кистевидного методом ВЭЖХ: 1-галловая кислота, 2-хлорогеновая кислота, 3-

кофейная кислота, 4-изоферуловая кислота, 5-лютеолин-7-гликозид, 6-гиперозид, 7-цикориевая кислота, 8-дигидрокверцитин, 9-коричная кислота, 10-гесперидин, 11-кверцитин, 12-нарингенин, 13-апигенин

По результатам 6 определений по разработанной методике ВЭЖХ установлено, что содержание никотина в ЛРС табака составляет не менее 0,88 % (табл. 1). Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками никотина. Ошибка опытов с добавками не превышает 0,38 %.

Количественное определение содержания суммы алкалоидов в пересчете на никотин было проведено также с помощью метода спектрофотометрии.

Таблица 1

Метрологические характеристики методики количественного определения

никотина в листьях табака настоящего методом ВЭЖХ

п Г Хсо Р,% ЦР,0 дхсо

6 5 0,883 0,00014 0,00474 95 2,57 0,01221 ± 1,38

Содержание суммы алкалоидов в пересчете на никотин в ЛРС и НГМ табака настоящего составило не менее 1,0 % и не менее 0,12 % соответственно (табл. 2). Результаты проведенных опытов

Рис. 4. Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений спиртового извлечения из ЛРС табака настоящего: 1-галловая кислота, 2-хлорогеновая кислота, 3-кофейная ксилота, 4-лютеолин-7-гликозид.

1 4

шА

" ' ' ' ¡5 ' ' ' ' 3 ' 33 ' 1 1 ' 35 ' ^

Рис. 5. Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений НГМ табака настоящего: 1-галловая кислота, 2-хлорогеновая кислота, 3-кофейная ксилота, 4-лютеолин-

7-гликозид.

Таблица 2

Метрологические характеристики методики количественного определения

суммы алкалоидов в пересчете на никотин в листьях табака настоящего _методом СФ_

п f Хср S2 Sx Р,% t(P,f) ДХср е, %

6 5 1,165 0,00044 0,00856 95 2,57 0,02200 ± 1,89

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы алкалоидов в пересчете на никотин в НГМ табака настоящего методом СФ

п f хср S sx Р,% t(P,f) ДХср

6 5 0,121 0,00002 0,00192 95 2,57 0,00494 ±4,08

с добавками показали отсутствие систематической ошибки разработанной методики. Полученные спектры приведены на рис. 6.

Как показали результаты исследований, содержание суммы алкалоидов в ЛРС табака, определенное методом СФ, несколько превышает содержание никотина, определенное методом ВЭЖХ (не менее 1 % и не менее 0,88 % соответственно), что говорит о разной чувствительности методов и о возможном наличии незначительного количества других алкалоидов в изучаемом сырье.

Wavelength (nm)

Рис. 6. Спектры поглощения в УФ свете. 1 - стандартный раствор никотина, 3 - НГМ табака настоящего, 2 - извлечение из сырья табака настоящего

Поскольку качественные реакции показали наличие аминокислот (АК) в изучаемом сырье и НГМ табака настоящего, а также наличие общегрупповой реакции на АК в зарубежных НД на

матричную настойку табака, нами дополнительно был исследован качественный и количественный состав аминокислот (АК) в гомеопатическом разведении D2 изучаемой настойки матричной табака настоящего в сравнении с гомеопатическим разведением D2 настойки Tabacum производства DHU (Германия).

Исследование проводилось методом ВЭЖХ с помощью аминокислотного анализатора «Biotronic» LC-2000, снабженном аналитической колонкой размером 400 х 3,2 мм, заполненной смолой «Durrum» DC4A, размер частиц 7-8 мкм. Разделение аминокислот проводилось в трехбуферной системе натрий-цитратных буферов. Детектирование проводилось параллельно при длинах волн 440 нм и 570 нм.

Анализ данных АК анализа позволил сделать вывод о схожести аминокислотных составов изучаемой и настойки сравнения (Германия). Так наиболее значительное содержание в АК фракции в обоих образцах показали аспарагиновая и глутаминовая кислоты, пролин и аланин.

2. Фармакогностическое изучение и стандартизация JIPC клоиогона кистевидного и НГМ на его основе.

Растения рода клопогон (Cimicifuga), широко используемые как в аллопатии, так и гомеопатии, издавна применяются для приготовления лекарственных средств в зарубежной и народной медицине.

В России настойка корневищ с корнями клопогона даурского (Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.) была разрешена к применению в качестве успокаивающего и гипотензивного средства в 1956 г. Однако, в настоящее время отсутствует российский нормативный документ, регламентирующий показатели качества J1PC клопогона кистевидного {Cimicifuga racemosa L. Nutt.), широко применяемого для приготовления JIC, используемых для лечения симптомов менопаузы, а также в приготовлении гомеопатических средств.

Целью проведенного исследования являлась разработка методов контроля качества сырья и НГМ клопогона кистевидного, интродуцированного в Российской Федерации для последующего включения в нормативные документы с современным уровнем требований.

Объектами исследования служили образцы свежесобранных корневищ с корнями клопогона кистевидного, произрастающие в ботаническом саду ВИЛАР РАСХН и собранные в фазу увядания надземных частей растения, а также НГМ, приготовленная на основе изучаемого сырья по методу 3 ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные».

Исследование морфологических и микроскопических признаков сырья Cimicifuga racemosa L. Nutt.

Нами было проведено изучение и описание морфологических признаков свежих корневищ с корнями клопогона кистевидного.

Для изучения микроскопических признаков корневищ и корней клопогона кистевидного готовили поперечные срезы свежего сырья бритвой от руки. При рассмотрении поперечного среза корневища видны перидерма, стенки клеток которой имеют коричневый цвет. Среди тангентально вытянутых полигональных клеток паренхимы коры встречаются овальные клетки - идиобласты с желтоватым содержимым. Широкие сердцевинные лучи состоят из радиально вытянутых тонкостенных клеток. Сердцевина представлена полигональными паренхимными клетками (рис. 7). Клетки коры, сердцевинных лучей и сердцевины густо заполнены крахмальными зернами. Открытые проводящие пучки расположены очень узкими радиальными участками между широкими сердцевинными лучами. Линия камбия между флоэмой и ксилемой выражена слабо. Проводящие элементы луба к периферии деформированы, к центру среди них можно видеть на поперечном срезе лубяную паренхиму и лубяные волокна.

Древесина имеет лучистое строение, проводящие элементы которой образуют цепочки из радиально вытянутых овальной формы групп одревесневших сосудов и трахеид.

При рассмотрении микропрепаратов корня должны видны: перидерма с опробковевшим эпидермисом, клетки которого имеют утолщенные пигментированные оболочки и куполообразную наружную стенку; широкая первичная кора, состоящая из крупных тангентально вытянутых тонкостенных полигональных клеток; клетки эндодермы с утолщенными лигнифицированными радиальными стенками; более узкая вторичная кора, состоящая из более мелких полигональных клеток. Камбиальная зона хорошо выражена. В центральном цилиндре корня имеются крестообразно

ксилема перидерма

камбий

флоэма

эндодерма

паренхима коры

сердцевинный луч

Рис. 7. Фрагмент поперечного среза корневища клопогона кистевидного (ув. х 111).

расположенные 4 (иногда 3-6) открытые сосудисто-волокнистые пучки вторичной ксилемы, разделенные широкими клиновидными сердцевинными лучами. Элементы ксилемы образуют характерные трапециевидные участки, расширенные кнаружи. Проводящие элементы луба деформированы, его участок имеет форму треугольника, основание которого обращено к камбию, а вершина к периферии. В основании вторичной ксилемы видны небольшие участки первичной ксилемы. В центре корня имеется участок сердцевины, состоящей из полигональных клеток с тонкими стенками (рис. 8). Клетки коры, сердцевинных лучей и сердцевины густо заполнены простыми, 2-3 сложными, размером 3-15 мкм, овальными, округлыми, иногда многоугольными, крахмальными зернами, иногда с трещинкой в центре.

Также нами было проведено установление норм числовых показателей (влажность, зола, органическая и минеральная примеси, наличие остатков стеблей и других частей растения, содержание суммы фенольных соединений в пересчете на изоферуловую кислоту).

Рис. 8. Препарат поперечного среза корня клопогона кистевидного. Диаметр корня 3 мм (ув. х 74).

Фитохимическое изучение JIPC и НГМ клопогона.

Проведенные общегрупповые реакции на основные группы БАВ указали на наличие терпеноидов, фенольных соединений, Сахаров и аминокислот в JIPC и НГМ клопогона.

Компонентный состав фенольных соединений в изучаемом сырье и настойке клопогона был проведен методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1100 с использованием системы растворителей метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная-

тетрагидрофуран (370:570:5:60) в качестве подвижной фазы, скорость подачи элюента 1,0 мл/мин, Детектирование осуществлялось при длине волны 254 нм на УФ-детекторе.

Полученные результаты представлены на рис. 9 и 10. Хроматограмма смеси стандартов приведена на рис. 3.

На основании полученных данных в изучаемых сырье и настойке клопогона кситевидного были идентифицированы кофейная, хлорогеновая, цикориевая, коричная и изоферуловая кислоты. Также в JIPC был идентифицирован флавоноид гиперозид. Анализ хроматограмм ВЭЖХ матричной настойки и извлечения из J1PC клопогона кистевидного показывает схожее распределение пиков.

Тритерпеновые гликозиды считаются основным классом БАВ, входящим в состав клопогона кистевидного. Большинство авторов склоняется к тому, что благодаря наличию тритерпеновых гликозидов обусловлено фармакологическое действие лекарственных форм на основе клопогона кистевидного.

Нами было показано наличие тритерпеновых гликозидов в изучаемом сырье и настойке клопогона с помощью ТСХ. В качестве раствора сравнения был использован 27-деоксиактеин (Chromadex, кат. № ASB-00004130), терпеноид, являющийся, как показано многими авторами, основным компонентом фракции тритерпеновых гликозидов клопогона кистевидного.

При хроматографировании в разработанных условиях (толуол -этил формиат- кислота муравьиная (50:50:10)), неподвижная фаза: «Силикагель 60 F» (Мерк) и последующей обработки раствором анисового альдегида на хроматограмме спиртового извлечения из JIPC и НГМ клопогона обнаруживаются зоны адсорбции с Rs (по 27-деоксиактеину): около 0,7 пурпурного цвета, около 1 интенсивно пурпурного цвета, около 1,2 интенсивно пурпурного цвета, около 2,9 бледно-фиолетового цвета зона, около 3,1 бледно-фиолетового цвета.

1 3 2

Рис. 9. Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений спиртового извлечения из ЛРС клопогона кистевидного: 1-хлорогеновая кислота, 2-кофейная кислота, 3-изоферуловая килоста, 4-гиперозид, 5-цикориевая кислота,

6-коричная кислота

Рис. 10. Хроматограмма ВЭЖХ фенольных соединений НГМ клопогона кистевидного: 1-хлорогеновая кислота, 2-кофейная кислота, 3-изоферуловая килоста, 4-цикориевая кислота, 5-коричная кислота

Допускается наличие других слабоокрашенных зон адсорбции фиолетового цвета. Схема хроматограммы ТСХ приведена на рис. 11.

Согласно полученным данным можно сделать вывод о присутствии 27-деоксиактена в исследуемых образцах, а также о наличие других схожих терпеноидов в сырье и настойке клопогона кистевидного.

К!

1,0......

0,9 —

0,8.....

0,70,6— 0,50,40,30,20,1.....

0,0.....

Рис. 11. Схема хроматограммы ТСХ 1 - извлечение из корневищ с корнями клопогона кистевидного;

2 - раствор сравнения 27-деоксиактеина

Анализ данных ВЭЖХ анализа показал, что в подземных органах клопогона кистевидного содержится значительное количество фенольных соединений, в том числе изоферуловой | кислоты. Кроме того, монография ВОЗ «Rhizoma Cimicifugae recemosae» указывает на возможность стандартизации JIPC клопогона кистевидного по количественному содержанию данных БАВ, а также и некоторые зарубежные производители лекарственных препаратов на основе подземных органов клопогона кистевидного проводят стандартизацию по содержанию изоферуловой кислоты.

Нами была разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммы фенольных соединений в сырье и настойке клопогона кистевидного в пересчете на изоферуловую кислоту с использованием стандартного образца изоферуловой кислоты (Chromadex, кат. № ASB-00009251). Полученные спектры представлены на рис. 12.

/ V \

/ \ vy \ \ \ / _ \ \

\ \ \ \ 'ч

\N

200 250 300 350 400

Wavelength (nm)

Рис 12. Спектры поглощения в УФ свете.

1 - стандартный раствор изоферуловой кислоты 2- Извлечение из JIPC клопогона 3 - НГМ клопогона

Содержание суммы фенольных соединений в пересчете на изоферуловую кислоту в J1PC и НГМ клопогона составило не менее 0,45 % и не менее 0,1 % соответственно (табл. 3). Проведенные опыты с добавками изоферуловой кислоты к навеске сырья и НГМ клопогона кистевидного показали отсутствие систематической ошибки в разработанных методиках.

3. Изучение сроков годности и разработка нормативной документации

Нами было проведено изучение сроков годности J1PC и НГМ изучаемых растений и установлены сроки хранения для JIPC табака настоящего (2 года), НГМ табака настоящего (2 года), НГМ клопогона кистевидного (2 года).

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы фенольных соединений в пересчете на изоферуловую кислоту в JIPC клопогона кистевидного методом СФ

п f ХСр S2 Sx Р,% t(P,f) ДХСр

5 4 0,48 0,00130 0,31612 95 2,78 0,03932 8,19

Метрологические характеристики методики количественного определения

суммы фенольных соединений в пересчете на изоферуловую кислоту в НГМ

клопогона методом СФ

п f Хср S s* Р,% t(P, 0 АХср с, %

5 4 0,11 0,000007 0,00255 95 2,78 0,00317 2,88

Разработанные методики качественного анализа БАВ методом ТСХ, качественные реакции на наличие алкалоидов, фенольных соединений, аминокислот, а также количественного определения суммы алкалоидов и фенольных соединений, нормы числовых показателей и диагностические признаки в анатомическом строении JIPC табака настоящего и клопогона кистевидного включены в проект ФС «Табака настоящего листья» и в первые разработанные проекты НД на матричную настойку табака настоящего, JIPC и матричную настойку клопогона кистевидного.

4. Усовершенствование технологии получения комплекса гомеопатических разведений препарата Никомель.

С учетом современных требований к изготовлению комплексных гомеопатических лекарственных средств нами пересмотрена и усовершенствована технология получения активного четырехкомпонентного комплекса разведений состава Cimicifuga С24, Staphisagria СЗО, Tabacum С50, Nux vomica C30, используемого для получения препарата Никомель.

Разведения, используемые в данном препарате, готовят по сотенной шкале Ганемана. Матричные настойки и их разведения, используемые в составе данного препарата, позволяют, согласно ОФС 42-0026-05 «Растворы и разведения гомеопатические», получать препарат через один комплекс разведений. Разработанная схема приготовления разведений из матричных настоек приведена в табл. 4.

Комплекс разведений готовится из 1 части каждого промежуточного разведения (Cimicifuga С23, Staphisagria С29, Tabacum С49, Nux vomica C29) и 96 частей спирта этилового 43 % по стандартной методике. В результате получается комплекс разведений №1 состава: Cimicifuga С24, Staphisagria СЗО, Tabacum С50, Nux vomica СЗО, который может быть внесен в смесь вспомогательных веществ для приготовления любой гомеопатической лекарственной формы. Соответствующие изменения по технологии получения активного комплекса разведений внесены в промышленный регламент производства препарата Никомель.

Таблица 4

Получение промежуточных разведений многокомпонентного _гомеопатического препарата Никомель _

Активная субстанция Соотношение субстанция / растворитель Получаемое разведение Концентрация спирта этилового

Cimicifuga 0 3 части матричной настойки и 97 частей этанола С1 62%

1 часть разведения С1 и 99 частей этанола С2 43%

1 часть предыдущего сотенного разведения и 99 частей этанола С3-С23 43%

Staphisagria 0=D1 10 частей матричной настойки (01) и 90 частей этанола С1 86%

1 часть разведения С1 и 99 частей этанола С2 43%

1 часть предыдущего сотенного разведения и 99 частей этанола СЗ-С29 43%

Tabacum 0=D1 10 частей матричной настойки (01) и 90 частей этанола С1 62%

1 часть разведения С1 и 99 частей этанола С2 43%

1 часть предыдущего сотенного разведения и 99 частей этанола СЗ-С49 43%

Nux vomica 0=D1 10 частей матричной настойки (01) и 90 частей этанола С1 62%

1 часть разведения С1 и 99 частей этанола С2 43%

1 часть предыдущего сотенного разведения и 99 частей этанола СЗ-С29 43 %

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фармакогностическое изучение двух видов растительного сырья: листьев табака настоящего и подземных органов клопогона кистевидного.

2. Установлены морфолого-диагностические (макро- и микроскопические) признаки сырья, определены числовые показатели для ЛРС клопогона кистевидного.

3. Выявлены морфолого-диагностические (макро- и микроскопические) признаки сырья и определены числовые показатели и нормы для контроля качества сырья табака настоящего.

4. Современными физико-химическими методами впервые изучен состав фенольных соединений ЛРС и НГМ табака настоящего. Разработана методика ТСХ для качественного обнаружения алкалоида никотина. Подобраны оптимальные условия экстракции алкалоидов из сырья табака и разработаны методики ВЭЖХ и СФ для количественного определения содержания никотина в ЛРС и НГМ табака настоящего

5. Предложена номенклатура показателей качества и их нормы для нормативного документа на НГМ табака настоящего.

6. Проведено изучение качественного состава фенольных соединений и терпеноидов в ЛРС и НГМ клопогона кистевидного. Разработана ТСХ методика для качественного обнаружения в сырье и настойке основных терпеноидов.

7. Разработана спектрофотометрическая методика определения содержания суммы фенольных соединений в пересчете на изоферуловую кислоту в ЛРС и НГМ клопогона кистевидного. Подобраны оптимальные условия экстракции фенольных соединений из сырья клопогона кистевидного.

8. Проведено изучение состава аминокислот, входящих в состав НГМ клопогона кистевидного и табака настоящего в сравнении с аналогичными настойками производства Германии.

9. Изучена стабильность и определены сроки годности ЛРС табака настоящего - 2 года, а также НГМ на основе изучаемого сырья клопогона кистевидного и табака настоящего - 2 года.

10.На основании проведенных исследований разработаны: проект ФС «Табака настоящего листья» взамен ВФС 42-2190-93. Впервые разработан проект ФС «№со1лапа 1аЬасиш (ТаЬасиш) Настойка гомеопатическая матричная».

11. Впервые разработаны проекты отечественных нормативных документов для контроля качества сырья и матричной настойки клопогона кистевидного: проект ФС «Клопогона кистевидного корневища с корнями» и проект ФС «Cimicifuga racemosa (Cimicifuga) Настойка гомеопатическая матричная».

12. На основе современных требований предложена оптимальная технология производства комплекса разведений, используемого для получения гомеопатического препарата Никомель.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

l.Obolskiy D.M., Sokolskaya Т.А., Vandishev V.V. Phytochemical and pharmacognostical study of Cimicifuga racemosa L. Nutt. and standardization of plant raw material and homoeopathic mother tincture on its basis // Planta medica, 7th Joint Meeting of GA, AFERP, ASP, PSI & SIF, Athens, Greece.- 2008,- P. 316

2. Обольский Д.М., Сокольская T.A., Вандышев В.В., Денисов A.A. Изучение лекарственного растительного сырья (ЛРС) табака настоящего (Nicoíiana tabacum L.) II Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.-2008.- №6.- С. 15-18.

3. Обольский Д.М., Сокольская Т.А., Денисов A.A. Табак настоящий. Химический состав, фармакологические свойства и применение в медицине // Фармация.-2007.- №5.- С. 44-48.

4. Обольский Д.М., Сокольская Т.А., Денисов A.A. Цимицифуга кистевидная. Химический состав, фармакологические свойства и применение в медицине // Фармация.-2007.- №1- С. 52-56.

5. Обольский Д.М., Сокольская Т.А., Вандышев В.В. Фармакогностическое изучение и стандартизация клопогона кистевидного (Cimicifuga racemosa L. Nutt.) и настойки гомеопатической матричной на его основе // Тезисы докладов XIX Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 23-24 января 2009, С 59.

6. A.A. Копнин, Д.М. Обольский, Т.А. Сокольская, Т.Д. Даргаева. Подходы к стандартизации сырья табака настоящего (Nicoíiana tabacum L.) и настойки гомеопатической матричной на его основе // Тезисы докладов XIX Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 23-24 января, 2009 г, С 61.

Для заметок

Заказ №227/12/08 Подписано в печать 25.12.2008 Тираж 50 экз. Усл. п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 '^О^У/' 1 vww.cfr.ru; е-таП: info@cfr.ru

Актуальность темы. Табакокурение занимает первое место в мире среди предотвратимых причин смертности, однако от 3,5 до 5,4 миллионов человек ежегодно умирают в результате проблем со здоровьем, вызванных курением. Основными причинами смерти курильщиков являются поражение дыхательной и сердечно-сосудистой систем, а также развитие злокачественных опухолей. Распространение табачной эпидемии является глобальной проблемой, которая имеет серьезные последствия для здоровья людей и требует широкого международного сотрудничества и участия всех стран в эффективных ответных мерах. В 2003 году Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) приняла документ «Рамочная Конвенция по борьбе против табака», который к настоящему моменту был подписан 167 странами и Европейским Сообществом, в том числе и Российской Федерацией (РФ) [92].

Среди других экономических и политических мер регулирования конвенция также предусматривает поддержку научно-технических исследований и разработку новых эффективных лекарственных средств, направленных на борьбу с курением. В настоящее время в РФ зарегистрировано 3 лекарственных препарата никотинозаместительной терапии (2 из которых зарубежного производства), а также 4 отечественных комплексных гомеопатических препарата, применяемых для облегчения отвыкания от курения.

Ввиду чрезвычайно узкого и ограниченного ассортимента импортных и отечественных препаратов этой группы и многочисленных опасностей, которые несет табакокурение, актуальным является разработка лекарственных препаратов применяемых для лечения никотиновой зависимости.

Российской компанией ООО «НПФ «Материа Медика Холдинг» разработан комплексный гомеопатический лекарственный препарат Никомель, применяемый для снижения влечения к табакокурению, уменьшения раздражительности и дискомфорта. В состав препарата входит 4 активных компонента на основе матричных настоек: Nux vomica (чилибуха рвотная) СЗО; ТаЪасит (табак настоящий) С50; Cimicifuga (клопогон кистевидный) С24; Staphisagria (живокость аптечная) СЗО.

Для эффективного и безопасного применения лекарственных средств (JIC) первостепенное значение имеет их качество. В случае с гомеопатическим лекарственным средством основное внимание придается контролю качества исходных матричных настоек и видов сырья, из которого они были получены. Однако стандартами, регламентирующими показатели качества вышеуказанных настоек, являются монографии зарубежных фармакопей. Российская нормативная документация на лекарственное растительное сырье (JIPC) и соответствующие матричные настойки отсутствует. К настоящему времени разработана лишь ВФС 42-2190-93 «Листья табака настоящего», регламентирующая качество сырья табака настоящего для приготовления одной матричной настойки из состава препарата Никомель.

Более того, препараты на основе сырья табака настоящего и клопогона кистевидного помимо препарата Никомель являются активными компонентами и других лекарственных средств, зарегистрированных в РФ. Так матричная настойка табака настоящего также входит в состав комплексных гомеопатических препаратов Табакум, Табакум-плюс и Никостен. Сырье клопогона кистевидного используется в производстве JIC, применяемых для лечения симптомов менопаузы (Климадинон, Климактоплан Н), а также для получения различных биологически активных добавок к пище.

В этой связи считаем актуальным проведение фитохимического и фармакогностического изучения, стандартизации с последующей разработкой проектов нормативной документации (НД) на сырье клопогона кистевидного и табака настоящего, а также НД на настойки гомеопатические матричные (HTM), приготовленные на их основе.

Цель н задачи исследования

Целью настоящих исследований является изучение химического состава БАВ и разработка современных методик стандартизации качества JIPC клопогона кистевидного (Cimicifuga racemosa L. Nutt., семейство лютиковые — Ranunculaceae), табака настоящего (Nicotiana tabacum L., семейство пасленовые — Solanaceae) и HTM на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить компонентный состав биологически активных веществ (БАВ) свежесобранного лекарственного растительного сырья клопогона кистевидного и высушенного лекарственного растительного сырья табака настоящего;

• разработать методики качественного и количественного анализа БАВ в исследуемых видах сырья;

• отработать способ получения гомеопатических матричных настоек на основе изучаемых растений;

• исследовать химический состав настоек гомеопатических матричных, полученных из изучаемых видов сырья;

• разработать методики качественного и количественного анализа БАВ в матричных настойках клопогона кистевидного и табака настоящего;

• разработать и оформить нормативные документы на исследуемые виды растительного сырья и HTM.

Научная новизна работы

На основании микроскопического анализа ЛРС табака настоящего и клопогона кистевидного выявлены диагностически значимые признаки в анатомическом строении для каждого из них. Разработаны условия анализа БАВ в сырье и HTM клопогона кистевидного и табака настоящего с помощью физико-химических методов: хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрофотометрия (СФ).

Изучен качественный состав основных групп БАВ (фенольные соединения, тритерпеновые гликозиды, алкалоиды) в JTPC и HTM табака настоящего и клопогона кистевидного, интродуцированных в РФ, в соответствии с установленными за рубежом требованиями к качеству HTM.

Изучен качественный и количественный состав аминокислот в HTM табака настоящего и клопогона кистевидного в сравнении с аналогичными настойками производства Германии.

С учетом современных требований к растительному сырью и HTM разработаны критерии подлинности и нормы содержания БАВ в сырье табака настоящего и клопогона кистевидного и в HTM на их основе.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований разработан:

• проект новой ФС «Табака настоящего листья» взамен ВФС 42-2190-93.

Впервые разработаны:

• проект ФС «Клопогона кистевидного корневища с корнями»

• проект ФС «Nicotiana tabacum (Tabacum) Dl Настойка гомеопатическая матричная»

• проект ФС «Cimicifuga racemosa (Cimicifuga) Настойка гомеопатическая матричная»

Основные положения, выносимые на защиту

1. Анализ номенклатуры и состава препаратов, применяемых для коррекции нарушений при никотиновой зависимости на фармацевтическом рынке Российской Федерации.

2. Результаты фармакогностического исследования и стандартизации качества сырья клопогона кистевидного и табака настоящего.

3. Результаты изучения химического состава БАВ и разработки методик стандартизации HTM клопогона кистевидного и табака настоящего.

Апробация работы

Основные результаты экспериментальных исследований доложены на международной научно-практической конференции «Натуральные продукты для фармацевтической, косметической и агрохимической промышленности» (Афины, 2008), XIX Московской Международной Гомеопатической Конференции (Москва, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Связь задач и исследования с проблемным планом фармацевтической науки.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 гг.», задание 04, шифр 04.13 «Разработка технологий производства высокоэффективных лечебных и профилактических препаратов из растительного сырья».

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фармакогностнческое изучение двух видов растительного сырья: листьев табака настоящего и подземных органов клопогона кистевидного.

2. Установлены морфолого-диагностические (макро- и микроскопические) признаки сырья, определены числовые показатели для JTPC клопогона кистевидного.

3. Выявлены морфолого-диагностические (макро- и микроскопические) признаки сырья и определены числовые показатели и нормы для контроля качества сырья табака настоящего.

4. Современными физико-химическими методами впервые изучен состав фенольных соединений JIPC и HTM табака настоящего. Разработана методика ТСХ для качественного обнаружения алкалоида никотина. Подобраны оптимальные условия экстракции алкалоидов из сырья табака и разработаны методики ВЭЖХ и СФ для количественного определения содержания никотина в ЛРС и HTM табака настоящего

5. Предложена номенклатура показателей качества и их нормы для нормативного документа на HTM табака настоящего.

6. Проведено изучение качественного состава фенольных соединений и терпеноидов в JIPC и HTM клопогона кистевидного. Разработана ТСХ методика для качественного обнаружения в сырье и настойке основных терпеноидов.

7. Подобраны оптимальные условия экстракции фенольных соединений из сырья клопогона кистевидного. Разработана спектрофотометрическая методика определения содержания суммы фенольных соединений в пересчете на изоферуловую кислоту в ЛРС и HTM клопогона кистевидного.

8. Проведено изучение состава аминокислот, входящих в состав HTM клопогона кистевидного и табака настоящего в сравнении с аналогичными настойками производства Германии.

9. Изучена стабильность и определены сроки годности JTPC табака настоящего - 2 года, а также HTM на основе изучаемого сырья клопогона кистевидного и табака настоящего - 2 года.

10. На основании проведенных исследований разработаны: проект ФС «Табака настоящего листья» взамен ВФС 42-2190-93. Впервые разработан проект ФС «Nicotiana tabacum (Tabacum) Dl. Настойка гомеопатическая матричная».

11.Впервые разработаны проекты отечественных нормативных документов для контроля качества сырья и матричной настойки клопогона кистевидного: проект ФС «Клопогона кистевидного корневища с корнями» и проект ФС «Cimicifuga racemosa (Cimicifuga). Настойка гомеопатическая матричная».

12.На основе современных требований предложена оптимальная технология производства комплекса разведений, используемого для получения гомеопатического препарата Никомель.