Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование в области стандартизации препаратов, содержащих гестагенные гормоны

На правах рукописи

ОД

I , -.г-

МАСЛОВ Леонид Германович

• ИССЛЕДОВАНИЕ В ОБЛАСТИ СТАНДАРТИЗАЦИИ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ГЕСТАГЕННЫЕ ГОРМОНЫ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 1995

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте по стандартизации и контролю лекарственных средств Минздравмедпроыа РФ.

Научныйруководитель-доктор фармацевтических наук, академик Международной академии информатизации А. Н. ЩАВЛИНСКИЙ

Доктор фармацевтических наук, член-корр. Международной академии информатизации, старший научный сотрудник Д. М. ПОПОВ

Кандидат фармацевтических наук, профессор А. X. ЛАЙПАНОВ

Ведущая организация (предприятие) - Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Защита состоится " к часов на

заседании диссертационного совета Д 074.28.01 при Научно-исследовательском институте фармации (117418, г. Москва, ул. Красикова, 34).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ фармации.

О ф ициальные оппоненты

Автореферат

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 074.28.01 канд. фармац. наук, ст. науч. сотр.

Л.М. БОБРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Лекарственные средства (ЛС), содержащие гестагенные гормоны, широко используются в гинекологической практике в случаях разнообразных острых и хронических заболеваний. Данные ЛС являются сильнодействующими и назначаются, как правило, длительными курсами. Следовательно, качество этих ЛС должно быть достаточно жестко нормировано. Важное значение для объективной оценки качества ЛС имеет:

- наличие современных физико-химических методов анализа, позволяющих с высокой степенью точности оценить качество ЛС;

- возможность нормирования родственных (т.е. сходных по строению) примесных соединений в ЛС.

При проведении государственного контроля, осуществляемого Государственным научно-исследовательским институтом по стандартизации и контролю лекарственных средств (ГНЙИСКЛС) Минздравмедпро-ма (МЗ) РФ, установлено, что уровень требований и методы анализа НД на гестагенные гормональные препараты, в частности прогестерон и прегнин и их лекарственные формы, недостаточно совершенны и не обеспечивают объективную оценку их качества. Так, в НД на прогестерон и прегнин не предусмотрены испытания на обнаружение примесей, а методика оценки примесей в прегнине-стандарте методом ТСХ не позволяет обнаружить основные примеси. Для количественного определения прогестерона в субстанции и лекарственных формах в НД включен трудоемкий гравиметрический метод, не позволяющий правильно оценить содержание основного действующего вещества. Несовершенны методы подтверждения подлинности прогестерона и прегнина.

Необходимая информация о структуре примесей прогестерона и прегнина, их идентификации и накоплении отсутствовала в НД и дос-

тупной литературе.

В связи с этим проведение исследований по разработке новых методов оценки качества указанных ЛС на базе использования современных методов анализа является актуальной проблемой.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы явилось проведение исследований, направленных на создание комплекса эффективных методик стандартизации и контроля качества гестагенных гормональных препаратов; изучение химической структуры обнаруживаемых в них примесей, природы их происхождения, возможности их нормирования, а также разработка способов очистки изучаемых соединений.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- провести сравнительную оценку уровня требований к качеству прогестерона, прегнина и их лекарственных форм в сравнении с зарубежными аналогами по данным отечественных и зарубежных НД (фармакопея и фармакопейных статей);

- изучить условия обнаружения и выделения возможных родственных соединений прогестерона методами ТСХ и препаративной адсорбционной хроматографии;

- установить структуру обнаруживаемых родственных соединений прогестерона, используя методы ТСХ, ВЗЖХ, ИК-, УФ-, ЯМР-спектрос-копии, встречного синтеза;

- изучить технологический процесс синтеза прогестерона с целью выявления стадий, где возможно образование и накопление примесей, и установить возможности снижения родственных соединений (посторонних стероидов) в прогестероне;

- разработать условия нормирования примесей в прогестероне методами ТСХ, ВЗЖХ и дифференциальной сканирующей калориметрии

(ДСК) и провести сравнительную оценку применения этих методов для определения содержания примесей в прогестероне;

- исследовать возможность присутствия и условия образования полиморфных форм прогестерона методом ДСК;

- разработать методики определения подлинности прогестерона и прегнина в субстанции и лекарственных формах методами Ж-спектроскопии и БЖ, а также прогестерона в субстанции - методом УФ-спектроскопии;

- разработать методики количественного определения прогестерона и прегнина в субстанциях и лекарственных формах;

- на основании полученных результатов включить показатель "Посторонние стероиды" в фармакопейную статью на прогестерон; внести в НД на прогестерон, прегнин и их лекарственные формы объективные физико-химические методики контроля по показателям "Подлинность". "Посторонние стероиды" и "Количественное определение".

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. С использованием методов ЯМР-, ИК- и УФ-спектроскопии, ТСХ, Ш, препаративной адсорбционной хроматографии, встречного синтеза идентифицированы шесть примесей в прогестероне: 5«-прегнан-3,20-дион; 16-дегидропрогестерон; 203-гидроксипрегн- 4- ен-3- он; 20а-гидроксипрегн- 4- ен-3- он; 6-ок-сопрогестерон; 16«-метоксипрогестерон; что позволит оптимизировать технологический процесс с целью получения более чистого продукта.

На основе данных результатов анализа, полученных методом УФ-спектрофотометрии, установлена величина зкстинкции прогестерона в максимуме поглощения в области 241 нм, положенная в основу спектрофотометрической методики количественного определения прогестерона в субстанции.

Методом ВЗЖХ установлено, что в структуре двух основных примесей прегнина содержатся группировки 4-ен-3,6-диона и 4,6-ди-ен-3-она; существенное отличие УФ-спектров данных примесей от спектра прегнина позволило подтвердить правильность УФ-спектрофо-тометрической методики количественного определения прегнина в субстанции.

На базе сравнительных данных результатов анализа, полученных методом ВЗЖХ, выбраны условия (подвижная фаза: гекоан - дизтило-вый эфир - изопропанол = 64:35:1; колонка Силасорб 600, 64x2 мм) разделения прогестерона и посторонних стероидов, а также прегнина и сопутствующих примесей, которые положены в основу унифицированной методики ВЗЖХ для анализа прогестерона, прегнина и их лекарственных форм по показателям "Подлинность", "Посторонние стероиды" и "Количественное определение", основанной на использовании отечественного оборудования и недорогих растворителей.

С использованием данных сравнительного анализа, полученных методом ТСХ, подобраны условия (подвижная фаза: гекоан - бута-нол-1 = 4:1; сорбент - Сорбфил УФ-254, 15x10 см) выделения прогестерона из масляных инъекционных растворов, на основе которых разработана методика определения подлинности прогестерона в лекарственных формах методом ИК-спектроскопии, с предварительным препаративным его выделением методом ТСХ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. На основании проведенных исследовании разработаны и внедрены:

- методики оценки качества прогестерона по показателям "Подлинность", "Посторонние стероиды" и "Количественное определение" и другим физико-химическим характеристикам (ФС 42-2831-92 на прогестерон) ;

- методики определения подлинности и количественного содержания прогестерона в 1 % и 2,5 % растворах для инъекций (проект ФС 42- на раствор прогестерона в оливковом или персиковом масле

1 % и 2,5 % для инъекций рассмотрен Фармакопейным комитетом и рекомендован к утверждению, протокол заседания фармацевтической комиссии ФК от 10.02.94 г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты экспериментальных исследований доложены на конференции молодых ученых ГНШСКЛС Минздрава РФ (Москва, 1990 г.), на Ученом совете ГНШСКЛС (Москва, 1994 г.), на межлабораторном коллоквиуме НИИФ (Москва. 1995 г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Исследования выполнены в соответствии с темой-заданием "Разработка новых, совершенствование и унификация существующих методов исследований лекарственных веществ", планом научно-исследовательской работы ГНШСКЛС Минздрава РФ (И госрегистрации 01.90.0062318), соответствуют тематике научных исследований Межведомственного совета по фармации N 47 АМН РФ.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ следующие основные положения:

- результаты исследования прогестерона, прегнина и их лекарственных форм методами УФ-, ИК-спектроскопии, ТСХ, ВЭЖХ, ДСК;

- методика количественного определения прогестерона спектро-фотометрическим методом;

- методика установления подлинности прогестерона в лекарственных формах с использованием ТСХ;

- методика установления подлинности прогестерона в лекарственных формах с использованием препаративной ТСХ и ИК-спектроскопии (в качестве альтернативной);

- методики оценки качества прогестерона по показателю "Посторонние стероиды" методом ТСХ;

- унифицированная методика ВЭЖХ количественного определения примесей в прогестероне и прегнине, прогестерона и прегнина в субстанциях и лекарственных формах;

- результаты изучения структуры примесей в прогестероне.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит иэ введения, трех глав, выводов, списка литературы, содержащего 212 источников, из них 166 на иностранных языках, и приложения. Работа изложена на 254 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 53 рисунка.

В первой главе обобщены литературные данные по методам контроля качества прогестерона, прегнина и их лекарственных форм. Критически оценены возможности применения химических, физических и физико-химических методов анализа.

Во второй главе обсуждаются результаты экспериментальных исследований по разработке методик контроля качества и стандартизации прогестерона, прегнина и их лекарственных форм, а также по идентификации примесей в прогестероне.

В третьей главе описан ход эксперимента по оценке качества отечественного прогестерона и его лекарственных форм в соответствии с требованиями зарубежных фармакопей, разработке методов анализа исследуемых объектов. Приведены разработанные нами методики контроля качества прогестерона, прегнина и их лекарственных форм, описание ЯМР-спектров примесей прогестерона.

В приложении к диссертации приведены результаты количественного определения примесей в прогестероне, ИК-, ЯМР-спектры прогестерона и его примесей; сравнительные требования к качеству

исследуемых лекарственных веществ и лекарственных форм в нашей стране и за рубежом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были лекарственные вещества - прогестерон, прегнин и их лекарственные формы: растворы прогестерона в масле оливковом 1 %. и 2,5 % для инъекций; таблетки прегнина 0,01 г

Для выбора оптимальных условий разделения прогестерона и примесей использовали образцы прогестерона отечественного производства, стандартный образец (ВОЗ), примесное соединение 63-гид-роксипрогестерон, а также вещества-свидетели, идентичные примесям и полученные встречным синтезом: 16-дегидро- и 6-дегидропрогесте-рон, 203- и 20с<-гидроксипрегн-4-ен-3-он, б-оксопрогестерон, 163-метоксипрогестерон.

ИК-спектры получены на спектрофотометре Perkin-Elmer 180. Спектры ЯМР 1Н и 13С получены на спектрометрах ЯМР Bruker WP 200 SY (рабочая частота на протонах 200,1 МГц, на ядрах 13С -50,3 МГц) и Bruker AM 400 (400,1 МГц для аН и 100,0 МГц для 13С), в дейтерохлороформе. В качестве внутреннего эталона использован тетраметилсилан (бтмс 0 м.д.).

Для ТСХ использовали пластинки Силуфол ("Кавалиер", Чехословакия), Ляэне Калур (Эстония), Сорбфил УФ-254 (НПО "Пластмаш", г. Краснодар), Kleselgel 60 F254, Kleselguhr F254 (фирмы "Мерк"). Кроме того, приготавливали пластинки с тонким слоем полиамида фирмы "Woelm", Германия.

Исследование методом ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе "Милихром" (НПО "Научприбор", г. Орел), используя колонки размером 64x2 мм (внутренний диаметр), набитые силикагелем Силасорб 600, размер частиц 4 мкм (фирмы "Лахема", Чехословакия).

Кривые плавления получены на приборах 0БС-20 и ЕСС-ЗО термоаналитической системы МеШег ТА-3000 (Швейцария).

1. ИЗУЧЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОГЕСТЕРОНА И ПРЕГНИНА МЕТОДОМ ТСХ

В ходе экспериментальных исследований по оценке качества отечественного прогестерона в соответствии с требованиями зарубежных НД установлено, что образцы прогестерона ХФК "Акрихин" не соответствуют требованиям Японской и Чехословацкой фармакопей по показателю "Посторонние стероиды".

Подобраны оптимальные условия разделения прогестерона и примесей методом двумерной ТСХ: системы растворителей хлороформ -этилацетат (2:1) и изооктан - диоксан (2:1), сорбент Силуфол УФ-254, 15x15 см, детекция при 254 нм. В 400 мкг серийного прогестерона обнаруживали 6 пятен примесей, количество которых составило 1,0 - 1,5 %.

Методом ТСХ на сорбенте "К1езе1де1 60" в системе растворителей хлороформ - этилацетат (2:1) определили, что в технических образцах прогестерона содержится около 2 % 5«-прегнан-3,20-диона, который не детектируется по нашей методике ВЭЖХ, а в серийных и опытных образцах - около 0,1 %, т.е. содержание примеси успешно снижается при очистке по регламенту.

На основании проведенных сравнительных исследований разработана методика оценки прогестерона по показателю "Посторонние стероиды", использующая систему растворителей хлороформ - этилацетат (50:3) и сорбент "Силуфол" УФ-254 или систему растворителей хлороформ - этилацетат (2:1) и сорбент "Сорбфил" УФ-254. Содержание примесей нормировано в пределах 1,5 % (фактическое содержание составило в различных сериях 0,9 - 1,4 %).

Для установления подлинности лекарственных форм прогестерона предложено кроме пластинок Силуфол УФ-254 использовать более дешевые пластинки Сорбфил УФ-254 размером 10x10 см, с проявлением хроматограммы в той же системе растворителей: гептан - бензол -ацетон (5:5:2), явившейся оптимальной для обоих видов сорбента.

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В КОНТРОЛЕ И СТАНДАРТИЗАЦИИ ПРОГЕСТЕРОНА И ЕГО ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

2.1. ИК-спектроскопия

В качестве одного из методов подтверждения подлинности прогестерона в субстанции и лекарственных формах нами был выбран метод ИК-спектроскопии. Спектры субстанции снимали в дисках с КВг. В ИК-спектре образца, снятом в интервале от 4000 до 400 см"1, наблюдались пики в области 1700 см"1 (С20=0), 1660 см"1 (С3=0), 1610 см"1 (С4=С5), а также 940 и 865 см-1 (деформационные колебания групп СН при С4). Для анализа лекарственных форм использовали экстракцию 95 % этанолом с последующим выделением прогестерона методом ТСХ на пластинках "Сорбфил" УФ-254, 10 х 15 см. Была выбрана оптимальная система растворителей: гексан - бутанол-1 (4:1).'

ИК-спектры образцов прогестерона, выделенных таким образом из 1 % и 2,5 % масляных препаратов и модельных смесей, снятые на пластинке КВг (наносили раствор в ССЦ и высушивали), были сходны со спектрами серийных образцов прогестерона, но имели дополнительные максимумы поглощения в области 780 и 760 см-1 (ССЦ), 1740 см-1 (С=0 примеси сложных эфиров), а также 1015 см-1. Отмечена также большая интенсивность полосы поглощения при 1220 см-1 (полоса поглощения С-О-С сложных эфиров налагается на одну из полос спектра прогестерона). Указанные выше данные позволили включить в проект фармакопейной статьи рисунок эталонного спектра.

В свою очередь ИК-спектры примесей значительно отличались от спектра прогестерона, что может использоваться в идентификации данных соединений.

2.2. УФ-спектрофотометра

В УФ-спектрах образцов прогестерона ХФК "Акрихин" и стандартного образца (ВОЗ), снятых в 96 % этаноле и метаноле, в интервале 220 - 350 нм наблюдался только один максимум поглощения в области 241 ± 1 нм. Большинство примесей, кроме 1, 3, 5 и 8, имеют максимумы поглощения при длинах волн, близких к этому значению (239 ± 3 нм). Примесь 3 не имеет выраженных максимумов поглощения в интервале 220 - 350 нм; примеси 1 и 5 имеют максимумы около 280 нм. а примесь 8 - при 252 нм. Примеси 1. 5 и 8. присутствуя в серийных образцах в небольших количествах (0,1 X и менее), не образуют дополнительных максимумов в спектре прогестерона.

На базе полученных данных разработана У^-спектрофотометри-ческая методика количественного определения прогестерона в субс-

танции, основанная на измерении поглощения раствора в 95 7. этаноле в максимуме при 241 ± 2 нм. Содержание прогестерона рассчитывают с использованием значения удельного показателя поглощения (Е1%1см), полученного нами экспериментально для стандартного образца (ВОЗ) и перекристаллизованных из ацетона серийных образцов прогестерона и равного 535.

Разработанная методика отличается от методики ГФ X меньшей трудоемкостью; те примеси, которые слабо поглощают в области 241 нм, не влияют на результат количественного определения, в то время как гравиметрическим методом определяется вся сумма кетос-тероидов.

3. ИЗУЧЕНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОГЕСТЕРОНА И ПРЕГНИНА МЕТОДОМ ВЭЖХ

3.1. Анализ родственных соединений прогестерона методом ВЗЖХ

Идентификацию примесей прогестерона методом ВЗЖХ проводили сравнением времени удерживания и максимума поглощения примеси и вещества-свидетеля, полученного встречным синтезом или выделенного из прогестерона препаративно.

На рис. 1 и 2 прогестерон обозначен буквой "П", а номера пиков соответствуют номерам примесей в таблице 1.

Для обнаружения и количественного определения примесей 1, 2, 4-9 оптимальной явилась подвижная фаза гексан - диэтиловый эфир - изопропанол (64:35:1) (рис. 1), для обнаружения примесей 10 и 11 - гексан - диэтиловый эфир - изопропанол (39:60:1) (рис. 2).

В качестве внутреннего стандарта при количественном опреде-

Таблица 1

Примеси в прогестероне и стадии, на которых они образуются

N примеси Название примеси Стадия, на которой обра-

зуется примесь (или ее предшественник)

1 3-(2-оксоциклогексилиде-но-)прегн-4-ен-20-он Окисление прегненолона

2 20-(2-оксоциклогексилиде-но-)прегн-4-ен-3-он Окисление прегненолона

3 5о£-прегнан-3,20-дион Окисление прегненолона

4 1б-дегидропрогестерон Гидрирование ацетата дегидропрегненолона

5 6-дегидропрогестерон Окисление прегненолона

6 203-гидроксипрегн-4-ен-3-он Окисление прегненолона

7 20«-гидроксипрегн-4-ен-3-он Окисление прегненолона

8 6-оксопрогестерон Окисление прегненолона

9 1ба-метоксипрогестерон Гидрирование ацетата дегидропрегненолона

10 бе-гидроксипрогестерон Окисление прегненолона

11 7сс-гидроксипрогестерон Окисление прегненолона

лении примесей 1, 5 и 8 использовали даназол, а при определении остальных примесей - дезоксикортикостерона триметилацетат (ДОКТМА).

Зависимость площади пика примеси от концентрации была линейной в рабочем интервале концентраций (коэффициент корреляции составлял более 0,987; ГФ XI рекомендует не менее 0,98). Относительная ошибка единичного определения составила 10,3 % для суммы примесей.

Чистоту образцов прогестерона, полученных перекристаллизацией из ацетона, определяли в сравнении с исходными образцами тремя методами: ДСК, ТСХ и ВЗЖХ. Сравнительные данные представлены в таблице 2.

Из таблицы следует, что метод ДСК дает заниженные результаты

Хроматограммы прогестерона в потоке смеси гексан - дизтиловый эфир - иаопропанол (64:35:1) на колонке Скласорб 600 (64x2 мм). Длина волны детекции: а - 230 нм; б - 250 нм; в - 270 нм. Примесь 3 не детектируется; примеси 10 и 11 не элшруются

А 01$-

<320

О,15

ОЮ-

о,оь~-

<г

6 в Рис. 1

ю

а

/2 Ттмин

Хроматограмма прогестерона в потоке смеси гексан - дизтиловый эфир - изопропанол (39:60:1) на колонке Силасорб 600 (64x2 мм). Длина волны детекции: 230 нм

А

0,05".

П

10

.11

1

т-6

10

12 Г,мин

Рис. 2

содержания примесей по сравнению с методами ТСХ и ВЭЖХ. Это связано, по-видимому, со способностью некоторых примесей образовывать твердые растворы.

Таблица 2

Сравнительные данные оценки чистоты прогестерона методами ДСК, ТСХ и ВЭЖХ

Образец Чистота

Метод ДСК, мол. X Метод ТСХ, мол. % Метод ВЭЖХ. % по массе

С. с. 80989 80989, перекрист. 0,4 0,3 1.0 0,2 1.14 0,19

с. с. 150688 150688, перекрист. 0,4 0,1 1.2 0,3 0,98 0,14

с. с. 121089 121089, перекрист. 0,7 0,1 1.2 0,3 1,30 0,21

Для того, чтобы оценить возможности очистки прогестерона в процессе его получения согласно регламенту, были проанализированы технические и очищенные по регламенту опытные партии прогестерона.

Технический прогестерон согласно регламенту очищают методом адсорбции примесей оксидом алюминия и осветляющим углем с последующей кристаллизацией из ацетона.

Расчет содержания примесей проводили в пересчете на прогестерон, которого в технических образцах всего 68 - 75 %. Затем вычислили коэффициенты снижения содержания каждой примеси в про-

у „ Т • 100 цессе очистки по формуле: К = ---—,

где Т - содержание примеси в техническом образце, в процентах;

О - содержание примеси в очищенном по регламенту образце, в процентах;

П - содержание прогестерона в техническом образце, в процентах.

Величина коэффициента указывает на эффективность очистки

прогестерона от примеси.

Коэффициент снижения содержания примеси уменьшается в ряду: примесь 3 > примесь 1 > примесь 4 > примесь 9 > примесь 8 > примесь 2 > примесь 5 > примесь 6 > примесь 7. Следовательно, очистка по регламенту почти не позволяет избавиться от 200-гидроксип-регн-4-ен-З-она (примеси 6) и его 20«-эпимера (примеси 7), а также от 6-дегидропрогестерона (примеси 5). Другие примеси снижаются при очистке в значительной степени (в 3,8 - 8,4 раза). Примеси 2, 4, 6 и 7 являются основными примесями очищенного продукта.

С целью снижения примеси 4 в конечном продукте рекомендуем контролировать и снижать примесь 16-дегидропрегненолона в прегне-нолоне, промежуточном продукте в синтезе прогестерона.

Снизить содержание примеси 2 можно путем дополнительной перекристаллизации из ацетона.

Очистить прогестерон от примесей 6 и 7 можно методом препаративной хроматографии на колонке с силикагелем; содержание примесей снижается и при перекристаллизации прогестерона из ацетона.

3.2. Анализ родственных соединений прегнина методом ВЗЗКХ

Оптимальной для анализа примесей прегнина явилась система гексан - диэтиловый эфир - изопропанол (64:35:1), использованная и при изучении примесей в прогестероне.

Основываясь на результатах наших исследований примесей в прогестероне и на данных литературы о структуре примесей в норэ-тистероне, мы предположили, что в прегнине, имеющем время удерживания 4,2 мин, примесь с Хщах 246 нм и временем удерживания 6 мин имеет структуру 4-ен-3,6-диона, а примесь с Атах 272 нм и време-

ном удерживания 5 мин - структуру 4,6-диен-З-она.

Количественную оценку примесей прегнина проводили при 250 и 270 нм, с внутренним стандартом даназолом, используя значения калибровочных коэффициентов, вычисленные для б-оксо- и б-дегид-ропрогестерона. Установлено, что отечественный прегнин содержит меньшее суммарное количество родственных соединений (0,5 - 1,2 %), чем стандарт этистерона ВОЗ (1,4 £); 4,6-диен-З-она в стандарте ВОЗ в 6 - 6,5 раза выше, чем 4-ен-3,6-диона, тогда как в образцах отечественного прегнина этих соединений содержится почти поровну.

Относительная ошибка единичного определения составила 8,6 % для суммы примесей.

3.3. Анализ прогестерона и прегнина в субстанциях и лекарственных формах методом ВЭЖХ

Проведено'количественное определение прогестерона и прегнина в субстанции (стандартом сравнения являлся соответствующий стандарт ВОЗ). Методика количественного определения характеризуется высокой точностью, воспроизводимостью и повторяемостью результатов. Относительная ошибка единичного определения составила 3,8 % для прогестерона и 1,5 % для прегнина.

Для' анализа инъекционных форм прогестерона мы применили метод ВЭЖХ при тех же условиях, что и для оценки примесей, с внутренним стандартом - ДОКТМА.

Время удерживания составило: ДОКТМА - 3 мин, прогестерона -4,3 мин, масла и бензилбензоата - около 1 мин. Разделение пиков было хорошим. ДОКТМА хорошо отделялся от компонентов препарата.

Значение составляло 4,5 - 4,8.

Выбранная длина волны детекции (230 нм) соответствует максимумам поглощения прогестерона (232 нм) и ДОКТМА (231 нм) в используемой смеси растворителей.

Метрологическую оценку методики выполняли на четырех модельных смесях, содержащих прогестерон, оливковое или персиковое масло и бензилбензоат в количествах, соответствующих прописи проекта фармстатьи (таблица 3).

Таблица 3

Результаты анализа модельных смесей и метрологические характеристики методики ВЗЖХ

N П/П Взято Концентрация прогестерона д, мг/мл

Прогестерона, г Бензилбен-зоата, мл Масла оливкового, мл Масла персикового мл

1 2 3 4 0,6217 0,6118 0,2426 0,2570 5 5 до 25 до 25 до 25 до 25 24,87 24,47 9 848 10,280

N П/П Г Хер 52 3 Р ЦР,П Дх £

1 2 3 4 7 7 7 7 25,10 24,89 10,004 10,302 0,133 0,100 0,0068 0,0082 0,364 0,317 0,083 0,090 95 95 95 95 2,36 2,36 2,36 2,36 0,85 0,75 0 195 0,213 3,39 3,00 1.95 2,07

Методы количественного определения прогестерона в лекарственных формах, спектрофотометрический и ВЗЖХ, включенные в проект ФС в качестве альтернативных, характеризуются высокой точностью, повторяемостью, воспроизводимостью и сходимостью результатов (таблица 4).

Метод ВЗЖХ использован нами и в количественном определении прегнина в таблетках.

Методы УФ-спектрофотометрии и ВЗЖХ дают сходные результаты определения прегнина в таблетках (средние значения содержания

Таблица 4

Результаты количественного определения прогестерона двумя альтернативными методами

Метод Серия m f хСр s2 s Дх е

ВЭЖХ 71291 220392 50792 10393 5 4 9,996 0,00678 0,0823 0,229 2,29 5 4 9,886 0,00504 0,0710 0,197 2,00 5 4 24,880 0 07458 0,2731 0,759 3,05 5 4 25,536 0,07031 0,2652 0,737 2,89

Спектро-фотометрический 71291 220392 50792 10393 5 4 10,096 0,00858 0,0927 0,258 2,55 5 4 10,186 0 01573 0,1254 0,349 3,42 5 4 25.200 0,06763 0,2601 0,723 2,87 5 4 26,198 0 05847 0,2418 0,672 2,57

прегнина в образцах четырех серий 9,242 мг/табл. и 9,236 мг/табл. соответственно), характеризуются приблизительно одинаковой воспроизводимостью (средние значения s2 0,0113 и 0,0095 соответственно). Поэтому, при данном составе препарата "Таблетки прегнина 0,01 г", в посерийном контроле целесообразно использовать фармакопейный метод УФ-спектрофотометрии, отличающийся меньшей трудоемкостью; метод ВЗЖХ может быть использован для анализа комбинированных препаратов.

Таким образом, разработанные методики ВЗЖХ позволяют успешно определять количественное содержание примесей в прогестероне и прегнине; прогестерона и прегнина в субстанции и лекарственных формах.

4. ИЗУЧЕНИЕ ПЛАВЛЕНИЯ ПРОГЕСТЕРОНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

Исследование полиморфизма на нескольких сериях субстанции прогестерона методом ДСК показало, что в диапазоне температур от 30 до 170 °С кривые плавления содержат во всех случаях только один четкий эндотермический пик плавления с ДН 80 - 82 Дж/г. Ка-

кие-либо другие эффекты до и после плавления, указывающие на наличие в препарате летучих компонентов или на его разложение, на кривых плавления отсутствуют.

Методом ДСК было установлено, что степень чистоты субстанции прогестерона составляет, как правило, не менее 99 % и после очистки методом перекристаллизации возрастает на 0,2 - 0,3 %.

Отсутствие дополнительных эндотермических пиков на кривых плавления ДСК всех проанализированных образцов прогестерона (даже при максимальной чувствительности записи кривой) свидетельствует о том, что препарат находится только в одной, термодинамически стабильной при комнатной температуре, кристаллической модификации с температурой плавления 127 - 130 °С.

При плавлении на приборе ПТП серийные и очищенные образцы прогестерона ведут себя так же, как при плавлении методом ДСК.

5. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЯМР ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРИМЕСЕЙ В ПРОГЕСТЕРОНЕ

В связи с тем, что нами впервые выделены из прогестерона 5«-прегнан-3,20-дион (примесь 3), 2О0-гидроксипрегн-4-ен-3-он (примесь 6) и 6-оксопрогестерон (примесь 8), представляло интерес изучение их ЯМР-спектров.

Спектр ЯМР 13С 208-гидроксипрегн-4-ен-3-она не был описан ранее. Отнесение сигналов к определенным углеродам в спектре 13С примеси 6 было выполнено сопоставлением со спектром 13С прогестерона. В спектре этого соединения, вместо сигнала С20 карбонильной группы с б 208,3 м.д., появляется сигнал метанового углерода с химическим сдвигом, типичным для углерода СНОН-группы (70,5 м.д.).

Кроме того, значительное изменение претерпевает химический сдвиг сигнала ближайшего к этому углероду С17Н (Û6 4,8 м.д.).

Спектр ЯМР l3G б-оксопрогестерона не был описан ранее. Наличие 3 сигналов углеродов карбонильных групп (5 199,2 м.д.; 201,5 м.д.; 208,6 м.д.), две из которых (первая и вторая) находятся в сопряжении с двойной связью, а также заметное изменение сигнала четвертичного углерода двойной связи (С5, Аб -10,1 м.д.) по сравнению с прогестероном подтверждают структуру данной примеси.

Спектры ЯМР 1Н примесей 6 и 8 совпали с описанными в литературе для 20е-гидроксипрегн-4-ен-3-она и 6-оксопрогестерона соответственно.

Спектры ЯМР аН и 13С примеси 3 совпали со спектрами, описанными в литературе для 5«-прегнан-3,20-диона.

ВЫВОДЫ

1. Проведены исследования по разработке более эффективных методик оценки качества некоторых гестагенных препаратов (прогестерон, прегнин и их лекарственные формы), позволяющих проводить их объективную стандартизацию в процессе государственного контроля.

2. Выявлено, что образцы прогестерона ХФК "Акрихин" соответствуют по показателю "Посторонние стероиды" требованиям Британской фармакопеи 1988 г., Компендиум Медикаменторум и фармакопеи ГДР 1985 г. и не соответствуют требованиям Японской 1982 г. и Чехословацкой 1987 г. фармакопей.

3. Разработана методика контроля качества прогестерона по показателю "Посторонние стероиды" методом ТСХ. Содержание примесей в прогестероне ХФК "Акрихин" составило от 0,9 до 1,4 % при опре-

делении по этой методике.

4. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения прогестерона в субстанции с использованием экспериментально найденного значения удельного показателя поглощения прогестерона, равного 535.

5. Подобрана оптимальная система растворителей (гексан - бута-нол-1 =4:1) для препаративного выделения прогестерона из лекарственных форм на пластинках Силуфол и Сорбфил; ИК-спектры образцов прогестерона, выделенных из модельных смесей и серийных образцов препарата "Раствор прогестерона в масле оливковом 1 % и 2,5 % для инъекций", сходны со спектрами серийных образцов прогестерона, но имеют дополнительные максимумы поглощения, обусловленные присутствием сложных зфиров (масла, бензил-бензоата) и четыреххлористого углерода.

6. Разработана унифицированная методика ВЭНХ на отечественном приборе "Милихром" для количественного определения:

- примесей в прогестероне (относительная ошибка единичного определения е = 10,3 % для суммы);

- примесей в прегнине (е = 8,8 + 13,8 % для отдельных примесей и 8,6 % для суммы);

- прогестерона в технических образцах и образцах фармакопейной степени чистоты (е = 3,8 %);

- прегнина в фармакопейных и стандартных образцах (е = 1,5 X);

- прогестерона в лекарственных формах (е = 2,0 + 3,2 %);

- прегнина в таблетках (е = 2,6 X).

7. В отечественных образцах прогестерона обнаружены 11 примесей, из них шесть идентифицированы впервые, методами ЯМР-, ИК-, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ, встречного синтеза; пять примесей были

идентифицированы ранее. Определено, что девять примесей образуются на стадии окисления прегненолона по Оппенауеру, а две примеси (16-дегидропрогестерон и 16«-метоксипрогестерон) - на стадии гидрирования ацетата дегидропрегненолона.

8. Методом ВЭЖХ доказано, что основными примесями в серийных образцах прогестерона являются 20-(2-оксоциклогексилиде-но-)прегн-4-ен-3-он (0,36 - 0,50 %), 16-дегидропрогестерон (0,11 - 0,32 %), 20В-гидроксипрегн-4-ен-3-он (0,30 - 0,45 %) и его 20«-эпимер (0,11 - 0,15 %). Путем уменьшения содержания 16-дегидропрегненолона в прегненолоне можно снизить содержание 16-дегидропрогестерона в конечном продукте. Путем дополнительной перекристаллизации прогестерона из ацетона наиболее существенно снижается примесь 20-(2-оксоциклогексилиде-но-)прегн-4-ен-3-она. Методом препаративной хроматографии на силикагеле устраняются 20е-гидроксипрегн-4-ен-3-он, его 20ос-эпимер, 20-(2-оксоциклогексилидено-)прегн-4-ен-3-он и многие другие примеси.

9. Методом ДСК установлено, что отечественная субстанция прогестерона, кристаллизованная из ацетона или октанола, находится в одной высокоплавкой полиморфной модификации с температурой плавления около 130 °С и не содержит других полиморфных форм. При повторной и т.д. кристаллизации расплава при охлаждении образуются низкоплавкие полиморфные формы прогестерона, которые наблюдаются на кривой плавления ДСК при втором и т.д. плавлении одного и того же образца.

10. Метод ДСК дает заниженные результаты содержания примесей в серийных образцах по сравнению с методами ТСХ и ВЭЖХ.

11. Разработанные методики включены в два проекта НД.

ФС 42-2831-92 на прогестерон утверждена МЗ РФ. Проект ФС 42-взамен ФС 42-2429-86 на "Раствор прогестерона в оливковом или персиковом масле 1 % и 2,5 £ для инъекций" одобрен Фармакопейным комитетом МЗ РФ и находится на стадии утверждения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щавлинский А.Н., Маслов Л.Г., Лазарева Н.П. Методы контроля качества прогестерона и его лекарственных форм (обзор).// Хим.-фармац. журн. - 1994. - Т. 28, N 2. - С. 54 - 60.

2. Применение метода термического анализа для стандартизации и оценки качества лекарственных средств. 2. Анализ качества прогестерона методом дифференциальной сканирующей калориметрии. / Львова М.Ш., Маслов Л.Г., Випшевецкая И.А., Щавлинский А.Н., Козлов Э.И. // Фармация. - 1993. - Т. 42, N 3. - С. 29 - 32.

3. Маслов Л.Г., Щавлинский А.Н., Лазарева Н.П. Методика разделения прогестерона и его примесей методом ВЗЖХ на приборе "Милихром". // Контроль качества лекарств: Информ.- метод, бюлл. N 2. - М., 1992. - С. 52 - 54.

4. Щавлинский А.Н., Маслов Л.Г., Лазарева Н.П. К вопросу о повышении качества синтетического гормонального препарата "Прогестерон".// Синтез и контроль качества лекарств: Сб. научных трудов./ Рязанский мед. ин-т. - Рязань, 1991. - С. 115 - 119.

5. Маслов Л.Г., Щавлинский А.Н., Лазарева Н.П. Использование метода ВЭНХ в анализе прогестерона и прегнина и их лекарственных форм. // В кн.: "Тез. докл. конф. "Перспективы создания и производства лекарственных средств в Украине", г. Одесса, 4-8 окт. 1993 г." - Харьков, 1993. - С. 346 - 347.

6. Маслов JI.Г., Щавлинский А.Н., Лазарева Н.П. Исследование в области стандартизации гестагенных гормонов. 1. Пути повышения качества прогестерона.// В кн.: "Тез. докл. конф. "Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР" и Пленума ВНОФ 12 - 13 марта 1991 г." - Владимир, 1991. - С. 54 - 55.

7. Маслов Л.Г., Щавлинский А.Н., Лазарева Н.П. Исследование в области стандартизации прогестерона.// В кн.: Материалы конф. "Применение современных лекарственных препаратов и медицинской техники на крупных промышленных предприятиях". - Ленинград -Тольятти, 1991. - С. 33 - 34.

8. Исследование в области стандартизации лекарственных препаратов, содержащих гестагенные гормоны. 1. Прогестерон./ Щавлинский А.Н., Маслов Л.Г., Лазарева Н.П., Быков В.А., Суханова Н.Д., Кирпичева Э.И., Глушакова В.П./ Рукопись деп. во ВНИИМИ 10.01.91 г. N Д-20815.

9. Щавлинский А.Н., Маслов Л.Г., Лазарева Н.П. Исследование в области -стандартизации лекарственных препаратов, содержащих гестагенные гормоны. 2. Прогестерон и его лекарственные формы./ Рук. депонир. в ГЦНМБ 20.12.93 г. N Д-23747.

.10. Изучение плавления прогестерона и метилтестостерона методом дифференциальной сканирующей калориметрии. /Львова М.Ш., Вишневецкая И.А., Маслов Л.Г., Щавлинский А.Н., Козлов Э.И. // В печати (направлена в Хим.-фармац. журн. 12.07.93 г.).

11. Идентификация примесей в прогестероне и разработка методов их определения. /Маслов Л.Г., Щавлинский А.Н., ■Филиппова Т.М., Лазарева Н.П. / В печати (направлена в Хим.-фар-мац. 'журн. 09.02.94 г.).

пмп мдс 3.608 т.100 - 95 г. 107078 Москва, Ново-Басманная,6