Молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки

Федотчева, Татьяна Александровна

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Федотчева, Татьяна Александровна Москва 2012 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.06

Автореферат диссертации по медицине на тему Молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки

На правах рукописи

ФЕДОТЧЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЦИТОСТАТИЧЕСКОГО И ХИМИОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГЕСТАГЕНОВ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

• з МаП 2012

Москва-2012

005016660

Работа выполнена на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика РАМН П.В.Сергеева Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России».

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН, профессор Шимановский Николай Львович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Минздравсоцразвития России, Козлов Иван Генрихович

Доктор медицинских наук, профессор,

директор НИИ клинико-экономической

экспертизы и фармакоэкономики

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Минздравсоцразвития России, Омельяновский Виталий Владимирович Доктор медицинских наук, профессор, руководитель Научно-аналитического отдела ФГУ НЦЭСМП

Минздравсоцразвития России, Яворский Александр Николаевич

Ведущая организация:

Первый Московский Государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова.

Защита состоится «30 мая » 2012г. в 14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.072.01 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан «__»_20_года

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор

Н .Г.Потешкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Препараты на основе гестагенов широко применяются в современной медицине в составе контрацепции, гормональной заместительной терапии, а также в гормонотерапии опухолей. В качестве паллиативной гормональной терапии рака молочной железы, рака шейки матки, рака эндометрия, почки применяются медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, депостат. Однако механизм противоопухолевого действия гестагенов полностью не исследован, в связи с чем возникают трудности при подборе адекватного препарата для лечения опухолей. Выявление механизмов цитостатического действия гестагенов остается важной проблемой молекулярной фармакологии. Так как гестагены более эффективны в рецептор-положительных опухолях, предполагается рецептор-опосредованное антиэстрогенное противоопухолевое действие гестагенов [Sitruk-Ware R., 2002]. Эффективность гестагенов зависит от индивидуального профиля пациента — возраста, анамнеза, представленности рецепторов прогестерона и эстрадиола [Sitruk-Ware R., 2005; Байназарова A.A., Искакова Ж. К., 2006]. С развитием персонализированной медицины дифференцированные подходы к применению гестагенов с учетом новых сведений о механизмах их действия могут значительно повысить эффективность гестагенов, для чего требуется правильный выбор препарата, оптимальные дозы и режимы введения в каждом конкретном случае. Изучение механизмов цитостатического действия гестагенов позволит также вести более направленный поиск новых противоопухолевых соединений на основе гестагенов с минимальным числом побочных эффектов.

Другой аспект возможного клинического применения гестагенов в онкологии — в качестве химиосенсибилизаторов опухолевых клеток, то есть соединений, повышающих чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, представляет особую актуальность. Как известно, существенным ограничением эффективности противоопухолевой терапии является возникновение устойчивости опухолевых клеток к применяемым препаратам - феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) [Богуш Е.А., Кирсанов В.Ю., 2006; Baguley В., 2010]. Снижение активности цитостатиков вследствие развития в опухолевых клетках устойчивости к структурно и функционально разнородным противоопухолевым средствам происходит уже после первых курсов лечения. Требуются все более высокие дозы цитостатиков, что увеличивает их повреждающее действие на нормальные клетки и ткани.

ABC-транспортеров в норме является защита клетки от токсических метаболитов, в том числе образуемых самой клеткой. Наибольшая экспрессия этих белков обнаруживается в различных гемато-тканевых барьерах. Среди АТР-зависимых помп плазматической мембраны опухолевых клеток, выбрасывающих ксенобиотики, идентифицирован Р-гликопротеин, кодирующийся геном MDR-1 (Multydrug Resistance-1), и представляющий собой наиболее изученный белок МЛУ, активизация которого приводит к выбросу цитостатиков: антрациклиновых антибиотиков (адриамицин, даунорубицин), винкаалкалоидов (винкристин, винбластин), таксанов (таксол, таксотер), митоксантрона, ингибиторов топоизомераз (этопозид), что снижает эффективность перечисленных препаратов [Li J. et al., 2010].

В настоящее время ведется интенсивный поиск селективных модуляторов состояния МЛУ опухолевых клеток с целью повышения эффективности химиотерапевтического лечения. С каждым годом количество таких соединений увеличивается, но сенсибилизатора с ближайшей перспективой использования в клинической практике пока не найдено, также как не исследовано их возможное действие на другие клеточные мишени. Поэтому поиск новых химиосенсибилизирующих соединений, направленно влияющих на снижение МЛУ, остается актуальной проблемой современной фундаментальной медицины и фармакологии.

Среди ингибиторов Р-гликопротеина известны такие, как циклосоприн, верапамил, трастузумаб, вогонин, тариквидар и др. [Sauna Z. et al., 2001, Lee R. et al., 2009; Fox E. et al., 2007]. В противоопухолевой терапии из них используется только трастузумаб, область применения которого ограничена опухолями, содержащими НЕ112-рецепторы.

В последние годы появились указания на возможность использования гестагенов в качестве ингибиторов Р-гликопротеина [Сергеев П.В. и др., 2007]. В 1991 г. было показано, что прогестерон является субстратом Р-гликопротеина и транспортируется через прогестерон-специфический сайт. Это свойство прогестерона послужило основанием для исследования способности синтетических гестагенов ингибировать Р-гликопротеин. Влияние синтетических гестагенов на активность Р-гликопротеина и другие факторы МЛУ ранее не изучалось, в литературе существуют лишь отрывочные противоречивые данные по этой проблеме.

Таким образом, механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов мало изучены, как неизвестны и мишени действия новых синтезированных гестагенов. Не определена зависимость величины противоопухолевого эффекта от химической структуры гестагена.

Понимание молекулярных механизмов цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки повысит рациональность их назначения, откроет новые возможности преодоления МЛУ. Цель работы.

Выявление молекулярных механизмов цитостатического действия гестагенов на опухолевые клетки и способов сенсибилизации опухолевых клеток к цитостатикам.

Задачи исследования:

1) Исследовать влияние новых гестагенов на жизнеспособность опухолевых клеток.

2) Исследовать механизмы цитостатического действия гестагенов:

- изучить влияние гестагенов на экспрессию рецепторов прогестерона и эстрадиола в клетках рака молочной железы и рака шейки матки человека;

- изучить влияние гестагенов на клеточный цикл клеток;

- изучить влияние гестагенов на экспрессию про- и антиапоптотических белков в опухолевых клетках и продукцию активных форм кислорода (АФК) митохондриями.

3) Изучить влияние гестагенов в комбинации с цитостатиками на жизнеспобоность опухолевых клеток.

4) Установить механизмы сенсибилизации гестагенами опухолевых клеток к цитостатикам:

- изучить влияние гестагенов на активность Р-гликопротеина;

- изучить влияние гестагенов на экспрессию мРНК Р-гликопротеина, белка, ассоциированного с резистентностью (MRP1), и белка резистентности рака молочной железы (BCRP) в клетках рака молочной железы;

- изучить влияние гестагенов в комбинации с доксорубицином на клеточный цикл опухолевых клеток.

5) Исследовать влияние гестагенов на функции митохондрий как ключевую органеллу клетки, обеспечивающую ее жизнеспособность:

- изучить влияние гестагенов на дыхание митохондрий; -изучить влияние гестагенов на открытие митохондриапьной поры.

6) Изучить влияние синтетических гестагенов и Бутерола на продукцию АФК в митохондриях как один из механизмов сенсибилизации клеток к цитостатикам.

7) Определить мишени действия Бутерола как потенциального противоопухолевого средства и химиосенсибилизатора.

Научная новизна.

В работе изучены молекулярные механизмы цитостатического действия гестагенов. Показано, что оно опосредуется снижением количества эстрогеновых рецепторов, торможением митотического цикла и индукцией апоптоза за счет продукции активных форм кислорода. Показано, что гестагены, помимо собственной цитостатической активности, обладают также химиосенсибилизирующей активностью, увеличивая цитостатическое действие доксорубицина, винкристина, этопозида на 20-50%. Установлено, что механизмы химиосенсибилизации связаны с ингибированием активности Р-гликопротеина, ингибированием экспрессии белков-транспортеров ксенобиотиков - BCRP (breast cancer resistance protein) и MRP1 (multydrug resistance-associated protein) в клетках рака молочной железы), торможением клеточного цикла в фазе G2/M.

Помимо известных и применяемых в клинической практике гестагенов, в работе изучены новые отечественные гестагены - Бутерол, разработанный в

ЦХЛС-ВНИХФИ совместно с ЭНЦ РАМН, под руководством Г.С. Гриненко и В.М. Ржезникова, и Мецигестон, разработанный в ИОХ РАН в лаборатории A.B. Камерницкого. Новые гестагены обладают высокой цитостатической и химиосенсибилизирующей активностями, превосходящими препараты сравнения. Впервые выявлены механизмы их цитостатического и химиосенсибилизирующего действия. С помощью новой, разработанной в работе модификации метода количественной оценки экспрессии мРНК для подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола, установлены принципы их регуляции гестагенами.

При изучении механизмов химиосенсибилизирующей активности гестагенов впервые выявлено их уникальное действие на циклоспорин-чувствительную Са2+-зависимую митохондриальную пору - главный участок, ответственный за инициацию апоптоза в клетке. Обнаружено принципиально новое, зависимое от химической структуры, свойство прогестинов - при наличии эфирных остатков в позиции СЗ (Бутерол, Ацетомепрегенол) у гестагенов появляется способность связываться с SH-группами. Впервые показано, что связывание Бутеролом SH-групп нуклеотид-связывающего домена Р-гликопротеина и аденилатгранслоказы является одним из механизмов сенсибилизации клеток к цитостатикам.

Научно-практическая значимость.

В работе выявлены молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов, открывающие новые возможности персонализированной терапии опухолей с учетом индивидуального статуса гормональных рецепторов. С этой целью разработана модификация реал-тайм ОТ-ПЦР метода определения подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола. На основании анализа представленности подтипов рецепторов в опухоли показана возможность прогнозирования успешности применения гестагенов.

Среди изученных гестагенов выявлены гестагены с наибольшей цитостатической и химиосенсибилизирующей активностью - Бутерол и Мецигестон. Бутерол пригоден для перорального применения, не обладает побочными андрогенной и минералкортикоидной активностями и является наиболее перспективным для применения в клинической практике.

Изучение молекулярных механизмов действия гестагенов на опухолевые клетки выявило оптимальные дозовые и временные параметры для осуществления максимального противоопухолевого эффекта. Экстраполируя концентрации, исследованные in vitro, можно заключить, что при длительном введении гестагенов в режиме 1 раз в 4-6 дней в высоких дозах (200 мкМ конечная концентрация в плазме крови), противоопухолевый эффект будет максимальным.

Помимо цитостатической активности гестагены также проявили химиосенсибилизирующую активность, увеличивая эффект цитостатиков на 2050%, и, следовательно, могут применяться совместно с цитостатиками на первых этапах лечения химиотерапией.

Особое значение имеет проведенное исследование противоопухолевой активности нового гестагена Бутерола. Бутерол превосходит по противоопухолевой активности препараты сравнения и обладает уникальным свойством ингибировать митохондриальную пору благодаря наличию бутаноилокси- группировки при СЗ.

Бутерол, влияя на различные белки транспортеры плазматической и митохондриальной мембран, может или повышать цитостатическую активность химиотерапевтических препаратов благодаря ингибированию системы транспорта их из клетки или уменьшать ее за счет ингибирования открытия митохондриальной поры (МТП, mitochondrial permeability transition pore). Результирующее действие будет определяться концентрацией бутерола в области плазматической мембраны и митохондриях в опухолевых и нетрансформированных клетках. Ингибирование открытия митохондриальной поры может оказаться очень полезным в плане снижения кардиотоксичности ряда противоопухолевых средств, так как известно, что ингибиторы проницаемости мембран митохондрий (внутренней или внешней) обладают кардиопротекторным эффектом. Поэтому Бутерол, ингибируя открытие МТП, может существенно снизить кардиотоксичность цитостатиков, связанную с инициацией апоптоза, и в то же время, ингибируя активность Р-гликопротеина, повысить их цитостатическую активность в отношении резистентных опухолевых клеток. Это свойство позволяет прогнозировать его использование не только в онкологической практике, но и в качестве кардиопротектора.

Благодаря этому впервые обнаруженному свойству Бутерола найден принципиально новый подход к поиску и созданию соединений, преодолевающих МЛУ, который заключается в разработке новых классов препаратов, обратимо связывающих SH-группы нуклеотидсвязывающих доменов белков-транспортеров и ферментов МЛУ. Основные положения, выносимые на защиту:

1) Гестагены Бутерол, Мецигестон обладают цитостатическим действием в отношении гормонозависимых опухолевых клеток. Механизмы цитостатической активности связаны со снижением прогестероновых рецепторов ПР-А и эстрогеновых 3Pß, индукцией апоптоза за счет стимуляции продукции активных форм кислорода.

2) Гестагены Бутерол, Мецигестон обладают химиосенсибилизируюшим действием в отношении опухолевых клеток. Механизмы химиосенсибилизации связаны с ингибированием активности Р-гликопротеина, подавлением экспрессии мРНК MRP1 (multidrug associated protein 1), и BCRP (breast cancer resistance protein), усилением продукции АФК.

3) Наличие у прогестинов эфирных остатков в позиции СЗ приводит к появлению способности связываться с SH-группами аденилаттранслоказы, основного регуляторного компонента МТП, и нуклеотидсвязывающих доменов белков-транспортеров МЛУ.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на Международной конференции «Митохондрии, клетки и активные формы

кислорода» (Москва, 2000); на заседаниях Российского национального конгресса "Человек и лекарство" (Москва, 2001, 2002, 2003, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010 и 2011 г.г.); на II конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); на Всероссийском рабочем совещании «Митохондрии в патологии» (Москва, 2001); на I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2002); на конференции «Медицина будущего» (Москва, 2002); на 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2003); на Европейском съезде фармакологов (Москва, 2004); на I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции (Москва, 2006); на 3-м Съезде фармакологов «Фармакология - практическому здравоохранению» (Москва, 2007); на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); на VI Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (Москва, 2011) Публикации. Результаты исследований опубликованы в 29 работах, в числе которых 18 статей в изданиях, рекомендованных ВАК. Получено 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав с изложением результатов и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 294 источника. Общий объём работы -246 стр., включая 71 рисунок и 37 таблицы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве объектов исследования использовали клеточную культуру HELA (эпителиоидный рак шейки матки человека) - предоставлена Институтом Вирусологии им. Мечникова, клеточную культуру MCF-7 (рак молочной железы человека); ее производные - чувствительные (MCF-7/WT, WT - wild type) и резистентные к доксорубицину (MCF-7/R, R - resistance) были получены из банка клеток ВНЦМДЛ, клеточную культуру Нер-2 (рак гортани человека); ее производные - чувствительные (Hep-2/WT) и резистентные к винкристину (Hep-2/VCR, VCR - vincristin), получены из лаборатории регуляции пролиферации и гибели клеток Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, перевиваемую опухоль острого лейкоза мыши (Р388); ее производные - чувствительные (P388/WT) и резистентные к винкристину (P388/VCR, VCR - vincristin), получены из лаборатории регуляции пролиферации и гибели клеток, г. Пущино, перевиваемый рак шейки матки человека (РШМ-5), предоставлена РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (и.о. зав. лаб. - д.м.н. Смирнова З.С.), образцы карциномы молочной железы и нормальной ткани молочной железы, любезно предоставленные лабораторией клинической биохимии Н.Е. Кушлинского (РОНЦ РАМН им. Блохина), самки мышей линий СВА и DBA2, беспородные самки мышей и крыс (предоставлены питомником лабораторных животных г. Пущино).

Культивирование клеток осуществлялось в стерильных условиях с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). Клетки инкубировали при 37 С в условиях 5% С02. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 10 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотиков гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата в концентрации 40 мкг/мл. Методы оценки противоопухолевой и химиосенсибилизирующей активности изучаемых соединений.

Оценку жизнеспособности и метаболической активности опухолевых клеток проводили методом МТТ [Mealey К. et al., 2002]. Оценку влияния соединений на пролиферативную активность опухолевых клеток измеряли по включению 3Н-тимидина в ДНК [Фрешни Р., 1989]. Оценку противоопухолевой активности гестагенов проводили морфометрическим методом. Химиосенсибилизирующая активность Бутерола на перевиваемом остром лейкозе мыши Р388, резистентном к винкристину, оценивалась по подсчету нарастания опухоли (количеству клеток в асцитной жидкости). Анализ специфических участков связывания 3Н-прогестерона (3Н-Р4) и относительной связывающей способности (RBA) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона в культурах клеток проводили по методу [Бассалык JI.C., 1987; Martín et al., 2003]. Активность Р-гликопротеина определяли по кинетике выхода родамина 123 [Wielinga P. et al., 1998, 2000]. Активность глутатион-Б-трансферазы определяли спектрофотометрически с использованием C1DNB в качестве субстрата [Habig W., Jacoby, 1981]. Анализ клеточного цикла опухолевых клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии. Экспрессию мРНК белков определяли методом Реал-тайм ПЦР (количественной оценки мРНК исследуемых генов). Для нормирования уровня транскрипции в разных образцах измеряли также транскрипцию мРНК «housekeeping» генов глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Для анализа данных использовали математическую модель оценки экспрессии методом РТ-ПЦР [Pfaffl et al., 2002] с интеркалятором SYBR Green I на приборе IQ5 Cycler фирмы «Biorad» (США).

Определение активности и регуляции гестагенами открытия митохондриальной поры.

Митохондрии получали из печени взрослых крыс-самцов линии Wistar стандартным методом дифференциального центрифугирования [Johnson, Lardy, 1967].

Эффекты гестагенов на индукцию митохондриальной поры (МТП) ионами кальция определяли с помощью измерения кальциевой емкости как описано ранее [Basso et al., 2005] и набухания митохондрий. Измерение продукции АФК и определение изменений мембранного потенциала митохондрий (ДЧ'т) проводили с помощью флуоресцентных и хемилюминесцентных методов. Мембранный потенциал измеряли с помощью ТФФ+-селективного электрода и флуоресцентного красителя Родамина 123. Продукцию АФК регистрировали по методике [Kambayashi, Ogino, 2003] селективным хемилюминесцентным зондом 3,7-дигидро-2-метил-6-(4-метоксифенил)имидазол [1,2-а]пиразин-3-

один (MCLA). Продукцию перекиси водорода измеряли с помощью флуоресцентных зондов 2,7-дихлорофлуоресцина диацетата (DCFDA) и «Amplex Red». Хемилюминисценцию MCLA и флуоресценцию DCFDA (Ех 485 нм, Em 525 нм) регистрировали в течение 40 мин на планшетном ридере Infinite F200 (Тесап, Австрия) в 96-луночных планшетах при 30°С. Статистическая обработка результатов.

В работе использованы стандартные методы статистического анализа [Лакин Г., 1990]. Все полученные результаты представлены в виде: X = M+S, где X - изучаемый показатель, M - его среднее значение в исследуемой статистической выборке, 5- стандартное отклонение.

Статистическая достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрического рангового критерия Т - критерия Уилкоксона (Манна-Уитни) для уровня значимости а = 5% и Т - критерия Стьюдента для уровня значимости а = 0.1 -5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В данном исследовании проведено комплексное изучение гестагенов как противоопухолевых средств и химиосенсибилизаторов. Представленные ниже разделы посвящены молекулярным механизмам цитостатической и химиосенсибилизирующей активности гестагенов, поиску мишеней действия гестагенгов в опухолевой клетке, анализу зависимости действия гестагенов от химической структуры.

ГЛАВА 1. МЕХАНИЗМЫ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЕСТАГЕНОВ

Экспериментальный анализ цитостатической активности гестагенов.

При исследовании цитостатической активности гестагенов показано, что они обладают цитостатическим действием в отношении опухолевых клеток MCF-7, MCF-7/R и HeLa. Антипролиферативный эффект, выявленный в МТТ-тесте и тесте с 3Н-тимидином, развивается на 6 сутки инкубации, наиболее выраженный эффект наблюдался в концентрации гестагенов 10"5М (табл. 1).

Таблица 1. Влияние гестагенов на жизнеспособность клеток при инкубации в течение 6 суток, выраженное в процентах ингибирования жизнеспособности клеток. _ _

Тип клеток Конц., М. Прогестерон Бутерол МПА Мецигестон

MCF-7/WT 10° 90.1±4.2* 83.6±6* 93.1±4.2* 96.7+3.6*

ю-4 39.6±10.5* 77±3.9* 85±7.8* 95.2±4.6*

10" 11.5±8.7* 16.7±5.9* 28±13.5* 43+10.5*

MCF-7/R Iff* 33±7* 49±7.5* 44±5.5* 92±4.9*

10* 4±6.5 39±10* 36±12* 36±12*

10" 30±11* 24+8.5* 24±8.5* 26±8.5*

HeLa 10° 30±6.5* 51±6* 24+8.5* 62±5.5*

ю* 8±2* 23±6.5* 5±11 +3+8.5

ю-' +36±12* 7±7 +28±14* +24±15*

Примечание: * - достоверное отличие от контроля при Р< 0,05.

Обнаружена положительная корреляционная связь для данных, полученных методом МТТ и методом с использованием 3Н-тимидина. Наиболее высокий коэффициент корреляции получен для значений процента гибели клеток (МТТ-тест) и торможения пролиферативной активности (3Н-тимидиновый тест) в присутствии Мецигестона в клетках НеЬа (к = 0.93).

При сравнительной оценке цитостатического действия гестагенов показано, что Мецигестон и Бутерол по цитостатической активности либо превосходят препараты сравнения (МСР-7/Я, НеЬа, 10'5 М), либо обладают таким же по величине цитостатическим эффектом (МСР-7ЛУТ, 10"5 М). Ряды по эффективности цитостатического действия гестагенов на культуры клеток МСР-7ЛУТ, МСР-7/11, НеЬа представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Сравнительная эффективность подавления гестагенами жизнеспособности

Концентрация, М МСР-7Л¥Т МСР-7/Я НеЬа

ю-5 М>МПА>Б > П М>Б>МПА > П М>Б>П > МПА

10"6 М>МПА>Б > П Б > М=МПА>П Б > П

Ю-7 М>МПА>Б > П П >М >Б=МПА Стимуляция *

Примечание: Б-бутерол, М-мецигестон, МПА - медроксипрогестерона ацетат, П-прогестерон; * - усиление жизнеспособности клеток в присутствии гестагенов (кроме бутерола); > - достоверное отличие между препаратами (Р<0.001), >- недостоверное отличие.

При изучении влияния гестагенов на нормальные клетки - фибробласты кожи крыс и стромальные клетки человека, цитостатического действия гестагенов в диапазоне концентраций 10'7 - 10'5 М выявлено не было. Анализ специфических участков связывания гестагенов в опухолевых клетках.

Для выяснения роли рецепторов прогестерона в цитостатическом действии гестагенов был изучен характер взаимодействия гестагенов с опухолевыми клетками - проведен радиолигандный анализ связывания 3Н-прогестерона (3Н-Р4) и относительной связывающей способности (ЯВА) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона в культурах клеток. Показано, что клетки МСР-7 и НеЬа содержат рецепторы прогестерона, сходные между собой по константе ассоциации с прогестероном (Ка = 1.29*10®моль'' и 0.78*109 моль соответственно).

При анализе относительной связывающей способности (ЯВА) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона показано, что Мецигестон, Бутерол и МПА связываются с рецепторами прогестерона с большим сродством, чем прогестерон. Мецигестон, Бутерол и МПА превосходят прогестерон по ЯВА в 15, 17 и 5 раз соответственно. Таким образом, Мецигестон и Бутерол имеют большее сродство к рецепторам прогестерона, чем прогестерон и МПА.

При анализе зависимости цитостатического действия гестагенов от сродства к рецепторам была выявлена положительная корреляционная связь: коэффициент корреляции между цитостатическим эффектом гестагенов в концентрации 10~бМ и сродством к рецепторам прогестерона в клетках MCF-7/WT равен 0.70, в концентрации Ю М = 0.49. Коэффициент корреляции между цитостатическим эффектом гестагенов в концентрации 10"SM и сродством к рецепторам прогестерона в клетках HeLa равен 0.87, в концентрации 10~6 М = 0.33. С уменьшением концентрации гестагенов уменьшается коэффициент корреляции между цитостатическим эффектом и сродством к рецепторам, что указывает на возможную роль неспецифического связывания гестагенов. Таким образом, цитостатическое действие гестагенов реализуется с участием рецепторов прогестерона. Влияние гестагенов на экспрессию подтипов рецепторов прогестерона (ПР) и эстрадиола (ЭР) было изучено далее с помощью метода РЕАЛ-ТАЙМ ПЦР.

Влияние гестагенов на уровень экспрессии рецепторов прогестерона и эстрадиола.

На основании имеющихся литературных данных было выдвинуто предположение, что один из механизмов цитостатической активности гестагенов может быть связан с изменением экспрессии ПР и ЭР. Также было выдвинуто несколько гипотез, объясняющих механизм цитостатического действия гестагенов, опосредованный изменением количества рецепторов:

1) гестагены увеличивают экспрессию ПР-В, вследствие чего повышается чувствительность клеток к гестагенам;

2) гестагены снижают экспрессию ПР-А, что приводит к ингибированию транскрипции ЭР и, как следствие, блоку пролиферации;

3) гестагены подавляют экспрессию ЭРр, вследствие чего снижается транскрипция ЭРа-активируемых генов, что также ведет к блоку пролиферации.

В результате исследований влияния гестагенов в концентрации 10'SM (1С50) на экспрессию подтипов ПР и ЭР в опухолевых клетках нами установлено, что:

• Гестагены снижают экспрессию ПР-А и ЭРр в клетках рака молочной железы и рака шейки матки человека.

• Эффект гестагенов на экспрессию ПР-В зависит от тканевой принадлежности клеточной культуры. Так, в клетках рака шейки матки (HeLa) -уровень экспрессии ПР-В увеличивается под влиянием исследуемых синтетических гестагенов, а в клетках рака молочной железы (MCF-7/wt и MCF-7/R) - снижается.

• Эффект гестагенов на экспрессию ЭРа также неоднозначен и зависит от типа клеточной линии. В клетках MCF-7/R происходит снижение экспрессии ЭРа. В клетках HeLa преимущественно увеличивается экспрессия ЭРа.

• Таким образом, в механизме цитотоксического действия гестагенов на клетки рака молочной железы и рака шейки матки определенную роль играет снижение экспрессии ПР-А и ЭРр. Увеличивая экспрессию ПР-В и ЭРа в клетках HeLa, гестагены понижают отношение ПР-А /ПР-В и ЭРа/ ЭРр. Снижением ПР-А /ПР-В и ЭРа/ ЭРр, по литературным данным, сопровождается

противоопухолевое действие средств гормонотерапии [1л е1 а1., 2009, №1г Н. е1 а1,2011].

Влияние гестагенов на уровень экспрессии белков-модуляторов апоптоза в опухолевых клетках.

В качестве критерия оценки апоптоза определяли экспрессию мРНК проапоптотического белка Вах и антиапоптотического белка Вс1-2 (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние гестагенов на экспрессию мРНК Вс1-2 и Вах в трех типах опухолевых клеток.___

Вид белка Гестагены Клетки НеЬа Клетки МСР-7/\УТ Клетки МСР-7/11

Дни инкубации Дни инкубации Дни инкубации

2 4 6 10 2 4 6 10 2 4 6 10

Вс1-2 МГА 15* 19* -4* -26* 1 -15* -2* -6* -45* -84* -29* -2*

МПА 6* -2* -2* 0 2* -5* -1 -4* -40 -117* -25* -4*

БУТ 3* 13* 13« 5* -3* -12* -4* -6* -34 -4* 1 1

АМП 1.7 2* 4* -7* -2* -25* -4* -11* -37 -24* -3* 1,1

ПРОГ 3* 6* 5* 5* -3* -21* -6* -5* -82 -27* -2* -49*

Вах МГА 7* 8* -7* -8* -5* -7* -2* -14* -9 -16* -4* -3*

МПА 4* -8* -3* 0 -5* -2* -2* -2* -10* -7* -4* -1

БУТ -2» 2* 1,3 -1,1 -5* -10* -3* -17* -24* -3* -1,1 18*

АМП -2* 2* -2* -18* -4* -6* -2* -2* -95* -15* -5* 6*

ПРОГ -1 1 2* -1 -2* -7* -2* -1 -98* -24* -6* 4*

Примечание: Концентрация гестагенов составляла Ш М. Представленные значения - изменение экспрессии Вс1-2 в количество раз, рассчитанное по формуле Я=2^а' (.) _ уменьшение экспрессии. В качестве

контроля использовали клетки тех же культур, инкубировавшиеся в отсутствие соединений в тех же условиях. Приведены средние значения трех экспериментов. * - достоверное отличие от контроля при Р<0,05.

Анализ полученных данных позволил выявить следующие закономерности:

• В клетках НеЬа под влиянием гестагенов происходит увеличение экспрессии мРНК Вс1-2, в клетках МСР-7/\*Л и МСР-7/Я - снижение мРНК Вс1-2.

• В клетках НеЬа происходит увеличение экспрессии мРНК Вах на 2-4 сутки инкубации с гестагенами (МГА, МПА, БУТ)

• В клетках МСР-7/\\1 гестагены вызывают снижение экспрессии мРНК Вах.

• В клетках МСР-7/11 происходит снижение экспрессии мРНК Вах, при более длительной инкубации - на 10 сутки - экспрессия мРНК начинает расти (Бутерол, АМП, ПРОГ).

Представленные данные свидетельствуют о том, что гестагены обладают апоптотическим действием, которое развивается на 2-4 сутки инкубации, а в резистентных клетках - на 10 сутки инкубации. Апоптотическое действие гестагенов более выражено в клетках рака молочной железы, чем в клетках

НеЬа, что объясняется большим сродством рецепторов прогестерона к гестагенам в этих клетках по сравнению с культурой клеток МСР-7. Влияние гестагенов на клеточный цикл опухолевых клеток.

Как уже было сказано выше, гестагены могут оказывать цитостатические эффекты не только за счет модуляции экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, но также и за счет собственной цитостатической активности, компонентом которой может быть влияние на клеточный цикл опухолевых клеток. В связи с этим было исследовано влияние гестагенов на клеточный цикл опухолевых клеток МСР-7 путем их инкубации с прогестероном, МПА, Мецигестоном и Бутеролом в концентрации 10"5М в течение 6 суток (табл. 4).

Таблица 4.

Распределение опухолевых клеток МСР-7/\УТ по фазам клеточного цикла (%)

Препарат G1 S G2/M

Контроль 46.7 23.3 30

Прогестерон 40.6* 32.8* 26.6*

Мецигестон 34.3* 38.6* 27.1*

Бутерол 40.9* 28.2* 30.9

МПА 42.9* 25.7 31.4

Примечание: погрешность значений не превышает 2%. * - достоверное отличие от контроля при Р<0,05.

Данные таблицы 4 показывают, что при сроке инкубации и концентрации препаратов, при которых достигается максимальный эффект гестагенов как самостоятельных препаратов и в комбинации с доксорубицином, достоверно снижается процент активно пролиферирующих клеток в фазе G1 и увеличивается процент клеток, находящихся в синтетической фазе S. Данные по процентному распределению опухолевых клеток MCF-7/R по фазам клеточного цикла после инкубации с гестагенами в течение 6 суток несущественно отличались от представленных в таблице 4.

Результаты, полученные в этой части исследования, свидетельствуют о том, что цитостатический эффект гестагенов связан с торможением клеточного деления.

Противоопухолевая активность Бутерола и Мецигестона на перевиваемом мышам раке шейки матки РШМ-5.

В экспериментах in vitro было продемонстрировано выраженное цитотоксическое действие новых гестагенов Мецигестона и Бутерола на культурах опухолевых клеток рака молочной железы и шейки матки человека. Мецигестон превосходит по цитотоксической активности препараты сравнения МПА и прогестерон в отношении клеток рака молочной железы, Бутерол - в отношении клеток рака шейки матки. Противоопухолевая активность Бутерола и Мецигестона in vivo ранее не исследовалась.

С этой целью исследовали влияние Бутерола и Мецигестона на рост перевиваемого мышам рака шейки матки человека РШМ-5. В качестве

препарата сравнения использовали медроксипрогестерона ацетат - МПА (табл. 5 и 6).

Таблица 5.

Противоопухолевая активность Бутерола при пероральном введении в течение 14 дней мышам с раком шейки матки РШМ 5.

Группа Доза (мг/мышь) Масса опухоли, М±м ТРО (торможение роста опухоли), %

Контроль - 417193.5 -

Бутерол 0.5 265,4±126.9 36

1.0 113.6±27.8 **

2.0 285.31129.0 32

МПА 1.0 205.0171.8 55*

2.0 187.1173.7 55*

Примечание: * - достоверные отличия от контроля для р<0.01; ** -достоверное отличие от ТРО для МПА (р<0.05).

Таблица 6.

Противоопухолевая активность Мецигестона при пероральном введении в

Гпуппа Лоза Масса опухоли ТРО. %

Контроль - 614+77.8 -

Мецигестон 0.5 917.51189.5 +49*.**

1.0 675.81155.1 +10*'**

2.0 430.81128.9 30**

МПА 1.0 205.0171.7 55**

2.0 187.1173.7 55**

Примечание: * - знак "+" означает стимуляцию роста опухоли, **- р<0.05 по отношению к контролю.

Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что Бутерол в дозе 1 мг/мышь тормозит рост опухоли РШМ-5 на 73%, тогда как препарат сравнения МПА в той же дозе - на 55% (табл. 5). Эти данные показывают, что Бутерол при пероральном применении обладает противоопухолевой активностью в отношении РШМ-5, причем по терапевтическому эффекту он превосходит препарат сравнения МПА. Влияние Мецигестона (табл. 6) на рост опухоли РШМ-5 зависит от дозы. В меньших дозах Мецигестон стимулирует рост опухоли, тогда как в дозе 2 мг/мышь он достоверно (на 30%) тормозит его.

Таким образом, в данной части исследования показано, что все изучаемые гестагены дозозависимо ингибируют репликативные процессы в опухолевых клетках, подавляют их рост и биосинтетическую активность. Цитостатическое действие гестагенов максимально проявляется на 6 сутки инкубации с опухолевыми клетками, максимально действующая концентрация - 10"5М, минимально действующая - 10"7М. Синтетические гестагены Бутерол и

Мецигестон обладают более выраженным цитостатическим действием, чем прогестерон.

Выявленный в наших исследованиях антипролиферативный эффект прогестерона и новых гестагенов согласуется с литературными данными. В работе [Diaz-Perez М. et al., 1996] прогестерон дозозависимо ингибировал включение 3Н-тимидина в ДНК клеток HeLa, в работе [Mizukami Y. et al., 1991] - в ДНК клеток MCF-7. Нами впервые выявлен антипролиферативный эффект нового гестагена Мецигестона и цитостатический эффект Бутерола по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток HeLa и MCF-7.

Можно предположить, что ингибирование роста клеток в присутствии гестагенов обусловлено замедлением репликативных процессов. Клетки переходят в секреторную фазу или фазу дифференцировки, запускается каскад ферментативных реакций, приводящий с течением времени к гибели клеток [Purmonen S. et al., 2002]. На это указывает и тот факт, что цитостатическое действие гестагенов развивается на 4-6 сутки инкубации. В отличие от гестагенов, доксорубицин в концентрации 5*10"6М вызывает торможение роста клеток на 60% уже при 2-х суточной инкубации в клетках MCF-7/WT. Следовательно, для осуществления цитостатического эффекта доксорубицина должно пройти около 2-х клеточных циклов. Поэтому цитостатический эффект гестагенов не связан с алкилирующим действием на ДНК опухолевой клетки, иначе процент погибших клеток был бы высок уже при 48-часовой инкубации, как это происходит в случае классических цитостатиков. По данным [Thuneke I. et al., 2000], синтетический гестаген МПА, использованный в нашей работе в качестве препарата сравнения, оказывает на клетки линии рака молочной железы человека T-47D двухфазное действие: при инкубации в течение 24 и 48 часов - стимулирует пролиферацию, а при 72 ч - ее ингибирует.

Одной из мишеней действия гестагенов в опухолевых клетках является так называемый G protein-coupled receptor (GPR)30 — рецептор, ассоциированный с G-белком 30. Некоторые исследователи [Ahola Т. et al., 2002] считают, что ап-регуляция этого рецептора гестагеном МПА ведет к инактивации ERK-1 и ERK-2, вследствие чего МПА индуцирует клеточную гибель. ERK-1 и ERK-2 являются МАР-киназами (Mitogen-activated protein kinase) - ключевыми ферментами, регулирующими сигнальные каскады реакций, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации и клеточной гибели.

Среди основных МАР-киназ, представленных в тканях человека, МАР-киназы ERK-1 и ERK-2 наиболее свойственны клеткам рака молочной железы [Santen R. et al., 2002]. Важно отметить, что снижение активности ERK-1 и -2 наблюдается через 23 часа после введения МПА, так что клеточная гибель, регистрирующаяся МТТ-тестом на 6 сутки инкубации, является результатом не только изменения активности киназ, но и других клеточных процессов, регулируемых гестагенами.

Сравнивая цитостатическую активность Мецигестона и Бутерола на клеточных культурах и на перевиваемой опухоли РШМ-5, можно заключить, что in vitro более эффективен Мецигестон, a in vivo - Бутерол.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ГЕСТАГЕНОВ.

На основании имеющихся экспериментальных данных о влиянии прогестерона на систему МЛУ, было выдвинуто предположение о наличии химиосенсибилизирующей активности у синтетических гестагенов, производных прогестерона. С целью выявления химиосенсибилизирующей активности гестагенов изучали влияние гестагенов на цитостатическое действие доксорубицина в опухолевых клетках.

Влияние гестагенов в комбинации с доксорубицином на жизнеспособность опухолевых клеток MCF-7 и Hela

В качестве объектов исследования использовали чувствительные и резистентные к доксорубицину клетки MCF-7 и клетки HeLa. Показано, что максимальное усиление цитостатического действия доксорубицина наблюдалось при 6-суточной инкубации с гестагенами в концентрации Данные о влиянии прогестерона и синтетических гестагенов в комбинации с доксорубицином представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Усиление цитостатического действия доксорубицина (%) в присутствии гестагенов в разных культурах клеток при инкубации 6 суток.

Препарат MCF-7/WT МСР-7/Я HELA

Прогестерон, 10_iM 39* 24* 108.9*

Прогестерон, 10"6М 24* Нет усиления 13

Прогестерон, 10"'М Нет усиления Нет усиления 6*

МПА, 10"5М 47* 51* 55.5*

МПА, КГ'М 43* Нет усиления 29*

МПА, 10"7М 43* Нет усиления 13*

Бутерол, 10'5М 30* 47* 105*

Бутерол, 10" М 31* 13 10*

Бутерол, 10"7М 32.5* Нет усиления 10*

Мецигестон, 10' М 52.5* 54* 102*

Мецигестон, 10~6М 29* Нет усиления 20*

Мецигестон, 10"'М 19* Нет усиления 9*

Примечание: * - достоверно при Р<0.05.

Наибольшим химиосенсибилизирующим действием в клетках МСЕ-7Л1 обладали Мецигестон и Бутерол, в клетках МСР-7/\УТ - МПА, в клетках НеЬа - прогестерон. Однако, Бутерол усиливал цитостатическое действие доксорубицина в более широком диапазоне концентраций, чем препараты сравнения.

Кроме того, как было показано в предыдущей главе, Бутерол наиболее эффективен среди тестированных гестагенов при пероральном введении. На основании этих данных, дальнейшие исследования были направлены на изучение молекулярных механизмов химиосенсибилизирующей активности Бутерола как наиболее перспективного соединения для внедрения в клинику.

В следующей линии экспериментов было изучено влияние Бутерола на рост опухолевых клеток гормон-зависимых и гормон-независимых опухолей в присутствии противоопухолевых препаратов Этопозида, являющегося ингибитором топоизомеразы, и Vinca-алкалоида Винкристина, являющегося ингибитором митоза.

Влияние Бутерола в комбинации с этопозидом на жизнеспособность опухолевых клеток MCF-7, Hela

Для оценки сенсибилизирующей активности Бутерола по отношению к другому соединению — представителю класса ингибиторов топоизомеразы II -Этопозиду, клетки HeLa и MCF-7 инкубировались с Бутеролом, этопозидом и с их комбинацией. Предварительно была проведена оценка влияния этопозида в диапазоне концентраций (0.001-0.2 мг/мл) на жизнеспособность опухолевых клеток (Рис. 1). Полученные данные показали примерно одинаковую чувствительность клеток обоих типов к этопозиду с 1С50 = 0,01 мг/мл.

этопозидом.

Примечание. А,- Влияние Бутерола (10~5М) и его комбинации с этопозидом (0,01 мг/мл) на жизнеспособность клеток НеЬа. Б,- Влияние Бутерола (10'5М) и его комбинации с этопозидом (0,01мг/мл) на жизнеспособность клеток МСБ-7. * - достоверное отличие от контроля при Р<0,05, * достоверное отличие от значения «Этопозид» при Р<0,05.

Можно видеть, что в клетках НеЬа при концентрации этопозида 0.01 мг/мл Бутерол усиливает его цитостатическую активность на 31%. В клетках МСР-7 Бутерол усиливает цитостатическое действие этопозида на 39%.

Таким образом, Бутерол обладает химиосенсибилизирующей активностью по отношению к этопозиду, препарату, относящемуся к другому классу противоопухолевых средств — ингибиторам топоизомеразы, действующим на процессы репликации ДНК, в отличие от доксорубицина, который вызывает расщепление ДНК вследствие образования свободных радикалов. Химиосенсибилизирующая активность Бутерола на перевиваемом остром лейкозе мыши Р388, резистентном к винкристину.

Изучение Бутерола как потенциального химио сенсибилизатора было продолжено на модели гормононезависимой резистентной опухоли (острый лимфолейкоз мыши Р388, резистентный к винкристину). Для выявления

химиосенсибилизирующей активности Бутерола на перевиваемом остром лимфолейкозе мыши Р388, резистентном к винкристину, сравнивали противоопухолевую активность винкристина как самостоятельного препарата с противоопухолевой активностью винкристина в комбинации с Бутеролом (Рис. 2).

Рис. 2. Противоопухолевое действие Бутерола в комбинации с винкристином на перевиваемом лимфолейкозе мыши Р388, резистентного к винкристину

Примечание. Мышам линии DBA2 прививали лимфолейкоз Р388, устойчивый к винкристину, по схеме: 2 млн. клеток /мышь, на следующий день группе «Винкристин» (7 мышей) вводили винкристин 1 мкг/г внутрибрюшинно (20 мкг/мышь), группе «Винкристин + Бутерол» (7 мышей) винкристин 1 мкг/г внутрибрюшинно (20 мкг/мышь), и через 2 часа Бутерол 1мг/мышь в масле перорально. Контрольная группа (7 мышей) получала масло перорально. На 7 день после прививания подсчитывали нарастание опухоли по количеству опухолевых клеток в асцитной жидкости.

Можно видеть, что в контрольной группе опухоль увеличилась на 185 %, во 2-й группе - на 80 %, в 3-й - на 35 %. Результаты показывают, что Бутерол в дозе 1мг/мышь проявляет химиосенсибилизирующее действие, повышая цитостатический эффект винкристина на 16% и ингибируя в комбинации с винкристином рост опухоли на 53 %. Винкристин как самостоятельный препарат ингибирует рост опухоли на 37 %.

Таким образом, Бутерол на 25% (Р<0.001) усиливает противоопухолевое действие винкристина в отношении гормононезависимого резистентного острого лимфолейкоза мыши Р388, что свидетельствует о способности Бутерола оказывать химиосенсибилизирующее действие независимо от наличия рецепторов к прогестерону.

Влияние гестагенов на транспортную функцию Р-гликопротеина в опухолевых клетках.

Активность Р-гликопротеина в клеточных культурах определялась с помощью флуоресцентного красителя родамина 123. Родамин 123 является специфическим субстратом Р-гликопротеина, в связи с чем степень ингибирования транспорта родамина 123 из клетки потенциальными модуляторами соответствует степени ингибирования активности Р-гликопротеина.

Влияние гестагенов на активность Р-гликопротеина оценивали в опухолевых клетках, гиперэкспрессирующих Р-гликопротеин. Классической моделью для изучения активности Р-гликопротеина являются клетки рака гортани человека Нер-2, резистентные к винкристину (Нер-2/11). Параметры ингибирования Р-гликопротеина представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Параметры Я-1 для новых гестагенов и препаратов сравнения в опухолевых

Мецигестон, ЮмкМ 1.22

Бутерол, ЮмкМ 1.77

Прогестерон, ЮмкМ 0.63

МПА, ЮмкМ 1.79

Мифепристон, ЮмкМ 1.29

Циклоспорин, 0,002мкМ 2.0

Верапамил, ЮОмкМ 0.55

Примечание: параметр Н-1 равен отношению контрольной и ингибированной скоростей выхода родамина 123, за вычетом пассивного транспорта (принятого за единицу), и характеризует степень ингибирования скорости выхода родамина 123 из клеток в присутствии модулятора.

Чем больше показатель 11-1, отражающий снижение скорости выхода родамина 123 из клетки, тем больше степень ингибирования активности Р-гликопротеина. Как видно из табл. 8, наибольшим среди гестагенов ингибирующим эффектом на клетки линии Нер-2/Л обладают Бутерол и МПА.

Ингибирующие эффекты были изучены и в других линиях опухолевых клеток. В клетках МСР-7ЛУТ Бутерол в концентрации 10"5М не ингибировал активность Р-гликопротеина, в клетках МСР-7Л1 ингибировал с Я-1 = 0.28. Мецигестон ингибировал активность Р-гликопротеина в клетках МСР-7Л1 в 2 раза эффективнее Бутерола с 11-1 = 0.48. Циклоспорин ингибировал Р-гликопротеин с наибольшей константой Я-1 = 1.34. МПА и мифепристон (1Ш 486) ингибировали активность Р-гликопротеина в клетках МСР-7/\¥Т с К-1 0.76 и 0.96 соответственно.

Таким образом, константы ингибирования скорости выхода родамина 123 для всех модуляторов ниже в клетках МСР-7, чем в клетках Нер-2. Однако, принимая во внимание, что базальная скорость выхода родамина 123 в 3 раза выше в клетках МСР-7/Я по сравнению с клетками МСР-7/\УТ и Нер-2/11, эффект ингибирования сохраняется. В клетках рака гортани человека МПА и Бутерол в равной степени ингибировали активность Р-гликопротеина. В клетках рака молочной железы преимуществом обладает Мецигестон. Наиболее полно описанный в литературе МЛУ-модулятор и ингибитор Р-гликопротеина верапамил, в концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию Бутерола и Мецигестона (100 и 10 мкМ соответственно) ингибировал активность Р-гликопротеина в клетках Нер-2/К в 3.2 раза менее эффективно, чем Бутерол и в 2.2 раза менее эффективно, чем Мецигестон.

Полученные результаты однозначно демонстрируют способность гестагенов ингибировать Р-гликопротеин, причем в большей степени, чем препараты сравнения - верапамил и циклоспорин.

Влияние гестагенов на аккумуляцию доксорубицина в опухолевых клетках.

В подтверждение гипотезы об ингибиторном действии гестагенов на активность Р-ГП исследовали аккумуляцию доксорубицина в опухолевых клетках с помощью конфокальной лазерной микроскопии с использованием сканирующего конфокального микроскопа LSM-5 Pascal.

Анализ влияния синтетических гестагенов - производных прогестерона на аккумуляцию доксорубицина был проведен в опухолевых клетках MCF-7 и HeLa. Существенным отличием между ними является различная чувствительность к доксорубицину. Известно, что клетки линии HeLa более восприимчивы к цитостатическому действию доксорубицина в течение длительной инкубации, так как практически не экспрессируют Р-гликопротеин, а клетки MCF-7/R менее чувствительны к доксорубицину ввиду высокой экспрессии Р-гликопротеина [Weaver S, et al., 1991].

На рис. 3 и рис. 4 представлены фотографии клеток MCF-7 и HeLa соответственно, промытые средой после 15-минутной инкубации с доксорубицином в концентрации 5*10"4М. Клетки HeLa аккумулировали и удерживали после промывки доксорубицин, в то время как клетки MCF-7 не содержали препарат, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания.

1 м— -

мй^Ш J

~ s ■ * ^«L : : V шм |1Ш1||||

¡••-¿^ ; «g,

ешнмннИ

¡1МЯ

1 "¡fÄ -

Рис. 3. Клетки MCF-7, промытые после инкубации с доксорубицином (5*10"4М) в течение 15 минут. Фотография с микроскопа LSM-5 Pascal.

Рис. 4. Клетки HeLa, промытые после инкубации с доксорубицином (5*10"4М) в течение 15 минут. Фотография с микроскопа LSM-5 Pascal.

При предварительной инкубации клеток с гестагенами МПА и Бутеролом в течение 2 суток, доксорубицин (5*10"5 М конечная концентрация, инкубация с клетками 15 минут) накапливается в большей степени, чем в опытах в отсутствие гестагенов (Р<0.05). О степени накопления доксорубицина в клетках судили по интенсивности флуоресценции доксорубицина внутри клетки. В

клетках МСР-7 гестагены МПА и Бутерол увеличили накопление доксорубицина на 60% и 80% соответственно, а дидрогестерон (аналог природного прогестерона) и прогестерон практически не влияли на него (Таблица 9).

Таблица 9.

Влияние гестагенов на аккумуляцию доксорубицина в клетках МСР-7Л1 и НеЬа.

1фл, М±т,%. Контроль Дидрогестерон МПА Прогестерон Бутерол

MCF-7/R 100 ±8 87 ±4 159 ±8* 94 ±8 179 ±6*

HeLa 100 ±8 211 ±10* 100 ± 12 100 ±4 215 ±6*

Примечание: контроль - аккумуляция доксорубицина в отсутствие гестагенов - 100%. *- достоверное отличие от контроля при Р<0.05

В чувствительных к доксорубицину клетках HeLa, практически не экспрессирующих Р-гликопротеин, Бутерол и дидрогестерон значительно увеличили аккумуляцию доксорубицина, что может быть связано с ингибированием белков-траспортеров МЛУ, например, MRP1, или неспецифическим действием на клеточную мембрану. Таким образом, по увеличению аккумуляции и удержания доксорубицина в клетках, показана сенсибилизирующая активность синтетических гестагенов.

Влияние гестагенов на экспрессию мРНК Р-гликопротеина в опухолевых клетках. Для оценки влияния Бутерола и других гестагенов на экспрессию мРНК Р-гп (MDR-1 ген), клетки культур HeLa и MCF-7 (чувствительного и резистентного к доксорубицину типов) инкубировались с исследуемыми веществами в течение 2, 4, 6 и 10 суток. С помощью реал-тайм ПЦР определяли изменение экспрессии мРНК MDR1 гена по сравнению с контролем - клетками, инкубировавшимися в тех же условиях без добавления соединений. Полученные данные представлены в таблице 10.

Таблица 10.

Влияние гестагенов на экспрессию мРНК Р-гликопротеина в опухолевых клетках.

Гестагены Клетки HeLa Клетки MCF-7/WT Клетки MCF-7/R

дни инкубации дни инкубации дни инкубации

2 4 6 10 2 4 6 10 2 4 6 10

МГ -2* 2* -2* -4* 2* 2* 7* 7* 88* 41* 108* 70*

МПА -2* -2* -4* -3* 44* -1 -2* -2* 91* 101* 88* 35*

БУТ 1 -6* -18* 5* 1 1 -1 -4* 84* 53* 78* 72*

АМП -4* -2* -9* -11* -1 -1 2* -3* 164* 40* -12* 19*

ПРОГ 28* 17* 8* 5* 1 1 -2* -1 22* 67* 9* 535*

Примечание: концентрация гестагенов составляла 10~5М. Представленные значения -изменение экспрессии мРНК Р-гп в количество раз, рассчитанное по формуле R=2'(r'cp ог'р"ж,<-аср контроль)^ _ уменьшение экспрессии. МГ-мегестрола ацетат, МПА -

медроксипрогестерона ацетат, БУТ-Бутерол, АМП-ацетомепрегенол, ПР - прогестерон.

* - достоверное отличие от контроля при Р<0,05.

Уровень экспрессии мРНК Р-гп под действием гестагенов меняется неоднозначно. В культуре HeLa наблюдается общая тенденция к его снижению под влиянием мегестрола ацетата, МПА и Бутерола. Прогестерон увеличивал экспрессию мРНК Р-гп.

В MCF-7/WT все гестагены, кроме МГА, снижают экспрессию Р-гликопротеина, но на 4-6 сутки инкубации. МГА увеличивает экспрессию MDR1 гена на протяжении всего срока инкубации в среднем в 4.5 раза.

В клетках MCF-7/R наблюдается увеличение экспрессии MDRlreHa под действием всех исследуемых веществ на протяжении всего срока инкубации, однако наименьшая индукция экспрессии происходит на 6 сутки инкубации, тогда же, когда и развивается химиосенсибилизирующий эффект, показанный в МТТ-тесте.

Таким образом, в чувствительных к цитостатикам клетках гестагены Бутерол и МПА способны подавлять экспрессию Р-гп, а в резистентных клетках, наоборот, стимулируют его экспрессию. Данные совпадают с данными ряда работ, в которых оценивалось влияние прогестерона на экспрессию мРНК Р-гликопротеина [Fukuda Н., 2007; Coles L., 2009]. Поэтому механизм химиосенсибилизации гестагенами скорее всего не связан с подавлением синтеза мРНК Р-гп.

Влияние гестагенов на экспрессию мРНК MRP1 в опухолевых клетках.

При инкубации клеток с гестагенами в течение 1-12 суток было показано, что в клетках HeLa гестагены стимулировали экспрессию мРНК MRP1, а в клетках MCF-7 - подавляли, но только начиная с 6 суток инкубации (Рис. 5).

Рис. 5. Влияние гестагенов на экспрессию мРНК МЯР1 в клетках МСР-7/Л. Примечание к рис. 5, 6: концентрация гестагенов составляла 10~5М. Представленные значения - изменение экспрессии мРНК Р-гп в количество раз, рассчитанное по формуле к=2-(&ср обракц-АСР контроль)^ _ уменьшение экспрессии. МГ-мегестрола ацетат, БУТ -

Бутерол, АМП - ацетомепрегенол, ПР - прогестерон.

Отсроченный эффект гестагенов на экспрессию мРНК гена MRP1, совпадающий с развитием химиосенсибилизации в МТТ-тесте, означает рецепторный механизм регуляции гестагенами экспрессии белков, ответственных за МЛУ.

Влияние гестагенов на экспрессию BCRP в клетках MCF-7.

В отличие от мРНК MRP1, экспрессия которого снижалась только на 4-е сутки инкубации, мРНК другого значимого фактора МЛУ - BCRP (breast cancer resistance protein) - подавлялась в присутствии гестагенов в значительной степени и при всех сроках инкубации. Данные о влиянии Бутерола и других гестагенов на уровень экспрессии мРНК BCRP представлены на рис. 6.

Рис. 6. Влияние гестагенов на уровень экспрессии BCRP в клетках MCF-7/R.

На 6 день инкубации с Бутеролом выявлено максимальное снижение уровня экспрессии BCRP - в 576 раз, тогда как ацетомепрегенол уменьшал уровень экспрессии в 97 раз, мегестрола ацетат в 14 раз, а прогестерон - в 317 раз. Представленные данные свидетельствуют об участии механизма даун-регуляции гена BCRP в химиосенсибилизирующем действии гестагенов. Влияние гестагенов в комбинации с доксорубицином на клеточный цикл опухолевых клеток.

Синергизм в действии доксорубицина и гестагенов отразился на клеточном цикле опухолевых клеток. В таблице 11 представлены данные о влиянии комбинации гестагенов с доксорубицином на клеточный цикл клеток MCF-7/R при 6-суточной инкубации.

Таблица 11.

Распределение опухолевых клеток MCF-7/R по фазам клеточного цикла (%) при инкубации с гестагенами в концентрации 10-5М в течение 4 суток и последующей инкубацией с доксорубицином в течение 2 суток в концентрации 5*10"6М.

Препарат Сутки Фаза Gl Фаза S Фаза G2/M

Контполь 6 46.7 23.3 30

Шогестеоон +Д 4 + 2 45.5 24.2 30.3

Мецигестон + Д 4 + 2 20.7* 43.1* 36.2*

МПА + Д 4 + 2 30.6* 37* 32.4

Бутеоол + Л 4 + 2 15.7* 41.4* 42.9*

Локсооубицин 2 59.7* 17.7* 22.6*

Примечание: Контроль - распределение клеток по фазам клеточного цикла в отсутствие препаратов; Доксорубицин - при инкубации с доксорубицином в течение 2 суток в концентрации 5*10'6М; Погрешность значений не превышает 2%. * - достоверное отличие от контроля при Р<0.001. Продолжительность клеточного цикла — 22 часа.

Так как при такой схеме инкубации гестагены действуют 6 суток, когда развивается их максимальный цитотоксический эффект, в пробах было много погибших клеток, о чем свидетельствует большой процент клеток в модальном канале пика от клеток с менее, чем диплоидным количеством ДНК. Из данных таблицы 11 следует, что все гестагены при такой схеме инкубации достоверно изменяют процентное содержание клеток в разных фазах клеточного цикла. При воздействии доксорубицина в комбинации с прогестероном, МПА, Мецигестоном и Бутеролом, активно пролиферирующих клеток (фаза 01) становится на 14.2%, 29.1%, 39% и 44% меньше соответственно, чем при воздействии доксорубицина как самостоятельного препарата. Достоверно увеличивается процент клеток в синтетической фазе и фазе С2/М. Так, в присутствии прогестерона, МПА, Мецигестона и Бутерола количество клеток в фазе Б возрастает на 6.5%, 19.3%, 25.4% и 23.7% соответственно, в фазе в2/М -на 7.7%, 9.8%, 13.6% и 20.3% соответственно. Препарат сравнения прогестерон практически не изменяет влияние доксорубицина на клеточный цикл клеток МСР-7/Я.

Таким образом, синтетические гестагены Мецигестон и Бутерол в достоверно большей степени влияют на эффект доксорубицина, чем эндогенный гормон прогестерон и препарат сравнения МПА. Мецигестон в большей мере способствует переходу клеток в фазу Б, тогда как Бутерол - в фазу в2/М.

При анализе результатов 6-суточной инкубации гестагенов с доксорубицином (таблица 11) возник вопрос о том, при каком времени инкубации гестагены начинают воздействовать на цитостатический эффект доксорубицина, то есть какова временная зависимость эффекта влияния гестагенов на изменения в клеточном цикле, вызванные доксорубицином. Для решения этого вопроса инкубацию проводили в течение меньшего времени.

Было проведено сравнение распределения опухолевых клеток МСР-7/11 в трех пробах: при их инкубации с Бутеролом и доксорубицином в течение 2 суток, при инкубации клеток в присутствии прогестерона и доксорубицина в течение 2 суток и контрольная проба с клетками МСР-7/11, инкубировавшимися в присутствии доксорубицина в течение 2 суток (табл. 12).

Таблица 12.

Распределение опухолевых клеток МСР-7/Я по фазам клеточного цикла (%) при инкубации с гестагенами в концентрации в комбинации с

----------------------------------------С*1Л"6\Т „ О-------

Фаза клеточного цикла Препарат в С2/М

Конто т. 40 Я 77 7

Прогестерон 40.4 25.6 34

Бутерол 31.5* 22.4* 46.1*

Примечание: Контроль - распределение клеток при инкубации с доксорубицином течение 2 суток в концентрации 5*10'6М; Погрешность значений не превышает 2%. * достоверное отличие от контроля при Р<0.05

Можно видеть, что при инкубации клеток МСР-7/Я с Бутеролом и доксорубицином в течение 48 часов (2 суток), влияние Бутерола на клеточный цикл уже регистрируется. Кроме того, только в пробе с Бутеролом происходит достоверное накопление клеток в фазе в2/М.

Ниже проиллюстрированы результаты по измерению распределения опухолевых клеток МСР-7Л1 по фазам клеточного цикла (%) при инкубации с гестагенами в концентрации 10"5М в комбинации с доксорубицином в

концентрации 5*10" М в течение 2 суток (Рис. 7).

Рис 76 Бутерол +доксорубицин, 48 часов

-si

.g2/m

Рис. 7. А - Распределение опухолевых клеток MCF-7/R по фазам клеточного цикла (%) при инкубации с доксорубицином в концентрации 5*10 М в течение 2 суток. Б - Распределение опухолевых клеток MCF-7/R по фазам клеточного цикла (%) при инкубации с Бутеролом в концентрации в комбинации с

доксорубицином в концентрации 5*10~6М в течение 2 суток.

Примечание к рис. 7: <2С - модальный канал пика от клеток с менее, чем диплоидным количеством ДНК (фрагменты ДНК); 2С - модальный канал пика от клеток с диплоидным количеством ДНК; 4С - модальный канал пика от клеток с тетраплоидным количеством ДНК.

Представленные данные демонстрируют, что в присутствии Бутерола (Рис. 7Б) пик от клеток с тетраплоидным количеством ДНК (4С) более выражен, чем в контрольной пробе (Рис. 7А), что означает развитие эффекта С2/М-блока только в присутствии комбинации Бутерола и доксорубицина. Полученные результаты по оценке влияния гестагенов на клеточный цикл опухолевых клеток выявили эффект G2/M - блока при инкубации клеток с комбинацией гестагенов и доксорубицина, наиболее выраженный в случае Бутерола.

Итак, в данном разделе работы для исследования молекулярных механизмов химиосенсибилизирующей активности гестагенов прежде всего изучали химиосенсибилизирующее действие Мецигестона и Бутерола in vitro. Для этого оценивали цитостатический эффект доксорубицина и этопозида как самостоятельных препаратов и в комбинации с гестагенами в опухолевых клетках MCF-7 и HeLa.

Установлено, что при комбинированном использовании доксорубицина и гестагенов наблюдается усиление цитостатического эффекта доксорубицина во всех клеточных линиях. Эффект усиления развивается на 6 сутки инкубации с клетками при одновременном введении гестагенов и доксорубицина. Процент усиления цитостатического действия доксорубицина зависит от концентрации гестагенов и максимален при концентрации 10"5М.

Рядом авторов [Атасси Г., Жиро Б., 2000] было предложено несколько возможных схем химиотерапии резистентных опухолей:

1) восстановление чувствительности опухолевых клеток к определенным цитостатическим препаратам (например, к доксорубицину при раке молочной железы).

2) при неэффективности химиотерапии проведение повторного курса в комбинации с препаратом-модулятором.

3)назначение препаратов-модуляторов перед проведением курса химиотерапии.

Для изученных соединений гестагенного ряда наиболее адекватна схема 2,

так как только при их одновременной инкубации с доксорубицином или этопозидом развивается эффект химиосенсибилизации. Нами установлено, что синергизм в цитостатическом действии гестагенов и доксорубицина имеет место как в резистентных, так и в чувствительных клетках MCF-7.

Нами впервые выявлен эффект синергизма на культуре HeLa. При оценке цитостатического действия новых гестагенов и препаратов сравнения выявлено преимущество новых гестагенов - Мецигестона и Бутерола - над прогестероном и МПА во всех клеточных культурах. Бутерол также увеличивает цитостатический эффект этопозида - ингибитора топоизомеразы -на 15-20%.

Изучение Бутерола in vivo как потенциального химиосенсибилизатора было продолжено на модели резистентной к винкристину, гормоннезависимой опухоли лимфолейкоза мыши. Бутерол в дозе 1мг/мышь проявляет химиосенсибилизирующее действие, повышая цитостатический эффект винкристина и ингибируя в комбинации с винкристином рост опухоли. Винкристин как самостоятельный препарат ингибирует рост опухоли. Так как данная опухоль не содержит рецепторов прогестерона [Diaz G. et al., 2001], химиосенсибилизирующая активность Бутерола опосредована не рецепторно, а за счет взаимодействия с факторами МЛУ, в результате повышается чувствительность клеток к винкристину.

Следующий этап работы был направлен на изучение возможных механизмов эффекта синергизма в цитостатическом действии доксорубицина и гестагенов, этопозида и гестагенов, винкристина и Бутерола. Связан ли этот эффект с влиянием гестагенов на систему МЛУ или опосредован через какие-то другие механизмы - ответ на этот вопрос можно было получить, изучив взаимодействие Мецигестона и Бутерола с наиболее хорошо изученным фактором МЛУ - Р-гликопротеином.

Нами показано, что гестагены способны ингибировать активность Р-гликопротеина. Ингибиторами Р-гликопротеина, упоминающимися многими авторами, исследующими проблему МЛУ, являются верапамил и циклоспорин.

Несмотря на длительное изучение этих препаратов в качестве потенциальных химиосенсибилизаторов, в клинической практике с целью повышения эффективности химиотерапии они не используются [Cianfrinlia M. et al., 2002]. Воздействуя на отдельные факторы МЛУ, потенциальные химиосенсибилизаторы, как правило, не обладают цитостатическим эффектом, и, кроме того, вызывают ряд побочных эффектов. Например, верапамил в дозе, позволяющей достигнуть повышения цитостатического эффекта доксорубицина, негативно влияет на сердечно-сосудистую систему, вызывая аритмии [Cianfrinlia M. et al., 2002], что в сумме с кардиотоксическим действием доксорубицина [Kalivendi S. et al., 2001] может привести к летальному исходу. Циклоспорин угнетает иммунную систему онкологических больных; его аналог, препарат PSC 833 синтезированный фирмой «Novartis», не обладает иммунносуппрессивным действием, но нейротоксичен [Cianfrinlia M. et al., 2002].

На наш взгляд, целесообразнее вести поиск химиосенсибилизаторов среди уже используемых в онкотерапии лекарственных средств. Так, ингибитором Р-гликопротеина является герцептин [Fox Е. , Bates А., 2007], но герцептин эффективен только для НЕ112-позитивных опухолей. В отличие от циклоспорина, верапамила и целого ряда их аналогов, исследующихся во всем мире в качестве перспективных химиосенсибилизаторов, гестагены применяются в онкологической практике и не обладают токсичностью в высоких дозах. Так, даже в дозе 7.5 г/сутки синтетический гестаген, аналог Мецигестона и Бутерола, мегестрола ацетат не вызывал побочных эффектов в комбинации с винбластином при назначении больным с различными солидными опухолями [Matin К. et al., 2002].

Таким образом, все изучаемые гестагены ингибируют транспортную активность Р-гликопротеина в опухолевых клетках MCF-7/WT, MCF-7/R, Нер-2/R, причем более эффективно, чем верапамил, хотя и менее эффективно, чем циклоспорин. Наиболее высокие константы ингибирования Р-гликопротеина получены в клетках Hep-2/R. В клетках MCF-7 получены невысокие константы ингибирования. Интересно, что в диком типе клеток MCF-7 Бутерол вообще не ингибировал активность Р-гликопротеина, тогда как в резистентном к доксорубицину - ингибировал. Это означает, что Бутерол способен ингибировать скорость выброса цитостатиков из клеток только в том случае, когда Р-гликопротеин гиперэкспрессирован, не нарушая распределение ксенобиотиков и эндогенных токсических метаболитов в клетках с невысоким уровнем экспрессии Р-гликопротеина. Этим Бутерол выгодно отличается, например, от циклоспорина. Циклоспорин практически полностью блокирует транспортную функцию Р-гликопротеина как в опухолевых, так и в нормальных клетках, например, в эндотелии гематоэнцефалического барьера, гематоплацентарного барьера, кишечника, почек, что приводит к нарушению биодоступности лекарственных соединений, накоплению токсических метаболитов [Cianfriglia M. et al., 2002].

Нами показано, что в чувствительных к цитостатикам клетках гестагены БУТ и МПА подавляют экспрессию Р-гп, а в резистентных клетках, наоборот,

стимулируют его экспрессию. По-видимому, в резистентных клетках MDR1 ген находится в индуцированном состоянии, и любой ксенобиотик, попадающий в клетку, инициирует синтез Р-гп.

Известно, что ингибиторы Р-гликопротеина верапамил, нифедипин и циклоспорин также вызывают стойкую индукцию экспрессии Р-гликопротеина уже при 8-часовой инкубации, и она увеличивается со временем, достигая максимума через несколько недель и быстро исчезая после их отмены [Herzog С. et al., 1993]. Схожим эффектом обладает и эстрадиол, вызывая индукцию экспрессии Р-гликопротеина в клетках MCF-7 [Zampieri L. et al., 2002].

Доступным методом выявления геномной природы цитостатического и химиосенсибилизирующего эффектов изучаемых соединений является исследование их влияния на клеточный цикл опухолевых клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. Нами установлено, что Мецигестон, Бутерол, МПА, прогестерон как самостоятельные препараты способствуют увеличению процентного содержания опухолевых клеток MCF-7/WT и MCF-7/R в фазе синтеза клеточного цикла. Влияние гестагенов на клеточный цикл в комбинации с доксорубицином изучали также на резистентных к доксорубицину клетках MCF-7/R. Показано, что доксорубицин как самостоятельный препарат в концентрации 5*10"бМ не влияет на клеточный цикл клеток MCF-7/R, наибольшее количество клеток при этом находится в фазе Gl (инкубация 2-6 суток). Уже при 2-х суточной инкубации в присутствии комбинации Бутерола и доксорубицина наблюдается эффект перехода клеток из фазы Gl в фазу G2/M, при 6 суточной инкубации с Бутеролом эффект усиливается. Мецигестон оказывает сходное с Бутеролом влияние на клеточный цикл, но менее выраженное.

Интересно, что прогестерон в комбинации с доксорубицином не вызывал достоверно значимых изменений в клеточном цикле клеток MCF-7/R, а препарат сравнения МПА оказывал достоверно меньший эффект. Следовательно, 02/М-блок — явление, развивающееся при совместном применении синтетических гестагенов и доксорубицина. Можно заключить, что с эффектом С2/М-блока связано химиосенсибилизирующее действие Мецигестона и Бутерола. Известно, что в этой фазе клеточного цикла опухолевые клетки наиболее чувствительны к цитостатикам [Wadler S. et al., 1987], так как фаза G2/M - одна из "сверочных точек" клеточного цикла, на этом этапе клетки либо вступают в следующую фазу цикла - митоз, либо клеточный цикл приостанавливается.

Таким образом, рассмотрение возможных механизмов химиосенсибилизирующего действия Мецигестона и Бутерола привело к следующим выводам:

1.) механизмы химиосенсибилизирующего действия Мецигестона и Бутерола связаны с ингибированием активности Р-гликопротеина.

2.) механизмы химиосенсибилизирующего действия Мецигестона и Бутерола в клетках MCF-7 связаны с подавлением экспрессии MRP1 и BCRP.

3.) механизмы химиосенсибилизирующего действия Мецигестона и Бутерола связаны с эффектом 02/М-блока клеточного цикла опухолевых клеток.

ГЛАВА 3. ОБЩИЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОРЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ (МЛУ) И

СА2+-ЗАВИСИМОЙ ЦИКЛОСПОРИН-ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ПОРЫ в МИТОХОНДРИЯХ (МТП) ГЕСТАГЕНАМИ

Вышеизложенные данные свидетельствуют об уникальности действия Бутерола как химиосенсибилизатора. Механизмы действия стероидных гормонов тесно связаны с влиянием на митохондрии - ключевую органеллу клетки, обеспечивающую ее жизнеспособность, поскольку открытие митохондриальной поры является ключевой стадией апоптоза.

АВС-транспортеры защищают клетки от действия цитотоксических веществ и ксенобиотиков, что лежит в основе множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Система Са2+-зависимой циклоспорин-чувствительной поры в митохондриях (МТП) и АВС-транспортеров в клеточной мембране имеют фундаментальное значение в регуляции гомеостаза клеток в норме и в индукции клеточной гибели. В результате проведенных экспериментов выявлены общие механизмы регуляции системы МЛУ и активности митохондриальной поры гестагенами.

Влияние прогестерона и его аналогов на дыхание митохондрий печени крыс.

С целью изучения механизмов влияния Бутерола и других стероидов на митохондрии, прежде всего, исследовали их эффекты на дыхательные параметры митохондрий.

Показано, что Бутерол и МПА не влияют на дыхание митохондрий, тогда как прогестерон дозозависимо ингибирует ЫАО-зависимое дыхание (Рис. 8). А Б

Рис. 8. Влияние прогестинов на АДФ-стимулируемое поглощение 02 при окислении ИАВ-зависимых субстратов.

А - митохондрии печени крыс инкубировались в стандартной КС1-среде. Прогестерон, МПА и Бутерол были добавлены (указано стрелкой) до внесения АДФ (2 мМ). Б - устранение ингибиторного эффекта прогестерона на АДФ-стимулируемое дыхание митохондрий сукцинатом и менадионом. Дыхание митохондрий в присутствии пирувата (4

мМ) и маната (2 мМ) стимулировалось 2 мМ АДФ. Добавки: прогестерон(150 мкМ), менадион (МД, 25 мкМ), сукцинат (4мМ).

Поскольку ингибирование дыхания полностью снималось сукцинатом или менадионом (Рис. 8, Б), мишенью действия прогестерона является I участок дыхательной цепи митохондрий.

Таким образом, Бутерол не влияет на дыхание митохондрий, тогда как прогестерон ингибирует I участок дыхательной цепи митохондрий. Влияние гестагенов на индукцию МТП.

На следующем этапе исследовали влияние гестагенов на индукцию МТП, регистрируя мембранный потенциал и кальциевую емкость митохондрий. Индукция поры ионами Са2+ определяется по падению мембранного потенциала в ответ на последовательные добавки ионов кальция (Рис. 9).

А . контроль

И- / >• ПРОГ

s Т К 1 JaYT

iv 1 МРА /

V+

t t t t t t i i

V Ca+

Рис. 9. Влияние прогестерона и его синтетических аналогов МПА и Бутерола на индуцированное ионами кальция открытие поры.

А. Изменения мембранного потенциала митохондрий, индуцированные ионами кальция в присутствии стероидов. Мембранный потенциал регистрировался ТРР -селективным электродом. Митохондрии печени крыс инкубировались в стандартной KCl-среде в присутствии пирувата и малата.

Б. Статистический анализ влияния прогестерона, МПА и Бутерола на Са2+-емкость митохондрий.

Представленные данные демонстрируют, что Бутерол действует на митохондрии в противоположном направлении, чем прогестерон и МПА. При окислении пирувата с мапатом Бутерол снижал чувствительность митохондрий к ионам Са2+, повышая кальциевую емкость митохондрий более чем в 2 раза, в то время как прогестерон и МПА снижали кальциевую емкость, причем прогестерон более эффективно, чем МПА.

При окислении сукцината в присутствии ротенона добавление гестагенов в концентрации 100 мкМ не приводило к таким изменениям в чувствительности МТП к ионам кальция. В этих условиях сохранялся протекторный эффект Бутерола (2-кратное увеличение Са2+-емкости), в то время как другие гестагены не влияли на открытие МТП.

Более того, Бутерол (100 мкМ) восстанавливал мембранный потенциал митохондрий после открытия поры, действуя подобно ингибиторам МТП циклоспорину и АДФ (Рис. 10 А). Селективный ингибитор аденилаттранслоказы карбоксиатрокилазид (CAT) снимал протекторный

эффект Бутерола (Рис. 10 Б), что указывает на общий сайт действия АДФ и Бутерола на МТП.

аденилаттранслоказы карбоксиатрокилазида (CAT) на открытие МТП (Б).

Мембранный потенциал регистрировался TP Р* -селективным электродом. Митохондрии печени крыс инкубировались в стандартной KCl-среде в присутствии сукцината.

Полученные результаты демонстрируют, что Бутерол, в отличие от прогестерона и МПА, действует как ингибитор кальций-индуцированного открытия поры. В то время как эффект прогестерона типичен для известных токсических эффектов, связанных с индукцией Са2+-зависимой неспецифической поры во внутренней мембране митохондрий, эффект Бутерола более уникален, так как направлен на ингибирование индукции поры.

Обнаруженное нами протекторное действие Бутерола на индукцию митохондриальной поры ионами кальция кажется парадоксальным по отношению к его цитотоксическому действию на опухолевые клетки. Участие митохондрий в цитотоксическом действии различных соединений, как правило, связано с активацией митохондриальной поры, сопровождающейся выходом из митохондрий цитохрома с и индукцией апоптоза. Как следует из наших данных, в этом направлении действуют прогестерон и в меньшей степени МПА. Бутерол, напротив, действует как ингибитор поры. Этот эффект подобен ингибирующему влиянию Бутерола на МЛУ опухолевых клеток.

Сравнение регуляции ABC-транспортеров и митохондриальной поры нуклеотидами демонстрирует их общие свойства, связанные с наличием АДФ-связывающих сайтов.

Влияние синтетических гестагенов и Бутерола на тиол-зависимую продукцию АФК в митохондриях как один из механизмов сенсибилизации клеток к цитостатикам.

Поскольку активность гестагенов существенно зависит от их химической структуры [Schindler et al., 2008], наличие бутаноил-окси- группы при углероде СЗ в молекуле Бутерола (Рис. 11) может придавать ему новые свойства, отличающиеся от свойств прогестерона и его известных аналогов [Калинина Е.В. и др., 2000; Сергеев П.В. и др., 2004].

Progesterone

Medroxyprogesterone acetate

Megestrol acetate

В ule rol

Acelo m epregenol

Рис. 11. Химические структуры прогестерона и его синтетических аналогов.

Одним из возможных механизмов прямого воздействия Бутерола на МТП является взаимодействие карбонильной группы Бутерола с тиоловыми группами аденилатгранслоказы путем образования водородных связей между ними. С целью оценки роли эфирного заместителя при СЗ в реализации этих эффектов было исследовано влияние на МТП структурного аналога Бутерола -АМП (Зр-ацетилокси-6-метил-17а-ацетокси-прегна-4 ,6-диен-20-на), который также содержит карбонильную группу при СЗ. В группу гестагенов, содержащих ненасыщенные кетоновые группы при СЗ, кроме медроксипрогестерона ацетата, был включен мегестрола ацетат.

Для изучения роли структурных различий гестагенов в проявлении их действия на функции митохондрий и химиосенсибилизацию опухолевых клеток, было исследовано их влияние на продукцию АФК в митохондриях. Связывание и окисление тиоловых групп является одним из существенных факторов снижения устойчивости митохондрий к окислительному стрессу. Эффект доксорубицина также в значительной степени опосредуется через редокс-зависимые процессы в митохондриях и клетках. На этом основании было сделано предположение, что тиол-связывающие гестагены могут усиливать действие доксорубицина. В качестве препаратов сравнения использовали тиол-связывающие реагенты Ы-этилмалеимид (ЫЕМ) и 5 ', 5'-дитиобис-(2-нитробензоат) (ОТЫВ). Принципиальное различие между этими реагентами состоит в том, что ЫЕМ проникает через мембрану митохондрий, и соответственно, может связывать тиоловые группы в матриксе и мембране митохондрий, а ОТЫВ не проникает через мембрану и, следовательно, способен связывать тиоловые группы только с внешней стороны мембраны митохондрий.

Сравнительное действие ^М, РТ^ и гестагенов на мембранный потенциал и продукцию АФК митохондриями.

Как показано на Рис. 12, ЫЕМ даже в низких концентрациях (20мкМ) индуцирует образование АФК. В отличие от ИЕМ, ЭТЫВ не влиял на Дут и не стимулировал образование Н202. Бутерол в концентрации 100-200 мкМ, как и ЭТИВ, не влиял на ДЧ'т и продукцию перекиси. Однако, также как и ИЕМ, Бутерол в высоких концентрациях снижал ДЧ'т и активировал продукцию Н202 (Рис. 12, А).

0) 300

о.

а а»

с;

-8- 100

5 °

"Нем*

NEM 20 1утерол400 бутерол 2СЮ " .контроль -DTNB 200

12 15 18 21 24 27

Рис. 12. Влияние Бутерола, NEM и DTNB на продукцию Н202 и супероксид аниона в митохондриях.

А - влияние различных концентраций NEM, DTNB и Бутерола на Н2О2 продукцию, измеряемую по флуоресценции Amplex Red (AR) при инкубации митохондрий в присутствии 4 мМ сукцината и 2 цМротенона. Концентрации NEM, DTNB и Бутерола варьировали в диапазоне 20-400 мкМ.

Б - влияние прогестерона, Бутерола и NEM на продукцию супероксида в митохондриях Показаны кривые люминесценции MCLA (10 мкМ) в митохондриях при окислении пирувата с малатом в присутствии прогестерона, Бутерола и NEM.

В, Г -сравнение действия гестагенов на продукцию супероксид аниона(люминесценция MCLAJ митохондриями при окислении NAD-зависимых субстратов(В) и сукцината в присутствии ротенона (Г).

пируват+малат

gj| Л PW -Эти -in Г^П ¡¡Аш

т lllllll /i

lipil

PI К« -1-

V-0 ^ #

^ /

J ^ /

«к

сукцинат+ротанон

1200 1000

NEM 20 NEM50 NEM 200

бутерол бутврол бутврол

Прог МРА МГА AMP

На рис. 12, Б представлены оригинальные записи продукции супероксид-аниона в присутствии прогестинов, ЫЕМ, и ЭТК'В в суспензии митохондрий, окисляющих пируват и малат. ЫЕМ, Бутерол и прогестерон увеличивали

образование супероксида. Как и ожидалось, максимальная продукция супероксида наблюдалась в присутствии NEM и прогестерона, которые действуют как ингибиторы NAD- зависимого дыхания. NEM в низкой концентрации (20 мкм) и Бутерол (200 мкМ) активировали продукцию супероксида в одинаковой степени.

Сравнение с другими гестагенами (Рис. 12 В, Г) показало, что Бутерол и АМП в концентрации > 200 мкМ значительно увеличивали продукцию АФК в присутствии обоих субстратов, в то время как МРА и МГА не оказывали влияния на продукцию АФК в митохондриях.

Таким образом, по эффективности влияния на продукцию АФК в митохондриях все тестированные соединения можно распределить в порядке убывания следующим образом: NEM > прогестерон > бутерол > ацетомепрегенол > медроксипрогестерон ацетат > мегестрол ацетат > DTNB. Если исключить образование АФК, опосредованное ингибированием комплекса I дыхательной цепи, характерное для NEM и прогестерона, то можно заключить, что Бутерол действует на продукцию АФК аналогично проникающему через мембрану митохондрий тиол-связывающему реагенту NEM, так как оба соединения вызывают продукцию АФК на всех субстратах окисления.

Влияние NEM и Бутерола на жизнеспособность опухолевых клеток и их чувствительность к доксорубицину.

Далее было исследовано влияние NEM и Бутерола на жизнеспособность и чувствительность гормон-зависимых и независимых линий опухолевых клеток: MCF-7 (Рис. 13, A), MCF-7R - эстроген-зависимых опухолей (Рис. 13, Б) и K562/R - гормон-независимая эритролейкемия (Рис. 13, В) резистентная к доксорубицину. Было проведено сравнение влияния NEM и Бутерола на опухолевые клетки MCF-7 и MCF-7/R. Клетки K562/R (эритролейкемия человека, устойчивая к доксорубицину) выступали в качестве модели гормон-независимой опухоли, в то время как MCF-7 и MCF-7R клетки - как модель эстроген-зависимых опухолей.

MCF-7

_ 120 tr 100

контроль NB/I20 NB/I200 DOXO,5 DOX5.0 NEM20+ бутерол бутерол +

DOXO.5 100 00X0,5

Б МСР-7К „

120 ^ 100 О ф 80 с; Ф 60 2 40 | 20 0 I щ Ш м 7 1

контроль ЫЕМ 20 200 00X0.5 ООХ5.0 ЫЕМ20*ООХ бутерол 100 бутерол ♦ ООХ 5.0 5.0

К-562

контроль ЫВЛ 20 N»1200 [Х>Х0,5 [30X5,0 N»20+ бутерол бутерол +

00X0,5 100 1X1X0,5

Рис. 13. Влияние ЫЕМ и Бутерола на индуцированную доксорубицином клеточную гибель. Примечание: выживание клеток (% от контроля) после инкубации в течение 48 часов в присутствии ЫЕМи Бутерола отдельно и в комбинации с доксорубицином (ООХ) определялось МТТ методом. *р < 0.05 и **р < 0.01 между сравниваемыми группами (показано соединительными линиями).

Как показано на рис. 13, ИЕМ индуцировал гибель клеток, при этом эффект зависел от его концентрации. При низкой концентрации (20 мкМ), ЫЕМ заметно усиливал цитотоксическое действие доксорубицина. При сочетанном действии двух соединений, гибель клеток МСР-7 увеличивалась в два раза по сравнению с действием каждого из соединений по отдельности в минимальной эффективной концентрации (Рис. 13, А).

Клетки МСР^^/Т и МСР-7/Я показали одинаковую чувствительность к ЫЕМ и разную чувствительность к доксорубицину как самостоятельному препарату и в сочетании с ЫЕМ. Для получения аналогичного, как в МСР-цитостатического действия доксорубицина в клетках МСР-7/К требовалась в 10 раз большая концентрация доксорубицина, то есть МСР-7Я клетки в десять раз более устойчивы к доксорубицину (Рис. 13, Б). В сочетании с 20 мкМ ИЕМ, эффект доксорубицина (в концентрации 5 * 10-6 М) увеличился на 25%.

Бутерол также увеличивал действие ООХ на клетки, то есть обладал химиосенсибилизирующим действием. В присутствии Бутерола цитостатическое действие доксорубицина увеличивалось на 30% в клетках МСР-7ЛУТ, и на 47% в клетках МСР-7/Я.

Для изучения химиосенсибилизирующего действия NEM и Бутерола на гормононезависимых клетках использовали клеточную культуру K562/R. Клетки этой культуры оказались более чувствительны к NEM (Рис. 13, В). Они также были более чувствительны к комбинированному действию NEM и доксорубицина. Как можно видеть, 20 цМ NEM усиливал цитостатическое действие доксорубицина почти в 5 раз. В то же время, Бутерол усиливал цитостатическое действие доксорубицина на 13%, т.е. был менее эффективен, чем на клеточной линии MCF-7.

Представленные результаты показывают, что синтетический аналог прогестерона Бутерол действует на митохондрии подобно тиол-связывающему соединению NEM. Действие Бутерола, также как NEM и DTNB, может объясняться взаимодействием с SH-группами критических белков. Общей мишенью для NEM и Бутерола являются SH-группы аденилаттранслоказы, которые чувствительны к карбоксиатрактилозиду и локализованы на внешней стороне внутренней мембраны. Связывание этих групп предотвращает открытие поры [Petronilli V. et al., 1994; McStay et al., 2002; Leung A., Halestrap, 2008]. Ответственными за ингибирование, индуцируемое NEM, могут быть также сульфгидрильные группы NADH: убихинон оксидоредуктазы, расположенные на внутренней стороне внутренней мембраны митохондрий [Gostimskaya I. et al., 2006]. Бутерол по своему действию ближе к NEM, чем к DTNB. Более ограниченное действие Бутерола по сравнению с NEM может быть обусловлено разной доступностью определенных тиолов для этих веществ и различными видами их химических взаимодействий с SH-группами.

Существенное различие между Бутеролом (и ацетомепрегенолом) и NEM состоит в том, что NEM содержит активные двойные связи, к которым тиолы или тиол-содержащие вещества могут прикрепляться в результате реакции Михаэля [Chalker J. et al., 2009]. Поэтому NEM способен ковалентно модифицировать цистеин-содержащие белки. Двойные связи Бутерола и ацетомепрегенола значительно менее активны, и включение этих прогестинов в реакцию Михаэля невозможно. Однако, они способны формировать нековапентно связанные комплексы благодаря водородным связям между эфирным карбонилом в позиции СЗ и SH-группами белка, как показано на схеме (Рис. 14).

R=CH3 (Acetomepregenol); (CHj )2CH3(Buterol)

Рис. 14. Схема взаимодействия Бутерола с тиоловыми группами.

Формирование этого комплекса с включением карбонила в позиции С20 или карбонила из 17-ацетотоксила менее вероятны, так как аналогичные группы присутствуют в МРА и мегестрол ацетате, которые не обладают свойствами Бутерола и ацетомепрегенола. Специфические свойства последних хорошо иллюстрируются сравнением их структур со структурой мегестрол ацетата, поскольку единственным различием между ними является наличие эфирных остатков в позиции СЗ. Наибольшая активность Бутерола по сравнению с ацетомепрегенолом связана, вероятно, с более эффективным взаимодействием эфирного карбонила Бутерола с SH-группами благодаря индуктивному влиянию дополнительных метиленовых групп.

Редокс-зависимые процессы, модифицированные NEM и Бутеролом, могут оказывать влияние на повышение чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину. Известно, что одним из механизмов цитотоксического действия доксорубицина является его способность включаться в редокс-цикл за счет реакций одноэлектронного восстановления [Tsang W. et al., 2003; Ravi, Das, 2004]. В клетке хиноновая часть доксорубицина восстанавливается до радикала семихинона, генерируя АФК. Окисление тиолов также участвует в доксорубицин-индуцируемой гибели клеток, в частности, микрофагов [Asmis R. et al., 2005]. Как было показано, только окисленная форма доксорубицина взаимодействует с тиолами: окисленный доксорубицин, но не его восстановленные радикалы семихинона, реагируют с глутатионом, образуя радикалы глутатиона [Muraoka S., Miura, 2004]. На основании этих и наших данных, демонстрирующих усиление эффекта доксорубицина в присутствии NEM или Бутерола в клетках, можно предположить, что связывание тиоловых групп с последующей стимуляцией продукции АФК усиливает цитотоксичность доксорубицина.

Кроме того, в клетках NEM и доксорубицин оказывают одинаковое действие на тиоловые группы TOP II — главную клеточную мишень для доксорубицина и других противоопухолевых препаратов. Было показано, что NEM, как и доксорубицин, способен индуцировать ТОР П-опосредованное расщепление DNA, связывая тиоловые группы этого фермента [Wang H. et al., 2001].

Синергизм, подобный обнаруженному нами для доксорубицина в комбинации с NEM или Бутеролом, наблюдался в действии NEM в комплексе с цитокином PDGF-BB на продукцию АФК в сосудистых гладкомышечных клетках [Yellaturu С. et al., 2002]. Применение одного NEM в концентрации 20 цМ и в комбинации с цитокином PDGF-BB усиливало продукцию АФК в этих клетках в 2 и 5 раз, соответственно, и приводило к блокаде PDGF-BB-индуцированного фосфорилирования BAD и, соответственно, активации апоптоза. Рецепторный сигнал может также вносить вклад в опосредованную Бутеролом гибель клеток, по крайней мере клеток MCF-7, у которых имеются прогестероновые рецепторы. В клетках K562/R, у которых эти рецепторы отсутствуют, эффект Бутерола может быть связан, главным образом, с воздействием на тиоловые группы и, соответственно, на редокс-зависимые системы.

В литературе имеются лишь единичные сведения по поводу оксидантной или антиоксидантной активности прогестинов. Так, было установлено, что МРА в комбинации с безафибратом проявляет антилейкемическую активность при миелоидной лейкемии, и этот эффект связан с активацией генерации АФК в опухолевых клетках [Tiziani S. et al., 2009]. Прогестерон оказывал стимулирующий эффект на генерацию АФК в культурах звездчатых печеночных клеток крысы [Itagaki T. et al., 2005]. С другой стороны, прогестерон и МРА проявляли значительную способность к детоксификации Н202 в клетках рака молочной железы и нормальных эпителиальных клетках молочной железы за счет повышения активности каталазы в этих клетках [Petit Е. et al., 2009]. Поэтому при применении прогестинов важно принимать во внимание их биохимические эффекты, которые могут различаться в зависимости от химической структуры.

Как следует из полученных данных, наличие у прогестинов эфирных остатков в позиции СЗ приводит к появлению новых свойств, таких, как способность связываться с SH-группами. При низких концентрациях и кратковременном воздействии Бутерол, подобно NEM и DTNB, тормозит открытие МТП и, соответственно, снижает апоптоз, что может быть полезным при лечении нейродегенеративных и ишемических заболеваний. При высоких концентрациях и длительном воздействии Бутерол, как и NEM, активирует продукцию АФК и усиливает цитотоксический эффект доксорубицина. На основании этих данных можно заключить, что тиол-блокирующие прогестины, структура которых подобна структуре Бутерола или ацетомепрегенола, являются новой группой прогестинов, потенциально эффективных при указанных патологиях.

Поскольку Бутерол ингибирует пору, действуя на тот же участок, что и АДФ, он также, вероятно, действует на нуклеотид-связывающие домены, ингибируя ABC - транспорт, и соответственно, снижая выход доксорубицина из клетки. Сравнение регуляции АВС-транспортеров и митохондриальной поры гестагенами демонстрирует их общность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Согласно поставленной цели - изучению молекулярных механизмов цитостатического действия гестагенов на опухолевые клетки было проведено комплексное исследование влияния ряда синтетических гестагенов на рост опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур MCF-7 и HeLa. В частности, изучена противоопухолевая активность новых отечественных гестагенов Мецигестона и Бутерола.

Все исследованные гестагены дозозависимо тормозят рост опухолевых клеток, максимальный цитостатический эффект развивается на 6 сутки инкубации с клетками, средняя 1С50 - 10"5М. Мецигестон и Бутерол ингибируют рост клеток в большей степени, чем прогестерон.

Для оценки противоопухолевой активности Мецигестона и Бутерола на мышах исследовали их влияние на рост перевиваемого рака шейки матки

человека РШМ-5. Бутерол (50мкг/кг) ингибирует рост опухоли на 73%, Мецигестон (100мкг/кг) - на 30%, МПА (50мкг/кг) - на 55%.

Механизмы цитостатического действия связаны со снижением экспрессии рецепторов прогестерона и эстрадиола, индукцией апоптоза, торможением митотического цикла.

С целью выявления химиосенсибилизирующей активности гестагенов исследовали их действие на опухолевые клетки в комбинации с цитостатиками. Для изучения Мецигестона и Бутерола как соединений, повышающих эффективность цитостатиков, исследовали их влияние на рост опухолевых клеток MCF-7/R, MCF-7/WT и HeLa в комбинации с доксорубицином. Во всех клеточных линиях выявлен синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина. Синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина в чувствительных к доксорубицину клетках MCF-7/WT и HeLa имеет кумулятивный характер, т.е. цитостатический эффект гестагенов суммируется с цитостатическим эффектом доксорубицина, в резистентных к доксорубицину клетках MCF-7/R синергизм связан с потенциированием гестагенами ослабленного цитостатического эффекта доксорубицина. Важно отметить, что химиосенсибилизирующий эффект гестагенов развивается при одновременном введении в среду инкубации гестагенов и доксорубицина.

С целью изучения механизмов сенсибилизации, изучали влияние гестагенов на факторы МЛУ - активность и экспрессию Р-гликопротеина и других АВС-траспортеров, активность глутатионтрансферазы. Возможные механизмы, обусловливающие синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина в резистентных к доксорубицину клетках MCF-7/R, связаны с ингибированием активности и экспрессии Р-гликопротеина, ингибированием экспрессии BCRP, с эффектом С2/М-блока клеточного цикла и не связаны с ингибированием активности глутатионтрансферазы.

Также показано, что Бутерол усиливает действие другого противоопухолевого препарата - ингибитора топоизомеразы — этопозида на 3140%.

Химиосенсибилизирующий эффект Бутерола имеет универсальный характер, так как наблюдается и в гормононезависимой опухоли лимфолейкоза мыши Р388, резистентной к винкристину. На это указывает также ингибирующий эффект Бутерола и Мецигестона на транспортную активность Р-гликопротеина в клетках рака гортани человека Нер-2, резистентных к винкристину. Данная клеточная линия также не содержит рецепторов прогестерона [Hagedorn Н. et al., 2002].

нейродегенеративных и ишемических заболеваний. При высоких концентрациях и длительном воздействии Бутерол, как и ЫЕМ, активирует продукцию активных форм кислорода и усиливает цитотоксический эффект доксорубицина. На основании этих данных можно заключить, что тиол-блокирующие прогестины, структура которых подобна структуре Бутерола или ацетомепрегенола, являются новой группой прогестинов, потенциально эффективных при лечении упомянутых патологий.

Полученные данные свидетельствуют о цитостатической и противоопухолевой активности новых гестагенов и целесообразности комбинированного применения гестагенов с цитостатиками для повышения их эффективности уже на первых этапах лечения опухолей, а не как препаратов паллиативной терапии. Мецигестон и Бутерол обладают химиосенсибилизирующей активностью и могут быть рекомендованы для клинического изучения как универсальные модуляторы МЛУ, действующие на различные типы опухолевых клеток.

ВЫВОДЫ.

1) Синтетические гестагены обладают цитостатическим действием в отношении клеток рака молочной железы человека МСР-7 и рака шейки матки человека НеЬа. Цитостатические эффекты Мецигестона и Бутерола значительно более выражены, чем эффекты прогестерона и МПА. Противоопухолевое действие Бутерола в отношении перевиваемого мышам рака шейки матки РШМ-5 также более выражено, чем противоопухолевое действие медроксипрогестерона ацетата.

2) Механизмы цитостатического действия гестагенов связаны

-со снижением экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов; -торможением клеточного цикла в Б-фазе;

-инициацией апоптоза за счет увеличения экспрессии ВСЬ-2 и усиления продукции АФК.

3) Гестагены Бутерол, АМП, МПА обладают химиосенсибилизирующим действием, повышая цитостатический эффект доксорубицина и этопозида в клетках рака молочной железы человека и винкристина на перевиваемом лимфолейкозе мыши.

4) Механизмы сенсибилизации гестагенами в резистентных клетках РМЖ связаны с ингибированием активности Р-гликопротеина, снижением экспрессии ВСИР и MR.P1, ингибированием экспрессии мРНК ВСЬ-2. При совместном действии доксорубицина и синтетических гестагенов (но не прогестерона) наблюдается эффект 02/М-блока в клеточном цикле опухолевых клеток.

5) Прогестерон ингибирует ЫАО-зависимое дыхание, в концентрациях, превышающих физиологические, тогда как другие гестагены не влияют на дыхание митохондрий. Бутерол, в отличие от прогестерона и медроксипрогестерона ацетата, действует как ингибитор кальций-индуцированного открытия поры.

6) Бутерол и прогестерон увеличивают образование активных форм кислорода митохондриями, тогда как медроксипрогестерона ацетат не влияет на продукцию АФК.

7) Помимо прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, мишенями цитотоксического и химиосенсибилизирующего действия Бутерола в опухолевых клетках являются аденилатгранслоказа митохондриальной поры и SH-группы нуклеотидсвязывающего домена Р-гликопротеина, и, возможно, топоизомеразы.

8) Замещение 3-кето-группы в молекуле стероида на бутаноилокси-группу (Бутерол) принципиально меняет свойства гестагенов, делая их активными не только по отношению к МЛУ, но и к Са2+-зависимой циклоспорин А-чувствительной поре митохондрий. Бутерол ингибирует пору, действуя на АДФ-связывающий сайт, а также повышает накопление доксорубицина в клетке, взаимодействуя с нуклеотид-связывающими доменами АВС-транспортеров.

Список сокращений:

АФК - активные формы кислорода

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

МТП- Са2+-зависимая циклоспорин-чувствительная митохондриальная пора

мРНК- матричная рибонуклеиновая кислота

МПА- медроксипрогестерон ацетат

ПРОГ - прогестерон

МГА - мегестрола ацетат

АМП - ацетомепрегенол

DTNB - 5 ', 5'-дитиобис-(2-нитробензоат)

NEM - N-этилмалеимид

ERK-киназа - (extracellular signal-regulated kinase)

TOP II — топоизомераза II

РЭ - рецепторы эстрадиола

РП - рецепторы прогестерона

РМЖ - рак молочной железы

РШМ- рак шейки матки

DOX - доксорубицин

Практические рекомендации.

Полученные в работе данные свидетельствуют о целесообразности применения гестагенов одновременно с цитостатиками для повышения чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии, а не как препаратов паллиативной терапии. Бутерол обладает химиосенсибилизирующей активностью и может быть рекомендован для клинического изучения как модулятор МЛУ, действующий на различные типы опухолевых клеток. Для оценки чувствительности опухоли к химиотерапии перед ее назначением важно определить выраженность параметров МЛУ - экспрессию мРНК Р-гликопротеина (MDRl-ген), белка,

ассоциированного с резистентностью (MRP 1-ген), белка резистентности рака молочной железы (BCRP-ген).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сергеев П.В., Семейкин A.B., Смирнова З.С., Ржезников В.М., Гриненко Г.С., Федосов A.B., Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л. Изучение противоопухолевой активности нового гестагена 17а-ацетокси-3 ß-бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-она // Экспериментальная и Клиническая Фармакология. 2004. Т. 67. № 4. С. 54-56.

2. Fedotcheva Т.А., Semeykin F.V., Shimanovsky N.L. Butagest is a perspective anticancer drug and chemosensitizer // Сборник материалов Европейского съезда фармакологов. M., 2004. С. 84.

3. Сергеев П.В., Семейкин A.B., Федотчева Т.А. Исследование комбинированного действия доксорубицина и гестагенов на чувствительные и резистентные к доксорубицину клетки MCF-7 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т. 138. № 3. С. 53-56.

4. Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л. Роль гестагенов и антигестагенов в регуляции пролиферативной активности клеток рака молочной железы // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2005. №3. С. 3-11.

5. Федотчева Т.А., Семейкин A.B., Шимановский Н.Л. Цитостатическое действие антигестагена мифепристона и гестагенов на клетки рака молочной железы человека MCF-7 // Сборник материалов XII Российского национального конгресса "Человек и лекарство". М., 2005. С. 718.

6. Соловьева М.Е., Корыстова А.Ф., Федотчева Т.А., Семейкин A.B., Акатов B.C. Подавление множественной лекарственной устойчивости клеток карциномы молочной железы человека MCF-7/R авермектинами // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2005. № 4. С. 30-34.

7. Сендерович А.И., Федотчева Т.А. Влияние стероидных соединений андростенов на рост нормальных и опухолевых клеток // Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. 2006. № 2. С. 421.

8. Федотчева Т.А., Банин В.В., Шимановский Н.Л. Влияние гестагенов на аккумуляцию доксорубицина в опухолевых клетках // XIII Росс. Нац. Конгресс «Человек и лекарство». М., 3-7 апреля 2006. С. 313.

9. Сендерович А.И., Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л. Влияние стероидных соединений андростенов на рост нормальных и опухолевых клеток // Сборник материалов I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. М., 2006. С. 421.

Ю.Федотчева Т.А., Голубовская JI.E., Минайлова О.Н., Смирнова З.С., Толкачев В.Н., Т.А. Титова, Семейкин A.B., Шимановский Н.Л. Ржезников В.М. Исследование комбинированного действия антиэстрогенцитостатиков и доксорубицина на пролиферацию чувствительной MCF-7/WT и резистентной MCF-7/R линий клеток // Российский биотерапевтический журнал. 2007. Т. 6. № 1. С. 39-40.

П.Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л., Сендерович А.И, Чермных Н.С., Семейкин A.B., Ржезников В.М., Голубовская Л.Е., Гриненко Г.С., Банин В.В., Сергеев П.В. Сравнительный анализ влияния гормональных соединений классов гестагенов, антиэстрогенцитостатиков и андростенов на жизнеспособность опухолевых и нормальных клеток // Химико-Фармацевтический Журнал. 2007. Т. 41. № 7. С. 3-7.

12. Маяцкая Е.Е., Шимановский Н.Л., Банин В.В., Федотчева Т.А., Семейкин A.B., Ржезников В.М. Исследование комбинированного действия бис-бета-хлорэтиламиновых произврдных эстрогена и доксорубицина на пролиферацию чувствительной и резистентной линий клеток MCF-7 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т. 143. № 3. С. 305-307.

П.Федотчева Т.А., Смирнова З.С., Гриненко Г.С., Голубовская Л.Е., Ржезников В.М., Семейкин A.B., Шимановский Н.Л. Изучение противоопухолевой активности нового гестагена Бутерола // Российский биотерапевтический журнал. 2007. Т. 6. № 1. С. 52.

Н.Сергеев П.В., Федотчева Т.А., Семейкин A.B., Ветчинкина В.Б., Атрошкин К.А., Шимановский Н.Л. Новый отечественный гестаген с противоопухолевой активностью // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. 2007. № 5. С. 27-32.

15.Федотчева Т.А., Семейкин A.B., Шимановский Н.Л., Капушева Л.М., Скандари О.В., Разработка нового метода определения подтипов рецепторов эстрадиола в биоптатах эндометрия // Материалы 14-го Конгресса «Человек и лекарство». М., 2007. С. 633.

16.Сергеев П.В., Федотчева Т.А., Ржезников В.М., Гриненко Г.С. , Смирнова З.С., Толкачев В.Н. Шимановский Н.Л. Фармакологические свойства нового отечественного гестагена с противоопухолевой активностью // Психофармакология и биологическая наркология. 2007. Т. 7. Спец. выпуск, ч. 2. С. 1942. (3-й Съезд фармакологов «Фармакология -практическому здравоохранению»).

П.Федотчева Т.А., Смирнова З.С., Ржезников В.М., Толкачев В.Н., Шимановский Н.Л. Перспективы использования синтетических производных стероидных гормонов как цитотоксических средств // Сборник материалов Междунар. конфер. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2007. С. 338-341.

18.Сергеев П.В., Атрошкин К.А., Семейкин A.B., Шимановский Н.Л., Федотчева Т.А., Секирина М.А. Регуляция гестагенами пролиферативной активности клеток-мишеней // Вестник Российского

Онкологического Научного Центра им. H. Н. Блохина РАМН. 2008. Т. 19. № 1.С. 22-28.

19.Федотчева Т.А., Шимаиовский H.J1., Лапшина A.M., Бабичев В.Н. Оценка экспрессии МРНК рецепторов эстрадиола в биоптатах аденом гипофиза // XV Росс. Нац. Конгресс «Человек и лекарство. М., 2008. С. 718.

20.Fedotcheva N.I., Teplova V.V., Fedotcheva Т.А., Rzheznikov V.M., Shimanovskii N.L. Effect of progesterone and its synthetic analogues on the activity of mitochondrial permeability transition pore in isolated rat liver mitochondria // Biochemical Pharmacology. 2009. V. 78. No 8. P. 10601068.

21.Атрошкин К.А., Шимановский Н.Л., Семейкин A.B., Ржезников B.M., Секирина М.А., Кирсанова Е.А., Федотчева Т.А. Сочетанное действие гестагенов и доксорубицина на клетки культур опухолевых линий HeLa и MCF-7 // Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. 2009. №1. С. 57-61.

22.Бабичев В.Н., Марова Е.И., Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л. Рецепторы эстрогенов в диагностике и лечении гормонозависимых опухолей // Проблемы эндокринологии. 2009. Т. 55. № 4. С. 34-36.

23.Федотчева Т.А., Одинцова Е.В, Шимановский Н.Л. Молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. 2010. № 9. С. 42-50.

24.Федотчева Т.А., Одинцова Е.В., Ржезников В.М., Теплова В.В., Федотчева Н.И., Шимановский Н.Л. Влияние стероидных гормонов на тиол-зависимые процессы в митохондриях и опухолевых клетках // Материалы VIII Междунар. конференции «Биоантиоксидант». Москва, 46 октября 2010 г. С. 478-479.

25.Барышев П.М., Федотчева Т.А., Одинцова Е.В., Шимановский Н.Л. Возможности персонализированной терапии гормонозависимых опухолей с помощью определения подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола// Клиническая фармакология и фармакоэкономика. 2010. Т. 3. № 4. С. 6.

26.Одинцова Е.В., Федотчева Т.А., Седов Е.А., Ржезников В.М., Шимановский Н.Л. Влияние синтетических аналогов прогестерона на экспрессию мРНК MRP -Шелка и Р-гликопротеина в клетках HeLa и MCF-7 // Российский биотерапевтический журнал. 2011. Т. 10. № 1. С. 42.

27.Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л Роль факторов апоптоза в цитостатическом действии гестагена бутерола // Сборник материалов XVIII Российского нац. конгресса «Человек и лекарство». М., 2011. С. 491.

28.Федотчева Т.А., Шимановский Н.Л., Круглов А.Г., Теплова В.В., Федотчева Н.И. Роль митохондриальных тиолов различной локализации в

генерации активных форм кислорода. // Биологические мембраны. 2011. Т.28. №6. С.1-8

29.«Молекулярная фармакология» (электронный курс) в соавторстве с Н.Л. Шимановским и др. Медицинский образовательный портал Российского Государственного Медицинского Университета. М.: 2011.

30.Федотчева Т. А., Одинцова Е. В., Банин В. В., Шимановский Н. Л. Фармакологическое значение сопряженной регуляции системы множественной лекарственной устойчивости и митохондриальной поры гестагенами. Вестник Российского Онкологического Научного Центра им. Н. Н. Блохина РАМН. 2011. Т. 4. С. 34-38.

31.0динцоваЕ. В., Федотчева Т. А., Банин В. В., Шимановский Н. Л. Анализ цитотоксической и противоопухолевой активности нового отечественного гестагена Бутерола с помощью тест-системы культуры опухолевых клеток человека. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2012. № 1. С. 93-97.

32.0динцова Е.В., Федотчева Т.А. Влияние Бутерола и других синтетических аналогов прогестерона на экспрессию мРНК ЮР-1, ЮРЯ-1 и ЮРВР-1 в клетках НеЬа. Вестник Российского государственного медицинского университета. 2012. Спец. выпуск.№1. С.284.

Патенты на изобретение:

- № 2292209 от 30.06.2004г. «Противоопухолевое средство для перорального применения и способ его получения» (в соавторстве);

- № 2426737 от 18.08.2011г. «4-Гетеро-16, 17-циклогексанопрегнаны» (в соавторстве).

Оглавление диссертации Федотчева, Татьяна Александровна :: 2012 :: Москва

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Цитотстатическое действие гестагенов

2.1.1. Рецепторы прогестерона и эстрадиола.

2.1.2. Роль определения подтипов рецепторов прогестерона и 18 эстрадиола в лечении гормонозависимых опухолей

2.1.3.Функциональная активность эстрогеновых рецепторов

2.1.4. Функциональная активность прогестероновых рецепторов

2.1.5. Прогностическое значение подтипов рецепторов эстрадиола в 22 лечении гормонозависимых опухолей

2.1.6. Прогностическое значение подтипов рецепторов прогестерона в 23 лечении гормонозависимых опухолей

2.1.7. Механизмы цитостатической активности гестагенов

2.2. Химиосенсибилизирующее действие гестагенов

2.2.1. Факторы мультилекарственной резистентности

2.2.2. Фармакологическая регуляция МЛР

2.2.3. Гестагены как химиосенсибилизаторы

2.3. Гестагены и митохондрии

2.4. Общие механизмы взаиморегуляции МТП и МЛР гестагенами

3. Материалы и методы исследования

3.1. Химическая структура изучаемых гестагенов

3.2. Используемые реактивы

3.3. Объекты исследования

3.4. Метод культивирования клеток

3.5. Определение активности митохондриальной поры (МТП)

3.6. Методы оценки противоопухолевой активности изучаемых 59 соединений

3.6.1. Интегральный МТТ-тест оценки жизнеспособности и 59 метаболической активности опухолевых клеток

3.6.2. Оценка влияния соединений на пролиферативную активность 60 опухолевых клеток по включению 3Н-тимидина в ДНК

3.6.3. Оценка противоопухолевой активности соединений на мышах

3.6.3.1. Оценка противоопухолевой активности мецигестона и 61 бутерола на перевиваемом мышам раке шейки матки РШМ

3.6.3.2. Оценка химиосенсибилизирующей активности бутерола на 62 перевиваемом остром лейкозе мыши Р388, резистентном к винкристину

3.7. Анализ специфических участков связывания Н-прогестерона ( Н- 63 Р4) и относительной связывающей способности (ЫВА) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона в культурах клеток

3.8. Оценка параметров резистентности опухолевых клеток к 65 доксорубицину и влияния на них исследуемых соединений

3.8.1. Метод определения МЛР опухолевых клеток по кинетике 65 выхода родамина

3.8.2. Метод определения активности глутатион-8-трансферазы в 66 объектах исследования

3.8.2.1. Определение активности глутатион-8-трансферазы в гомогенате тканей

3.8.2.2. Определение активности глутатион-8-трансферазы в 69 суспензии опухолевых клеток

3.9. Анализ клеточного цикла опухолевых клеток методом проточной цитофлуориметрии

3.10. «Реал-тайм» ПЦР-метод количественной оценки мРНК 72 исследуемых генов

3.10.1. Сущность метода

3.10.2. Этапы выявления мРНК исследуемого гена

3.10.3. Достоинства и особенности метода РТ-ПЦР

3.10.4. Схема эксперимента

3.11. Статистическая обработка результатов 83 4. Материалы собственных экспериментальных исследований 84 4.1. Механизмы цитостатической активности гестагенов

4.1.1. Цитостатическая активность гестагенов в культурах клеток. 84 Концентрационная и временная зависимости

4.1.2. Анализ специфических участков связывания 3Н-прогестерона 92 ( Н-Р4) и относительной связывающей способности (ШВА) исследуемых гестагенов со специфическими участками связывания прогестерона в опухолевых клетках

4.1.3. Оценка влияния гестагенов на уровень экспрессии подтипов ЭР 100 и ПР в опухолевых клетках

4.1.3.1. Влияние гестагенов на уровень экспрессии подтипов ПР

4.1.3.2. Влияние гестагенов на уровень экспрессии подтипов ЭР

4.1.3.3. Влияние гестагенов в концентрации 10-9М на уровень экспрессии подтипов ЭР и ПР в опухолевых клетках

4.1.4. Влияние гестагенов на уровень экспрессии белков-модуляторов 112 апоптоза в опухолевых клетках

4.1.5. Влияние гестагенов на клеточный цикл опухолевых клеток

4.1.6. Противоопухолевая активность новых гестагенов. 116 Противоопухолевая активность бутерола и мецигестона на перевиваемом мышам раке шейки матки РШМ

4.1.7. Влияние гестагенов на жизнеспособность фибробластов кожи 118 крыс

4.1.8. Влияние гестагенов на жизнеспособность стромальных клеток 119 человека

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Федотчева, Татьяна Александровна, автореферат

Актуальность проблемы.

Выявление механизмов цитостатического действия гестагенов остается важной проблемой молекулярной фармакологии. Так как гестагены более эффективны в рецептор-положительных опухолях, предполагается рецептор-опосредованное антиэстрогенное противоопухолевое действие гестагенов [Зкгик^аге, 2002]. Эффективность гестагенов зависит от индивидуального профиля пациента - возраста, анамнеза, представленности рецепторов прогестерона и эстрадиола [Бкгик^аге, 2005; Байназарова, Искакова, 2006].

С развитием персонализированной медицины дифференцированные подходы к применению гестагенов с учетом новых сведений о механизмах их действия могут значительно повысить эффективность гестагенов, для чего требуется правильный выбор препарата, оптимальные дозы и режимы введения в каждом конкретном случае. Изучение механизмов цитостатического действия гестагенов позволит также вести более направленный поиск новых противоопухолевых соединений на основе гестагенов с минимальным числом побочных эффектов.

Другой аспект возможного клинического применения гестагенов в онкологии - в качестве химиосенсибилизаторов опухолевых клеток, то есть соединений, повышающих чувствительность опухолевых клеток к химиотерапии, ■ ранее не изучался. Как известно, существенным ограничением эффективности противоопухолевой терапии является возникновение устойчивости опухолевых клеток к применяемым препаратам - феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) [Богуш, Кирсанов, 2006; Baguley, 2010]. Снижение активности цитостатиков вследствие развития в опухолевых клетках устойчивости к структурно и функционально разнородным противоопухолевым средствам происходит уже после первых курсов лечения. Требуются все более высокие дозы цитостатиков, что увеличивает их повреждающее действие на нормальные клетки и ткани.

Основными проявлениями МЛУ являются увеличение экспрессии генов, кодирующих ферменты, которые участвуют в метаболизме лекарственных веществ и регуляции уровня глутатиона, а также увеличение экспрессии и активности мембранных белков - АТФ-зависимых помп плазматической мембраны с низкой специфичностью, выбрасывающих ксенобиотики. АВС-транспортеры (ATP-binding cassette) присутствуют во всех клетках и используют энергию АТФ гидролиза для транспорта различных соединений через клеточную мембрану [Gatti et al., 2011]. Физиологической функцией ABC-транспортеров в норме является защита клетки от токсических метаболитов, в том числе образуемых самой клеткой. Наибольшая экспрессия этих белков обнаруживается в различных гемато-тканевых барьерах. Среди АТР-зависимых помп плазматической мембраны опухолевых клеток, выбрасывающих ксенобиотики, идентифицирован Р-гликопротеин, кодирующийся геном MDR-1 (Multydrug Resistance-1), и представляющий собой наиболее изученный белок МЛУ, активизация которого приводит к выбросу цитостатиков: антрациклиновых антибиотиков (адриамицин, даунорубицин), винкаалкалоидов (винкристин, винбластин), таксанов (таксол, таксотер), митоксантрона, ингибиторов топоизомераз (этопозид), что снижает эффективность перечисленных препаратов [Li et al., 2010].

Среди ингибиторов Р-гликопротеина известны такие, как циклосоприн, верапамил, трастузумаб, вогонин, тариквидар и др. [Sauna et al., 2001, Lee et al., 2009; Fox et al., 2007]. В противоопухолевой терапии из них используется только трастузумаб, область применения которого ограничена опухолями, содержащими НЕБ12-рецепторы.

В последние годы появились указания на возможность использования гестагенов в качестве ингибиторов Р-гликопротеина [Сергеев и др., 2007]. В 1991 г. было показано, что прогестерон является субстратом Р-гликопротеина и транспортируется через прогестерон-специфический сайт. Это свойство прогестерона послужило основанием для исследования способности синтетических гестагенов ингибировать Р-гликопротеин. Влияние синтетических гестагенов на активность Р-гликопротеина и другие факторы МЛУ ранее не изучалось, в литературе существуют лишь отрывочные противоречивые данные по этой проблеме.

Понимание молекулярных механизмов цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки усилит рациональность и эффективность их назначения, откроет новые возможности преодоления МЛУ.

Цель работы.

Задачи исследования:

1) Исследовать влияние новых гестагенов на жизнеспособность опухолевых клеток.

2) Исследовать механизмы цитостатического действия гестагенов:

- изучить влияние гестагенов на клеточный цикл клеток ;

3) Изучить влияние гестагенов в комбинации с цитостатиками на жизнеспобоность опухолевых клеток.

4) Установить механизмы сенсибилизации гестагенами опухолевых клеток к цитостатикам:

- изучить влияние гестагенов на активность Р-гликопротеина;

- изучить влияние гестагенов в комбинации с доксорубицином на клеточный цикл опухолевых клеток.

- изучить влияние гестагенов на дыхание митохондрий; -изучить влияние гестагенов на открытие митохондриальной поры.

Научная новизна.

Помимо известных и применяемых в клинической практике гестагенов, в работе изучены новые отечественные гестагены - Бутерол, разработанный в ЦХЛС-ВНИХФИ совместно с ЭНЦ РАМН, под руководством Г.С. Гриненко и В.М. Ржезникова, и Мецигестон, разработанный в ИОХ РАН в лаборатории А.В. Камерницкого. Новые гестагены обладают высокой цитостатической и химиосенсибилизирующей активностями, превосходящими препараты сравнения. Впервые выявлены механизмы их цитостатического и химиосенсибилизирующего действия. С помощью новой, разработанной в работе модификации метода количественной оценки экспрессии мРНК для подтипов рецепторов прогестерона и эстрадиола, установлены принципы их регуляции гестагенами.

При изучении механизмов химиосенсибилизирующей активности гестагенов впервые выявлено их уникальное действие на циклоспорин-чувствительную Са2+-зависимую митохондриальную пору - главный участок, ответственный за инициацию апоптоза в клетке. Обнаружено принципиально новое, зависимое от химической структуры, свойство прогестинов - при наличии эфирных остатков в позиции СЗ (Бутерол, Ацетомепрегенол) у гестагенов появляется способность связываться с SH-группами. Впервые показано, что связывание Бутеролом SH-rpynn нуклеотид-связывающего домена Р-гликопротеина и аденилаттранслоказы является одним из механизмов сенсибилизации клеток к цитостатикам. Научно-практическая значимость.

Помимо цитостатической активности гестагены также проявили химиосенсибилизирующую активность, увеличивая эффект цитостатиков на 20-50%, и, следовательно, могут применяться совместно с цитостатиками на первых этапах лечения химиотерапией.

Бутерол, влияя на различные белки транспортеры плазматической и митохондриальной мембран, может или повышать цитостатическую активность химиотерапевтических препаратов благодаря ингибированию системы транспорта их из клетки или уменьшать ее за счет ингибирования открытия митохондриальной поры (МТП, mitochondrial permeability transition роге). Результирующее действие будет определяться концентрацией бутерола в области плазматической мембраны и митохондриях в опухолевых и ^трансформированных клетках. Ингибирование открытия митохондриальной поры может оказаться очень полезным в плане снижения кардиотоксичности ряда противоопухолевых средств, так как известно, что ингибиторы проницаемости мембран митохондрий (внутренней или внешней) обладают кардиопротекторным эффектом. Поэтому Бутерол, ингибируя открытие МТП, может существенно снизить кардиотоксичность цитостатиков, связанную с инициацией апоптоза, и в то же время, ингибируя активность Р-гликопротеина, повысить их цитостатическую активность в отношении резистентных опухолевых клеток. Это свойство позволяет прогнозировать его использование не только в онкологической практике, но и в качестве кардиопротектора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Гестагены Бутерол, Мецигестон обладают цитостатическим действием в отношении гормонозависимых опухолевых клеток. Механизмы цитостатической активности связаны со снижением прогестероновых рецепторов ГТР-А и эстрогеновых ЭР(3, индукцией апоптоза за счет стимуляции продукции активных форм кислорода.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Цитостатическое действие гестагенов.

Гормональная терапия опухолей является наиболее эффективной и наименее токсичной из применяющихся в настоящее время методов лечения гормонозависимых опухолей. Гормонотерапия является, как правило, второй линией терапии РМЖ, РШМ, рака эндометрия [Путырский и др., 2002; Федеральное руководство, 2009]. В зависимости от возраста пациентки (репродуктивный или менопаузальный период), стадии заболевания и рецепторного статуса, в составе гормонотерапии РМЖ могут использоваться различные сочетания препаратов, в которых в качестве гормональных средств могут быть антиэстрогены, прогестины, и даже андрогены [Hardin et al., 2007; Nahleh, 2008]. Степень эффективности того или иного вида гормонотерапии и прогноз лечения можно оценить, определив рецепторный статус опухоли [Тюляндин, 2002; Стенина, 2005].

Специфические биологические эффекты гестагенов и, в частности, цитостатические эффекты, опосредованы рецепторами прогестерона (РП), относящимися к суперсемейству ядерных лигандзависимых транскрипционных факторов.

Заключение диссертационного исследования на тему "Молекулярные механизмы цитостатического и химиосенсибилизирующего действия гестагенов на опухолевые клетки"

6. ВЫВОДЫ.

1.) Синтетические гестагены обладают цитостатическим действием в отношении клеток рака молочной железы человека МСБ-7 и рака шейки матки человека НеЬа. Цитостатические эффекты Мецигестона и Бутерола значительно более выражены, чем эффекты прогестерона и МПА. Противоопухолевое действие Бутерола в отношении перевиваемого мышам рака шейки матки РШМ-5 также более выражено, чем противоопухолевое действие медроксипрогестерона ацетата.

2.) Механизмы цитостатического действия гестагенов связаны

-со снижением экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов; -торможением клеточного цикла в Б-фазе;

-инициацией апоптоза за счет увеличения экспрессии ВСЬ-2 и усиления продукции АФК.

3.) Гестагены Бутерол, АМП, МПА обладают химиосенсибилизирующим действием, повышая цитостатический эффект доксорубицина и этопозида в клетках рака молочной железы человека и винкристина на перевиваемом лимфолейкозе мыши.

4.) Механизмы сенсибилизации гестагенами в резистентных клетках РМЖ связаны с ингибированием активности Р-гликопротеина, снижением экспрессии ВСЫР и МИРІ, ингибированием экспрессии мРНК ВСЬ-2. При совместном действии доксорубицина и синтетических гестагенов (но не прогестерона) наблюдается эффект С2/М-блока в клеточном цикле опухолевых клеток.

5) Прогестерон ингибирует ЫАБ-зависимое дыхание, в концентрациях, превышающих физиологические, тогда как другие гестагены не влияют на дыхание митохондрий. Бутерол, в отличие от прогестерона и медроксипрогестерона ацетата, действует как ингибитор кальций-индуцированного открытия поры.

7) Помимо прогестероновых и эстрогеновых рецепторов, мишенями цитотоксического и химиосенсибилизирующего действия Бутерола в опухолевых клетках являются аденилаттранслоказа митохондриальной поры и SH-группы нуклеотидсвязывающего домена Р-гликопротеина, и, возможно, топоизомеразы.

8) Замещение 3-кето-группы в молекуле стероида на бутаноилокси-группу (Бутерол) принципиально меняет свойства гестагенов, делая их активными не только по отношению к МЛУ, но и к Са -зависимой циклоспорин А-чувствительной поре митохондрий. Бутерол ингибирует пору, действуя на АДФ-связывающий сайт, а также повышает накопление доксорубицина в клетке, взаимодействуя с нуклеотид-связывающими доменами АВС-транспортеров.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Согласно поставленной цели - изучению молекулярных механизмов цитостатического действия гестагенов на опухолевые клетки было проведено комплексное исследование влияния ряда синтетических гестагенов на рост опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур МСТ-7 и НеЬа. В частности, изучена противоопухолевая активность новых отечественных гестагенов Мецигестона и Бутерола.

Все исследованные гестагены дозозависимо тормозят рост опухолевых клеток, максимальный цитостатический эффект развивается на 6 сутки инкубации с клетками, средняя 1С5о - 10"5М. Мецигестон и Бутерол ингибируют рост клеток в большей степени, чем прогестерон.

Для оценки противоопухолевой активности Мецигестона и Бутерола на мышах исследовали их влияние на рост перевиваемого рака шейки матки человека Р1ПМ-5. Бутерол (50мкг/кг) ингибирует рост опухоли на 73%, Мецигестон (100мкг/кг) - на 30%, МПА (50мкг/кг) - на 55%.

С целью выявления химиосенсибилизирующей активности гестагенов исследовали их действие на опухолевые клетки в комбинации с цитостатиками. Для изучения Мецигестона и Бутерол а как соединений, повышающих эффективность цитостатиков, исследовали их влияние на рост опухолевых клеток МСР-7/Я, МСР-7/\¥Т и НеЬа в комбинации с доксорубицином. Во всех клеточных линиях выявлен синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина. Синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина в чувствительных к доксорубицину клетках МСР-7ЛУТ и НеЬа имеет кумулятивный характер, т.е. цитостатический эффект гестагенов суммируется с цитостатическим эффектом доксорубицина, в резистентных к доксорубицину клетках МСР-7/Я синергизм связан с потенциированием гестагенами ослабленного цитостатического эффекта доксорубицина. Важно отметить, что химиосенсибилизирующий эффект гестагенов развивается при одновременном введении в среду инкубации гестагенов и доксорубицина.

С целью изучения механизмов сенсибилизации, изучали влияние гестагенов на факторы МЛУ - активность и экспрессию Р-гликопротеина и других АВС-траспортеров, активность глутатионтрансферазы. Возможные механизмы, обусловливающие синергизм в цитостатическом действии новых гестагенов и доксорубицина в резистентных к доксорубицину клетках МСР-7/К, связаны с ингибированием активности и экспрессии Р-гликопротеина, ингибированием экспрессии ВСИР, с эффектом 02/М-блока клеточного цикла и не связаны с ингибированием активности глутатионтрансферазы.

Также показано, что Бутерол усиливает действие другого противоопухолевого препарата - ингибитора топоизомеразы - этопозида на 31-40%.

При изучении влияния Бутерола и других гестагенов на митохондрии, обнаружено уникальное действие Бутерола на циклоспорин чувствительную кальций-зависимую пору митохондрий, ключевую точку инициации апоптоза. Показано, что Бутерол действует также, как тиол-связывающий реагент - N-этилмалеимид (NEM). При низких концентрациях и кратковременном воздействии Бутерол, подобно NEM и DTNB, тормозит открытие МРТР и соответственно снижает апоптоз, что может быть полезным при лечении нейродегенеративных и ишемических заболеваний. При высоких концентрациях и длительном воздействии Бутерол, как и NEM, активирует продукцию активных форм кислорода и усиливает цитотоксический эффект доксорубицина. На основании этих данных можно заключить, что тиол-блокирующие прогестины, структура которых подобна структуре Бутерола или ацетомепрегенола, являются новой группой прогестинов, потенциально эффективных при лечении упомянутых патологий.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Федотчева, Татьяна Александровна

1. Атасси Г., Жиро Б. Доклинические и клинические исследования новыхпротивоопухолевых препаратов //Медикография. 2000. Т. 22. № 1-2. С. 46-53.

2. Барышников А.Ю., Степанова Е.В. Проблемы лекарственнойрезистентности // Материалы 3-й ежегодной Российской онкологической конференции. 1999, Санкт-Петербург. С. 87.

3. Байназарова A.A., Искакова Ж.К. Рецепторный статус карциномыэндометрия и его влияние на результаты лечения больных // Вопросы онкологии. 2006. Т. 52. № 6. С. 654-658.

4. Бассалык JI.C. Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека. М.,1987-С. 120-136.

5. Добренький М.Н., Добренькая Е.М. Факторы риска, современныевозможности профилактики и ранней диагностики рака молочной железы // Фундаментальные исследования. 2008. №8. С. 48-50.

6. Калинина Е.В., Новикова М.Д., Щербак Н.Р. и др. Прогестерон ингибируетглутатион-з-трансферазу Р1 -1 и оказывает антипролиферативный эффект на клетки эритролейкемии человека К562 // Вопросы онкологии. 2000. Т. 46. № 1. С. 68-73.

7. Калинина Е.В., Саприн А. Н., Соломка B.C. и др. Роль антиоксидантнойсистемы и транскрипционных факторов bcl-2 и р53 в формировании резистентности клеток JI562 эритролейкемии человека к доксорубицину // Вопросы онкологии. 2001. Т. 47. № 5. С. 595-600.

8. Колесниченко J1.C., Кулинский В.И. Глутатионтрансферазы // Успехисовременной биологии. 1989. Т. 107. С. 179-194.

9. Кушлинский Н. Е., Герштейн Е. С. Современные возможностимолекулярно-биохимических методов оценки биологического "поведения" рака молочной железы // 2001. №9. С. 65-70.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: «Высшая школа», 1990. 353 стр.

11. Моргун A.B. Прогностическая значимость Р-гликопротеина в развитиихимиорезистентности при онкологических заболеваниях.//. Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2007. Т. 70. № 3. С. 9-12.

12. Олийниченко Г.П., Захарцева JI.M,, Дроздов В.М. и др. Клиническоезначение рецепторов эстрогенов, прогестерона и онкобелка HER-2/NEU в клетках рака молочной железы // Онкология. 2002. Т. 4. № 1. С. 33-36.

13. Путырский JI.A., Жаврид Э.А., Антоненкова А.Н. Лечение больныхметастатическим раком молочной железы в пременопаузе. Руководство для врачей. Беларусь, 2002.

14. Северин С.Е. Геном человека и фармакотерапия // Труды 7-го

15. Российского национального конгресса "Человек и лекарство". 2000. С. 213-265.

16. Сергеев П.В., Карева E.H., Ткачева Н.Ю., Высоцкий М.М.

17. Антипрогестины // Проблемы эндокринологии. 1994. Т. 40. № 3. С. 5254.

18. Сергеев П.В., Семейкин A.B., Смирнова З.С. и др. Изучениепротивоопухолевой активности нового гестагена 17а-ацетокси-3 ß-бутаноилокси-6-метил-прегна-4,6-диен-20-она // Эксп. Клин. Фармакол. 2004. Т. 67. № 4. С. 54-56.

19. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии,клетки и органы: роль активных форм кислорода // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 6. С. 4-10.

20. Стенина М.Б. Рак молочной железы: некоторые важные научные событияи выводы последних лет // Практическая онкология. 2005. Т. 6. № 1. С. 26-32.

21. Тюляндин С.А. Системная терапия операбельного рака молочной железы

22. Практическая онкология. 2002. Т. 3. № 1. С. 29-37.

23. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств.2009, стр. 696.

24. Федосов А.В. Семейкин А.В. Механизмы влияния прогестинов напролиферацию клеток чувствительных тканей // Вопр. онкол. 2003. Т. 49. № 1.С. 9-20.

25. Федотчева Н.И., Теплова В.В., Белобородова Н.В. Участие фенольныхкислот микробного происхождения в дисфункции митохондрий при сепсисе // Биологические мембраны. 2010. Т. 27. № 1. С. 60-66.

26. Фрешни Р. (под ред.) Культура животных клеток. Методы. М.: Мир,1989. 133 стр.

27. Ahola Т.М., Manninen Т., Alkio N., Ylikomi Т. G protein-coupled receptor 30is critical for a progestin-induced growth inhibition in MCF-7 breast cancer cells // Endocrinology. 2002. V. 143. No 9. P. 3376-3384.

28. Alkhalaf M., El-Mowafy A., Karam S. Growth inhibition of MCF-7 humanbreast cancer cells by progesterone is associated with cell differentiation and phosphorylation of Akt protein // Eur. J. Cancer Prev. 2002. V. 11. No 5. P. 481-488.

29. Allen J.A., Shankara T., Janus P. et al. Energized, polarized, and activelyrespiring mitochondria are required for acute Leydig cell steroidogenesis // Endocrinology. 2006. Vol. 147. No 8. P. 3924-3935.

30. Altuvia S., Stein W.D., Goldenberg S. et al. Targeted disruption of the mousemdrVo gene reveals that steroid hormones enhance MDR gene expresión // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. No 36. P. 27127-27132.

31. Araújo G.W., Beyer C., Arnold S. Oestrogen influences on mitochondrial geneexpression and respiratory chain activity in cortical and mesencephalic astrocytes // J. Neuroendocrinol. 2008. Vol. 20. No 7. P. 930-941.

32. Arceci R.J., Baas F., Raponi R. et al. Multidrug resistance gene expression iscontrolled by steroid hormones in the secretory epithelium of the uterus // Mol. Reprod. 1990. V. 25. No 2. P. 101-109.

33. Asmis R., Wang Y., Xu L. et al. A novel thiol oxidation-based mechanism foradriamycin-induced cell injury in human macrophages // FASEB J. 2005. V. 19. P. 1866-1868.

34. Awasthi S. Interactions of GST-pi with ethacrynic acid // BBA. 1993. V. 1164.1. No 2. P. 173-178.

35. Baguley BC. Multiple drug resistance mechanisms in cancer // Mol.

36. Biotechnol. 2010. V. 46. No 3. P. 308-316.

37. Barnes K.M., Dickstein B., Cutler G.B. et al. Steroid transport, accumulation,and antagonism of P-glycoprotein in multidrug-resistant cells // Biochemistry. 1996. V. 35. No 15. P. 4820-4827.

38. Basso E., Fante L., Fowlkes J. et al. Properties of the permeability transitionpore in mitochondria devoid of Cyclophilin D // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 18558-18561.

39. Baumert C., Hilgeroth A. Recent advances in the development of P-gpinhibitors // Anticancer Agents Med. Chem. 2009. V. 9. No 4. P. 415-436.

40. Beck C.A., Weigel N.L., Moyer M.L. et al. The progesterone antagonist

41. RU486 acquires agonist activity upon stimulation of cAMP signaling pathways // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1993. V. 90. No 10. P. 4441-4445.

42. Bernardini S., Bernassola F., Córtese C. et al. Modulation of GST Pl-1 activityby polymerization during apoptosis // Cell Biochem. 2000. V. 77. No 4. P. 645-653.

43. Berndt C., Lillig C.H., Holmgren A. Thiol-based mechanisms of thethioredoxin and glutaredoxin systems: implications for diseases in the cardiovascular system // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 2007. V. 292. P. H1227-H1236.

44. Boland R., Vasconsuelo A., Milanesi L. et al. 17 beta-estradiol signaling inskeletal muscle cells and its relationship to apoptosis // Steroids. 2008. Vol. 73. No 9-10. P. 859-863.

45. Borst P., Elferink R.Ó. Mammalian ABC transporters in health and disease //

46. Annu. Rev.Biochem. 2002. V. 71. P. 537-592.

47. Bottini A., Berruti A., Bersiga A. et al. p53 but not bcl-2 immunostaining ispredictive of poor clinical complete response to primary chemotherapy in breast cancer patients // Clin. Cancer Res. 2000. V. 6. No 7. P. 2751-2758.

48. Bottini A., Dogliotti L., Bersiga A. et al. p53 expression and disease outcome ofbreast cancer patients undergoing primary chemotherapy with anthracycline-containing regimens // Ann. Oncol. 2003. V. 14. No 7. P. 1156.

49. Brangi M., Litman T., Ciotti M. et al. Camptothecin resistance: role of the

50. ATP-binding cassette (ABC), mitoxantrone-resistance half-transporter (MXR), and potential for glucuronidation in MXR-expressing cells // Cancer Res. 1999. V. 59. No 23. P. 5938-5946.

51. Bulteau A.L., Ikeda-Saito M., Szweda L.I. Redox-dependent modulation ofaconitase activity in intact mitochondria // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 14846-14855.

52. Bunik V.I. 2-Oxo acid dehydrogenase complexes in redox regulation // Eur. J.

53. Biochem. 2003. V. 270. P. 1036-1042.

54. Burger A.M. Highlights in experimental therapeutics // Cancer Lett. 2007. V.245. No 1-2. P. 11-21.

55. Buxbaum E. Co-operative binding sites for transported substrates in themultiple drug resistance transporter Mdrl // Eur. J. Biochem. 1999. V. 265. No l.P. 64-70.

56. Buzdar A.U. Advances in endocrine treatments for postmenopausal womenwith metastatic and early breast cancer // Oncologist. 2003. V. 8. No 4. P. 335-341.

57. Chalker J.M., Bernardes G.J., Lin Y.A., Davis B.G. Chemical modification ofproteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology // Chem. Asian J. 2009. V. 4. P. 630-640.

58. Chambo D., Kemp C., Costa A.M., Souza N.C., Guerreiro da Silva I.D.

59. Polymorphism in CYP17, GSTM1 and the progesterone receptor genes and its relationship with mammographic density // Braz. J. Med. Biol. Res. 2009. V. 42. No 4. P. 323-329.

60. Charpin C., Garcia S., Bouvier C. et al. Automated and quantitativeimmunocytochemical assays of Bcl-2 protein in breast carcinomas. // Br. J. Cancer. 1997. V. 76. No 3. P. 340-346.

61. Chen J.H., Nalcioglu O., Su M.Y. MR imaging features of invasive breastcancer correlated with hormonal receptors: does progesterone receptor matter? // Ann. Oncol. 2008. V. 19. No 5. P. 1024-1026.

62. Chen H., Bi W., Cao B. et al. A novel podophyllotoxin derivative (YB-1EPN)induces apoptosis and down-regulates express of P-glycoprotein in multidrug resistance cell line KBV200 // Eur. J. Pharmacol. 2010. V. 627. No 1-3. P. 69-74.

63. Cheng X., Shimizu I., Yuan Y. et al. Effects of estradiol and progesterone ontumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in human hepatoma HuH-7 cells//Life Sci. 2006. V. 79. No 21. P. 1988-1994.

64. Cheung K.L., Owers R., Robertson J.F. Endocrine response after priortreatment with fulvestrant in postmenopausal women with advanced breast cancer: experience from a single centre // Endocr. Relat. Cancer. 2006. V. 13. No l.P. 251-255.

65. Choksuchat C., Zhao S., Deutch T.D. et al. Effects of progesterone,levonorgestrel and medroxyprogesterone acetate on apoptosis in human endometrial endothelial cells // Contraception. 2009. V. 79. No 2. P. 139-145.

66. Cianfriglia M., Cenciarelli C., Barca S. et al. Monoclonal antibodies as a toolfor structure-function studies of the MDR1-P-glycoprotein // Curr.Protein Pept. Sci. 2002. V. 3. No 5. P. 513-530.

67. Claudio J. A., Emerman J.T. The effect of cyclosporin A, tamoxifen, andmedroxyprogesterone acetate on the enhancement of adryamycincytotoxicity in primary cultures of human breast epithelial cells // Breast Cancer Res.Treat. 1996. V.41,Nm2. P. 111-122.

68. Clottes E., Burchell A. Three thiol groups are important for the activity of theliver microsomal glucose-6-phosphatase system. Unusual behavior of one thiol located in the glucose-6-phosphate translocase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 19391-19397.

69. Coles L.D., Lee I.J., Voulalas P.J., Eddington N.D. Estradiol and progesteronemediated regulation of P-gp in P-gp overexpressing cells (NCI-ADR-RES) and placental cells (JAR) // Mol. Pharm. 2009. V. 6. No 6. P. 1816-1825.

70. Conneely O.M., Mulac-Jericevic B., Lydon J.P. Progesterone-dependentregulation of female reproductive activity by two distinct progesterone receptor isoforms // Steroids. 2003. V. 68. No 10-13. P. 771-778.

71. Cork D.M., Lennard T.W., Tyson-Capper A.J. Alternative splicing and theprogesterone receptor in breast cancer // Breast Cancer Res. 2008. V. 10. No 3.P. 207.

72. Correa F., Garcia N., Garcia G., Chavez E.J. Dehydroepiandrosterone as aninducer of mitochondrial permeability transition // Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 87. No 4-5. P. 279-284.

73. Costantini P., Jacotot E., Decaudin D., Kroemer G. Mitochondrion as a noveltarget of anticancer chemotherapy // J. Natl. Cancer Inst. 2000. V. 92. P. 1042-1053.

74. Crescenzi E., Varriale L., Iovino M. et al. Photodynamic therapy withindocyanine green complements and enhances low-dose cisplatin cytotoxicity in MCF-7 breast cancer cells // Mol. Cancer. Ther. 2004. V. 3. P. 537-544.

75. Cross J.V. Templeton D.J. Regulation of signal transduction through proteincysteine oxidation // Antioxid. Redox. Signal. 2006. V. 8. P. 1819-1827.

76. Dahlman-Wright K., Cavailles V., Fuqua S.A. et al. International Union of

77. Pharmacology. LXIV. Estrogen receptors // Pharmacol. Rev. 2006. V. 58. No 4. P. 773-781.

78. Dai C.L., Tiwari A.K., Wu C.P. et al. Lapatinib (Tykerb, GW572016) reversesmultidrug resistance in cancer cells by inhibiting the activity of ATP-binding cassette subfamily B member 1 and G member 2 // Cancer Res. 2008. V 68, No 19. P. 7905-7914.

79. Davis WJr., Ronai Z., Tew K.D. Cellular thiols and reactive oxygen species indrug-induced apoptosis // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. V. 296. P. 1-6.

80. De Oliveira F., Chauvin C., Ronot X. et al. Effects of permeability transitioninhibition and decrease in cytochrome c content on doxorubicin toxicity in K562 cells // Oncogene. 2006. V. 25. No 18. P. 2646-2655.

81. Diaz G., Diana A., Falchi A. et al. Intra- and intercellular distribution ofmitochondrial probes and changes after treatment with MDR modulators // IUBMB Life. 2001. V. 51. No 2! P. 121-126.

82. Diaz-Perez M.J., Wainer I.W., Zannis-Hadjopoulos M., Price G.B. Applicationof an in vitro system in the study of chemotherapeutic drug effects on DNA replication. // J.Cell.Biochem. 1996 V. 61. No 3. P. 444-451.

83. Dive C. Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance // J. Intern.

84. Med. 1997. V. 242. Suppl. 740. P. 139-145.

85. Dorr R.T., Liddil J.D. Modulation of mitomycin C-induced multydrugresistance in vitro // Cancer Chemother.Pharmacol. 1991. V. 27. No 4. P. 290-294.

86. Duffy M.J. Predictive markers in breast and other cancers: a review // Clin.

87. Chem. 2005. V. 51. No 3. P. 494-503.

88. Dünschede F., Zwicker K., Ackermann H., Zimmer G. ADP- and oligomycinsensitive redox behavior of F0 b thiol in ATPsynthase depends onneighbored primary structure: investigations using 14-C-labeled alpha lipoic acid // Biofactors. 2003. V. 19. P. 19-32.

89. Er F., Michels G., Gassanov N., Rivero F., Hoppe U.C. Testosterone inducescytoprotection by activating ATP-sensitive K+ channels in the cardiac mitochondrial inner membrane // Circulation. 2004. Vol. 110. No 19. P. 3100-3107.

90. Evers R., Kool M., Smith A.J. et al. Inhibitory effect of the reversal agents V104, GF120918 and Pluronic L61 on MDR1 Pgp-, MRP1- and MRP2-mediated transport // Br. J. Cancer. 2000. V. 83. No 3. P. 366-374.

91. Fedotcheva N.I., Kazakov R.E., Kondrashova M.N., Beloborodova N.V. Toxic

92. Effects of Microbial Phenolic Acids on the Functions of Mitochondria // Toxicol. Lett. 2008. V. 180. P. 182-188.

93. Fedotcheva N.I., Kondrashova M.N. Opposite effects of 6-ketocholestanol anddehydroepiandrosterone on the coupling of mitochondria. In: "Biological motility", Pushchino, 2008. P. 149-153.

94. Fedotcheva N.I., Sokolov A.P., Kondrashova M.N. Nonenzymatic formation ofsuccinate in mitochondria under oxidative stress // Free Radie. Biol. 2006. V. 41. P. 56-64.

95. Fedotcheva N.I., Teplova V.V., Fedotcheva T.A., Rzheznikov V.M.,

96. Shimanovskii N.L. Effect of progesterone and its synthetic analogues on the activity of mitochondrial permeability transition pore in isolated rat liver mitochondria // Biochem. Pharmacology. 2009. V. 78. P. 1060-1068.

97. Felty Q., Xiong W.C., Sun D. et al. Estrogen-induced mitochondrial reactiveoxygen species as signal-transducing messengers // Biochemistry. 2005. Vol. 44. No 18. P. 6900-6909.

98. Ferte J. Analysis of the tangled relationships between p-glycoprotein-mediatedmultydrug resistance and the lipid phase of the cell membrane // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 277-294.

99. Formby B., Wiley T.S. Bcl-2, survivin and variant CD44v7-vl0 are downregulated and p53 is upregulated in breast cancer cells by progesterone:inhibition of cell growth and induction of apoptosis // FASEB J. 1999. V.13. No 8. P. 793-803.

100. Foster C.E., Bianchet M.A., Talalay P. et al. Crystal structure of humanquinone reductase type 2, a metalloflavoprotein // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 9881-9886.

101. Fox E., Bates S.E. Tariquidar (XR9576): a P-glycoprotein drug efflux pumpinhibitor // Expert Rev. Anticancer Ther. 2007. V. 7. No 4. P. 447-459.

102. Fox E.M., Davis R.J., Shupnik M.A. ERbeta in breast cancer—onlooker,passive player, or active protector? // Steroids. 2008. V. 73. No 11. P. 10391051.

103. Fröhlich M., Albermann N., Sauer A., et al. In vitro and ex vivo evidence formodulation of P-glycoprotein activity by progestins // Biochem. Pharmacol. 2004. V. 68. No 12. P. 2409-2416.

104. Fujimoto J., Ichigo S., Hirose R. et al. Clinical implication of expression ofprogesterone receptor form A and B mRNAs in secondary spreading of gynecologic cancers // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 62. No 5-6. P. 449-454.

105. Fukuda H., He P.J., Yokota K. et al. Progesterone-dependent and -independentexpression of the multidrug resistance type I gene in porcine granulosa cells // Mol. Cell Biochem. 2007. V. 298. No 1-2. P. 179-186.

106. Gabriel M.P., Storm J., Rothnie A. et al. Communication between thenucleotide binding domains of P-glycoprotein occurs via conformational changes that involve residue 508 // Biochemistry. 2003. V. 42. No 25. P. 7780-7789.

107. Gaddy V.T., Barrett J.T., Deik J.N. et al. Mifepristone induces growth arrest,caspase activation, and apoptosis of estrogen receptor-expressing, antiestrogen-resistant breast cancer cells // Clin. Cancer Res. 2004. V. 10. No 15. P. 5215-5225.

108. Gao X., Loggie B.W., Nawaz Z. The roles of sex steroid receptor coregulatorsin cancer // Mol.Cancer. 2002. V. 1. No 1. P. 7.

109. Gatti L., Cossa G., Beretta G.L., Zaffaroni N., Perego P. Novel insights intotargeting ATP-binding cassette transporters for antitumor therapy // Curr. Med. Chem. 2011. V. 18. No 27. P. 4237-4249.

110. Gavrilova-Jordan L.P., Price T.M. Actions of steroids in mitochondria //

111. Semin. Reprod. Med. 2007. Vol. 25. No 3. P. 154-164.

112. Gius D., Spitz D.R. Redox signaling in cancer biology // Antioxid. Redox

113. Signal. 2006. V. 8. P. 1249-1252.

114. Glavinas H., Kis E., Pal A. et al. ABCG2 (breast cancer resistanceprotein/mitoxantrone resistance-associated protein) ATPase assay: a useful tool to detect drug-transporter interactions // Drug Metab. Dispos. 2007. V. 35. No 9. P. 1533-1542.

115. Goetz M.E., Luch A. Reactive species: a cell damaging rout assisting tochemical carcinogens // Cancer Lett. 2008. V. 266. P. 73-83.

116. Gompel A, Somai S, Chaouat M, et al. Hormonal regulation of apoptosis inbreast cells and tissues // Steroids. 2000. V. 5. No 10-11. P. 593-598.

117. Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. Determination of serum proteinsby means of the biuret reaction // J. Biol. Chem. 1949. V. 177. P. 751-766.

118. Graham J.D., Clarke C.L. Expression and transcriptional activity ofprogesterone receptor A and progesterone receptor В in mammalian cells // Breast Cancer Res. 2002. V. 4. No 5. P. 187-190.

119. Griffiths D.G., Pringle M.J., Hughes J.B., Sanadi D.R. Environment of thesulfhydryl groups in bovine heart mitochondrial H+-ATPase // J. Bioenerg. Biomembr. 1984. V. 16. P. 465-475.

120. Habig W. H., Jakoby W. B. Assays for differentiation of glutathione Stransferases // Methods Enzymol. 1981. V. 77. P.398-405.

121. Hagedorn H.G., Nerlich A.G. Analysis of sex-hormone-receptor expression inlaryngeal carcinoma // Eur.Arch.Otorhinolaryngol. 2002. V. 259. No 4. P. 205-210.

122. Hagen T., D'Amico G., Quintero M. et al. Inhibition of mitochondrialrespiration by the anticancer agent 2-methoxyestradiol // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol. 322. No 3. P. 923-929.

123. Halestrap A.P. What is the mitochondrial permeability transition pore? J. Mol.

124. Cell Cardiol. 2009. V. 46. No 6. P. 821-831.

125. Han Y., Chin Tan T.M., Lim L.Y. In vitro and in vivo evaluation of the effectsof piperine on P-gp function and expression // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2008. V. 230. No 3. P. 283-289.

126. Hanekamp E.E., Kiihne L.M., Grootegoed J.A. et al. Progesterone receptor Aand B expression and progestagen treatment in growth and spread of endometrial cancer cells in nude mice // Endocr. Relat. Cancer. 2004. V. 11. No 4. P. 831-841.

127. Hao X., Widersten M. Co-variation of GST expression and cytostatic drugresistance in HELA cells: establishment of class Mu GST M3-3 as the domaining isoenzyme // Biochem.J. 1994. V. 297 P.59-67.

128. Hardin C., Pommier R., Calhoun K. et al. A new hormonal therapy forestrogen receptor-negative breast cancer // World J. Surg. 2007. V. 31. No 5. P. 1041-1046.

129. Hayashi S.I., Eguchi H., Tanimoto K. et al. The expression and function ofestrogen receptor alpha and beta in human breast cancer and its clinical application // Endocr. Relat. Cancer. 2003. V. 10. No 2. P. 193-202.

130. Hayeshi R., Chinyanga F., Chengedza S., Mukanganyama S. Inhibition ofhuman glutathione transferases by multidrug resistance chemomodulators in vitro // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2006. V. 21. No 5. P. 581-587.

131. He G., Liang C., Lippard S.J. Steroid hormones induce HMG1 overexpressionand sensitize breast cancer cells to cisplatin and carboplatin // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 2000. V. 97. No 11. P. 5768-5772.

132. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res. 1996. № 6. P. 986994.

133. Heldring N., Pike A., Andersson S. et al. Estrogen receptors: how do theysignal and what are their targets // Physiol. Rev. 2007. V. 87. No 3. P. 905931.

134. Herzog C.E., Tsokos M., Bates S.E., Fojo A.T. Increased mdr-l/Pglycoprotein expression after treatment of human colon carcinoma cells with P-glycoprotein antagonists // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. No 4. P. 29462952.

135. Higgins C.F., Linton K.J. The ATP switch model for ABC transporters // Nat.

136. Struct. Mol. Biol. 2004. V. 11. No 10. P. 918-926.

137. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNAamplification reactions//Biotechnology. 1993. № 11. P. 1026-1030.

138. Honjo Y., Hrycyna C.A., Yan Q.W. et al. Acquired mutations in the

139. MXR/BCRP/ABCP gene alter substrate specificity in MXR/BCRP/ABCP-overexpressing cells. // Cancer Res. 2001 V. 61. No 18. P. 6635-6639.

140. Hopper-Borge E., Xu X., Shen T. et al. Human multidrug resistance protein 7

141. ABCC10) is a resistance factor for nucleoside analogues and epothilone // B. Cancer Res. 2009. V. 69. No 1. P. 178-184.

142. Hu Y.F., Lau K.M., Ho S.M., Russo J. Increased expression of estrogenreceptor beta in chemically transformed human breast epithelial cells // Int. J. Oncol. 1998. V. 12. No 6. P. 1225-1228.

143. Humphries K.M., Szweda L.I. Selective inactivation of alpha-ketoglutaratedehydrogenase and pyruvate dehydrogenase: reaction of lipoic acid with 4-hydroxy-2-nonenal //Biochemistry. 1998. V. 37. P. 15835-15841.

144. Irwin R.W., Yao J., Hamilton R.T., Cadenas E. et al. Progesterone andestrogen regulate oxidative metabolism in brain mitochondria // Endocrinology. 2008. Vol. 149. No 6. P. 3167-3175.

145. Ishida H., Okabe M., Gomi K. et al. Modulation of adriamycin resistance inhuman breast carcinoma MCF-7 cells in vitro and in vivo by medroxyprogesterone acetate // Jpn.J.Cancer Res. 1994. V. 85. No 5. P. 542549.

146. Ishii I., Kitada M. Multidrug-resistance by induction of inactivation for anticancer drugs // Nihon Rinsho. 1997. V. 55. No 5. P. 1044-1049.

147. Jabr-Milane L.S., van Vlerken L.E., Yadav S., Amiji M.M. Multi-functionalnanocarriers to overcome tumor drug resistance // Cancer Treat. Rev. 2008. V. 34. No 7. P. 592-602.

148. Janas E., Hofacker M., Chen M. et al. The ATP hydrolysis cycle of thenucleotide-binding domain of the mitochondrial ATP-binding cassette transporter Mdllp // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. No 29. P. 26862-26869.

149. Janvilisri T., Venter H., Shahi S. et al. Sterol transport by the human breastcancer resistance protein (ABCG2) expressed in 'Lactococcus lactis' // J.Biol.Chem. 2003. V. 278. No 23. P. 20645-20651.

150. Jensen E. V., Numata M., Brecher P. I. Hormone-receptor interaction as aguide to biochemical mechanism // Biochem. Soc. Symp. 1971. Vol.32. P. 133-159.

151. Johnson D., Lardy H.A. Isolation of liver or kidney mithochondria // Methods

152. Enzymol. 1967. V. 10. P. 94-96.

153. Kalivendi S.V., Kotamraju S., Zhao H. et al. Doxorubicin-induced apoptosisis associated with increased transcription of endothelial nitric-oxide synthase // J.Biol.Chem. 2001. V. 276. No 50. P. 47266-47276.

154. Kalken, van C.K., Broxterman H.J., Pinedo H.M. et al. Cortisol is transportedby the multidrug resistance gene product P-glycoprotein // Br.J.Cancer. 1993. V. 67. No 2. P. 284-289.

155. Kambayashi Y., Ogino K.J. Reestimation of Cypridina luciferin analogs

156. MCLA) as a chemiluminescence probe to detect active oxygen species-cautionary note for use of MCLA // Toxicol. Sci. 2003. V. 28. P. 139-148.

157. Katyare S.S., Modi H.R., Patel M.A. Dehydroepiandrosterone treatment alterslipid/phospholipid profiles of rat brain and liver mitochondria // Curr. Neurovasc. Res. 2006. Vol. 3. No 4. P. 273-279.

158. Kerr I.D., Haider A. J., Gelissen I.C. The ABCG family of membraneassociated transporters: you don't have to be big to be mighty // Br. J. Pharmacol. 2010. doi: 10.1111/j.1476-5381.2010.01177.x. Epub ahead of print.

159. Klijn J.G., Setyono-Han B., Foekens J.A. Progesterone antagonists andprogesterone receptor modulators in the treatment of breast cancer // Steroids. 2000. V. 65. No 10-11. P. 825-830.

160. Kuang Y., Shen T., Chen X. et al. Lapatinib and erlotinib are potent reversalagents for MRP7 (ABCClO)-mediated multidrug resistance // Biochem. Pharmacol. 2010. V. 79. No 2. P. 154-161.

161. Kuiper G.G., Enmark E., Pelto-Huikko M. et al. Cloning of a novel receptorexpressed in rat prostate and ovary // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. No 12. P. 5925-5930.

162. Kuo MT. Redox regulation of multidrug resistance in cancer chemotherapy:molecular mechanisms and therapeutic opportunities // Antioxid. Redox Signal. 2009. V. 11. No l.P. 99-133.

163. Lange C.A. Integration of progesterone receptor action with rapid signalingevents in breast cancer models // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008. V. 108. No 3-5. P. 203-212.

164. Lange C.A., Richer J.K., Horwitz K.B. Hypothesis: Progesterone primesbreast cancer cells for cross-talk with proliferative or antiproliferative signals // Mol. Endocrinol. 1999. V. 13. No 6. P. 829-836.

165. Lee E., Enomoto R., Koshiba C., Hirano H. Inhibition of P-glycoprotein bywogonin is involved with the potentiation of etoposide-induced apoptosis in cancer cells//Ann. NY Acad. Sci. 2009. V. 1171. P. 132-136.

166. Leonhardt S.A., Boonyaratanakornkit V., Edwards D.P. Progesterone receptortranscription and non-transcription signaling mechanisms // Steroids. 2003. V. 68. No 10-13. P. 761-770.

167. Leung A.W., Halestrap A.P. Recent progress in elucidating the molecularmechanism of the mitochondrial permeability transition pore // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1777. P. 946-952.

168. Lewin J., Cooper A., Birch B. Progesterone: a novel adjunct to intravesicalchemotherapy // BJU Int. 2002. V. 90. No 7. P. 736-741.

169. Li J., Xu L., He K. et al. Reversal effects of nomegestrol acetate on multidrugresistance in adriamycin-resistant MCF7 breast cancer cell line // Breast Cancer Res. 2001. V. 3. N 4. P. 253-263.

170. Li R., Wu R., Zhao L. et al. P-glycoprotein antibody functionalized carbonnanotube overcomes the multidrug resistance of human leukemia cells // ACS Nano. 2010. V. 4. No 3. P. 1399-1408.

171. Limtrakul P. Curcumin as chemosensitizer // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. V.595. P. 269-300.

172. Lin T.K., Hughes G., Muratovska A. et al. Specific modification ofmitochondrial protein thiols in response to oxidative stress: a proteomics approach // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 17048-17056.

173. Lin Y., Kokontis J., Tang F. et al. Androgen and its receptor promote Baxmediated apoptosis //Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26. No 5. P. 1908-1916.

174. Lindenmaier H., Becker M., Haefeli W.E., Weiss J. Interaction of progestinswith the human multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) // Drug Metab. Dispos. 2005. V. 33. No 11. P. 1576-1579.

175. Loo T.W., Clarke D.M. Covalent modification of human P-glycoproteinmutants containing a single cysteine in either nucleotide-binding fold abolishes drug-stimulated ATPase activity // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. No 39. P. 22957-22961.

176. Lu A., Frink M., Choudhry M.A. et al. Mitochondria play an important role in17beta-estradiol attenuation of H(2)0(2)-induced rat endothelial cell apoptosis // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2007. Vol. 292. No 2. P. E585-E593.

177. Maki N., Moitra K., Silver C. et al. Modulator-induced interference infunctional cross talk between the substrate and the ATP sites of human P-glycoprotein // Biochemistry. 2006. V. 45. No 8. P. 2739-2751.

178. Mann S., Laucirica R., Carlson N. et al. Estrogen receptor beta expression ininvasive breast cancer // Hum. Pathol. 2001. V. 32. No 1. P. 113-118.

179. Martin M.B., Reiter R., Pham T. et al. Estrogen-like activity of metals in

180. MCF-7 breast cancer cells // Endocrinology. 2003. V. 144. No 6. P. 24252436.

181. Masuyama H., Nakatsukasa H., Takamoto N., Hiramatsu Y. Down-regulationof pregnane X receptor contributes to cell growth inhibition and apoptosis by anticancer agents in endometrial cancer cells // Mol. Pharmacol. 2007. V. 72. No 4. P. 1045-1053.

182. Matin K., Egorin M.J., Ballesteros M.F. et al. Phase I and pharmacokineticstudy of vinblastine and high-dose megestrol acetate // Cancer Chemother. Pharmacol. 2002. V. 50. No 3. P. 179-185.

183. Matthews J., Gustafsson J.A. Estrogen signaling: a subtle balance between ERalpha and ER beta // Mol. Interv. 2003. V. 3. No 5. P. 281-292.

184. Mattingly K.A., Ivanova M.M., Riggs K.A. et al. Estradiol stimulatestranscription of nuclear respiratory factor-1 and increases mitochondrial biogenesis // Mol. Endocrinol. 2008. Vol. 22. No 3. P. 609-622.

185. Mayur Y.C. Design of new drug molecules to be used in reversing multidrugresistance in cancer cells // Curr. Cancer Drug Targets. 2009. V. 9. No 3. P. 298-306.

186. McRae M.P., Brouwer K,L., Kashuba A.D. Cytokine regulation of Pglycoprotein // Drug Metab. Rev. 2003. V. 35. No 1. P. 19-33.

187. McStay G.P., Clarke S.J., Halestrap A.P. Role of critical thiol groups on thematrix surface of the adenine nucleotide translocase in the mechanism of the mitochondrial permeability transition pore // Biochem. J. 2002. V. 367. Pt 2. P. 541-548.

188. Mealey K.L., Barhoumi R., Burghardt R.C. et al. Doxycycline inducesexpression of P glycoprotein in MCF-7 breast carcinoma cells // Antimicrob. Agents Chemother. 2002 V. 46. No 3. P. 755-761.

189. Meng J., You Z., Guo Y. Effects of estradiol and medroxyprogesterone on thegrowth and doxorubin-resistance of drug-resistant human epithelial ovarian cancer cell line OVCAR-3 // Zhonghua Fu.Chan.Ke.Za.Zhi. 1999. V. 34. No 11. P. 670-673.

190. Miyaguchi C., Muranaka S., Kanno T. et al. 17beta-estradiol suppresses

191. ROS-induced apoptosis of CHO cells through inhibition of lipid peroxidation-coupled membrane permeability transition // Physiol. Chem. Phys. Med. NMR. 2004. Vol. 36. No 1. P. 21-35.

192. Mizutani Т., Masuda M., Nakai E., Furumiya K. Genuine functions of Pglycoprotein (ABCB1) // Curr. Drug Metab. 2008. V. 9. No 2. P. 167-174.

193. Molino A., Pedersini R., Micciolo R. et al. Relationship between the thymidine labeling and Ki-67 proliferative indices in 126 breast cancer patients // Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 2002. V. 10. No 4. P. 304-309.

194. Montero G.G., Vanzulli S.I., Cerliani J.P. et al. Association of estrogenreceptor-alpha and progesterone receptor A expression with hormonal mammary carcinogenesis: role of the host microenvironment // Breast Cancer Res. 2007. V. 9. No 2. P. R22.

195. Moreira P.I., Custödio J., Moreno A. et al. Tamoxifen and estradiol interactwith the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure//J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. No 15. P. 10143-10152.

196. Morkunaite-Haime S., Kruglov A., Teplova V. et al. Reactive oxygen speciesare involved in the stimulation of the mitochondrial permeability transition by dihydrolipoate // Biochem. Pharmacol. 2003. V. 65. No 1. P. 43-49.

197. Morota S., Mänsson R., Hansson M.J. et al. Evaluation of putative inhibitorsof mitochondrial permeability transition for brain disorders—specificity vs. toxicity // Exp. Neurol. 2009. V. 218. P. 353-362.

198. Moskaleva E.Yu., Posypanova G.A., Shmyrev I.I. et al. Alpha-fetoproteinmediated targeting—a new strategy to overcome multidrug resistance of tumour cells in vitro // Cell. Biol. Int. 1997 V. 21. No 12. P. 793-799.

199. Mote P.A., Bartow S., Tran N., Clarke C.L. Loss of co-ordinate expression ofprogesterone receptors A and B is an early event in breast carcinogenesis // Breast Cancer Res. Treat. 2002. V. 72. No 2. P. 163-172.

200. Mukanganyama S., Bezabih M., Robert M. et al. The evaluation of novelnatural products as inhibitors of human glutathione transferase Pl-1 //J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2010 Oct 28. Epub ahead of print.

201. Mulac-Jericevic B., Conneely O.M. Reproductive tissue selective actions ofprogesterone receptors // Reproduction. 2004. V. 128. No 2. P. 139-146.

202. Muraoka S., Miura T. Thiol oxidation induced by oxidative action ofadriamycin // Free Radic. Res. 2004. V. 38. P. 963-968.

203. Murdoch W.J., Van Kirk E.A., Isaak D.D., Shen Y. Progesterone facilitatescisplatin toxicity in epithelial ovarian cancer cells and xenografts // Gynecol. Oncol. 2008. V. 110. No 2. P. 251-255.

204. Murphy L.C., Watson P.H. Is oestrogen receptor-beta a predictor of endocrinetherapy responsiveness in human breast cancer? // Endocr. Relat. Cancer. 2006. V. 13. No 2. P. 327-334.

205. Mutoh K., Tsukahara S., Mitsuhashi J. et al. Estrogen-mediated posttranscriptional down-regulation of P-glycoprotein in MDR1-transduced human breast cancer cells // Cancer Sci. 2006. V. 97. No 11. P. 1198-1204.

206. Nahleh Z. Androgen receptor as a target for the treatment of hormonereceptor-negative breast cancer: an unchartered territory // Future Oncol. 2008. V. 4. No l.P. 15-21.

207. Naito M., Yusa K., Tsuruo T. Steroid hormones inhibit binding of Vincaalkaloid to multidrug resistance related P-glycoprotein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 158. No 3. P. 1066-1071.

208. Nguyen H., Syed V. Progesterone inhibits growth and induces apoptosis incancer cells through modulation of reactive oxygen species // Gynecol. Endocrinol. 2010. Dec 21. Epub ahead of print

209. Nuessler V., Stotzer O., Gullis E. et al. Bcl-2, bax and bcl-xL expression inhuman sensitive and resistant leukemia cell lines // Leukemia. 1999. V. 13. No 11. P. 1864-1872.

210. Nulton-Persson A.C., Szweda L.I. Modulation of mitochondrial function byhydrogen peroxide // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 23357-23361.

211. Orlowski S., Mir L.M., Belehradek J.Jr., Garrigos M. Bromocriptinemodulates P-glycoprotein function // Biochem.J. 1996. V. 317. Pt. 2. P. 515522.

212. Pagnini U., Pacilio C., Florio S. et al. Medroxyprogesterone acetate increasesanthracyclines uptake in chronic lymphatic leukemia cells: role of nitric oxide and lipid peroxidation // Anticancer Res. 2000. V. 20. No 1 A. P. 3342.

213. Pedram A., Razandi M., Wallace D.C., Levin E.R. Functional estrogenreceptors in the mitochondria of breast cancer cells // Mol. Biol. Cell. 2006. Vol. 17. No 5. P. 2125-2137.

214. Perez-Victorias F.J., Conseil G., Munoz-Martinez F. et al. RU49953: a nonhormonal steroid derivative that potently inhibits P-glycoprotein and reverts cellular multidrug resistance // Cell Mol. Life Sci. 2003. V. 60. No 3. P. 526535.

215. Petit E., Courtin A., Kloosterboer H.J. et al. Progestins induce catalaseactivities in breast cancer cells through PRB isoform: correlation with cell growth inhibition // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2009. V. 115. No 3-5. P. 153-160.

216. Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. Relative expression software tool

217. REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. No 9. P. e36.

218. Psarra A.M., Sekeris C.E. Steroid and thyroid hormone receptors inmitochondria // IUBMB Life. 2008. Vol. 60. No 4. P. 210-223.

219. Purmonen S., Ahola T.M., Pennanen P. et al. HDLG5/KIAA0583, encoding a

220. MAGUK-family protein, is a primary progesterone target gene in breast cancer cells // Int.J.Cancer. 2002. V. 102. No 1. P. 1-6.

221. Rajkumar T. Gullick W.J. The type I growth factor receptors in human breastcancer // Breast Cancer Res. Treat. 1994. V. 29. P. 3.

222. Ravi D., Das K.C. Redox-cycling of anthracyclines by thioredoxin system:increased superoxide generation and DNA damage // Cancer. Chemother. Pharmacol. 2004. V. 54. P. 449-458.

223. Ravna AW, Sager G. Molecular modeling studies of ABC transportersinvolved in multidrug resistance // Mini Rev. Med. Chem. 2009. V. 9. No 2. P. 186-193.

224. Razmara A., Sunday L., Stirone C. et al. Mitochondrial effects of estrogenare mediated by estrogen receptor alpha in brain endothelial cells // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008. Vol. 325. No 3. P. 782-790.

225. Regev R., Assaraf Y.G., Eytan G.D. Membrane fluidization by ether, otheranesthetics, and certain agents abolishes P-glycoprotein ATPase activity and modulates efflux from multydrug-resistant cells // Eur. J. Biochem. 1999. V. 259. No 1-2. P. 18-24.

226. Requejo R., Hurd T.R., Costa N. J., Murphy M.P. Cysteine residues exposedon protein surfaces are the dominant intramitochondrial thiol and may protect against oxidative damage // FEBS J. 2010. V. 277. P. 1465-1480.

227. Richer J.K., Jacobsen B.M., Manning N.G. et al. Differential gene regulationby the two progesterone receptor isoforms in human breast cancer cells // J.Biol.Chem. 2002. V. 277. No 7. P. 5209-5218.

228. Rodriguez G.C., Rimel B.J., Watkin W. et al. Progestin treatment inducesapoptosis and modulates transforming growth factor-beta in the uterine endometrium // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2008. V. 17. No 3. P. 578-584.

229. Roger P., Sahla M.E., Makela S. et al. Decreased expression of estrogenreceptor beta protein in proliferative preinvasive mammary tumors // Cancer Res. 2001. V. 61. No 6. P. 2537-2541.

230. Rosenberg M.F., Velarde G., Ford R.C. et al. Repacking of thetransmembrane domains of P-glycoprotein during the transport ATPase cycle // EMBO J. 2001. V. 20. Mo 20. P. 5615-5625.

231. Roskoski R. Jr. The ErbB/HER receptor protein-tyrosine kinases and cancer //

232. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 319. No 1. P. 1-11.

233. Rugo H.S. The breast cancer continuum in hormone-receptor-positive breastcancer in postmenopausal women: evolving management options focusing on aromatase inhibitors // Ann. Oncol. 2008. V. 19. No 1. P. 16-27.

234. Safiulina D., Peet N., Seppet E. et al. Dehydroepiandrosterone inhibitscomplex I of the mitochondrial respiratory chain and is neurotoxic in vitro and in vivo at high concentrations // Toxicol. Sci. 2006. Vol. 93. No 2. P. 348-356.

235. Sager G., Orbo A., Jaeger R., Engstrom C. Non-genomic effects of progestins—inhibition of cell growth and increased intracellular levels of cyclic nucleotides // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 84. No 1. P. 1-8.

236. Saha P., Yang J. J., Lee V.H. Existence of a p-glycoprotein drug efflux pumpin cultured rabbit conjunctival epithelial cells // Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 1998. V. 39, No 7. P. 1221-1226.

237. Saji S., Hirose M., Toi M. Clinical significance of estrogen receptor beta inbreast cancer // Cancer Chemother. Pharmacol. 2005. V. 56. Suppl 1. P. 2126.

238. Salerno S., Da Settimo F., Taliani S. et al. Recent advances in thedevelopment of dual topoisomerase I and II inhibitors as anticancer drugs // Curr. Med. Chem. 2010. V. 17. No 35. P. 4270-4290.

239. Santen R.J., Song R.X., McPherson R. et al. The role of mitogen-activatedprotein (MAP) kinase in breast cancer // J. Steroid Biochem. Mol. Biol.2002. V. 80. No 2. P. 239-256.

240. Sauna Z.E., Smith M.M., Muller M. et al. The mechanism of action ofmultidrug-resistance-linkedP-glycoprotein// J. Bioenerg. Biomembr. 2001. V. 33. No 6. P. 481-491.

241. Scheller K., Sekeris C.E. The effects of steroid hormones on the transcriptionof genes encoding enzymes of oxidative phosphorylation // Exp. Physiol.2003. Vol. 88. No 1. P. 129-140.

242. Schindler A.E., Campagnoli C., Druckmann R. et al. Classification andpharmacology of progestins // Maturitas. 2008. V. 61. P. 171-180.

243. Scotto K.W., Johnson R.A. Transcription of the multidrug resistance gene

244. MDR1: a therapeutic target // Mol. Interv. 2001. V. 1. No 2. P. 117-125.

245. Seeger H., Wallwiener D., Mueck A.O. The effect of progesterone andsynthetic progestins on serum- and estradiol-stimulated proliferation of human breast cancer cells // Horm. Metab. Res. 2003. V. 35. No 2. P. 76-80.

246. Shapiro A.B., Fox K., Lam P. Stimulation of P-glycoprotein-mediated drugtransport by prazosin and progesterone // Eur. J. Biochem. 1999. V. 259. P. 841-850.

247. Shapiro A.B., Ling V. Stochiometry of coupling of rhodamine 123 transportto ATP hydrolysis by P-glycoprotein // Eur.J.Biochem. 1998. V. 254. P. 189-193.

248. Shi Z., Peng X.X., Kim I.W., Shukla S. Erlotinib (Tarceva, OSI-774)antagonizes ATP-binding cassette subfamily B member 1 and ATP-binding cassette subfamily G member 2-mediated drug resistance // Cancer Res. 2007. V. 67. No 22. P. 11012-11020.

249. Shimada H., Hirai K., Simamura E., Pan J. Mitochondrial NADH-quinoneoxidoreductase of the outer membrane is responsible for paraquat cytotoxicity in rat livers // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 351. P. 75-81.

250. Sikic B.I., Fisher G.A., Lum B.L. et al. Modulation and prevention ofmultidrug resistance by inhibitors of P-glycoprotein // Cancer Chemother. Pharmacol. 1997. V. 40. P. S13-S19.

251. Singh M., Dykens J.A., Simpkins J.W. Novel mechanisms for estrogeninduced neuroprotection // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2006. Vol. 231. No 5. P. 514-521.

252. Sitruk-Ware R. Progestogens in hormonal replacement therapy: newmolecules, risks, and benefits // Menopause. 2002. V. 9. No 1. P. 6-15.

253. Sitruk-Ware R. Pharmacology of different progestogens: the special case ofdrospirenone // Climacteric. 2005. V. 8. Suppl. No 3. P. 4-12.

254. Sitruk-Ware R., Plu-Bureau G. Exogenous progestagens and the human breast

255. Maturitas. 2004. V. 49. No 1. P. 58-66.

256. Skliris G.P., Leygue E., Watson P.H., Murphy L.C. Estrogen receptor alphanegative breast cancer patients: estrogen receptor beta as a therapeutic target // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2008. V. 109. No 1-2. P. 1-10.

257. Soldati R., Wargon V., Cerliani J.P. et al. Inhibition of mammary tumorgrowth by estrogens: is there a specific role for estrogen receptors alpha and beta // Breast Cancer Res. Treat. 2010. V. 123. No 3. P. 709-724.

258. Starkov A.A., Simonyan R.A., Dedukhova V.I. et al. Regulation of the energycoupling in mitochondria by some steroid and thyroid hormones // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1318. No 1-2. P. 173-183.

259. Stowe D.F., Camara A.K. Mitochondrial reactive oxygen species productionin excitable cells: modulators of mitochondrial and cell function // Antioxid. Redox Signal. 2009. V. 11. P. 1373-1414.

260. Swierczynski J., Mayer D. Dehydroepiandrosterone-induced lipidperoxidation in rat liver mitochondria // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1996. Vol. 58. No 5-6. P. 599-603.

261. Szewczyk A., Wojtczak L. Mitochondria as a pharmacological target //

262. Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 101-127.

263. Tahara E.B., Navarete F.D.T., Kowaltowski A.J. Tissue-, substrate-, and sitespecific characteristics of mitochondrial reactive oxygen species generation // Free Rad.Biol.Med. 2009. V. 46. P. 1283-1297.

264. Takebayashi Y., Nakayama K., Fujioka T. Expression of multidrug resistanceassociated transporters (MDR1, MRP1, LRP and BCRP) in porcine oocyte // Int. J. Mol. Med. 2001. V. 7. No 4. P. 397-400.

265. Thomas H., Coley H.M. Overcoming multidrug resistance in cancer: an updateon the clinical strategy of inhibiting p-glycoprotein // Cancer Control. 2003. V. 10. No 2. P. 159-165.

266. Thomas H.D., Calabrese C.R., Batey M.A. et al. Preclinical selection of anovel poly(ADP-ribose) polymerase inhibitor for clinical trial // Mol. Cancer Ther. 2007. V. 6. No 3. P. 945-956.

267. Thuneke I., Schulte H.M., Bamberger A.M. Biphasic effect ofmedroxyprogesterone-acetate (MPA) treatment on proliferation and cyclin D1 gene transcription in T47D breast cancer cells. // Breast Cancer Res.Treat. 2000. V. 63. No 3. P. 243-248.

268. Tiziani S., Lodi A., Khanim F.L. et al. Metabolomic profiling of drugresponses in acute myeloid leukaemia cell lines // PLoS One. 2009. V. 4. No 1.e4251.

269. Townsend D.M., Tew K.D. The role of glutathione-S-transferase in anticancer drug resistance // Oncogene. 2003. V. 22. No 47. P. 7369-7375.

270. Tsang W.P., Chau S.P., Kong S.K. et al. Reactive oxygen species mediatedoxorubicin induced p53-independent apoptosis // Life Sci. 2003. V. 73. P. 2047-2058.

271. Tsujimoto Y., Nakagawa T., Shimizu S. Mitochondrial membranepermeability transition and cell death // Biochim. Biophys. Acta. 2006. V. 1757, No 9-10. P. 1297-1300.

272. Tung L., Shen T., Abel M.G. et al. Mapping the unique activation function 3in the progesterone B-receptor upstream segment. Two LXXLL motifs and a tryptophan residue are required for activity // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. No 43. P. 39843-39851.

273. Vegeto E., Shabaz M.M., Wen D.X. et al. Human progesterone receptor Aform is a cell- and promoter- specific repressor of human progesteron receptor B function // Mol. Endocrinol. 1993. V. 7. P. 1244-1255.

274. Votyakova T.V., Reynolds I.J. Detection of hydrogen peroxide with Amplex

275. Red: interference by NADH and reduced glutathione auto-oxidation // Arch. Biochem. Biophys. 2004. V. 431. P. 138-144.

276. Wadler S., Subar M., Green M.D. et al. Phase II trial of oral methotrexate anddipyridamole in colorectal carcinoma // Cancer Treat. Rep. 1987. V. 71. No 9. P. 821-824.

277. Wang B., Xiao C., Goff A.K. Progesterone-modulated induction of apoptosisby interferon-tau in cultured epithelial cells of bovine endometrium in vitro // Biol. Reprod. 2003. V. 68. No 2. P. 673-679.

278. Wang E., Casciano C.N., Clement R.P., Johnson W.W. Cholesterolinteraction with the daunorubicin binding site of P-glycoprotein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 276. P. 909-916.

279. Wang H., Mao Y., Chen A.Y. et al. Stimulation of topoisomerase II-mediated

280. DNA damage via a mechanism involving protein thiolation // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 3316-3323.

281. Wang K., Ramji S., Bhathena A. et al. Glutathione S-transferases in wild-typeand doxorubicin-resistant MCF-7 human breast cancer cell lines // Xenobiotica. 1999. V. 29. No 2. P. 155-170.

282. Wang X., Simpkins J.W., Dykens J.A., Cammarata P.R. Oxidative damage tohuman lens epithelial cells in culture: estrogen protection of mitochondrial potential, ATP, and cell viability // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. Vol. 44. No 5. P. 2067-2075.

283. Weaver J.L., Pine P.S., Aszalos A. et al. Laser scanning and confocalmicroscopy of daunorubicin, doxorubicin, and rhodamine 123 in multidrug-resistant cells // Exp Cell Res. 1991. V. 196. No 2. P. 323-329.

284. Wielinga P.R., Heijn M., Westerhoff H.V., Lankelma J. A method forstudying plasma membrane transport with intact cells using computerized fluorometry // Anal. Biochem. 1998. V.263. No 2. P. 221-231.

285. Wielinga P.R., Westerhoff H.V., Lankelma J. The relative importance ofpassive and P-glycoprotein mediated anthracycline efflux from multidrug-resistant cells // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. No 3. P. 649-657.

286. Xu B., Kitawaki J., Koshiba H. et al. Differential effects of progestogens, bytype and regimen, on estrogen-metabolizing enzymes in human breast cancer cells // Maturitas. 2007. V. 56. No 2. P. 142-152.

287. Xue C., Haber M., Flemming C. et al. p53 determines multidrug sensitivityof childhood neuroblastoma // Cancer Res. 2007. V. 67. No 21. P. 1035110360.

288. Yager J.D., Chen J.Q. Mitochondrial estrogen receptors new insights intospecific functions // Trends Endocrinol. Metab. 2007. Vol. 18. No 3. P. 8991.

289. Yang C.P., Cohen D., Greenberger L.M. et al. Differential transport propertiesof two mdr gene products are distinguished by progesterone // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. No 18. P. 10282-10288.

290. Yang K., Wu J., Li X. Recent advances in the research of P-glycoproteininhibitors // Biosci. Trends. 2008. V. 2. No 4. P. 137-146.

291. Yellaturu C.R., Bhanoori M., Neeli I., Rao G.N. N-Ethylmaleimide inhibitsplatelet-derived growth factor BB-stimulated Akt phosphorylation via activation of protein phosphatase 2 A. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 40148-40155.

292. Yokoyama Y., Shinohara A., Takahashi Y. et al. Synergistic effects of danazol and mifepristone on the cytotoxicity of UCN-01 in hormone-responsive breast cancer cells // Anticancer Res. 2000. V. 20. No 5A. P. 3131-3135.

293. Zampieri L., Bianchi P., Ruff P., Arbuthnot P. Differential modulation byestradiol of P-glycoprotein drug resistance protein expression in cultured MCF7 and T47D breast cancer cells // Anticancer Res. 2002. V. 22. No 4. P. 2253-2259.

294. Zeinyeh W., Alameh G., Radix S. et al. Design, synthesis and evaluation ofprogesterone-adenine hybrids as bivalent inhibitors of P-glycoprotein-mediated multidrug efflux // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010. V. 20. No 10. P. 3165-3168.

295. Zhang W., Ling V. Cell-cycle-dependent turnover of P-glycoprotein inmultidrug-resistant cells // J.Cell Physiol. 2000. V. 184. No 1. P. 17-26.

296. Zhou S.F., Wang L.L., Di Y.M. et al. Substrates and inhibitors of humanmultidrug resistance associated proteins and the implications in drug development // Curr. Med. Chem. 2008. V. 15. No 20. P. 1981-2039.

297. Zimmer G., Mainka L., Krüger E. Dihydrolipoic acid activates oligomycinsensitive thiol groups and increases ATP synthesis in mitochondria // Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 288. P. 609-613.