Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование цитостатических препаратов алкилирующего действия и антиметаболитов (фармацевтический анализ и фармакокинетика)

Н'Я - о ~ п

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ЛЮСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи БИСЕНБАЕВ, Эдвард Мухамеджановнч

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ АЛКИЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ И АНТИМЕТАБОЛИТОВ

(фармацевтический анализ и фармакокинетика)

15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

А В, ТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

/ ' ^ - .. Москва — 1992

* ■ У * ■' •

" > о /х А

г и

Работа выполнена на кафедре фармацевтической химии Алма-Атинского государственного медицинского института (зав. кафедрой — профессор А. С. Бейсенбеков) н в Онкологическом научном центре РАМН

Официальные оппоненты — доктор фармацевтических наук,

профессор В. Е. Чичиро доктор медицинских наук, профессор В. П. Жердев доктор химических наук, профессор Ю. А. Ершов

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт

фармации

Защита состоится _199 г.

в _ часов на заседании специализированного совета

Д-074.05.06 при Московской медицинской академии им. И. М.

Сеченова по адресу: 121019, г. Москва, Суворовский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И. М. Сеченова.

Автореферат разослан___199 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Д-074.05.06, кандидат фармацевтических наук, доцент

Н. П. Садчиковй

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЬ!

Актуальность темы. Одной из важнейших задач мбдицш!-ской науки является лечение злокачественных новообразований, имеющих тенденцию к росту. Противоопухолевые препараты в настоящее время занимают одно из первых мест в лечении злокачественных новообразований. Разработка новых лекарственных средств, совершенствование лекарственных форм, контроль их доброкачественности остаются на современном этане наиболее важными вопросами и здравоохранении и фармации.

Согласно прогнозам Н. Н. Трапезникова и В. .В. Двойри-на (1991) рост числа заболеваний раком достигнет максимума к 2000 году и в числе наиболее важных форм заболева* ний останутся рак молочной железы, органов пищеварения, дыхания и др.

В борьбе с злокачественными новообразованиями особое место занимает химиотерапия, применяющаяся в комбинаций с хирургическим лечением и лучевой терапией.

Изучаемая нами группа цитостатических препаратов включает препараты, полученные сравнительно недавно — гормоноцитостатики кортифен и тестифенон, сочетающие в себе свойства гормонов и цитостатических веществ, производных бис-(р-хлорэтил)-амина, а также антиметаболиты — 5-фторурацнл (5-ФУ) и фторафур (ФТ). Фторпроизводные пиримидина широко применяются в онкологии, однако фармацевтический анализ этих препаратов разработан недостаточно: реакции идентификации не определяют функциональные группы, от которых зависит фармакологический эффект, методики количественного определения неспецифичны.

Лекарственные формы, используемые в клинике вызывают нежелательные осложнения. Разработка моделей других лекарственных фор м (мазей, суппозиториев) по нашему мнению, позволит проводить лечение не только в клинике, но и в амбулаториях.

Цитостатические препараты кортифен и тестнфенон проходят первую фазу клинических .испытании, фармацевтический анализ этих веществ пока несовершенен, поэтому требуется разработка методик определения подлинности и количественного определения как самих препаратов, так и их лекарственных форм. Необходимы методики анализа пригодные как для клиник, так и для контрольно-аналитических лабораторий.

Для внедрения в клиническую практику кортифен а, тесгн-феиона и новых лекарственных форм мазей и суппозиториев 5-фторурацила и фторафура требуется обязательное исследование их фармакокинетики (ФК) и биодоступности.

Цель работы: комплексное выполнение цикла исследований, взаимосвязанных единым методологическим подходом, заключающимся в последовательном развитии и совершенст-нованпн методов анализа противоопухолевых препаратов при оценке лх качества и для исследования фармакокинетики лекарственных форм исследуемых препаратов.

Задачи исследования:

— изучение современного состояния вопроса о методах исследования цитостатиков производных бис-(р-хлорэтил) -амина, гормональных веществ, производных циклопентан-иергидрофенантрена и фторпроизводных пиримидина;

— разработка реакций идентификации препаратов, отличающихся большей избирательностью, чувствительностью, пригодных для определения исследуемых веществ в лекарственных формах и в биологических жидкостях;

— разработка надежных и достаточно чувствительных методик количественного определения гормоноцитостатиков кортп-фена и тестифенона, а также фторпроизводных пиримидина 5-фторурацила л фторафура в лекарственных формах и и биологических объектах;

— разработка методики определения п-бнс(р-хлорэтпл)-оминофенилуксусноп кислоты (БХФК), как специфической примеси в цитостатиках алкилирующего действия;

— разработка требований и методов контроля предлагаемых лекарственных форм (суппозитории и мази фторпроизводных пиримидина);

— определение токсичности и химиотерапевтическои активности 5-ФУ и ФТ;

— изучение оптимальных условий выделения изучаемых веществ из биологических объектов (кровь, моча, внутренние органы) для разработки методики их анализа в биологических жидкостях;

— определение величины биодоступности препаратов при различных способах их введения экспериментальным животным;

— фармакокинетические исследования па животных для оценки лекарственных форм препаратов;

— создание проектов временных фармакопейных статей (ВФС) на мазь и суппозитории ФТ, внесение изменений в ВФС на методики количественного определения кортифена в лекарственных формах.

Научная новизна. Впервые разработаны методики количественного определения кортифена и тестифенона, основанные на:

а) реакции образования полиметиновых красителей;

б) реакции с 2,4-динитрофенплгидразином;

в) гидроксаматной реакции и

г) реакции образования фармазана для кортифена, отличающиеся от известных ранее возможностью определения по функциональным группам, обусловливающим специфическую активность цптостатиков.

Ыа методику определения подлинности кортифена по реакции образования фармазана получено авторское свидетельство на изобретение № 1642336—1991 г. «Способ качественного определения кортикостерондов, аскорбиновой кислоты и фурацилина».

Впервые разработана методика количественного определения БХФК, применяемой при синтезе цитостатических препаратов и анализируемой как специфическая примесь ( в т. ч. в кортифене и тестифеноне). На методику количественного определения этого вещества получено положительное решение НИИГПЭ о выдаче патента на «Способ количественного определения вещества, содержащего хлорал-кильную группу» от 26.11.91 г.

Впервые разработаны методики количественного определения 5-ФУ и ФТ в лекарственных формах, основанные на реакциях азосочетания, окисления и образования комплекс-пых соединений с солями кобальта. На методику количественного определения ФТ по реакции окисления получено

положительное решение НИИГПЭ о выдаче авторского свидетельства на «Способ количественного определения фтора-фура» от 10.12.90 г.

Впервые изучено связывание кортифена и тестифенона с белками. Впервые исследована фармакокинетика кортифена и тестифенона у мышей, установлена величина биологической доступности препарата при различных путях его введения.

Впервые изучена фармакокинетика 5-ФУ и ФТ в мазях и суппозиториях, определена их биодоступность.

Практическая значимость. Способ количественного определения БХФК в субстанции и цитостатиках предлагается для использования в заводских лабораториях .химико-фармацевтических заводов, выпускающих <и контролирующих цито-статикн. Методика внедрена в лаборатории химико-фармацевтического анализа онкологического научного центра (ОНЦ). РАМН.

Реакция образования полиметиновых красителей и реакция с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) использованы для изучения фармакокинетики препаратов при доклиническом изучении.

Методика определения степени окисленностн кортифена внедрена в опытно-наработочнон лаборатории и в лаборатории химико-фармацевтического анализа ОНЦ РАМН.

Токсикологическая характеристика и результаты изучения фармакокинетики мазей и суппозиториев 5-ФУ и ФТ внедрены в Казахском научно-исследовательском институте онкологии и радиологии для использования при углубленном клиническом -изучении'этих лекарственных форм.

Методика определения цитостатическпх препаратов, производных бис(р-хлорэтил) -амина, основанная на реакции образования полиметиновых красителей, внедрена в учебном процесс в Алма-Атинском, Кыргызском и Туркменском медицинских институтах.

Проекты ВФС на мази и суппозитории ФТ переданы в Фармакопейный комитет Министерства здравоохранения Республики Казахстан.

Внесены изменения в ВФС на количественное определение кортифена в 0,4 и 1,25% масляных растворах препарата по реакции образования фармазапа. (1

На защиту выносятся:

— обоснование целесообразности комплексного химико-фармацевтического и доклинического фармакокипетического исследования гормоноцнтостатиков алкилирующего действия и фторпронзводных пиримидина;

— результаты изучения химических свойств исследуемых препаратов и разработанные на их основе реакции подлинности;

— теоретическое обоснование и разработка методик количественного определения кортифена и тестифенона фотометрическими методами по реакциям образования полнметиновых красителей, реакции с 2,4-ДНФГ, реакции образования фармазана, гидроксаматной реакции в субстанциях, лекарственных формах и в биологических объектах;

— научное обоснование и разработка методики определения БХФК фотометрическим методом как специфической примеси ь цитостатиках;

— теоретическое обоснование и экспериментальная разработка количественного определения 5-ФУ и ФТ фотометрическими методами по реакции с ацетатом кобальта, реакции образования азокрасителей н окисления в лекарственных формах;

— экспериментальные данные изучения фармакокинетикп гормоноцнтостатиков кортифена и тестифенона и фторпронзводных пиримидина — 5-ФУ и ФТ.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований докладывались на III съезде фармацевтов Казахской ССР (Кустанай, 1987), V Всероссийском съезде фармацевтов (Ярославль, 1987), Республиканской конференции научного общества фармацевтов Казахской ССР (Чимкент, 989), па заседании кафедры фармацевтической химии (1990), межкафедральном заседании профильпых кафедр Алма-Атинского государственного медицинского института (1992 г.), совместной конференции отдела фармакологии и токсикологии и лабораторий химико-фармацевтического анализа, лаборатории разработки лекарственных форм и группы наработки готовых лекарств ОНЦ РАМН.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Алма-Атинского государственного медицинского института и тематикой научных исследований секции «Фармацевтическая химия» 10.06.03 по

7

проблеме научного совета № 10 «Фармакология и фармация РАМН», № регистрации 01.9.100.13.064 «Применение хромо-генных реакций полиметиновых (азометиповых) красителей в анализе лекарственных средств производных гидразина, ароматических аминов, пиридина, пиримидина, пмндазола. бенздиазепина и гормоноцитостатиков».

Публикации. По результатам проведенных 'исследований опубликована 21 печатная работа, в их числе 3 авторских свидетельства.

Объем и структура работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (1 глава), 4 главы с изложением собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, включающий 284 работы отечественных и зарубежных авторов и приложения. Печатный текст, не считая литературного указателя н приложений, составляет 272 страницы. В работе приведено 40 рисунков и 51 таблица.

В первой главе (первая часть) представлен обзор литературы о получении, физико-химических свойствах л методах анализа гормоноцитостатиков кортнфена и тестифенона, а также фторпроизводных пиримидина 5-ФУ и ФТ. Представлены методы ,их определения в биологических объектах (фотометрическими, радиоизотопными, иммунохимическимп методами). Во второй части представлен обзор литературы о фармако-токсикологической характеристике исследуемых препаратов. Рассмотрены особенности исследования ФК противоопухолевых препаратов, приведены сведения о совершенствовании лечения фторироизводными пиримидина, в т. ч-новыми лекарственными формами.

Во второй главе приводятся разработки методик идентификации исследуемых препаратов и их лекарственных форм.

В третьей главе дана разработка методик количественного определения гормоноцитостатиков кортифена и тестифенона в субстанциях, лекарственных формах и в биологических жидкостях. Приводится разработка методики определения БХФК, обнаруживаемой как примесь в гормоноцитостатиках. Рассматривается подготовка проекта дополнения ВФС по количественному определению кортифена в 0,4 % и 1,25 % масляных растворах кортифена.

В четвертой главе описана подготовка методик определения фторпроизводных пиримидина 5-ФУ и ФТ, пригодных для анализа этих препаратов в лекарственных формах и разработка проекта ВФС на мази и суппозитории ФТ. 8

В пятой главе изложено изучение ФК кортифепа и тсстифе-нона, связывание этих препаратов с белками, получение и химнотерапевтическое исследование модели лекарственной формы — имплантационных таблеток этих веществ, токсологп-ческое обоснование дозирования вещества в мазях и суппозиториях 5-ФУ и ФТ, химнотерапевтическое их исследование, исследование ФК мазей и суппозиториев 5-ФУ и ФТ, разработка проекта ВФС на эти лекарственные формы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОРЛЮНОЦИТОСТЛТИКОВ

Количественное определение гормоноцитостатпкон кортифепа и тестпфепона проводится методами спектрофотомет-рип, аргентометрпп (но Фольгарду) и неводного титрования. Перечисленные методы являются точными, по при частичном изменении структуры препаратов (гидролиз) они не позволят определить происшедших изменений; эти методы не применимы для определения небольших количеств веществ. Этим требованиям отвечает комплекс реакций, характерных для функциональных групп, обусловливающих фармакологический эффект.

Количественное определение кортифепа и тесшфенона проводилось с препаратами, выпускаемыми опытио-нарабо-точной лабораторией Онкологического научного центра РАМН, контроль осуществлялся по образцам кортифепа и тестифенона, чистота и процентное содержание 99,7% которых, подтверждены лабораторией химико-фармацевтического анализа.

1.1. Определение кортифепа и тестифеноиа по реакции образования полиметиновых красителей

Гормоноцитостатикн кортифеи и тестифеноп содержат фрагмент бис-([Кхлорэтнл)-амина (БХЭА), ответственный за цитостатнческпн эффект. Представляет интерес использование специфических методик, определяющих именно эту часть.

Л1ы предложили использовать реакцию Фудживара (определение полигалондных соединений) с целью разработки методики анализа гормоноцитатиков кортифена и тестифеноиа.

На эффективность методики количественного определения, выражающейся в снижении нижней границы определяемых содержаний кортифена и тестпфенона, значительное влияние оказывают следующие факторы: время образования глутако-нового альдегида, объем растворов никотиновой кислоты в гидроксиде натрия и их концентрации, объем и концентрация растворов бензидипа, а также условия фотометрирования.

Найдено, что для получения глутаконового альдегида при взаимодействии кортифена с раствором никотиновой кислоты в растворе гидрокоида натрия достаточно 20 мин, а для тестпфенона — 25 мин. Дальнейшее нагревание приводит к потерям глутаконового альдегида, ¡вследствие его летучести.

Изучение окрашенных растворов полиметиновых красителей показывает, что нарастание окраски идет медленно, что согласуется сданными литературы (Mantel М., etc. 1963): наряду с увеличением количеспва полиметиновых красителей, происходит их гидролиз до глутаконового альдегида.

Максимум окраски в растворах полиметиновых красителей, обусловленных воздействием тестифенона появляется через 30 мин и через 40 мин при воздействии кортифена и сохраняется в течение 90 мин. Оптимальным соотношением концентраций является 20% раствор никотиновой кислоты в 25% растворе гндроксида натрия, 0,5% концентрация раствора бензидина.

Для построения калибровочных графиков к растворам кортифена и тестифенона, полученных из рабочих стандартных образцов (PCO), прибавляли 20% раствор никотиновой кислоты в 25% растворе гидроксида натрия, кипятили растворы в пробирках с воздушными холодильниками, охлаждали, переносили ib мерные пробирки, прибавляли 0,5% раствор бензидина, перемешивали и доводили конечный объем этанолом до определенного объема. Для увеличения чувствительности определения конечный объем растворов уменьшали до 15 ¡мл.

Результаты исследования подвергнуты статистической обработке (ГФ XI).

При количественном определении исследуемых веществ расчет содержания проводился как с использованием калибровочных графиков, так и формул.

Расчет и статистическая оценка параметров линейной зависимости

Для расчета линейной зависимости между искомой концентрацией npenapaTqe х и измеряемой величиной у использовали уравнение:

у=Ьх-\-и,

(где у — измеряемая величина; .V — концентрация (количество) определяемого вещества; Ь — угловой коэффициент линейной зависимости; а — свободный член линейной зависимости), при условии, что наклон кривой может быть произвольным, правильность выбора наклона рассчитывалась с помощью ряда параметров: / — числа степеней свободы, средних значений X и У; констант а и Ь рассчитываемых с использованием метода наименьших квадратов; коэффициента Стыодента; производных величин АЬ и До; дисперсии я2; коэффициента корреляции г (жесткость линейной связи между переменными). Чем ближе величина г к единице, тем менее случайна линейная зависимость между переменными л- п у (ГФ, 1987).

Результаты изучения линейной зависимости данных калибровочного графика вписываются в таблицу, показывающую правильность работы.

При количественном определении кортифена и тестифено-на по реакции образования полиметиновых красителей наблюдается линейная зависимость между количеством препаратов, вступающих в реакцию и оптической плотностью фотометрируемых растворов. При определении кортифена и тестифенона подчинение основному закону светопоглоще-ния сохраняется в пределах от 0,1 до 1,5 мг в конечных объемах анализируемых растворов или от 6,66 до 100 мкг./мл. Относительная ошибка методики не превышает 1,25% при работе с количествами препаратов в пределах 1 —1,5 мг в анализируемой пробе.

Результаты обработки данных калибровочного графика методом линейной регрессии (для определения кортифена): /-=3; Х~= 1,04; У = 0,4228; 6 = 0,3753; я = 0,0325;/(Р;0=3,18; Д&=0,0277; Да = 0,0337; я2 = 0,0016; г = 0,992; (для определения тестифенона) ^ = 3; = 1,06; У=0,3192; Ь = 0,2772; £1 = 0,0253; *(Р;П=3,18; Д6 = 0,0657; Д« = 0,0809; ¿2 = 0,991; /- = 0,991.

Разработанная нами методика использована для анализа лекарственных форм кортифена и тестифенона.

1.1.1. Определение примеси БХФК в цитостатиках

Так как БХФК широко применяется при синтезе производных БХЭА, необходимо ограничить ее содержание в конечном продукте. Анализ основан на свойстве этого соединения при нагревании в мягких условиях окрашиваться в красный цвет. Препарат растворяли в этилацетате, применение которого не уменьшает интенсивности окраски полученных растворов.

Нами использовалась реакция образования полиметино-вых красителей, описанная выше для анализа кортнфена и тестифенона отличающаяся тем, что прибавление ароматических аминов, необязательно. Оптическую плотность растворов измеряли при 510 им в кювете 1 см или на фотоэлектро-колориметре со светофильтром, с областью пропускания света 540 нм.

1.2. Определение кортифена и тестифенона по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином

Определение стероидных соединении, основанное на реакции карбонильных групп с производными гидразинов, представляет особый интерес из-за специфической особенности таких соединений связываться в организме с соединениями типа глюкуроновой кислоты с образованием неактивных метаболитов.

Разработка методики количественного определения кортифена и тестифенона показала, что для анализа препаратов требуется нагревание их в течение 15 мин на кипящей водяной бане с воздушными холодильниками в присутствии 0,1% раствора 2,4-ДНФГ и равного объема концентрированной соляной кислоты. Для перевода 2,4-дпнитрофенилгидразонов кортифена и тестифенона в окрашенные соединения используется 25% раствор гидроксида натрия. Окрашенные растворы доводились до конечного объема 80% этанолом.

Оптическую плотность окрашенных растворов измеряли на спектрофотометре при 488 нм или фотоэлектроколориметре со светофильтром с областью пропускания 490 нм в кювете 10 мм.

Окрашенные растворы подчиняются закону Бугера-Бера в пределах от 25 до 150 мкг препаратов в 25 мл раствора, нижняя граница определяемых содержаний препаратов — 2 мкг/мл, относительная ошибка методики — в пределах 0,8-2 %.

Результаты обработки данных калибровочного графика препаратов методом линейной регрессии: (для определения кортифена) f = b\ Х = 1,0; 7=0,4251; Ь = 0,4137; о=0,01143; / (Р; /) = 2,57; АЬ = 0,0256; До = 0,0286; = 0,000174; г = 0,998 (для определения тестифенона) f=4; Х= 1,125; К=0,420; 6 = 0,355; а = 0,021; t(P; /) =2,78; А6=0,0384; Да=0,0463; s2=0,00021; г = 0,996. 12

1.3. Определение кортифена по образованию фармазана

Реакция образования фармазана применяется для анализа кортикостероидов, имеющих оксиметильную группу; при взаимодействии таких препаратов с 2, 3, 5-трифенилтетразо-лпя хлоридов (ТФТХ) в присутствии оснований оксиметиль-ная группа окисляется до альдегидной, а ТФТХ восстанавливается до 2, 3, 5-трифеннл-2Н-тетразола (фармазана), окрашенного в красный цвет.

Нами была поставлена задача выявить оптимальные условия для количественного определения препарата. Было необходимо определить концентрации и количества реактивов, участвующих в реакции, роль температуры, времени,«света в определении кортифена, возможности определения этого препарата в лекарственных формах.

Выяснилось, что нагревание реакционной смесн препятствует образованию окрашенных растворов. При взаимодействий кортифена с раствором ТФТХ окраска фармазана нарастает постепенно, становясь максимальной к 7—8 мин, затем постепенно падает. Ослабление окраски останавливает ледяная уксусная кислота.

Установлено, что для создания оптимальных условий определения кортифена необходимо присутствие спиртового раствора гидроксида калия (0,25 моль/л) и 0,1% спиртового раствора ТФТХ; вместо ледяной уксусной кислоты, применяемой в качестве стабилизатора нами использована 85% орто-фосфорная кислота, в смесн с этанолом (1 : 1).

Усовершенствованная нами методика определения кортифена выполнялась следующим образом: во флаконы, защищенные от света вносили анализируемые растворы кортифена, прибавляли 0,1 % спиртовые растворы ТФТХ и калия гидроксида (0,25 моль/л), флаконы закрывали (для предотвращения влияния кислорода) резиновыми пробками. Через 7 мин ibo флаконы вносили раствор концентрированной фосфорной кислоты в этаноле (1:1), перемешивали и доводили окрашенные растворы этанолом до определенного объема, после чего растворы перемешивали и измеряли их оптическую плотность при длине волны 486 нм. Параллельно проводили определение с раствором PCO кортифена. Контролем служила вода.

Подчинение закону Бугера-Бера лежит в пределах концентраций от 125 до 750 мкт/мл, относительная ошибка методики не превышает допустимых для спектрофотометриче-ских измерений пределов.

Результаты обработки данных калибровочного графика методом линейной регрессии: / = 3; Х=1,05; У = 0,6128; Л = 0,5616; а = 0,0231;

/(Р;/)=3,18; Лй = 0,0627 Ло = 0,0231; ^ = 0,000797; г = 0,998.

Методика применена для анализа 0,4% масляного раствора кортифена для инъекций, а также 1,25% масляного раствора препарата, гомогенность колориметрируемых растворов обеспечивалась смесью этилацетата, хлороформа и этанола, взятых в соотношении 1:1:1.

Результаты анализов показывают, что методика определения кортифена, основанная на реакции образования фарма-оапа, показывает объективную картину степени окисления препарата, как во-время хранения, так и при нагревании препаратов (особенно при стерилизации). Это наводит на мысль об изменении режима стерилизации препарата. По нашему мнению данная методика должна войти в НТД в качестве альтернативной при анализе 0,4% п 1,25% масляных растворов кортифена.

1А Определение кортифена и тестифенона гидроксаматной реакцией

Количественное определение исследуемых препаратов по данной реакции основано на наличии в их структуре сложно-эфирной группы, сохранность которой обеспечивает терапевтический эффект гормоноцитостатиков.

Целыо работы явилась разработка методики, улучшающей воспроизводимость и специфичность определения кортифена и тестифенона, для чего требовалось изучение условий определения, выбор концентраций и объемов реагентов.

Изучение условий анализа, показало, что для получения гидроксаматов требуется нагревание препаратов с щелочным раствором гидроксиламина «з течение 40 мин, оптимальной является концентрация гидроксиламина гидрохлорида (3 моль/л), концентрация щелочи (5 моль/л). Создание кислой среды обеспечивается внесением 57% раствора хлорной кислоты; для получения окрашенных растворов ¡в реакционную смесь вносят раствор железоаммониевых квасцов.

Определение препаратов проводилось по следующей методике: в пробирки с воздушными холодильниками вносили исследуемые препараты, прибавляли щелочные растворы гидроксиламина гидрохлорида и нагревали их на водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения к содержимому

пробирок прибавляли раствор хлорной кислоты, перемешивали н объем пробирок доводили 80% этанолом до определенного объема. Измерение оптической плотности проводили при 488 им. Содержание препаратов рассчитывалось по калибровочному графику или по формуле, используемой при спектро-фотометрпческих определениях.

Для построения калибровочных графиков использовались растворы PCO кортифена н тестифенона, с которыми повторялись все манипуляции, проводимые при изучении данной методики.

Результаты, полученные при построении калибровочных графиков свидетельствуют о том, что относительная ошибка методики удовлетворяет требованиям, предъявляемым к фотометрическому методу, подчиняемость закону Бугера-Бера находится ¡в пределах от 0,25 до 3 мг препаратов в анализируемых растворах.

Данные графиков обрабатывались методом линейной регрессии: (К_ количественному определению кортифена) / = 3; Х = 2,1; У = 0,4666; 0 = 0,21234; а = 0.20683; 1 [Р\ f) =--3,18 Äb = Q,3001 ;Д« = 0,07384; s2 = 0,00073; /" = 0,997. (К количественному определению тестифенона) / = 3; Х~—2,1\ )' = 0,4826; 0 = 0,2156; « = 0,0299; ЦР;[)= 3,18; Л/; = 0,03975; Ла = 0,09778; s2 = 0,001281; г = 0,995.

Описанные в данном разделе методики используются для идентификации субстанций и лекарственных форм гормоно-цитостатиков кортифена, тестифенона, а также БХФК.

2. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

А HTM МЕТА БОЛ И ТО В - ФТОРПРОИЗВОД НЫХ ПИРИМИДИНА

Синтетические антиметаболпты — фторпронзводные пиримидина 5-ФУ и ФТ по'НТД определяются спектрофотомет-рическим методом. В связи с недостаточной специфичностью этого метода требуется разработка альтернативных методик, дополняющих принятый метод.

Целью исследований является разработка методик, отличающихся высокой чувствительностью, воспроизводимостью и специфичностью, для которых можно использовать имеющиеся в большинстве лабораторий спектрофотометры п фотоэлектроколорп метры. Фторпронзводные пиримидина 5-ФУ и ФТ в щелочной среде проявляют свойства фенолов. Разработаны методики количественного определения 5-ФУ и ФТ по реакции с ацетатом кобальта, реакции образования азокрасигелей, реакции окисления,

Количественное определение 5-ФУ и ФТ проводили с использованием PCO, полученных из Института органического синтеза АН Латвии.

2.1. Количественное определение 5-фторурацила и фторафура по реакции с ацетатом кобальта

Определение производных пиримидина с ацетатом кобальта широко применяется для определения барбитуратов. В качестве основного реактива используется метанольный раствор ацетата кобальта.

Для определения барбитуратов к хлороформному или мета-нольному раствору исследуемого вещества прибавляют равное количество 0,125 % метанольного раствора ацетата кобальта и незначительное количество изопропиламина. Возникает сиреневое окрашивание, используемое для определения барбитуратов. Попытка провести определение фторпроизводных пиримидина но описанной методике успеха не имела. Методика определения барбитуратов модифицирована для анализа 5-ФУ и ФТ.

При выборе условий, влияющих на эффективность определения, оптимальной оказалась концентрация 0,04—0,05% раствора щелочи в конечном объеме анализируемого раствора, соотношение 5% раствора 5-ФУ и 0,2% метанольного раствора ацетата кобальта равно 1:2; для растворения осадка, образованного 5-ФУ с ацетатом кобальта требуется ДМСО.

Измерение светопоглощения окрашенных растворов, образованных 5-ФУ и ацетатом кобальта проводилось при 552 нм.

Расчет содержания 5-ФУ в лекарственных формах проводили по формуле, применяемой при спектрофотометрических определениях (требуется проведение параллельного определения с PCO) или с помощью калибровочного графика.

Подчинение закону Бугера-Бера наблюдается в пределах концентраций 5-ФУ от 0,5 до 3 мг/мл.

Данные графика обрабатывались методом линейной регрессии: / = 2; J = 0,5; ~У~=0,613; 0 = 1,188; а = 0,019; t(P;/)= 4,3; Ab = 0,1543;Да — 0,08452; s2 = 0,0002576; r = 0,999.

Анализ мазей н суппозиториев 5-ФУ непосредственно по данной методике затруднителен из-за ингредиентов, мешающих определению 5-ФУ. 16

Модели лекарственных форм включают следующие вещества:

5% мазь 5-ФУ 5-ФУ — 2,5 г

Эмульгатора Т-2 — 2,5 г Вазелина —45,0 г

2% суппозитории 5-ФУ 5-ФУ — 1,0 г

Эмульгатора Т-2 — 2,5 г Жира кондитерского —41,5 г

Количественное определение 5-ФУ в приготовленных нами модельных препаратах 5% мази и 2% суппозиториях провопили расплавлением основ препаратов с 0,4% раствором гндроксида натрия при 40—50=С. Растворы охлаждали, эфиром экстрагировали основу, с помощью делительной воронки отделяли водное извлечение, содержащее 5-ФУ и разводили его водой; в мерную пробирку отбирали алнквоту водного извлечения, прибавляли метанольный раствор ацетата кобальта и доводили раствор диметилсульфоксидом до метки. Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводили при 552 им.

Результаты определения 5-ФУ в лекарственных формах показывают, что при анализе мази относительная погрешность определения ниже, чем при анализе суппозиториев.

Определение ФТ по реакции с ацетатом кобальта малоэффективно из-за низкой чувствительности определения.

2.2. Определение 5-фторурацила и фгорафура по реакции азосочетания

Из исследованных ароматических аминов сульфаниловой кислоты, новокаина, норсульфазола, стрептоцида, сульфацн-ла, бензпдина для реакции азосочетания была отобрана сульфаниловая кислота. Приготовление реактива проводилось по методике, приведенной в ГФ X.

Максимальная оптическая плотность азокрасителеи наблюдается при взаимодействии диазотированной сульфаниловой кислоты с 5-ФУ, взятых в соотношении 5:1. Для ФТ "гто соотношение равно 2:1. Окрашенные растворы имеют максимум поглощения при 525 им.

Для определения 5-ФУ в виде субстанции к спиртовым растворам препарата прибавляли раствор дпазореактнва и общий объем доводили 25 % раствором гндроксида натрия до расчетного объема. Расчет содержания препарата проводился с помощью калибровочного графика или по формуле, используемой в спектрофотометрпческом анализе.

-—-212 17

Подчинение закону Бугера —Бера наблюдается в пределах концентраций от 0,5 до 5 мг/мл.

Данные графика обрабатывались методом линейной регрессии: /" = 4; Х = 0,7; У=0,61383; 6 = 0,8333; а = 0,03053; t (Р; f) =2,78; Ab = 0,1072; Да=0,08355; s2 = 0,001042; /- = 0,995.

Предлагаемая методика была использована для количественного определения 5-ФУ в лекарственных формах (5 % раствор для инъекций, 5% мазь и 2% свечи). Определение ФТ по реакции образования азокрасителей в лекарственных формах неперспективно из-за малой чувствительности.

Количественное определение 5-ФУ в 5% растворе для инъекции проводилось путем прибавления к раствору препарата диазореактива и 25 % раствора гидроксида натрия. Через 30 мин измеряли оптическую плотность окрашенных растворов при 525 им. Параллельно проводили определение с растворами PCO 5-ФУ. Расчет содержания 5-ФУ проводили как описывалось ранее при анализе субстанции препарата.

Определение раствора для инъекций 5-ФУ по точности имеет вполне удовлетворительные результаты.

Определение 5-ФУ в мазях и суппозиториях проводилось после расплавления основ на водяной бане при 40—50°С в присутствии 10,% раствора гидроксида натрия, после чего расплавленную смесь охлаждали, прибавляли эфир и в течение 3—5 мин взбалтывали. Водный слой отделяли (при необходимости отфильтровывали), прибавляли раствор диазореактива и проводили измерение оптической плотности. Расчет содержания 5-ФУ проводили как описано ранее при анализе субстанций 5-ФУ (параллельно проводили определение с PCO).

Методика дает удовлетворительные результаты по определению 5-ФУ в лекарственных формах.

2.3. Определение 5-фторурацила и фторафура по реакциям окисления

В предварительных исследованиях установлено, что 5-ФУ в щелочной среде способен к реакции окисления с пермангана-том калия, который количественно восстанавливается до гипо-манганата калия. Розовый цвет реактива переходит в зеленый, с максимумом поглощения при 600 им.

Наиболее заметно восстановление раствора перманганата калия проходит при использовании 0,01 % концентрации реактива в 10% растворе гидроксида натрия.

Определение 5-ФУ проводили следующим образом: в пробирки вносили раствор препарата, прибавляли 10% раствор гидроксида натрия и 0-01 % раствор перманганата калия. Смесь окрашивалась в зеленый цвет. Оптическую плотность растворов измеряли при (500 им. Расчет содержания 5-ФУ проводился по формуле пли по калибровочному графику (параллельно проводили определение с PCO).

Контролем служили реактивы применяемые при определении препарата.

При построении калибровочного графика найдено, что подчинение окрашенных растворов закону Бугера — Бера наблюдается в пределах концентраций от 12,5 до 100 мкг/мл 5-ФУ.

Данные графика обрабатывались методом линейной регрессии: / = 3; Х = 1,5; К=0,443; 0=0,2854; « = 0,0149; /(Р; f) =3,18; Ab = 0,03021; Д« = 0,0501; s2 = 0,002257; /' = 0,998.

Определение содержания 5-ФУ в 5 % растворе для инъекций проводили путем разведения этого, раствора до получения 0,005 % раствора, отбирали аликвоту и проводили определение как было описано ранее. При расчете концентрации препарата пользовались калибровочным графиком или формулой (параллельно проводили определение с PCO).

Относительная ошибка методики удовлетворительна для спектрофотометрического метода. Методика достаточно чувствительна (нижняя граница определяемых содержаний — 12,5 мкг/мл).

ФТ по строению очень похож на 5-ФУ, поэтому почти все реакции, выполняемые с 5-ФУ проходят и с ФТ. Специфических реакций на ФТ, пригодных для определения препарата в фармацевтическом анализе и при исследовании биообъектов мы не нашли.

Нами разработана методика определения ФТ, основанная на способности тетрагндрофурана, входящего в структуру ФТ окисляться до янтарного ангидрида, с дальнейшей конденсацией этого вещества с резорцином.

Определение фторафура выполнялось следующим образом: в термостойкие колбы вносили раствор ФТ, прибавляли раствор резорцина и выпаривали растворы досуха. К остаткам прибавляли серную кислоту и нагревали колбы на электроплитке в течение 1 мин (в вытяжном шкафу). После охлаждения в колбы вносили 10% раствор гидроксида натрия, хорошо перемешивали и измеряли оптическую плотность растворов

при длине волны 275 нм. В качестве контроля использовали раствор, содержащий используемые реактивы. Параллельно проводили определение PCO препарата.

Расчет содержания ФТ проводили по калибровочному графику или по известной формуле, применяемой при сйектрофо-томет{)ических определениях.

Нижняя граница определяемых содержаний ФТ равна 10 мкг. Подчинение растворов закону Бугера — Бера наблюдается в пределах концентраций ФТ от 0,5 до 80 мкг/мл. Относительная погрешность измерений находится в требуемых пределах.

Данные графика обрабатывались методом линейной регрес--, сии: [ = 4; Х= 1,033; Т=0,5115; ¿7 = 0,488; а = 0,00722; ?(/>; f) =2,78; &b=0,02319; Да = 0,02815; s2 = 0,0001693; г = 0,999.

Определение ФТ в 4 % растворе для инъекций проводилось по следующей методике: исследуемый раствор вносили в мерные колбы вместимостью 1 л, доводили водой до метки, перемешивали раствор и для анализа отбирали по 1 мл полученного раствора. Далее поступали как было описано ранее.

Определение ФТ в капсулах проводилось аналогично.

3. ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ГОРЛЮНОЦИТОСТАТИКОВ И ФТОРПРОИЗВОДНЫХ ПИРИМИДИНА

ФК. противоопухолевых препаратов изучалась на мелких грызунах: мышах и крысах. Целью работы было исследование распределения препаратов во внутренних органах животных, сроки создания максимальных концентраций препаратов, время и пути выведения препаратов, сравнение биодоступности различных лекарственных форм.

Выбор животных определялся количеством выводимых препаратов (сравнительно небольшие объемы) — количество мочи у мышей меньше, поэтому можно достичь большей концентрации препаратов в исследуемых объектах.

Гормоноцнтостатики кортифеи и тестпфеноп вводятся подкожно и перорально, в виде масляных растворов. Для достижения большей биодоступности были разработаны импланта-ционные таблетки (для вшивания под кожу).

Для достижения большей биодоступности 5-ФУ и ФТ разработаны модели мазей и суппозиториев и проведено фарма-кокинетпческое исследование этих лекарственных форм. '¿0

3.1. Исследование распределения меченого тритием

кортифена во внутренних органах животных и выведение.

Цель ФК исследования с помощью меченого кортифена состояла в том, чтобы изучить на возможно большем числе объектов места распределения препарата, пути и сроки выведения, время создания максимальной концентрации в отдельных органах.

Меченый тритием кортнфен получен на кафедре радиохимии и химической технологии МГУ канд. хим. наук, ст. научным сотрудником Е. Ф. Симоновым. В процессе получения препарат был загрязнен смолистыми веществами с очень высокой удельной радиоактивностью. Очистку 3Н-кортифена проводили на колонке сплнкагеля L-40—100 мц смесью бензол — этилацетат (6:1), собирая промывные фракции по 1 мл в отдельные пробирки.

Очищенный от осмоленных веществ меченый кортифеи находился в фракциях № 7—20.

Масляный раствор меченого кортифена для подкожного введения готовили растворением меченого кортифена в персиковом масле; к полученному раствору прибавляли 1,25% масляный раствор «холодного» кортифена с расчетом МПД кортифена — 47 мг/кг.

За неделю до введения меченого препарата линейным мышам-самкам С57 В1/6, подмышечно вводили по 0,5 мл взвеси опухоли АК 755 (из расчета 3 г опухоли в 20 мл среды 199). После появления опухолей животным в область живота под кожу вводили масляный раствор кортифена, содержащего меченый кортнфен.

Для изучения распределения препарата отбирали кровь, ткани сердца, легких, желудка, печени, почек, надпочечников, селезенки, толстого и тонкого кишечника (отдельно), матки, мозга, мышц, костей, кожи (в месте введения) и опухоли через 6, 12, 18, 24, 48 и 72 часа с момента введения препарата.

Определение меченого кортифена проводилось по числу актов распада (р-излучешпо). Исследуемые органы гомогенизировались, отбирались навески тканей, вносились в пробирки, куда прибавлялась концентрированная азотная кислота; растворы с гомогенатамн нагревались на водяной бане с температурой 70—80°С в течение 4—5 мин, охлаждались, мнне-ралнзаты из каждой пробирки вносились во флаконы для измерения радиоактивности, куда заранее вносилась сцинтил-ляционная жидкость ЖС-8 и измерялось [З-излученпе приготовленных образцов на радиометре «Chicago Mark 111».

Сравнение распределения кортифена проводилось по крови, значение радиоактивности которой бралось за единицу и по этим цифрам вычислялся коэффициент дифференциального накопления препарата (КДН) во внутренних органах.

В таблице 1 представлены сведения по накоплению кортифена во внутренних органах мышей.

Таблица I

Временная зависимость дифференциального накопления препарата по органам

Объект

Значения КДН в зависимости от времени (час)

исследования 6 12 18 24 48 72

кровь 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

сердце 1,34 1,45 1,90 1,37 1,50 1,42

легкие 1,22 1,91 1,46 1,14 1,44 1,49.

желудок- 4,12 9,26 11,96 4,12 7,13 4,78

печень 2,87 2,76 1,32 0,80 1,94 3,37

почки 2,17 2,35 1,80 0,74 1,83 2,77

надпоч. 1,99 1,72 4,06 1,76 1,83 9,24

селез. 0,96 1,67 1,25 0,65 9,17 5,10

тол. к. 4,31 2,98 2,74 3,08 3,00 2,98

тон. к. 2,36 3,04 1,61 1,47 2,24 2,34

матка 0,69 1,21 1,06 0,55 1,02 9,15

мозг 0,80 1,96 1,23 0,61 1,15 5,27

мышцы 0,98 1,33 1,14 0,71 1,12 3,84

кости 0,78 1,20 0,86 0,85 0,98 7,05

кожа 1,48 1,66 1,00 0,83 1,20 1,92

опухоль 1,03 1,72 1,76 1,35 1,33 2,10

Представленные в таблице результаты указывают на максимальное накопление меченого препарата в тканях желудка, надпочечников, почек, толстого и тонкого кишечника. В тканях селезенки, матки, мозга, мышц, опухоли и костей /кивотных наблюдается выраженная тенденция к накоплению кортифена на 2—3 сут опыта.

Выведение препарата изучалось несколько сут в обменных клетках. Животным вводили опухоль, через 7 дней подкожно масляный раствор кортифена с меченым препаратом и сразу

же собирали фекалии и мочу в отдельные пробирки н установленные сроки. Мочу (по 100 мкл) и фекалии (15—25 мг) подвергали минерализации с концентрированной азотной кислоты на водяной бане с температурой 70—80°С, минерализаты вносили во флаконы с сцннтилляционной жидкостью ЖС-8 и измеряли р-излучение на радиометре.

Результаты проведенной работы свидетельствуют о том, что выведение препарата с мочой и фекалиями начинается в первые часы в незначительных количествах и далее выведение продолжается в течение недели; к концу недели меченый препарат выводится в очень незначительных количествах.

Необходимо отметить, что лекарственная форма кортпфена в виде масляного раствора, введенная подкожно, плохо рассасывается; в месте введения в течение 2—3 сут наблюдались масляные растворы невсосавшегося препарата.

Опыты по изучению распределения и выведения кортифе-на, меченого тритием показали, что для исследования ФК гор-моноцитостатиков надо брать желудок, толстый и тонкий кишечник, печень, почки и матку. Перечисленные органы, а также кровь надо брать через 3, 6, 12, 18 и 24 часа после введения препаратов. Изучение выведения препаратов требует исследования мочи и фекалий через 4, 8, 12, 24, 48 часов.

3.2. Изучение фармакокинетики масляных растворов

кортифена и тестифенона для перорального применения

Изучение ФК исследуемых веществ проводилось после введения им лекарственных веществ. Исследование тканей животных проводилось по следующей методике: после декапнта-ции собирали кровь, отделяли плазму; белки плазмы осаждали этанолом, исследуемые вещества переходили в спиртовое извлечение, после чего центрифугированием отделяли белковые вещества от спиртового извлечения. При необходимости спиртовые извлечения концентрировали в вакууме.

Для исследования тканей внутренних органов их навески измельчали, гомогенизировали, осаждали этанолом белки; в течение часа происходит переход исследуемых веществ в экстрагент. Количественное определение кортифена и тестифенона проводили в спиртовых извлечениях, которые при необходимости концентрировали.

Выбор методов определения концентрации препаратов в извлечениях зависел от количества вводимых веществ и от целей исследования. Мы провели определение ФК с применением двух методик, т. к. необходимо было убедиться, что в исследуемых препаратах остались неизмененными как группировка. бис-((3-хлорэтил)-амина, так и карбонильные группы.

Использовались видоизмененные методики, разработанные па основе реакции Фудживара и реакции с 2,4-ДНФГ.

Расчет содержания препаратов проводили по калибровочному графику или по формуле, используемой при спектрофото-метрических определениях. В случае измерения оптической плотности растворов с содержанием препарата менее 20 мкг, использовали кюветы 20 мм («итсат»).

Проведенные нами эксперименты по влиянию спиртовых извлечении из крови и внутренних органов на результаты реакции Фудживара и с 2,4-ДНФГ показали, что калибровочные графики не изменили наклона.

Определение ФК. кортифена и тестифенона проводили на белых мышах, весом до 20 г, которым вводили 0,4 % масляный раствор кортнфена или 1 % масляный раствор тестифенона через рот. Доза кортифена равнялась 47 мг/кг; доза тестифенона равнялась 230 мг/кг. Объектами исследования служили кровь, желудок, тонкий и толстый кишечник, печень, почки и матка.

В таблице 2 представлены средние значения результатов определения кортифена в плазме крови и внутренних органах мышеи, которым препарат вводился через 3, 6, 12, 18 и 24 часа после введения. В связи с тем, что результаты определения кортифена по реакциям образования полнметиновых красителей и с 2,4-ДНФГ совпадают, приводятся данные по определению препарата по реакции Фудживара. К 24 часам концентрация кортифена достигает уровня нескольких мкг/мл.

Результаты, приведенные в таблице 2 свидетельствуют о присутствии значительных количеств кортифена в желудочно-кишечном тракте, крови, печени и почках. Максимальная концентрация препарата достигается к 12—18 часам.

Таблица 2

Фармакокинетические параметры распределения кортифена

Объект исследования Время достиж. максим, конц. (час) Максим, конц. препаратов (мкг/мл) КДН при маке. конц. препарата в иссл. объектах AUC исслед. объектов (мкг/мл. час) Огнош. ДиС крови к АиС органов

кровь 12 88,0+1,7 1,00 1047,7 1,00

желудок 3 172,0+6,7 11,94 1700,0 1,62

почки 12 48,9+0,9 0,55 678,6 0,64

печень 12 34,4+2,6 0,39 506,4 0,48

толст, киш 12 17,2+1,3 0,19 288,6 0,27

тонк. киш. 12 28,8+1,7 0,32 259,5 0,24

матка 18 4,8+2,4 0,10 96,6 0,09

Распределение тестифенона значительно отличается от распределения кортифена. Максимальная концентрация тестифенона достигается в крови и желудке через 6 час, в остальных органах через 18 часов (табл. 3).

Таблица 3

Фармакокннетические параметры распределения тестифенона

Объект исследования Время достиж. максим, конц. (час) Максим, конц. препаратов (мкг/мл) КДН при макс. конц. препарата в пссл. объектах лис исслед. объектов (мкг/мл. час) • 2 и § « н. Оэ ^ о

кровь 6 76,4±0,3 1,00 1102,0 1,00

желудок 6 190,0±0,6 2,51 2340,0 2,13

печень 18 115,1 + 1,1 2,87 1512,1 1,37

тол. киш. 18 78,6+1,1 1,95 831,6 0,75

почкн 18 56,1+2,3 1,36 800,5 0,72

тон. кпш. 18 45,7+1,7 1,35 577,7 0,52

матка 12 9,1+0,7 0,16 139,2 0,12

3.2.1. Исследование выведения препаратов

За неделю до эксперимента животным подмышечно вводилась суспензия опухоли АК 755, затем перорально вводились 0,4 % масляный раствор кортифена (в дозе 47 мг/кг) и 1 % масляный раствор тестифенона (в дозе 230 мг/кг).

Одновременно с опытными группами мышей проводили сбор мочи у контрольной группы мышей (5 штук), не получавших кортифена и тестифенона.

Мочу собирали через 3, 6, 12, 18, 24 и 48 час после введения масляных растворов. Объем мочи измеряли от каждой мыши, затем в 1 мл мочи определялось количество кортифена и тестифенона по реакции образования полиметиновых красителей и реакции с 24-ДНФГ.

Результаты определения гормоноцитостатиков в моче приведены в таблицах 4 и 5.

2 Г)

Таблица 4

Кинетика выведения кортифена мочой, после перорального введения масляного раствора

Сроки Общий Взято для Концентрация кортифена (мкг/м.т)

сбора мочи объем мочи анализа на 1 мышь, определенная по

(час) (мл) (мл) реакции Фудживара

0—3 3,0 1,0 11,04+0,6

3—6 3,6 1,0 9,21 ±0,5

6—12 3,0 1,0 31,684= 1,4

12—24 2,9 1,0 29,23±1,3

24—48 2,8 1,0 31,36+1,3

Скорость почечной экскреции, выражаемой почечным клиренсом, равна отношению максимальной концентрации препарата в моче, умноженной на время сбора мочи и поделенной на площадь под кривой (AUC) в плазме крови.

Почечный клиренс кортифена CLr равен 0,57 мл/мин.

Таблица 5

Кинетика выведения тестифенона мочой, после перорального введения масляного раствора

Сроки Общий Взято для Концентрация тестифенона (мкг/мл)

сбора мочи объем мочи анализа на 1 мышь, определенная по

(час) (мл) (мл) реакции Фудживара

0—3 3—6 6—12 12—24 24—48

2,9

3.1 3,0 3,5

3.2

1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

18,16±0,7 23,20+0,9 40,32±1,2 36,72+1,2 48,64+1,3

Почечный клиренс тестифенона ровен 0, 73 мл/мин.

Методики определения препаратов по реакции Фудживара и реакции с 2,4-ДНФГ дают сопоставимые результаты, выведение их нарастает постепенно, не заканчиваясь за 2 суток, что совпадает с результатами выведения с мочой меченого кортифена.

3.3 Химиотерапевтическое лечение опухолей мазями и суппозиториями 5-фторурацила и фторафура

В результате определения токсичности (критериями являлись вес животных и число лейкоцитов) найдена оптимальная доза для мазей и суппозиториев 5-ФУ — 90 мг/кг, а для мазей и суппозиториев ФТ — доза 450 мг/кг. 26

Изучалась специфическая активность моделей мазей и свеч 5-ФУ и ФТ. Критериями оценки лекарственных форм были: вес животных, размеры опухолей и продолжительность жизни (дни). Группы ( по о—о ж ивотных) были разбиты но следующему признаку:

1. Лечение 5,% мазыо 5-ФУ.

2. Лечение 2 % суппозиториями 5-ФУ.

3. Лечение 8 % мазыо ФТ.

4. Лечение 6 % суппозиториями Ф'Г.

5. Лечение 5 % раствором ФТ внутрибрюшинно.

6. Лечение 4 % раствором Ф'Г внутрибрюшинно.

7 и 8 группы контрольные (лечения не получали).

Критериями опенки эффективности лечения являлись средняя продолжительность жизни (СГЩ) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ). Статистическая обработка результатов проводилась по Р. Б. Стрелкову (1986).

Таблица 6

Определение продолжительности жизни крыс, леченых мазями и суппозиториями 5-ФУ и ФТ

— X So § * н 3 CJ д о н Лекарственная форма Продолжительность жизни (дн) спж (днем) УПЖ (%)

1 5 5,% мазь 5-ФУ 113 22,6±2,3 22,8

2 5 2 % суп поз. 5-ФУ 180 36,0±9,2 95,6

3 5 8 о/о мазь ФТ 99 19,8+1,9 7,6

4 6 6 % суппоз. ФТ 124 20,7+1,6 19,9

5 5 5% растя. 5-ФУ 148 29,6+1,5 60,9

6 5 4 % раств. ФТ 153 30,6+1,2 66,4

7,8 10 не леченые 184 18,4+0,6 0

Продолжительность жизни леченых животных возросла от 7,6 до 95,6 %. Необходимо было проверить эффективность лечения в более поздние сроки (на 7 день после введения опухолей).

Таблица 7

Определение продолжительности жизни крыс, получавших отсроченное лечение мазями и суппозиториями 5-ФУ и ФТ

5 х

о х о ¡- я g с". к о ^ ьег - Лекарственная форма Продолжительность жизни (дн) спж (дней) УПЖ (%)

1 5 5 % мазь 5-ФУ 115 23,0±8,6 37,7

2 5 2 % суппоз. 5-ФУ 123 24,6±8,6 47,3

3 5 8 % мазь ФТ 157 31,4±8,8 88,0

4 5 9 % суппоз. ФТ 161 32,2±8,8 92,8

5 5 5 % раств. 5-ФУ 134 26,8+1,3 60,4

6 5 4 % раств. ФТ 139 27,8±1,7 66,8

7,8 9 не леченые 150 16,7±2,1 0

В этом эксперименте результаты несколько лучше,

' здесь мы использовали крыс весом от 200 до 290 г, а в первом опыте использованы животные весом от 130 до 180 г. Результаты показывают, что более эффективно лечение мазью и свечами ФТ.

3.4. Изучение биодоступности мазей и суппозиториев 5-ФУ и ФТ

Ф1\ 5-ФУ и Ф'Г изучена на растворах для инъекций н капсулах. В описанных исследованиях показано, что при парентеральном введении, поступление препаратов в кровь достигает максимума за 15 мин, при пероральном — за 0,5—1 час (Гнлев А. П. и соавт. (1977, 1983), Гречаная В. Н. (1970), Фуджии С. (1983) и др.

Целью нашего исследования являлось изучение ФК мазей и суппозиториев для внедрения их в клиническую практику.

Изучение ФК мазей и суппозиториев 5-ФУ и ФТ проводилось на беспородных крысах-самцах и самках.

После введения лекарственных форм, для количественного определения исследуемых веществ брались по 1 мл плазмы крови п по 0, 5 г тканей желудка, тонкого кишечника, прямой кишки (при введении суппозиториев), печени и почек. Выбор объектов определялся описанными в литературе исследованиями ФК инъекционных растворов и капсул 5-ФУ и ФТ.

Извлечение 5-ФУ и ФТ из объектов исследования проводили спиртом (так, как это делалось при изучении ФК кортифепа и тестифенона). При необходимости извлечения дополнительно разводились спиртом. Количественное определение препа-

ратов проводили измерением оптической плотности препаратов на спектрофотометре в УФ области (5-ФУ при 268 им и ФТ при 275 им) в кюветах 10 мм.

Вещества, экстрагируемые спиртом из биообъектов не влияют на наклон калибровочных кривых, используемых для расчетов содержания препаратов при количественном определении препаратов спектрофотометрпческим методом.

Определение препаратов в плазме крови и внутренних органах проводили через 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 часов после введения препаратов. В таблицах 8 и 9 представлены результаты определения содержания препаратов в исследуемых объектах. Максимальное содержание обоих препаратов найдено через 0,5 часа, после введения суппозиториев и через час после нанесения мазей с препаратами. Статистическая обработка результатов определения проводилась по Р. Б. Стрелкову (1986).

Таблица 8

Фармакокинетические параметры 5-ФУ и ФТ после нанесения 5 % мази 5-ФУ и 8 % мази ФТ

• к о ~ ь § § § Максимальная концентрация препарата» (мкг/мл) КДН при макс. конц. преп. АиС иссл. объектен (мкг/мл. час Отнош. АиС крови к ЛиС иссл. объектов

о о 5-ФУ 1 ФГ 5-ФУ| ФТ 5-ФУ 1 ФТ 5-ФУ| ФТ

кровь тон. киш. желудок печень почки

30,3±1,3 24.3±0,6 14,8+0,9 28,8 + 1,2 26.5+1,5

175,0+3,0 179,2±2,6 130,1 ±2,5 120,0+2,5 115,1 + 1,5

1,00 0,80 0,48 0,95 0,87

1,00 1,02 0,74 0,68 0,65

147,7 76,7 43,0 78,3 89,3

1006,0 483,7

390.1 313,5

306.2

1,00 0,52 0,29 0,53 0,60

1,00 0,48 0,38, 0,31 0,30

Фармакокинетические параметры введения 2 % суппозиториев 5-ФУ и 9

Таблица 9 5-ФУ и ФТ после % суппозиториев ФТ

о 3 — я 2 1 Максимальная концентрация препаратов (мкг/мл) КДН при макс. конц. преп. ЛиС иссл. объектов (мкг/мл. час Отнош. АЪ'С крови к АиС иссл. объектов

о " О ^ 5-ФУ | ФТ 5-ФУ ФГ 5-ФУ ФТ 5-ФУ ФТ

кровь тон. киш. печень почки

38,2+0,3 15,8+0,4 13,2+0,4 15,5+0,8

прям. КНШ. 34,0 + 0,5 желудок 14,8+0,4

234,5+1,5 1,00 1,00

220,1+2,0 0,41 0,94

208,0+1,5 0,34 0,88

190,3+1,6 0,40 0,81

224,6+1,5 0,89 0,95

170,0+2,0 0,38 0,72

147,7 1006,0 1,00 1,00

44.3 56,0 51,7 60,7

48.4

623,7 515,0 485,7 442,0 110,0

0,29 0,61 0,38 0,51 0,34 0,48 0,40 0,43 0,32 0,10 29

Больше всего происходит накопление ФТ в тканях тонкого кишечника, желудка, печени, почках, прямой кишки. Накопление 5-ФУ во внутренних органах из мазей и суппозиториев отличается большим его содержанием в почках, печени, органах желудочно-кишечного тракта.

Концентрация препаратов, введенных в виде мазей и суппозиториев значительно уменьшается к 6 часам.

Таблица 10

Кинетика выведения 5-ФУ и ФТ мочой, после нанесения 5,% мази 5-ФУ и 8 % мази ФТ

= Определение 5-ФУ Определение ФТ

Сроки сбора мо (мл) Объем мочи (мл) Содержание препарата (мкг/мл) Объем мочи (мл) Содержание препарата (мкг/мл)

0-4 6,8 1,40±0,3 6,5 9,75±0,8

4—6 3,1 0,84+0,2 7,8 6,30±0,7

6-12 13,2 2,52±0,4 11,4 18,80+1,0

12—24 19,3 5,42±0,4 21,0 12,70+0,9

24—48 25,0 8,92±0,6 20,0 42,00+1,3

11очечный клиренс 5 % мази 5-ФУ равен 0,06 мл/мин.

Почечный клиренс 8 % мазп ФТ равен 0,08 мл/мин.

Таблица 11

Кинетика выведения 5-ФУ и ФТ мочой, после введения 2 % суппозиториев 5-ФУ и 9 % суппозиториев ФТ

= Определение 5-ФУ Определение ФТ

Сроки сбора мо (мл) Объем мочи (мл) Содержание препарата (мкг/мл) Объем мочи (мл) Содержание препарата (мкг/мл)

0—4 7,1 2,97±0,3 8,0 13,6+0,9

4—6 3,9 1,39±0,2 4,1 7,6+0,8

0—12 10,5 4,15+0,5 12,4 22,8+1,3

12—24 22,0 7,04+0,5 24,1 33,6+1,5

24—48 24,0 4,99+0,4. 20,0 40,0+1,4

Почечный клиренс 2 % суппозиториев 5-ФУ равен 0,09 мл/мин.

Почечный клиренс 9% суппозиториев ФТ равен 0,06 мл/мин.

30

Выведение препаратов в первые 4 часа происходит быстрее после введения свеч. На вторые сутки препаратов выводится меньше. Выведение 5-ФУ и ФТ после нанесения мазей происходит медленнее; по скорости выведения разница между первыми и вторыми сутками здесь менее ощутима.

В Ы В О Д Ы:

1. Для разработки надежных методик идентификации и количественного определения гормоноцитостатиков кортифена п тестифенона на основании использованной литературы изучены реакции: а) образования полн.метиновы.х красителей; б) реакции с 2,4-динптрофенилгндразином; в) образования фармазана; г) гпдроксаматной реакции.

Для разработки методик идентификации и количественного определения 5-фторурацила и фторафура изучены реакции образования: а) комплексов с ацетатом кобальта и меди; б) образования азокрасителей; в) реакций окисления, пригодных для анализа исследуемых веществ.

2. Исследованы оптимальные условия для проведения чувствительных п надежных реакций идентификации кортифена и тестифенона, основанных на определении фрагментов бис-(|3-хлорэтил) -амина (реакции Фудживара, Бейлыптейна, с аммиачным раствором нитрата серебра), карбонильной группы (реакции с 2,4-ДНФГ, по избирательному поглощению света в области 240 им), окисления (реакции с ТФТХ, реактивом Феллинга), реакции на сложноэфирную группу.

Для идентификации 5-фторурацила и фторафура впервые изучены реакции образования солей с тяжелыми металлами (с ацетатом кобальта и меди), реакции азосочетания (с диазо-тированпой сульфаннловой кислотой), реакции окисления (с перманганатом калия в щелочной среде, нагреванием с серной кислотой и резорцином) и реакции конденсации.

3. Для анализа препаратов в лекарственных формах н для изучения фармакокинетпкн разработаны фотометрические методики количественного определения кортифена и тестифенона по реакции образования полнметпновых красителей, с 2,4-ДНФГ, с ТФТХ, гпдроксаматной реакции. Нижние границы определяемых содержаний препаратов составляют 2— 10 мкг/мл. Относительные погрешности определения не превышают 1 —1,5 %.

4. Впервые предложены фотометрические методики количественного определения 5-фторурацила и фторафура, основанные на реакции с ацетатом кобальта в щелочной среде,

реакции азосочетания, окисления, конденсации. Указанные методики использованы для определения препаратов в лекарственных формах.

5. Разработана методика определения БХФК, используемой при синтезе ряда противоопухолевых препаратов, в т. ч. кортифена п тестпфенона. Методика позволяет определять это вещество, присутствующее в цитостатиках в качестве примеси.

6. С помощью меченого тритием кортифена проведено исследование процессов фармакокинетнки масляного раствора кортифена для парентерального введения. Определена биодоступность препарата, распределение его в тканях внутренних органов, пути и сроки выведения.

7. Исследованы процессы фармакокинетнки масляных растворов кортифена и тестифенона для перорального применения. Для количественного определения применен фотометрический метод, основанный на реакции образования полиме-тиновых красителей и на реакции с 2,4-ДНФГ. Определены фармакокинетические параметры: площадь под фармакокпне-тическон кривой, время достижения и максимальные концентрации препаратов, почечный клиренс.

8. Обосновано применение новых лекарственных форм 5-фторурацнла и фторафура. Модели мазей и суппозиториев 5-фторурацила и фторафура проявляют значительную химио-тераневтическую активность. Исследованы фармакокинетические параметры, имеющие различия с изученными ранее инъекционными растворами препаратов. Установлено, что препараты медленнее поступают в кровь, дольше задерживаются в организме. Мази и суппозитории с 5-фторурацнлом и фтора-фуром целесообразно передать в клинику для углубленного изучения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Получение конъ!бгата кортифена с альбумином для пммунохпмического определения //III съезд фармацевтов Казахстана; тез. докл. — Кустанай, 1987. — с. 245—246 (соавт. С. М. Андреев, К. А. Чекотаева, J1. П. Петрова).

2. Применение реакции образования полиметиновых красителей в количественном определении гормопоцитостатиков дистрона и кортифена //там же. — с. 249—250 (соавт. Н. И. Зп-макова, Т. И. Вепренцева, Н. Д. Рожкова).

3. Методы анализа цитостатпческих лекарственных средств алкплирующего действия (учебно-методические указания).— Алма-Ата, 1986. — с. 14 (соавт. А. С. Бейсенбеков).

4. Реакции идентификации кортпфена и тестпфенопа //Материалы V Всероссийского съезда фармацевтов. Гез. докл.— Ярославль, 1987. — с. 271—272 (соавт. М. А. Краснова, II. А. Соколова).

5. Изучение связывания тестифенона белками крови при различных значениях рН среды //Сб. Вопросы фармации. — Алма-Ата, 1988. — с. 15—17 (соавт. К. Турысбекова, Н. И. Зн-макова).

0. Химпотерапевтическпе свойства тритурационны.х таблеток с гормоноцитостатиком тестифеноном //Сб. Современные проблемы фармации. — Алма-Ата, 1989. — с. 14—16 (соавт. 3. С. Смирнова, Л. М. Михайлова, В. Н. Толкачев).

7. Экспресс-анализ производных пиримидина //III съезд фармацевтов Туркмении; тез. докл. — Ашхабад, 1989. — с. 243—244 (соавт. О. Н. Короткова, Л. Н. Кнзерева).

8. Количественное определение кортпфена по реакции с 2,-4-динитрофенилгидразипом //там же. — с. 249—250.

9. Анализ стероидных гормоноцитостатиков по функциональном группам (обзор) //Фармация. — 1991. — т. 40, № 5.— с. 81—84 (соавт. А. П. Арзамасцев).

10. Определение полнгалоидных лекарственных веществ па основе реакции образования полиметиновых красителей (обзор) //Фармация. — 1992. — т. 41, № 4. — с. 67—70 (соавт. А. П. Арзамасцев, А. С. Бейсенбеков).

11. Совершенствование методов анализа противоопухолевых препаратов, фторпроизводных пиримидина (обзор) //Фармация. — 1992. — т. 41, № 5.

12. Реакция азосочетання в анализе фторпроизводных пиримидина //Методы контроля лекарственных средств; Матер, междунар. науч. симпозиума. — Ашхабад, 1991. —с. 25.

13. Определение кортпфена по реакции фармазапа //Проблемы судебно-медицинской экспертизы (Сб. научных работ).— Вып. 9. //Алма-Ата, 1991. — с. 253—255 (соавт. А. С. Бейсенбеков).

14. Изучение распределения кортпфена в эксперименте //там же. — с. 293—294 (соавт. Е. Ф. Симонов).

15. «Способ качественного определения кортикостеропдов, аскорбиновой кислоты и фурацилнна» А. с. № 1642336. — Бюлл. № 14. 1991 г. — (соавт. К. А. Чекотаева, Л. П. Петрова).

16. «Способ количественного определения фторафура». Полож. решение НИИГПЭ от 10.12.90 г. (соавт. М. Ю. Лндака. А. П. Арзамасцев, Л. Н. Кнзерева).

17. «Способ количественного определения вещества, содержащего хлоралкильные группы». Полож. решение НИИГПЭ от 28.11.91 г. (соавт. В. Н. Толкачев, Б. С. Кикоть).

18. Определение п-бпс ((} - хлорэтнл) - аминофенилуксусноп кислоты как примеси в цитостатических препаратах //Бюлл. Всерос. научного общества фармацевтов. — 1992. — Вып. 2.— с. 20

19. Реакция определения подлинности 5-фторурацила и фторафура //там же. — с. 19

20. Изучение фармакокннетикн гормоноцитостатиков корти-фена и тестифенона //Сб. научных трудов республиканской конференции онкологов «Экологические проблемы злокачественных новообразований (диагностика, лечение)». — Алма-Ата — Актюбинск, 1992. — с. 204—205 (соавт. А. Б. Сыркин).

21. Изучение фармакокинетики мягких лекарственных форм 5-фторурацила и фторафура //там же. — с. 206—207 (соавт. А. Б. Сыркин).