Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование травы красавки как источника промышленного получения алкалоидов

На правахрукописи

ГАЕВСКАЯ ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАВЫ КРАСАВКИ КАК ИСТОЧНИКА ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

/

Москва -2004

Работа вы пол иена во ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.

Научный руководитель:

Доктор химических наук,

академик РАН

Мирошников Анатолий Иванович

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук

Громакова Алла Ивановна

Кандидат фармацевтических наук

Лякина Марина Николаевна

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. ИМ.Сеченова

Защита состоится «10» мая 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР РАСХН по адресу: 117216 г. Москва, ул. Грина, 7

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного советаД006.070.01

канд. с- х. наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Красавка относится к числу наиболее популярных и широко применяемых в медицине лекарственных растении. Трава красавки Atropa belladonna L. и Atropa caucasica Cr. служит главным источником природных тропановых алкалоидов. Основная часть сырья красавки перерабатывается для получения экстрактов густого и. сухого, входящих в состав 14 комбинированных лекарственных препаратов, применяемых, главным образом, при лечении желудочно-кишечных заболеваний.

Также красавки трава используется для производства очищенной суммы алкалоидов, производимой на ПЭЗ ВИЛАР, как компонент комплексного лекарственного средства «Беллатаминал».

В литературе имеются данные о том, что основным алкалоидом красавки является гиосциамин, при переработке сырья рацимизирующийся в атропин. Сведения о минорных алкалоидах в отечественном сырье практически отсутствуют.

Известно также, что гиосциамин, атропин и - скополамин, являясь сложными эфирами, в процессе переработки сырья легко гидролизуются с потерей биологической активности. Но в нормативной документации (НД) на экстракты красавки и • комбинированные препараты отсутствуют требования, позволяющие контролировать содержание неактивных соединений в готовых продуктах.

Методы - количественного анализа сырья и экстрактов с одной стороны и. лекарственных форм с другой стороны основаны на разных; принципах и требуют унификации.

Красавка, как. все алкалоидсодержащие растения, подвержена большой изменчивости химического состава, в том числе и состава алкалоидов, от погодных условий.

Оценка сырья только по сумме алкалоидов - (НД) не отражает его истинное качество, что обнаруживается при переработке сырья. Так, из некоторых многотоннажных партий сырья, отвечающих требованиям НД, по данным Чимкентского химфармзавода, невозможно получить густой экстракт фармакопейного качества. В связи с этим возникают проблемы рационального использования подобного сырья или получаемого из него экстракта.

При оптимальном содержании суммы алкалоидов в траве красавки природная биологическая изменчивость соотношения отдельных компонентов не позволяет

гарантировать стабильную биологическую активность

проблема может быть решена путем разработки новых лекарственных форм, содержащих очищенную сумму алкалоидов.

Анализ литературы и НД на траву, экстракты и препараты красавки показал, что недостаточно изучен состав, алкалоидов сырья и экстракта красавки, входящих в 14 комбинированных лекарственных препаратов; не унифицированы методы контроля качества сырья и лекарственных форм; не исследована возможность использования сырья с пониженным содержанием алкалоидов.

Таким образом, актуальным является изучение алкалоидного состава травы и экстракта красавки, совершенствование методов их химического контроля и технологии переработки.

Цель работы. Целью работы явилось:

- изучение алкалоидного состава сырья красавки, экстракта густого и отходов производства очищенной суммы алкалоидов;

- разработка новых экстракционно-фотометрических методик определения суммы алкалоидов в сырье и экстрактах красавки;

- усовершенствование способа очистки суммы алкалоидов с одновременным выделением гиосциамина и технического скополамина;

- разработка способов получения экстракта густого то технического продукта, не отвечающего требованиям НД.

Научная новизна. Впервые исследовано сырье красавки, при работе с которым оказались непригодными действующая технология получения экстракта густого и метод. контроля качества готового продукта.

Выявлена недостоверность действующих фармакопейных методик определения: суммы алкалоидов в сырье и экстрактах красавки, обусловленная; влиянием сопутствующих компонентов.

Разработаны новые методики определения суммы алкалоидов в сырье красавки и экстрактах густом и сухом.

Впервые показано накопление значительного количества продукта деструкции гиосциамина (тропинона) в некоторых серийных образцах экстракта густого и отходах производства суммы алкалоидов красавки.

Впервые обнаружено специфическое взаимодействие низкомолекулярных производных тропана (тропина, тропинона и др.) с реактивом Драгендорфа при хроматографировании в тонком слое силикагеля.

Впервые разработаны методы установления подлинности и количественного определения действующих веществ в таблетках комплексного лекарственного средства, содержащего алкалоиды красавки и фенольные соединения пижмы («Беллацехол»).

Практическая ценность работы.

. 1. Разработан проект ФСП на красавки траву цельную и измельченную.

2. Разработан. проект ФС на комплексное лекарственное: средство таблетки «Беллацехол».

3. Предложены способы переработки экстракта густого с пониженным содержанием алкалоидов.

4. Предложена методика определения суммы алкалоидов в экстрактах красавки густом и сухом.

5. Предложен метод обнаружения тропинона как показателя деструкции биологически активных алкалоидов красавки в продуктах ее промышленной переработки.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- результаты изучения алкалоидного состава сырья красавки и продуктов его переработки;

- методики определения суммы; алкалоидов в траве, экстрактах красавки и в таблетках «Беллацехол»;

- способ обнаружения тропинона в продуктах переработки сырья красавки;

- способы переработки экстракта густого красавки с пониженным содержанием алкалоидов.

Апробация работы и публикации.

Отдельные части работы доложены на Первом международном симпозиуме. «Новые и нетрадиционные растения. и перспективы их практического использования» (Пущино, 1995), на 2-й Всероссийской конференции по истории и методологии аналитической химии (Москва, 1999). По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), обсуждения результатов экспериментов (глава 2), экспериментальной части (глава 3), выводов и списка литературы. В тексте

имеется 40 таблиц, 2Грисунок. Список цитируемой литературы содержит 161 источник, из которых 88 - на русском языке и 73 - на иностранных языках.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1. Выделение и идентификация алкалоидов красавки

Для выделения алкалоидов были использованы следующие объекты: а) трава красавки, выращенная в Краснодарском крае и в Крыму, б) экстракты густые из различного сырья красавки, в) маточники от промышленных- загрузок после кристаллизации суммы алкалоидов, г) фракция суммы алкалоидов, сорбированная на колонке с оксидом алюминия и активированным углем при промышленной очистке суммы алкалоидов и полученная нами путем элюирования смесью хлороформа с метанолом (3:1).

При исследовании некоторых образцов отходов производства алкалоиды предварительно идентифицировали' без выделения компонентов с помощью хроматомасспектрометрии на приборе МАТ 44 (Уапап), колонка кварцевая 0,22 мм х 50 см с 8Е-30, 50°-300°С (за 25 мин.), газ - гелий,. 11 мл/мин. Из маточников и элюатов с колонки алкалоиды извлекали путем растворения в 2-5% растворах серной кислоты, осторожного подщелачивают этих растворов гидроксидом аммония при температуре 3-5"С до рН ~ 8 и последующего многократного встряхивания с хлороформом до отрицательной реакции на алкалоиды в водной фазе. После удаления хлороформа алкалоиды разделяли методами препаративной ТСХ и БХ.

Для выделения алкалоидов из травы красавки проводили экстракцию диэтиловым эфиром в присутствии гидроксида аммония, эфирное извлечение промывали водой. Из водно-аммиачной фракции алкалоиды извлекали смесью хлороформа с метанолом (4:1) (фракция «а»). Из эфирной фракции алкалоиды извлекали 5% раствором серной кислоты, осторожно нейтрализовали гидроксидом аммония до рН ~ 6, добавляли фосфатный буфер (рН 6) и многократно экстрагировали хлороформом до отрицательной реакции на алкалоиды в водной фазе (фракция «б»). Затем водную фазу подщелачивали до рН 8-9 и оставшиеся алкалоиды извлекали так же хлороформом (фракция «в»). Из хлороформного -извлечения выделяли гиосциамин с примесью атропина путем кристаллизации из смеси хлороформа с петролейным эфиром (1 : 3). Маточник после кристаллизации исследовали дополнительно (фракция «г»).

Все фракции разделяли на отдельные компоненты с помощью ТСХ и БХ. Хлороформное извлечение из слабокислого водного раствора и маточник после кристаллизации исследовали также с помощью препаративной ТСХ и БХ.

При исследовании густых экстрактов их разбавляли водой (1 : 9), алкалоиды извлекали хлороформом без подщелачивания (фракция «б»), затем водную фазу подщелачивали аммиаком до рН 8-9 и алкалоиды снова извлекали хлороформом (фракция «в»). Хлороформные фракции обрабатывали так же, как при исследовании сырья.

Для препаративного разделения алкалоидов использовали пластинки «Merck» Silica gel 60 G F254 и толщиной слоя 0,25 мм и 2 мм; система растворителей хлороформ -метанол - 25% раствор аммиака (19 : 11 : 0,7); пластинки с микрокристаллической целлюлозой "CEL 300-25 UV254" и бумагу Ватман 3 ММ, система растворителей н -бутанол - уксусная кислота (10:1) - вода до насыщения.

Для обнаружения алкалоидов края хроматограмм обрабатывали реактивом Драгендорфа с уксусной или винной кислотой. Вещества с необработанных участков хроматограмм элюировали метанолом или смесью метанола с хлороформом (1 : 1). После удаления растворителя сухие остатки исследовали методом масс-спектрометрии.

При длительном хранении некоторых образцов отходов производства суммы алкалоидов происходила кристаллизация одного из компонентов - тропинона. При идентификации этого соединения использовали данные температуры плавления, хроматографической подвижности в различных условиях ТСХ и БХ, масс-спектрометрии и ПМР-спектроскопии.

В связи с неудовлетворительным хроматографическим разделением компонентов фракции «а» было проведено ацетилирование их суммы в мягких условиях по методике, рекомендованной для ацетилирования 6-оксигиосциамина (Мирзаматов, Маликов, Лутфуллин и др., 1972). Исходную фракцию и продукты ацетилирования исследовали методом масс-спектрометрии.

При изучении всех объектов на силикагелевых пластинках было обнаружено 14 компонентов, окрашиваемых реактивом Драгендорфа. Из них выделены в виде оснований гиосциамин, апогиосциамин, скополамин, алоскополамин, тролин, тролинон. Идентифицированы по масс-спектрам фракций оснований и ацетильных производных 6-оксигиосциамин и 6-оксиапогиосциамин. Характеристика масс-спектров названных соединений приведена в табл. 1.

В суммарных масс-спектрах фракции «а» найдены сигналы, соответствующие молекулярным ионам 3,6-диокситропана (MMSS) и 6-окситропинона(М+151)

Таблица 1.

Характеристика масс-спектров тропановых алкалоидов

Алкалоиды М+ Массовые числа характерных ионов (высоты пиков относительно высоты максимального пика, %)

Апогиосциамин 271(31) 140(14) 124(100) 105(13) 95(66) 94(21) 83(49) 82(49)

Апоскополамин 285(28) 154(41) 138(54) 136(29) 108(44) 103(44) 94(100) 81(21)

Гиосциамин 289(20) 140(14) 124(100) 96(15) 94(20) 83(49) 82(42) 67(12)

6-оксигиосциамин 305(10) 261(12) 140(30) 96(15) 95(100) 94(98) 83(8) 67(10)

6-оксиапогиосциамин 287(8) 243(5) 140(18) 103(13) 96(10) 95(100) 94(99)

Тропин 141(24) 124(23) 113(10) 96(39) 83(51) 82(100) 67(11) 55(15)

Тропинон 139(48) 110(12) 96(40) 83(67) 82(100) 81(83) 68(10) 55(25)

Скополамин 303(28) 154(40) 138(64) 137(24) 136(33) 108(41) 94(100) 81(21)

Ацетил-6-оксиапогиосциамин 329(8) 285(7) 182(20) 124(100) 96(20) 95(45) 94(42)

Диацетил-6-оксигиосциамин 389(10) 329(14) 122(30) 122(30) 96(11) 95(76) 94(55)

Различные типы сырья различались по составу алкалоидов. Так, в сумме алкалоидов из травы красавки, полученной из Краснодарского края и Крыма, доминирует гиосциамин, содержание остальных алкалоидов - около 3% от суммы, апоскополамин и 6-оксигиосциамин практически отсутствуют. В сумме алкалоидов соответствующих, образцов экстракта густого компонентный состав в целом сохраняется при некотором снижении доли гиосциамина и повышении содержания тропинона (табл.2).

Для количественного определения суммы гиосциамин/атропин, скополамина и тропинона в растительном сырье и экстрактах использовали модифицированную нами хромато-фотометрическую. методику (Петришек и др., 1986). Содержание суммы алкалоидов в тех же объектах определяли с помощью разработанных нами методик (см. 2.2.1.,2.2.2.).

Некоторые образцы экстракта густого, полученного на Чимкентском: химфармзаводе, отличались повышенным содержанием скополамина (до 15-20% от суммы алкалоидов). В этих образцах найдены апоскополамин и 6-оксипроизводные тропана.

В одном из промышленных образцов экстракта густого найден трогашон в количестве, превышающем 20% от суммы алкалоидов.

Таблица 2.

Содержание алкалоидов в образцах травы и экстракта красавки густого.

Происхождение сырья, Содержание в %

объекты анализа Сумма Гиосциамин Скополамин Тропинок

алкалоидов

Краснодарский край,

Партия I

трава 0,36 0,30 0,006 Следы

экстракт густой < 1,25 1,01 0,02 0,010

Крым, партия II

трава 0,35 0,28 0,005 Следы

экстракт густой 1,40 1,18 0,017 0,015

Крым, партия П1

Трава 0,58 0,50 0,020 0,002

Экстракт 1.59 1,42 0,050 0,018

Хмельницкая обл.

Экстракт густой (1) 1.41 0,99 0,220 0,014

Хмельницкая обл.

Экстракт густой (II) 1,62 1,12 0,060 0,330

ПМР - спектр тропинона представлен на рис. 1.

Рис 1. ПМР-спектр тропинона.

При исследовании отходов производства суммы алкалоидов получены следующие результаты: сумма алкалоидов состоит из гиосциамина и атропина (не менее 96%) с примесью (до 0,5%) скополамина.

В отходах производства суммы алкалоидов найдены указанные выше соединения. При* этом в маточниках доминируют тропинон, скополамин и апогиоспиамин. Кристаллизующееся при хранении маточников соединение по всем физико-химическим показателям представляет собой тропинон.

Таким образом, тропинон является одним из главных продуктов деструкции гиосциамина • в технологических процессах и даже при проведении аналитических операций.

В ходе исследований было замечено, что при хроматография на пластинках с толщиной слоя 0,1-0,3 мм («Сорбфил», силикагель 60 «Merck») после обработки реактивом Драгендорфа пятна тропина, тропинона и еще 2-3-х соединений (в том числе предположительно диокситропана) приобретают интенсивную сине-фиолетовую или фиолетово-коричневую окраску. При хранении хроматограмм фиолетовая окраска постепенно исчезает и пятна приобретают оранжевый цвет.

Отмечено также, что эти соединения на пластинках с силикагелем с толщиной слоя 2 мм, пластинках с целлюлозой и на бумаге образуют с реактивом Драгендорфа обычные оранжево-коричневые комплексы.

Были проведены специальные опыты по определению чувствительности реакции и окраски пятен гиосциамина, скополамина, тропина и тропинона на различных пластинках при обработке реактивом Драгендорфа по прописи ГФХ1 и по прописи, предложенной Pucoh et all, 1972 г.

При. определении чувствительности реакции на пластинках с реактивом Драгендорфа: использовали полученные кристаллические основания гиосциамина, тропина и тропинона, а также фармакопейный образец скополамина гидробромида.

ТСХ проводили на готовых пластинках «Merck» с силикагелем 60, пластинках «Сорбфил», а также на стеклянных пластинках с наливными слоями силикагеля G(Merck) и КСК. Система растворителей: ацетон - 10% раствор гидроксида аммония (95: 5).

Результаты опытов представлены в таблице 3.

2.2. Разработка методик количественного определения алкалоидов

2.2.1. Методика определения суммы алкалоидов в экстрактах красавки

Экспериментально установлено, что применяемый в методике НД способ экстракции алкалоидов не всегда обеспечивает их полное извлечение. Это связано с недостаточным подшелачиванием • реакционной смеси (рН менее 8) и ее физическим состоянием. Потери алкалоидов на стадии экстракции достигают20-30% от суммы.

Применение более сильных подщелачивающих агентов не привело к улучшению экстракции, так как вызывает образование в реакционной: смеси обильной стойкой. эмульсии и сопровождается накоплением тропинона вследствие гидролиза гиосциамина. Вместо жидкофазной очистки суммы алкалоидов с последующим ее объемным титрованием для количественного определения было предложено использовать метод экстракционной фотометрии. НД на некоторые комплексные препараты, содержащие густой экстракт красавки, включают методики экстракционно-фотометрического определения суммы алкалоидов с индикатором бромтимоловым синим. Однако эти методики не позволяют достичь полной экстракции, т.к. в качестве экстрагента используется буфер с рН, близким к нейтральному. Удачной оказалась замена этого экстрагента на растворы кислот (рН 1-3) и использование кислотного красителя: тропеолина000-П ('р-оксинафталин-1 -азо-п-бензосульфанат Na; Ci«Hi iNjNa O4S).

При разработке новой методики количественного определения суммы алкалоидов было изучено: влияние водной фазы на полноту извлечения ионных ассоциатов алкалоидов; количество экстракций; зависимость полноты экстракции ионных ассоциатов скополамина и гиосциамина от соотношения объемов водной и хлороформной фаз;

влияние концентрации тропеолина 000-П; различных кислот в качестве экстрагентов, а также влияние на результат анализа величины навески густого экстракта и времени экстракции.

Таблица 3.

Реакции производных тропана на пластинках ТСХ

Сорбенты пластинки Алкалоиды Rf Реагенты Окраска Чувствитель-

пятен ность, мкг

Силикагель КСК, А 0,6 1 Ор 0.7

Незакрепленный Б 0,15 1 Ор 0,7

слой 2 мм > В 0,44 1 С 1,7

Г 0,70' 1 Ор 2,0

Силикагель 60 А 0,05 1 Ф 0,8

"Merck", Б. 0,11 1 Ор. 0,7

Незакрепленный В 0,41 1 С 1,5

слой 1 мм Г 0,60 1 Ор. 1.8

Пластинки А 0,02 1 ф 1,0

«Сорбфил» А 0,02 2 ф 0,8

(Силикагель КСК Б 0,12 1 Ор1 0,5

0,25 мм) Б 0,12 2 Ор 0,05

В 0,46. 1 С 0,7

В 0,46 2. С 0,7

Г 0,72 1 Ор 0,7

г 0,72 2 Ор 0.1

"Merck", А 0,02 1 ф 0,8

Пластинки А 0,02 2 ф 0,8

(Силикагель G 60 Б 0,08 1 Ор 0,4

0,25 мм). Б 0,08 2 Ор 0,05

В 0,38 1 С 0,6

В 0,38 2 С 0,6

Г 0,68 1 Ор 0,5

Г 0,68: 2 Ор o,t

Условные обозначения:

Алкалоиды: А - тропин, Б - гиосциамин, В - тропинон, Г - скополамин Реагенты: 1 - реактив Драгендорфа по ГФХ1

2- реактив Драгендорфа по Pucoh et all. Окраска пятен: Op - оранжевая,

С - сине-фиолетовая, Ф - фиолетово-коричневая.

В ходе исследования было установлено, что ионные ассоциаты алкалоидов с красителем разрушаются в значительной степени в присутствии минеральных солей и при

фильтровании на любых фильтрах. В связи с этим в методику включена стадия отстаивания после экстракции ионных ассоциатов и исключена стадия осушения.

В окончательном варианте методика сводится к следующему:

Навеску г экстракта густого или сухого экстрагируют раствором 1% НС1 в соотношении 1 : 80 в течение 40 минут, полученный раствор разбавляют вдвое 1% НС1, к аликвотной части разбавленного раствора добавляют 2% раствор тропиолина 000-П (1 мл) и хлороформ, очищенный от спирта, в соотношении 1: 20 и извлекают ионные ассоциаты алкалоидов в течение 30 минут. Затем реакционную смесь переносят в делительную воронку и отстаивают 30 минут. Хлороформную фазу используют для определения оптической плотности.

Оптическая плотность хлороформных растворов ионных ассоциатов стабильна не менее 3-х суток.

Установлено, что тропеолин ООО-П не образует извлекаемых ассоциатов с неалкалоидными веществами, включая аминокислоты.

По разработанной методике при однократной экстракции в хлороформ переходит 96-98% всех извлекаемых ассоциатов суммы алкалоидов.

Данные метрологической оценки свидетельствуют об удовлетворительной воспроизводимости результатов анализа (табл. 4).

Таблица 4.

Метрологические характеристики методики определения суммы алкалоидов в экстрактах красавки

f X Б Р Д* е

Экстракт 5 1,59 0,00066 0,0256 0,95 2,57 0,066 4,15%

густой 5 1Д8 0,00044 0,0210 0,95 2,57 0,054 4,22%

5 1,03 0,00048 0,0220 0,95 2,57 0,056 5,50%

Экстракт сухой 10 0,80 0,00036 0,0190 0,95 2,26 0,0432 5,40%

Проверка правильности методики путем добавок очищенной суммы алкалоидов (табл. 5) свидетельствует об отсутствии систематических ошибок при анализе.

Обшая продолжительность анализа экстрактов по предлагаемой методике составляет около 2,5 ч.

Результаты анализа экстракта красавки густого, полученные фармакопейным методом на Чимкентском химфармзаводе и предлагаемым экстракционно-

-фотометрическим методом в ВИЛАР, приведены

в табл. 6. В нее включены также Таблица 5.

Содержание суммы алкалоидов, мг Добавлено -суммы алкалоидов,мг Должно быть алкалоидов, мг Найдено алкалоидов, мг Отклонения, %

Экст ракт густой

40,2 20,4 40,8 61,2 60,6 81,0 101,4 60,0 79,8 102,2 -1,00 -1,48 +0,80

Экстракт сухой

23,4 11,2 22,4 33,6 34,6 45,8 57,0 35,3 44,9 56,1 +2,02 -1,96 -1,58

данные о содержании титруемых кислот, которые определяли в испытуемых образцах по известной методике (Ермаков и др., 1987). Сравнение этих данных свидетельствует о том, что занижение содержания суммы алкалоидов, определяемое фармакопейным методом, может наблюдаться не только при низком содержании их в препарате. Оно связано в первую очередь с величиной титруемой кислотности. В тех случаях, когда густой экстракт с повышенной кислотностью соответствует требованиям ГФХ по содержанию суммы алкалоидов, действительное их количество может превышать 1,6% (в сериях 60891, 140991 и в обогащенном экстракте).

Таблица 6.

_ _ _ Результаты анализа экстракта красавки___

№№ образцов экстракта густого Сумма алкалоидов, % Титруемая: кислотность, млэкв/г

Образцы, соответствующие нд Метод НД Метод ВИЛАР

1 1,46 1,62 0,91

2 1,44 1,63 0,87

3 1,47 1,44 0,73

4 1,48 1,44 -

5 1,59 1.53 0,50

6 1,47 1.43 0,64

7 1,48 1,53 0,72

8 1.54 1,56 0,64

9 1,60 1.56 0,68

10 1.41 1,41 0,64

Образец экстракта, нестаби-лизиро ванный патокой 1,00 1,26 0,91

Лабораторный образец 1.40* 1,66 0,89

Данные, полученные в НПО ВИЛАР.

2.2.1.1. Предварительное изучение состава органических кислот в экстракте красавки.

В связи с тем, что высокое содержание свободных органических кислот затрудняет количественный анализ суммы алкалоидов по ГФХ, был исследован состав органических кислот в различных образцах густого экстракта красавки. Особое внимание было обращено на наличие кислот фенольной природы. При всех условиях хроматографирования обнаружены щавелевая, лимонная, янтарная и троповая кислоты.

Установлено, что по набору кислот высоко- и низкоалкалоидные экстракты различаются незначительно.

Поскольку вновь разработанная методика включает экстракцию суммы алкалоидов хлористоводородной кислотой уровень содержания и состав органических кислот в густом экстракте не влияет на результат количественного определения.

2.2.2. Методика определения суммы алкалоидов в траве красавки

При изучении возможности использования - сырья красавки с пониженным содержанием суммы алкалоидов (0,28%) в лабораторных условиях установлено, что суммарное количество алкалоидов на стадиях выделения было выше (0,34%), чем в исходном сырье.

С помощью хромато-экстракционно-фотомстричсской методики в исследуемом сырье было найдено около 0Д&% гиосциамина и 0,06-0,07% сопутствующих алкалоидов в пересчете на гиосциамин. Таким образом, сумма алкалоидов в этом образце равна 0,340,35%, а не 0,28% по ГФХ1. Поскольку речь идет о соответствии сырья требованиям НД, была тщательно изучена возможность потерь алкалоидов в процессе анализа по ГФХ1.

Было установлено, что потери алкалоидов происходят, в основном, на двух стадиях анализа.

1. Промывка эфирного извлечения водой. В промывную жидкость переходит около 0,01% алкалоидов в пересчете на сырье, независимо от их общего содержания в траве красавки. Более половины этого количества составляет гиосциамин. Кроме того, были найдены тропин и 6-оксигиосциамин.

2. Потери алкалоидов за счет неполного растворения осадка их СУММЫ перед титрованием. Они обусловлены присутствием в осадке смолоподобных веществ неустановленной природы, которые препятствуют количественному переходу алкалоидов в титрованный раствор хлористоводородной кислоты.

Приведенные факты свидетельствуют о необходимости усовершенствования или замены действующего метода анализа сырья красавки.

С целью унификации методов контроля при разработке методики для сырья за основу была принята вновь разработанная экстракционно-фотометрическая методика анализа экстрактов.

В опытах с сырьем были испытаны различные способы подготовки. пробы: экстракция и очистка алкалоидов по ГФХ1; экстракция хлороформом в различных вариантах, экстракция 1%-ным раствором хлористоводородной кислоты с очисткой и без очистки кислотного извлечения. Изучали продолжительность экстракции, соотношение количества сырья и экстрагента, влияние степени измельчения сырья на полноту экстракции алкалоидов, а также влияние неалкалоидных примесей на результаты анализа.

Установлено, что оптимальным способом экстракции суммы алкалоидов из сырья является экстракция 1%-ным раствором хлористоводородной кислоты в течение 45 минут при комнатной температуре и соотношение сырья и экстрагента 1:50.

Установлено, что дополнительная очистка кислотного извлечения не требуется. В итоге аналитический процесс сводится к следующему: алкалоиды извлекают из сырья 1% раствором хлористоводородной кислоты, извлечение фильтруют, аликвотную, часть фильтрата используют для получения ионных ассоциатов с тропеолином 000-П, которые извлекают хлороформом, очищенным от спирта.

Метрологические характеристики (табл. 7) свидетельствуют о достаточно высокой воспроизводимости результатов.

Таблица 7.

Метрологическая характеристика методики определения суммы алкалоидов в траве

красавки,

Проверка правильности методики с помощью добавок суммы алкалоидов на стадии экстракции показала (табл. 8), что систематическая ошибка в процессе анализа отсутствует.

Таблица 8.

Данные проверки точности методики с помощью добавок

Содержание Добавление - Должно быть Найдено Погрешности

алкалоидов. в алкалоидов, алкалои- алкалои- метода

образце, иг мг дов, мг дов, мг мг %

28,5 14,1 42,6 41,6 -1,0 -Z3

28,5 28,2 56,7 55,9 -0,8' -1.41

28,5 42,3 70,8 71,2 +0,3 +0,42

Сопоставление результатов анализа различных образцов сырья с помощью действующей, вновь разработанной методики анализа и методики по British Pharmacopeia (ВР) приведено в таблице 9.

Таблица 9

Результаты анализа сырья красавки различными методами

Происхождение Сумма алкалоидов в %

образцов; Фармакопейный Фармакопейный Экстракционно-

метод ГФХ1 метод BP' фотометрический

метод

Совхоз

«Гиагинский»

1 0,45 0,47 0,4«

2 0,35 0,36 0,36

3 0,36 0,37 0,37

Совхоз «Радуга», 1 0,28 0,35 0,35

2 0 50 0,56 0,57

2.3. Разработка проекта ФСП на препарат «Беллацехол» Препарат «Беллацехол», впервые предложенный в ВИЛАР, представляет собой таблетки, в состав которых входят сумма алкалоидов красавки и экстракт пижмы -танацехол. Применение в комплексных препаратах стандартизированной суммы алкалоидов позволяет устранить недостатки, присущие экстрактам красавки.

В одной таблетке препарата «Беллацехол» содержится 0,15 мг суммы алкалоидов красавки, 50 мг танацехола и вспомогательные вещества, применяемые при производстве таблеток «Танацехол» и «Беллатаминал».

Фармакологическое изучение «Беллацехола», проведенное в ВИЛАР в сравнении с гиосциамином и танацехолом, показало, что полученный комплекс не влияет на проявление фармакологической активности, присущей гиосциамину и танацехолу, т.е.

«Беллацехол» увеличивает порог болевой чувствительности, оказывает спазмолитическое действие, стимулирует интенсивность желчеотделения, повышает холато-холестериновый коэффициент, оказывает защитное действие на слизистую желудка, обладает гепатопротекторным действием.

В раздел проекта ФСП «Подлинность» включены: цианидиновая реакция на флавоноиды, суммарные УФ-спектры фенольных соединений, характерные для таблеток «Танацехол», ТСХ на пластинках «Сорбфил» для обнаружения тропановых алкалоидов. Показано, что присутствие в таблетках суммы алкалоидов красавки в количестве 0,3% от танацехола не мешает идентификации и количественному определению суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. Тропановые алкалоиды обнаруживаются на пластинках ТСХ с помощью подвижной фазы метанол-хлороформ-25%-ный раствор аммиака (20 : 10 : 1), которая позволяет отделить сумму (атропин + гиосциамин) от всех производных тропана, идентифицированных в траве красавки к настоящему времени.

В раздел «Количественное определение» включены методики определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот пижмы в пересчете на лютеолин и суммы алкалоидов красавки в пересчете на атропин.

Для определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в таблетках «Беллацехол» использована методика, основанная на прямой спектрофотометрии при ЗЮнм аналогичная методике анализа танацехола экстракта сухого по ФСП 420175101 и таблеток «Танацехол» по ФСП 37-18-99. Относительная ошибка методики составляет ±4%.

С целью унификации методов количественного определения суммы алкалоидов в таблетках была изучена возможность применения в таблетках экстракционно-фотометрической методики. Изучалось влияние различных образцов танацехола на результаты экстракционно-фотометрического анализа. Установлено, что танацехол содержит вещества, которые завышают данные экстракционной фотометрии в 1,2-2 раза. Попытки отделить мешающие компоненты с помощью различных вариантов жидкофазной экстракции не дали положительных результатов. Поэтому было признано необходимым разработать хроматографическую методику контроля суммы алкалоидов.

На основе известной хромато-спектрофотометрической методики, модифицированной на ПЭЗ ВИЛАР для анализа сырья красавки, нами была разработана методика анализа таблеток «Беллацехол», включающая следующие стадии: экстракция суммы алкалоидов разбавленным (1 : 300) раствором ортофосфорной кислоты; перевод суммы алкалоидов в хлороформную фазу с последующим упариванием; растворение

сухого остатка в метаноле и хроматографирование в присутствии стандартного образца атропина сульфата; элюирование зон алкалоидов НС1, образование ионных ассоциатов с тропеолином ООО-И и определение оптической плотности'

Методика имеет удовлетворительную воспроизводимость (табл,10). Опыты с добавками суммы алкалоидов на стадии экстракции показали отсутствие систематической ошибки анализа (табл. 11),

Содержание суммы флавояоидов и фенолкарбоновых.кислот в одной таблетке «Беллацехрл» в пересчете на лютеолин должно быть не менее 0,0225 г и не более 0,0275 г.

Содержание суммы алкалоидов красавки в одной таблетке «Беллацехол» в пересчете на атропин должно быть не менее 0,000115 и не более 0,000155 г.

Таблица 10.

Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы алкалоидов красавки в таблетках «Беллацехола»

f ■ X * S Р ДАТ- 8

10 с 142-Ю"4 2,08 •! 0"'J 4,57-10"6 95 2,23 10,21)0"* ±7,11%

Таблица)1.

Результаты проверки правильности методики с помощью добавок

Содержание суммы алкалоидов в пробе, мг Добавлено суммы алкалоидов, мг Должно быть найдено суммы алкалоидов, мг Цайдено суммы алкалоидов, ' 'мг , Ошибка анализа

мг 0/0

2,84 0,75 3,59 - "3,41 -0,18 -5.0

•2,84 1,50 4,34 • 4,48 +0.14 +3,2

2,84 3,00 5,84 5,69 ■0,15 -2,6

2.4. Разработка способов получения продуктов, соответствующих требованиям НД из низкоалкалоидного экстракта густого красавки

Возможными путями переработки низкоалкалоидного экстракта красавки являются:

1. Применение его в комплексных готовых лекарственных средствах с повышением нормы вложения.

2. Получение сухого экстракта с пониженным содержаниемдекстрина.

3. Доведение содержания алкалоидов в концентрате до нормы путем частичного удаления неалкалоидных компонентов.

4. Использование низкоалкалоидного. концентрата для получения: очищенной суммы алкалоидов или индивидуальных соединении.

Были изучены все перечисленные пути переработки низкоалкалоидного экстракта красавки. Все они позволили получить продукты, соответствующие требованиям НД.

Проведенные фармакологические исследования соответствующего НД и несоответствующего НД экстрактов показали, что оба экстракта обладают однонаправленной биологической активностью и мало токсичны.

По совокупности экономических затрат, организационных усилий и результатов. фармакологических испытаний наиболее оптимальным явилось получение сухого экстракта с пониженным содержанием декстрина.

При разработке способа получения очищенной суммы алкалоидов из низкоалкалоидного экстракта было установлено, что при высоком содержании скополаммина. (14-20% от суммы) полученный продукт не соответствует НД, и в технологический процесс необходимо вводить стадии дополнительной очистки и многократные экстракции скополамина по принципу противотока.

3. ВЫВОДЫ

1. Изучен компонентный состав суммы алкалоидов в отечественном сырье красавки различного происхождения и продуктов его переработки. Всего обнаружено до 14алкалоидов, из которых идентифицированы: апоскополамин, 6-оксигиосциамин, 6-оксиапогисциамин (б-оксиапоатропин), трогата, тропинон, в суммарных масс-спектрах найдены также сигналы, соответствующие молекулярным пикам диокситропана и 6-окситропинона.

Показано, что в экстрактах красавки, доминирующим компонентом суммы алкалоидов является Ь-гиосциамин.

Впервые обнаружено высокое содержание тропинона (продукта деструкции гиосциамина) в некоторых промышленных сериях экстракта густого красавки и отходах производства суммы алкалоидов из травы красавки.

2. Впервые установлено, что действующая технология получения экстракта густого непригодна для переработки крупных партий сырья красавки, экстракта густого, соответствующих НД. Показано, что причиной этого является повышенное количество неалкалоидных веществ, извлекаемых 20%-ным этанолом в технологическом процессе.

3. Установлено, что. некоторые партии сырья содержат неалкалоидные компоненты, не отделяющиеся от алкалоидов в процессе количественного анализа по НД, что приводит к занижению результатов.

4. Впервые обнаружено специфическое взаимодействие низкомолекулярных производных тропана, прежде всего тропинона, с реактивом Драгендорфа на пластинках ТСХ, сопровождающееся образованием синей (фиолетовой) окраски пятен. Предложен' селективный способ обнаружения тропинона в препаратах красавки, полупродуктах и отходах производства.

5. Предложены способы переработки низкоалкалоидного концентрата красавки: дополнительное удаление неалкалоидных веществ; получение очищенной; суммы алкалоидов с применением метода очистки и кристаллизации по НД; получение экстракта сухого с пониженным содержанием декстрина.

Медико-биологическими исследованиями подтверждена специфическая активность и низкая токсичность полученных образцов.

6. Разработаны новые методики количественного определения суммы алкалоидов в сырье и экстрактах красавки на основе экстракционной фотометрии с применением красителя тропеолин 000-ЕЬ Методика анализа сырья включена в проект НД на траву красавки.

7. Разработан проект НД на новый; лекарственный препарат таблетки «Беллацехол», составлен проект ФСП на препарат.

Содержание диссертационной работы отражено в следующих публикациях:

1. ОАГаевская, С.В.Русакова, АИ.Мирошников, Т.Л.Сокольская, В.Л.Багирова. О количественном определении суммы алкалоидов в экстрактах красавки // Хим.-фарм. журнал - 1993 - Т.27, № 9 - с.61-64.

2. ОАГаевская, ТАСокольская, А.И.Мирошников. О количественном определении суммы алкалоидов в траве красавки // Хим.-фарм.журнал - 1994 - Т.28, № 1 -с.36-37.

3. ОАГаевская, Ю.П.Козьмин, В.О.Толкачев, А.И.Мирошников //.Идентификация алкалоидов в продуктах переработки травы красавки // Хим.-фарм.журнал - 1997 - Т.31, № 2-с. 46-50.

4. В.В.Гаевский, ОАГаевская, Е.В.Коваленко. Экспресс-анализ растительного сырья и продуктов его переработки с помощью цветных химических реакций // Материалы 1-го международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» - Пущино - 1995 - с.813-814.

5. АВ.Гаевский, Е.В.Дегтерев, ЕАСимонов, В.Г.Макаров, ОАХаевская, В.И.Сорокин. Методология анализа веществ, подлежащих специальному контролю в Российской Федерации // Материалы 2-ой Всероссийской конференции по истории и методологии аналитической химии - М. -1999 - с. 11-15.

6. АВ.Гаевский, Е.В.Дегтерев, ЕАСимонов, В.Г.Макарон,.. ОАГаевская, В.И.Сорокин. Аналитическая экспертиза веществ, подлежащих специальному контролю в Российской Федерации // Новые лекарственные препараты -1999 - вып.4 - с. 15-29.

7. ОАГаевская. О лекарственных средствах, содержащих алкалоиды красавки (Atropa belladonna L.) // Новые лекарственные препараты - 1999 - вып.4 - с.30-39.

8. АВ.Гаевский, Е.В.Дегтерев, ЕАСимонов, В.Г.Макаров, ОАГаевская, В.И.Сорокин. Методология и правовые аспекты аналитического контроля опасных веществ // Заводская лаборатория. Диагностика материалов - 2000 - Т.66, № 6 - с.56-63.

Актуальность темы. Красавка относится к числу наиболее популярных и часто применяемых в медицине лекарственных растений. Сырье красавки Atropa belladonna L. и Atropa caucasica Cr. служит основным источником природных тропано-вых алкалоидов для многочисленных отечественных лекарственных средств, обладающих антихолинэргическим действием и применяемых при лечении желудочно-кишечных и других заболеваний. Чаще всего в готовых и экстемпоральных лекарственных формах применяют экстракты красавки густой и сухой, которые получают методом быстротекущей реперколяции 20%-ным спиртом из травы красавки. Этот же вид сырья используют для производства очищенной суммы алкалоидов, известной под названием "беллагербин", которая входит в состав комплексного лекарственного средства таблетки "Беллатаминал" успокаивающего действия [44].

Сырье красавки и продукты его переработки стандартизируются по содержанию суммы алкалоидов в пересчете на гиосциамин. В соответствии с требованиями нормативно-технической документации в траве красавки должно быть не менее 0,35% суммы алкалоидов, в экстракте густом - 1,4-1,6%, в экстракте сухом - 0,70,8%. Сумма алкалоидов для таблеток "Беллатаминал" по своим свойствам близка к индивидуальному гиосциамину-основанию и содержит действующие вещества в количестве не менее 97,5%.

Исследованию природных источников тропановых алкалоидов посвящено большое количество отечественных и зарубежных публикаций [7, 15, 27, 46, 49, 91, 100, 108, 109, 126 и др.] Однако, до сих пор отсутствует детальная характеристика алкалоидного состава сырья, используемого для получения отечественных препаратов красавки и продуктов его переработки.

Известно, что важнейшие алкалоиды красавки гиосциамин и скополамин в процессе переработки сырья могут подвергаться деструкции с частичной или полной потерей биологической активности. Но в регламентах и фармакопейных статьях на суммарные и галеновые препараты отсутствуют какие-либо требования, позволяющие ограничить содержание неактивных соединений в готовых продуктах. Методы количественного анализа сырья, лекарственных веществ и лекарственных форм не унифицированы, что затрудняет получение сопоставимых результатов и усовершенствование технологических процессов.

Известны случаи, когда из многотоннажных партий сырья, отвечающего требованиям нормативной документации, невозможно получать по действующей технологии густой экстракт, кондиционный по содержанию алкалоидов. В связи с этим, возникают проблемы рационального использования подобного сырья или получаемого из него экстракта. Но даже при оптимальных условиях получения сырья и галеновых препаратов красавки сохраняется, в принципе, нестабильность их качества обусловленная природной изменчивостью компонентного состава. В связи с предполагаемым созданием сырьевой базы красавки в новых регионах России эта нестабильность может возрастать.

Радикальным способом устранения этих недостатков является замена галеновых форм суммой алкалоидов типа "беллагербина". Но, как уже отмечалось, "бел-лагербин" пока используют для производства единственного отечественного лекарственного средства. Создание новых комплексных препаратов с применением "беллагербина" взамен экстрактов красавки представляет существенный интерес для медицины.

В задачу наших исследований входило изучение алкалоидного состава сырья красавки и продуктов его переработки, разработка новых экстракционно-фотометрических методов определения суммы алкалоидов в сырье и экстрактах красавки, разработка способов утилизации некондиционного экстракта красавки, разработка методов контроля и проекта ВФС на новое комплексное лекарственное средство на основе суммы алкалоидов красавки и флавоноидов (таблетки "Белла-цехол").

Научная новизна. Впервые обнаружено и исследовано кондиционное сырье красавки, при работе с которым оказались непригодными действующая технология получения экстракта густого и метод контроля качества готового продукта.

Выявлена недостоверность действующих фармакопейных методик определения суммы алкалоидов в сырье и экстрактах красавки, обусловленная влиянием неалкалоидных компонентов.

Разработаны новые методики определения суммы алкалоидов в сырье красавки и экстрактах густом и сухом.

Впервые показано накопление значительного количества продукта деструкции гиосциамина (тропинона) в некоторых серийных образцах экстракта густого и отходах производства суммы алкалоидов красавки.

Впервые обнаружено специфическое взаимодействие низкомолекулярных производных тропана (тропина, тропинона и др.) с реактивом Драгендорфа при хро-матографировании в тонком слое силикагеля.

Впервые разработаны методы подлинности и количественного определения действующих веществ в таблетках комплексного лекарственного средства, содержащего алкалоиды красавки и фенольные соединения пижмы ("Беллацехол").

Практическая ценность работы. Предложены способы утилизации некондиционного экстракта густого: а) путем его обогащения за счет удаления части неалкалоидных соединений; б) путем использования его для получения экстрактов густого и сухого с пониженным содержанием наполнителя; в) путем его переработки в очищенную сумму алкалоидов.

Медико-биологические исследования продуктов "а" и "б" в медицинском отделе НПО "ВИЛАР" дали положительные результаты. Сумма алкалоидов красавки "в" полностью соответствует требованиям действующей НД.

Разработанная методика определения суммы алкалоидов красавки включена в проект новой фармакопейной статьи на траву красавки.

Разработан проект ВФС на комплексное лекарственное средство - таблетки "Беллацехол".

ВЫВОДЫ

1. Изучен компонентный состав суммы алкалоидов из отечественного сырья красавки различного происхождения и продуктов его переработки. Всего обнаружено до 14 компонентов, окрашиваемых реактивом Драгендорфа; идентифицированы: апоскополамин, 6-оксигиосциамин, б-оксиапогисциамин (6-оксиапоатропин), тропин, тропинон; в суммарных масс-спектрах найдены также сигналы, соответствующие молекулярным ионам диокситропана и 6-окситропинона; масс-спектры двух компонентов (М + 338 и М + 320) интерпретировать не удалось.

Показано, что в экстрактах красавки, доминирующим компонентом суммы алкалоидов является L-гиосциамин.

Впервые обнаружено высокое содержание тропинона (продукта деструкции гиосциамина) в некоторых промышленных сериях густого экстракта красавки и отходах производства суммы алкалоидов ("Беллагербин")

2. Впервые исследовано кондиционное низкоалколоидное сырье (трава) красавки, при работе с которым непригодны действующая технология получения экстракта густого и фармакопейные методы определения суммы алкалоидов в сырье и экстрактах. Показано, что исследуемое сырье по составу азотистых оснований близко к высокоалкалоидному сырью, но отличается повышенным количеством неалкалоидных веществ, в том числе титруемых кислот, извлекаемых 20%-ным этиловым спиртом.

3. Впервые обнаружено специфическое взаимодействие низкомолекулярных производных тропана, прежде всего тропинона, с реактивом Драгендорфа на пластинках ТСХ, сопровождающееся образованием синей (фиолетовой) окраски пятен. Предложен селективный способ обнаружения тропинона в препаратах красавки, полупродуктах и отходах производства.

4. Предложены способы утилизации некондиционного концентрата красавки по прямому назначению путем дополнительного удаления неалкалоидных веществ или получения экстракта сухого с пониженным содержанием наполнителя. Медико-биологическими исследованиями подтверждена специфическая активность и безвредность полученных образцов препарата.

5. Показана возможность переработки некондиционного низкоалкалоидного концентрата красавки в очищенную сумму алкалоидов ("Беллагербин") с применением действующего способа очистки и кристаллизации продукта. При аналогичной переработке экстракта с повышенным содержанием скополамина последний следует отделять перед кристаллизацией "Беллагербина".

6. Разработаны новые методики количественного определения суммы алкалоидов в сырье и экстрактах красавки на основе экстракционной фотометрии с красителем тропеолин ООО-Н. Методика анализа сырья включена в проект НД на траву красавки.

7. Разработаны методики определения суммы алкалоидов (гиосциамин + атропин) и суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в таблетках комплексного лекарственного средства "Беллацехол", составлен проект ВФС на препарат.

Показана стабильность содержания действующих веществ в таблетках "Беллацехол" при хранении в течение 2 лет.