Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование сарколизина, асалина - противоопухолевых препаратов, производных ди-(2-хлорэтил)-амина, с применением физико-химических методов (фармацевтический анализ и фармакокинетика)

АВТОРЕФЕРАТ
Исследование сарколизина, асалина - противоопухолевых препаратов, производных ди-(2-хлорэтил)-амина, с применением физико-химических методов (фармацевтический анализ и фармакокинетика) - тема автореферата по фармакологии
Яцевич, Олег Викторович Москва 1993 г.
Ученая степень
кандидата фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.02
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Исследование сарколизина, асалина - противоопухолевых препаратов, производных ди-(2-хлорэтил)-амина, с применением физико-химических методов (фармацевтический анализ и фармакокинетика)

4 , #

% ' МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЭНАКЕНИ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И.Н.СЕЧЕНОВА

ira правах рухоинси ■ УДК 6E5277.36!5031/034Gt50734..W.5

Я11ЕВНЧ ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ САРКОЛИЭИНА. ЛСЛЛИНА - ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ НРГПАРЛТОП, ПРОИЗВОДНЫХ ДН-12-ХЛОРЭТНЛ )-А101НА, С ПРИШВИНЕ!! 'ЯШКО-ШаИЕСКИХ »ГСТОДОВ <ФАРИЛЦЕВТНЧЕСКМП АНАЛИЗ и ФАРМАКОКММЕТНКЛI.

13.00.02 - фприпцевтнческвя хпкяа и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ «нссиртаюп! im co<u.ynmro учпноп степени Ко. шлата ларклш.'птмчаских наук

!ОСКГ '-19Ч )

Работа выполнена с Московскоя ордена Ленина м ордена Трудового Красного Знаианн иецицинскоп академик им. И.М.Сеченова и Научнг исследовательской институте Экспериментально*) Диагностики и Терапии Опухолей Онкологического научного центра Росснпскоп Академии Медицинских Наук

Научные* руководители!

- доктор фармацевтических ьаук, профессор Арзаиасцеи Л.П.

- кандидат биологических наук Зиыакова Н.И.

0<И)иипльнио оппоненты! ''

- доктор фармацевтических наук, профессор Берлина А.С.

- доктор химических наук, профессор Харитонов Ю.Р.

Ведуые учреждения - Научно-иселсдовательскив институт Фармации Министерства Здравоохранении Госсмископ Се с-""йшш.

3 агата состоите в " М) У^ДОЛ^Й, 1993 г. в •]£!" час. не эосе данни Специализированного совета Д.074.03.Об при Шсковскоп ордена Ленина и о- •'ена Трудового Красного Знамени Ш'дицмнской икадемин ии. Н.М.Сеченова по адресу» г.Ьйсква, Суворовские бульвар, д.13.

С ли ертацмей можно ознакомиться е библиотеке 1£!Л «к. И.М.Сеченова (г.кЪехва, Зубовская пл., д.II.

Автореферат разослан "'/,, ■ юол г.

.ченмп секретарь Споии;и1иэированного гонетл Л.074 .ОГ. .06, камдчлят ^йрм-1:!>'втических

наук, д.чкнг Н.П.Спдчинога

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Повышение эффективности противоопухолевой химиотерапии в настоящее время развивается по разный направлениям. Вместе с поиском и синтезом новых оригинальных препаратов с donee избирательным действием на опухолевые клетки важное значение имеет и исследования, связанные с оптимизацией методик применения противоопухолевых средств, уже зарекомендовавших себя в медицинской практике, путем совершенствования лекарственных форм, дозирования, схем и режимов введения. При этом все большее внимание уделяется изучение фариакокинетики препаратов, данные которой позволяют предложить рациональные методы использования известных лекарственных средств (Холодов Л.Е. и др.,1985; Фирсов A.A. и др., 1984)..

Кроме того, немаловажным является повышение качества лекарственных средств путем совершенствовг ля технологии их изготовления, методов анализа и стандартизации. Постоянно повышавшиеся требования к качеству, направленные на обеспечение эффективности и безопасности лекарственных средств, нашли отражение в Государственной Фармакопее xi-издания и в современных зарубежных фармакопеях.

Наибольшее практическое применение в онкологии нашли алкили-руюшие агенты, явл'яоютеся самым многочисленным классом противоопухолевых соединений. К этому классу относятся производные ди-<2-хлорэтил)-эмит. сарколизин и асалин (дипептид сарколизина). Препараты используются в клинике с 60-х годов и хорош зарекомендовали себя при лечении лимфо- и ретикулог,ркомы, миеломноя болез-HI- семиномы яичка и лругих опухолевых заболеваниях (Блохин H.H. и ср. ,1977,1984: Ларионо. Л. 0. ,1962; Переводч.чкова Ч.И.,1993).

Однако, несмотря па длительность применения препаратов в клинике (более 30 лет), до сих пор не были предприняты фармакокинати-ческие исследования. Направленные ha i еспеч^ние рационального

курса лечения и возможного снижения числа неблагоприятных побочных реакций. г1ед1: известных методов количественного анализа этих препаратов отсутствуют достаточно надежные и эффективные .методы, позволяющие определять содержание легкогидролизуовсгося сарколиэи-на в присутствии продуктов его деградации и содержание рацемических смесей дипептидов в ас ал пне, различающихся Оно логической активностьо.

В настоящее время в НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН разработаны новые лекарственные формы этих препаратов! лиофилизированныя порошок для внутривенных инъекций (с&рколиэцн) и таблетки для перорального применения (асалин).

Высказанные положения определяет актуальность и практи-ческуо значимость изуения доклинической фармакокинетики сарколизина и асалина в новых лекарственных формах и совершенствования методов анализа и контроля качества препаратов с помосьо современных физико-химических методов! высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ1, тонкослойной хроматографии (ТСХ1, УФ- , 4Н-'и ЧН-АИР-спектроскопии. Учитывая принадлежность препаратов к одному массу соединения, близость их химической структуры, сходность механизма действия наряду с индивидуальной спецификой фармакологического действия, представляет научный и практический интерес прг здение их сравнительного физико-химического- и фариакокинетического анализа.

Цель исследования - разработка эффективных методик контроля качества сарколизина и асалина в порошке, в новых лекарственных формах и изучение доклинической фарыакокинетики препаратов. Основ' е задачи исследования.

- разработка методик количественного анализа сарколизина и ас и-на, их возможны*, примесей с помощью метода ВЭЖХ;

- исследование стабильности сарколизина и асалина в лекарственных формах, растворах и биологических жидкостях с. помошьо ВЭЖХ:

- изучение фармакокинетики сарколизина при однократном ретраорбн-тальном введении у мышея;

- изучение фармакокинетики асалина с элементами ..¿таболизиа при однократно., пероральном введении у мышея и крыс.

Научная новизна. Впервые разработана унифицированная методика ВЭЖХ анализа сарколизина в порошке и в сложной лекарственной форме для инъ?кция, продуктов его гидролиза и возможных технологических примесея, таких как этиловый эфир сарколизина. Получены и охарактеризованы образцы специфических примесея сарколизина. Метод ВЭЖХ впервые использован для изучения кинетики гидролиза сарколизина в растворах при различных температурах и устойчивости препарата в биологических жидкостях.

Разработана методика ВЭЖХ анализа асалина и его рацемических смесей.

Изучена фармакокинетика неизмененного сарколизина у мывея . и выведение его мочоя. Предпринято тирокое доклиническое изучение фармакокинетики Н-асалика с элементами метаболизма у животных. Проведено математическое иоделирование <рармакокинетических процессов.

■ Практическая значимость. Предложена методика ВЭЖХ для количественного определения сарколизина, продуктов его деградации, технологических примесея в пороске, лекарственных формах, биологическом материале. Методика иояет быть использована для изучения стабильности, -инетики гидролиза и фармакокинетики препарата. Методика апробирована в лабораториях НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМП, в виде Дополнения и Пояснительной записки вошла в проект ETC на "Г-'рколизин-лио по 0,02г для инъекция". Материалы по изучения стабильности препарата f растзоре-концентрата приняты к' использовании при разработке лабораторно-технологического регламента по производству лиа^или^нрованного сарколизина для инъекция.

Методика анализа асалина методом ВЭ^, позволявшая оппегол^т1-

соотношения его рацемических смесей в порошке, таблетках и биологическом материале, апробирована а лабораториях НИН ЭДиТО ОНЦ РАМН.

Результаты фармакокинетических исследования включены о документацию, представляемую в ©армакологическия Комитет U3 РФ с целью разрешения проведения I фазы клинических испытания.

Связь чсследования с проблемным "лано:. фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НМЛ им. И.U.Сеченова и проблемой "вариация" Научного Совета №ю РАМН "Фармакология н .фармация" по специальности 13.00.02 "фармацевтическая химия к фармакогнозия", номер госрегистрации 01060046673 н планои научко-ксследовательских работ НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН, номер госрегмстрашш 01910001729 и 0191 ОООU J2.

Апробация работы. Результаты исследование долохэны на ш Всесоюзном совещании по проблеме "Скзиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильным» изотопами" (Зв\. ...дород, 1991 ), на Межреспубликанской научной конференции "Проблем стандартизации а контроля качества лекарственных средств" (Москва. 19911, на in Всесоюзно» конференции по фармакокинетике (Москва, 1991), на i t и научно-практической и иаучно-иетодическоп конференциях молодых ученых Казау-тана с участием деятелей науки стран СНГ и дальнего зарубежья (Москва, 1992,19931, на заседаниях Ученого Совь.а НИИ ЭДиТО ОНЦ PAISJ (Москва, апрель, нюнь-1993). Работа доложена на межлабораторных собраниях НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМН (Москва. 1992,19931 и на мехкафедральноя конференции фармацевтического факультета MVA им. И.М.Сеченова ((Москва, 1993Ii

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в работ.

IU затоту выносятся результаты экспериментальных исследования и их теоретическое обоснование■

- методики идентификации и количественного определения сарколкзи-на, продуктов его гидролиза и технологических примесеп в порояж*-.

лекарственных формах и биологическом материале с пом чимо ВЗЖХ;

- методики количественного определения асалина и его рацемических смесей з порошке, таблетках, биологическом материале методой ВЭЖХ;

- результаты изучения кинетики гидролиза сарколизина в растворах и в биологических жидкостях;

- результаты изучения доклинической фармакокинетики неизмененного сарколизина у мышей при однократной ретраорбитальном введении и вН-асалина у крыс и ыышэй при однократном пероральноы .введении.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа излоязена на 193 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка, 29 таблиц. Библиография включаат 223 наименования, з той числе 126 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении отражены актуг юность, научная новизна и практическая значимость исследований, определены их цель и задачи.

В обзоре литературы дана физико-хкмическмая характеристика сарколизина и асалина, критический анализ методов определения изучаемых препаратов в лекарственных формах и биологическом материале, обобпуны фармакологические и фармакокинетические свойства сарколизина и асалина.

1■ Количественный анализ сарколизина и его примесей методом

ВЭКХ.

Сарколизин (о. L-a-амино-^- щ-ди-( 2-хлорэтил )-аминофениЛ1 -про-пионовоп кислоты гидрохлорид! гидролитичг~ки неустойчив. В всд1шх рг 'творах хлорэтиламинная группа сарколизина подвергается гидролизу с образование) легко растворимых продукт "in - мопо- и ;и-гидроксисарколизина <МГС, ЛГС1 (Ягуяшския Л.С. и др.,1969; Hartwig к.о. et ei.,19801, не обладашшх противоопухолевым действие« (Rose w.c.J. ,1352 1. Кроне того о no.oicce сарколизина возможно

содержание технологическая принеси - этилового эфира сарколизина < ЭЭСI.

В основу предлагаемого метода ВЗКХ положена ион-парная

хроматография, позволяемая получить полное . разделение всех

примесея, присутствующих в препарате (рис. 11. Определение ееиеста

осуществляли на жидкостлом хроматографе sp еооо (США) с

УФ-детектором при постоянной длине волны 234 ни, на колонке

размером 250*4 ми с сорбентом "Силасорб С6", 7 imii и предколонке

размером 30*2 км с сорбентом "peiiicuur ods", 37-53 taut. 3 4 i Ü 3 4

S ft

w

0 4 0 12 O 'i 0 12 T, uy«

Рис.1. Хроматограмма пороки! Ш и лекарственной $орш <Б1 сарколизина.

1 - вспомогательные ингредиент лекарственной форш,

2 - МГС, 3 - спрколхзнн, 4 - внутрошшя стандарт,

3 - ЭЭС.

Условия ВЭЗК определены, исходя из предварительных экспериментальных данных и теоретических предпосылок разделения в рекиис иои-парлой хроматографии. Подвижной фазой с луг.;: л а сигсь игтанол-0,01 М фосфатнып буфер |рН - 2,4», содергасип 0,05* воде1 лсульфата натрия - 60:40 (по объеиу). Температура колонки 40°с, схорость потока подвижной фазы 1 ил/мин, обгеи во- 1моп пробы 10 мкм. Предел обнаружения для всех соединения - 30 нг/мл.

Количественный анализ сарколизина и его примесеп в порошке и в лекарственной форме для инъекция пр гмдили

- г

методом внутреннего стандарта по калибровочному коэффициенту. В качестве внутреннего стандарта использовали толуол марки "для УФ-спектроскопии". Ингредиенты лекарственной формы (органические кислоты, ПВП1 не мешает количественному определений сарколизина, МГС и ЭЭС (рис.1 Б). Время удерживания для ДГС, МТС, сарколизина, внутреннего стандарта и ЭЭС составляет 2,4;.3,2; 5,3; 6,4 и 11,9 мин. соответственно.

Определения калибровочного коэффициента - коэффициента пропорциональности ыэзду соотношениями площадей пиков и концентрацией препарата, его примесел и внутреннего стандарта - проводили, используя модельные смеси рабочего стандартного рбразца сарколизина, образцов МГС, ЛГС, ЭЭС с толуолом (табл. 1). Чистота полученных образцов примесеп (до 9Э7.I удорлетворяла задачам исследования.

Таблица 1.

Результаты определения калибровочных коэффициентов сарколизина и его примесеп по вн.г оеннеиу стандарту - толуолу

Соединение Сарколизин ЛГС liTC ЭЭС

0,03611 0,04370 0,04630 0,04643

Калибровочный 0,03666 0,04223 0,04502 0,04724

0,03624 0,04566 0,04569 0,04673

коэффициент 0,03738 0,04305 0,04353 0,04554

0,03759 0,04326 0,04390 0,04704

0,03652 " 0,04392 0,04674 0,04541

0,03724 0,04623 0,04438 0,04740

Астрологическая характеристика я . В Sa д* с 0,03062 0,397-10-» 2,040 •Ю-" 0,00050 1,367. 0,04429 1,607-Ю-з 6,073 ■ 10""* 0,00149 3,36'/. 0,04309 1 ,206-Ю-з 4,557-10-* 0,00112 . 2,48'/. 0,04654 7,963-10-' 3,01010-о 0,00074 1 ,567.

Оптималышл интервал концентрация дл;-' количественной оценки пр- соблюдении лшшлн^я зависимости плошади 'пика от коннентряции вешл'ств с использованном внутреннего стандарта составляет: • -¡я сарколизина и ЭЭС ~ 0,5-130 икс/мл, лпя ДГС и ИГС - о,2-1 ПО икс/мл. Рабочая концентрация, мстанольного расткора сарколизип-i и ana."1n?tipyPMux образцах - 50-100 ыкг/мл, «утреннего г-пчнлагт.!

700 мкг/мл. Результаты количественного определения сарколизина и его примесе;' в порошке и лекарственной форме для инъекции методом ВЭХХ представлены в табл.2. Наличие ДГС в анализируемых образцах порошка сарколизина в условиях опыта не обнаружено. В течение года при температуре хранения не выше ^"с содержание сарколизина и его примесей не изменяется.

Таблица 2.

Результаты количественного определения сарколизина и его примесея а порошке и лекарственной форме метопом РЭХХ

«Р-95Х, > „-31

Анализируемой Ц^трологичаская Найдено. X

¿бра^ч.СРри* характеристика сарколизин МГС ээ С

X 95.47 1 .й4 2,0/-

порошок, 8 1.376 7.63 10 -я 0,147

в» 0.613 3.5010 -ж 6.36' ю-«

серия 110191 а« 1.71 0,097 0,103

в 1,79* 3.29Х 6.64Х

ч 96,63 0.49 2,ив

порошок. 8 0.826 4.3210 -» о.из •

вв 0.370 1,9310 -» 3,9410"»

серия 120191 ё» ■ 1,03 0,054 0,140

* 1,0бХ 10.97Х 6.73Х

к 97,11 0.43 2.23

порошок. 8 0.923 3,3910 -а 0,136

В„ 0,409 1.3210 -» 7,00-10-»

серия 130191 Дх 1.14 0,042 0.194

с 1.17х 9.60Х 6.64Х

лекарствг 'ная X 92,21 !<92 1.9?

форма для 5 1 .¿зе 0,276 0.126

инъекций. 0,554 0,123 .62 10-»

серия 130391 Дх 1,54 0.343 и.13Т

с 1,67х 7,01 X 6,09*

лекарственная X 93,10 1.66 2,00

форма для 3 0,695 0,334 0,109

инъёкции, 8» 0.400 0,149 4.8В-Ю-»

серия 140391 Дх 1.11 0.413 0,136

с 1.19* 6.91Х б. 79»

лекарственная к 94,86 3.33 1.99

форма для г 1 ,2-15 0.240 0.113

инъекций. 0.557 0.107 5,06 • 10"~»

сери^ 150391 д* 1.55 0,299 0,141

с 1 .634 В.бГ/. 7.С-6Х

Показано, что содержание первого продукта гидролиза - к5ГС в лекарственной форме на 3-6% выше чей п субстанции сарколизнна. Содержание ЭЭС составляет во веек сериях препарата около 2*.

Разработанная методика ВЭХХ анализа адаптирована для количественного определения сарколизнна в биологической материала: аоче, плазме крови, гоиогенате внутренних органов. Подобраны штимальные условия приготовления биологических образцов для ЗЭДХ шализа, обеспечивавшие кншнгальныя гидролиз сарколизнна в них. 1увствителыюсть методика 0,15 икг/пл. Опибка определения арколизина в плазке и «оче зивотиых находится в пределах 3-9'/.. !а рис.2 приведена типичная хроыатогратга образца плазмы крови ыезгя, содержащего сарколизин и внутреннип стандарт.

I Й

У

О 4 8 12 0 4 8 12 т.мин

Рис.2. Хроматограммы образцов плазмы крови иышея, -

А - плазма крови, полученная через 30 мин. после рег-раорбнтального введения сарколизнна в дозе 20 иг/кг, Б - г^чтрольная плазма крови.

1 - сарколизин, 2 - внутренний стандарт.

2. Изучение гидролитическоп устойчив' ти сарколизнна в лекарг"-венной форие для инъекция. С помощью разработанного метода ВЭХХ. изучена к; етика гидр >а сарколизнна в 2х раствор« лекарственной форме для инъекции. • Кинетические кривые гидролиза сарколизина до МТС полу.али, :еряя КбйЦентраийв ^е.йэмеие'нного препг»оата в •>-•

растворо-концентрате лекарственной форкэ 11 2К раствора субстанции при различных ракишх териостьткровшшя, используй иэтдд отсора проб кз реакционной сроду с послодуосш аполигои изтодон рЭЖК.

Экспоринантйлиныа путей установлено, что гидролиз сарколизииа описывается кинетический ypaaiseimou псоедо-1-го поридиа. Б табл. 3 прцоедени значения констант скорости гидролиза (kl, как показатели линейной агрессии, оичислсшшо i ;одо. исыданьсшх каадратос, периоды полураспида <t4/Sl и коэффициенты корреляции. Завистасть к от температуры (Т) описие&атся уравнение« Лрроикуса:

я » 7,081010 « •RT ' . Стандартная оюбкь апрокскиации с ссрэстностьо 93* состс^лсот

3,056.

Таблица 3.

Константы скорости 1-го not (к 1 ре&кшш гидролиза с&рколнз>:на до ИГС в растоорах, периода полураспада itl/0! и коэффициенты

корреляции < «■ I

Анализируеиып раствор pH т. К к, »10 с tt/S, чье г

раствор лекарственной Формы д. . инъекция 2,4 2.4 2,4 2.4 2,4 278 283 296 298 313 б,2в£0,Ю 11,59:0 ,21 43.3911 ,15 47,3015.03 184,5-125,81 307,2 160.1 44.4 40.5 10.4 0.9926 0.9962 0,9984 0,9991 0.9984

раствор порошка 2,0 296 254.72i38.46 7.6 0.9909

Показано суиэственное замедление процесса гидроли: сьрколи-зина в растворах лекарственное форка по сравнение с раствором субстанции вследствие стабилизирующего влияния вспомогательных ингредиентов, 5а 5 часов сарколиэин гидрфлиэуется в раствор» лекаг твенноя форме на 1,7%, 1,9*, 7,4*, С,в* К 2вх п^ температуре 5°,10е, 23°, 28° и 40сС. Определены .активам' нни^ параметры процесса гидролиза сарколизина - энергия, энтропия и энтальпия активации.

На основании полученных данных для лабораторного производства

лиофшшэиропанного- препарата сарколизина для инъекция были ■рекомендованы оптимальные временны« и тоилературиыа условия, при которых будет происходить инициальны» гидролиз сарколизина п растзора-кониентрата, палучэеиои для лиофилизацин,

3. Количественный анализ асалина методой ВЭДХ.м Дсалин - этмлопия эфир п-ш' -аиетил-п-ди-12-хлорэтнл)-амино-D. с-^нилалашии -о', и' -валииа - представляет собол смесь двух рацемических днпептидсз i и п: г - + о-в' форыы асалина, II - 0-L' + ¡.-о' lopizi асалина. Лиастереоиерные днпептилы облаяа разлгшноя онологичеасоя, фармакологической и токсикологической ак-тигшостьо (Софьина З.П. и яр. ,19(33,1904; Васина О.С. и др.,19601.

Предложена кэтоднка ВЭКХ анализа асалина в порошка и таЗлзтяах по 0,25г с использованием УС-детектара (260 нч1. 1!спользуеыып пряио^аэныя вариант позволил получить полное разделений пиков ранеиатов асалина, ацатилсарколизина и други;: возможных принесез препарата (рис...

т i *4.~т

V, tuu t asJJ—'jsoq " kwo т.ижа о ss: S .... ijr

'¡I 1

I

J i

a.

J

t,

r.

1Л-'

и !гя J .lii. о ' т;«««. »,5 ( V )

-/UJ

5.5 (

м»1 ''15 5

Рис.3. Хроматограммы асалина: А - пороиок, Б - таблетки, В - образец плазмы крови иыше" содержащий асалин в концентрации 25 мкг/мл, Г - образец контрольной Плазмы кр.ет мышея. ,

1 - I рацемическая смесь асалин ,

2 - п рацемическая смесь асалина,

3 - Н'>ид^'!ги$ициропднная пс мось.

Анализ проводили на »идкостчом макрокпдоиочним >:ррмэт>тр-«|.е "Ки.т/>:р'«м-1 -Л." и и.яоикч рц-»ч*глм ми соре:! нт.г,* т« х-.-рс;

600", 9 мкм. Условия ВЭЖХ: состав подвижноя фазы хлороформ-метанол - 99,6:0.4 (по объему), скорость потока . подвижной фазы - 200мкл/м;ш, объеы вводимая пробы - 4 шел. Предел обнаружения рацематов асалина - 1 ихг/ил.

Количественное определение асалина и его рацемических смесей проводили по методу аСсолотнол калибровки по стандартному образцу ль иЯ одной из - рацедочаекк.. а асалина. Зависимость площади пика от концентрации асалина о растворе имеет лмкоянил характер в интервале концентрация препарата 3-1300 шег/кл.

Б табл.4 представлены результаты 3 независимых опрв^гяеина асалина и его рацемических сиесей в различный сериях порошка и таблеток.

Таблица 4.

Результата количественного определения асалниа о поредаш и

V. ТабЛЙТКйХ по 0.2ЭГ (Р»93Х, t_ "2,70» п«3!

_?* г_

Лекарственная форма, серия Навеска, г Наядено

рацемическая смесь î рацемическая сиесь II всего асалина

X шгтрояагич. «apaxïepiecT. г. кетр. xap. X иотроя каэ-г-а

1 2 3 « 3 6 7 0 9

порошу, серия 210390 0,0244В 0,02653 0.02377 0.02324 0.02613 1.ЙЭ 1.6S 2,02 1.93 1 .со к S s; 2 1.S0 0,0210-я 3,39-10-a 0,099 3,23* 97,30 97,97 103,50 9a. 2t 96.06 96.62 2,661 1 ,V'79 з, Z.&ÙX 99.13 99.03 103.32 (01.18 97.65 ICO.72 2.930 1.314 3.63 З.бЗх

ПОрОЕЭК, серия. 121190 0,02514 0,02460 0,02501 0,02493 0,02532 2,10 2,00 1 .99 i .97 1,99 ж S s5 д« с 2,01 5,13-Ю"» 2.30-Ю-» 0,064 3.167. 100.12 97, Сб 85.13 93.30 96.41 97.1 e 1.674 0.636 2.33 2.40* 102.22 99 те СО.12 97,33 93,40 S9.19 1 .S 22 0.С60 2.39 2,41Х

порошок, серия 16,191 0,02612 0,02511 0,02622 0,02573 0,02567 0,21 0,19 0,16 0,17 0.19 к S sS û* с 0,19 . 1,46-10"» 6.63-10-= 0,016 S.BIX 100.21 39,94 57.24 SC. 61 S0.98 98.64 ! ,533 0,693 1.93 1.96% ICO.43 100.13 S7.42 SB,95 S9.17 96.63 Î.356 0.701 1.95 1.9?г

таблетки, серия 021291 0,05255 0,05114 0,050^2 0,051 43 0,05г>90 0.31 0,30 0,33 0,33 0,35 к S S* ûx с 0.3S 2.C5-Î0"? I.IO-ID-Ч 0,033 9,67V. 97,SI 101,34 90,44 97.21 9T.20 93,46 1,765 0.738 2.22 2.Г5Х 96.22 101.92 90.77 S7.3-Î 97.03 У- ,62 1.605 О.С07 2.24 2.27?.

Продолжение таблицы 4.

1 2 3 4 э ь 7 в 9

таблетки, 0,03104 1,23 к 1.29 100,47 96.93 101,70 100,24

0,03062 1.36 S 6,22-10-» 98,43 1 .627 99.61 1 ,329

серия 0,^093 1,27 s; 2,76 10-» 99,26 0,663 100,33 0,664

0,< ИЗ 1.24 Дм 0.077 9G.39 1 ,90 97.63 1 ,90

030792 0.03112 1,32 с б.00* 99,99 1 ,92v. 0i .31 1 ,90v.

таблэтки. 0,03043 1,22 X . 1.22 ЮО.с J jd ,77 101.31 100,00

0,03012 1,18 3 4.1610-а 96,18 1 ,341 99,36 1 .Зт0

серия 0.03092. 1.29 з; 1 ,6610-» 100,68 0,669 101,97 0,702

0,03216 1.20 д* 0,032 97,07 1 .92 98.27 1 .93

081192 0,03122 1.23 £ 4.24* 97,64 1 ,94Х 99,07 1 ,93-/.

Разработанная иетодика ВЭЯЗС анализа была использована для определения асалина в плазме крови животных для изучения $а?!гак0!шиэт!ш! препарата в экспериментах in vitro (рис.31. Подобран оптимальный экстрагент (хлороформ) для извлечения асалина из плаэиы крови. Степень однократной экстракции - 9бх.

А.Дэклиничексое изучение фармакокинетики сарколизина.

Исследования проводили на мышах, (^bof^. Расчеты ^арнахокинетических параметров для i рколизина и асалина проводили па программ» "clnjt" на ЭБИ "Кскра-226", значения мят (среднее сремд уди'рвяваная! расчитывали по специальной прог^шме, реалиэуоыга сы .лсления методом трапеция.

Иденти^мкацип и холичестзенное определенче неизменес-ого

рколиэяна з биологических объектах проводили тетодоц ВЭЛХ.

В экспериментах i" .itro показала линейная зависимость "доза - связывание" сарколизина Сел«а«и плазмы в интервал»,- концентрации препарата 23-300 мхг/ил ировн или плазмы крови. Ч ¿ез 2 мин V чубааяи в плазме хрозл соягизашш белками подвергалось 16'/. саркалазмна от внесенного количества, в ови - 49x. В форменных элементам h ви содержалось JJ* препарата.

Изучена стабильность сарколизина в физиологическом растворе, Оезбелковол части плазгал, плазме крови и кроьи мышзп. Кривые г и,прилила гзрколизина в растворах и биологических жидкостях

- н -

описываются кинетическими уравнениями 1-го порядка. Установлено, •i га основное количество препарата связывалось белками крови с порауо минуту поело внесения! наблюдалось / резкоо падение концентрации свободного серколиэина от 200 шег/ил до 17015 ¡ш7цл п плазме н до 106í13 икг/ил в крови. Отиочена высокая скорость снижения концентрации сарколизина е крови с течеиио 90 иин эксперимента, что, по-видимону, объясняется как активно лрояодтш процессом связывания препарата бмк&ии, его аясорбииоп форноинини элементами ''рови, так и его иатаболизиом.

in vivo сарколизин вводили однократно в ротраорбиталышя зенозннл синус в дозе 20 иг/кг с объема 0,2 un 0.2Х растиора лекарственной формы.

Как видно из рис.4,в течение первый 30 иин происходит быстрое распределение препарата в организме юшотного,ь течение последующих 15,5 часов наблвдалась фаза ыедлэнноя элишжацш! сарколизина. Через 16 часов сарколизин в швдиэ крови не обнаруживался.

миопии ,tf, BOFj^ осле однократного ретраорбитального ввоцония препарата в дозе 20 'кг/кг.

•$ариаяоки!тшт неизмененного сарколизяна в плазме крови •.?«С9П удовлетворительно описывалась двухкакерноя ' модельв, язргшзтру которое прадстазяенц в табл.З.

Таблица 3.

Пгранэтри ДБухклшзрмоя подели, характеризуюсь <у ■ млкокинбтику .чоязизношюго сарколизнна в плазиэ кг^я цчскп,</',оор1 г.ри однократной рзтраорбитальнсм введении в дозе 20 иг/кг

Г.ис , о-»«' wtr • '.'Г-С - s час час v . о !!Л V . S» ил ^/Запас "ЛС tot ил/час CI гоп ил/час гэтт, час

н.;

10,10 2,02 1.16 10,3 31 ,9 0,ИЗ 1 ,33 39,6 11.9 1 ,27

Здесь ü для табл.7 и 0 - аус - плопадь под фариакокиметическоп кривоп; каь,кв1 ,квв й ко».гво " "оптанты скорости . всасывания, элиминации, экскреции и почечнгя экскреции соответственно; Ч/га. Ч/а,, и " период» полу-

всасывания, полураспределения и полуэлиминации соответственно; м хаж - константы скорости перехода из центральной з пернферическуо камеру и обратно; vc, vp-oöwu распределения в центральной и периферической кп-' / v c>to,. Cirmn - обпг» м реналь: л клиренсы,- мпт-

среднее время удеряивания.

5ыведемне неизмененного сарколнзина с мочой мышея имеет биэкспененииальния хар»ктер» быструо $а?у до 2 часов к медл1 ннуп течение посдедуоких 22 часов. Суммарно выведи j 30ч неизмененного сг.рколчзина от введенной дозы, при ч^а "7г препарата «uii'jeHO за первые 2 часа.

5.Доклиническое изучение фармакокинетики асалина.

Для пг-ред^ния флрмако. лнетических исследований совместно ;

кафедрой радиохимии 1Л"У ,м. М.В.Ломоносова методом термическоя

а

активации Г'Т.юобрзэного трития получен Н-асг ж с молекулярной активность« 0.7 ТБк/иолъ и радиохимической чистотой 95"''.. С помогши* Mi- 'пли *н- и ЭМ-ЯМГ-1м,ч1ктроскопии пияеленл преимущ^.'тп-чпм-!

локализация трития в эфирноя ен3-группе асалина.

Эксперименты проводили на Knucax.d'.wi«»:«'- и мышах, cf,BDFt. Асалин вводили однократно перорально и внутриброшинно в дозах 60 мг/кг (крыс.ы1 и 100 мг/кг (мыии1'в виде суспензии в крахмальном клейстере.

Для определения асалина и его метаболитов • в биологическом материале использовали методы радиометрического, ВЭЖХ, ТСХ и УФ-спектрометрического анализов. .

В экспериментах in vitro были изучены связывание "Н-асалина белками плазмы крови животных, распределение препарата во фракциях крови и плазмы в зависимости от времени инкубации (табл.61 и кон-, центрации. . • '

Таблица б.

Распределение »Н-соеди,"»ния во фракциях крови плазмы животных ín vi tro после добавления »Н-асалина в количестве 23 мкг II мкКи]/ш1 (мыши) и 50 мкг(2 икХи!/ил (крысы)

Вид животного Исследуемый образец Время инкубации при 37 С, мин Содержание ¡»Н-соединенив

кровь Формеиные элементы крови плазма метаноль-ная часть плазмы белки плазмы

...ыши, ' <f. кровь 2 60 100 100 45±3 4614 5713 3313 4112 4212 8.312,2 12,612

BDFj плазма 2 - • - 100 9412 1612

Г 1СЫ, J Wietar кровь 2 20 60 100 . 100 100 3613 3814 4113' 5512 5912 . 6012 3612 ' 3912 4013 1912 2513 2713

плазма 2 - 100 , 7313 2512

Определена невысокая степень связывания асалина белками плазмы: Ту/, у крыс, 177. у '«шшея. Выявлена .-чнеяная зависимость между, количеством связанного препарата и концентрацией его в плазме крови в «"тервалах 1-65 мкг/ил для крыс и 1-25 икг/мл, для мышзк. Показано,' что при инк, 5ации плазма крови животных'с асалиноы ь конц ;трации 50 (крысы) и 25 мкг/мл (мыта) происходит заметное, пш^гние содортпния "свободного" асалина пслрчствко активного

метаболизма препарата. Через 2 часа методом радио-ТСХ ич -выявлено не менее б гидрофильных "н-метаболитов в плазме ги<. При этом содержание неизмененного препарата составляло 10-20*. . > первоначально! уровня.

э

Фармакокикетические криеые концентрация Н-сое,мнении в кочни животных после однократного перорального вьедения удовлетворительно описывается трехэкспоненниальными уравнениями для двухн«-у<>рно1'

—а.ооэк» -о 01)1

модели со всасыванием» с(1)-3б,1» ' 017» '

—о о&з» —о ов* -а цт^

(КрЫСЫЦ С(пМ7,917э ' ''♦б,765» " ' ( I .

Фармакокинеткческие параметры представлены в табл.7 и й.

Таблица у.

Параметры двухкамерной модели со всаснванием, характеризуете • а *

Фармакокинетику Н-асалина и Н-метаболитов в крови крыс,<г, ттаг

при однократном пероральиом введении в дозе 60 мг/кг

лис — » "мг" час шГ час час"1 к . час к О к.Г«П - «, час *»/*а' час час час

0,112 0,0336 0,0192 0,0130 0, ,023 12,9 17,1 201.5

-1 час < -1 час мл мл мл/час ¿1 Г»П 1 'час МРТ члС

0,0174 0,0072 63.28 132,7 1,92 0,23 126,1

Таблица б.

Параметры диухкамерно?. модели со иеасиванием, характеризующие

ш а н

риакокинетику Н-асалина и Н-метаболитов в крови гишеи.ег, гэг^

при однократном пероральиом введении в дозе 1П0 "г/кг

»ОС , О-»10 лг'-чаг ЫЛ~ к ... -1 час -» час в*' -1 час к в*,гво час-1 час час час

1,306 ? ,47' 0,0137 0, 111 0,0043 0,28 22,4 52.1

"Ч» • • "" ^ , р С) гвп ипт.

час час МЛ МЛ ил/час и^/час час

0,0023 0,0261 01 .03 7,37 1,29 0.37 53,86

Концентрация "н-соединения в крови достигала максимальною значения через 46 часов у крыс и через 3 часа у мышея после вве-дениия дозы и составляла око30 "мкгн/ил и 24 "мкг"/мл соответственно.

В интервале доз 40-160 кг/кг выявлена сильная корреляционная зависимость между доэоя и концентрацией в крови крыс.

Установлено, что профиль фармакокинетических кривых, описываю-вгих изменение суммарной концентрации Н-соединении в органах и тканях xptc, а также в опухоли - карциносархоме Уокера 236, ана-лгничен таковому л : крови (рис.5 I. Из рис.5 видно, что максимальное содержание меченных соединения в органах и тканях, опухоли наблюдается в интервале времени 46-72 часа: наибольшую тропность к . 3)!-асалину (в порядке убывания! имеют селезенка, тимус, лис для печени, почек и сердца очень 'низка к auc крови. «Более низкую тропность (в порядке возрастания! показывает опухоль, легкие, головной мозг, яички и лимфоузлы.

а

Распределение Н-соединенип во фракциях крови крыс in vivo коррелирует с данными in vi tro.Выявлено, что происходит накопление р иоактивности в форменных элементах крови (до 33X1 в сравнении с чзмой в течение первых трех суток и частичное последующее снижение до 37'/. на участке n-фазы фармакокинетическоя кривой. Связывание препарата белками плазмы крови колебалось в пределах ЗОХ.

При изучении фармакокинетики "н-асалина в органах •желудочно-кишечного канала J2KK) животных обнаружено, что с течение первых часов, скорег всего, происходит ак-чвное всасывание препарата в кровь из желудка, а э=тем преобладает замедленное всасывание

g

»еалина и Н-ы габолитов в тонкоя кишке. У крыс через 24 часа в ЖКК находилось 34ч препарата от введенной дозы (хэлудок - Ю*, тонкая кишка - 47.1, через 72 часа - 9-/.. Через 5 часов

ИХ.К мышей определялось 30'/. от введенной ■ дозы, • через ■утки - av.. Показано, что в содержимом желудка крыс

преобладает содержание неизмененного препарата. В тонкой кишке происходит постепенное увеличение содержания гидрофильных метабрлитов (20 и ЗОх через 2 и 24 часа соответственно от оОшч-о

а

содержания Н-<~-»диненил I. Получены данные, свидетельствующие о наличии экскреции препарата с желчью или с секрете слизистых в ЖК и процесса киие.чно-печеночнзя циркулях, и

Элиминация "л-соединения у крыс и мыиея происходила с ыочоя и фекалиями и имела биэкспоненциальчып характер» быструю фазу 8 течение трех суток у крыс и суток у мышоя и

уедленнуо. Основное количество радиоактивности экскретировалось с :салои. У крыс за 192 часа выведено 74% радиоактивности от заеденной дозы, с мочоп и калом - 23 и 30ч соответственно. За 166 '¡асов у иыиеп суммарно выведено 70* от введенной дозы, с мочоп и халой - 29 и 42*.

При проведении сравнительного фарнакокинетичесчого анализа при

э

однократном пероральнои и внутриброкинном введении (¡-асалина крысой а доза 60 мг/кг было установлено, что характер

¿-ариакокинетики аН-соединенип в крови при двух способах введения очень близок д^уг к друг и могет быть описан дву химерной I :елы> со всасыванием. Относительная биодоступнссть при пероральнои введении при наблюдении в течение 9 суток составляет 37..

3

1.>>с!шуЕэстосниое выведение Н-соединения происходило с калом при г->г.оралы!ои и с тачоп :прн внутрибрвшиннои способах введения. Суинврна за 216 часов при введении препарата внутрибровлшно было вывезено 30* от дозы» по 23х с мочоп и калом.

С цельв изучения метаболизма препарата были проведены первые этапи идентификации Н-кете литов в зю. .рактах из мочи и фекалие глвотных.Показано низкое содержание •неизмененного асалина в фекалиях» не более 7-9* как у крыс, так н у иыт°я. В иоче животных наличие неизмененного асалина на обнаружено. *Н-метаболиты асалина у разных видов животных ра-'личаогся по химическому строгий». По-

Рис.5 . Фармакокинетика 3Н-асалина в крови и органах крыс, о*, ш^г после лднократного пероралытго введения в дозе

ВО кг/кг.

Но оси ординат - концентрация препарата в "икг"/мл(П.

садимому, различие в метаболизме препарата обуславливает [Шзкус

противоопухолевую активность препарата у мивдая н высокую - у крое

ЕЬШОЛЫ

1 .Разработана уг-'фицированная, высокочувствительная, специфичная ЗЭЯХ католика количественного определения сарколиз; а, продуктов его гидролиза, технологической примеси в п о„.<е и лекарственных Дорнах, а такие неизмененного сарколизина а биологическом ¡материале,

- Получены м охарактеризованы образцы специфических примесея сарколизина (liOHO- и дигидроксисарколизина, этилового эфира сарколизина! с цельс контроля качества препарата.

2.В результате изучения кинетики гидролиза сарколизина а растворе-

концентрате лекарственной формы определено, что зависимость

хонстанти скорости гидролиза сарколизина от температуры описыва-

о ^еихжа

ется урззнениеы Appeiwycai к-7,082-ю п •.

3.Разработана высокочувствительная, специфичная ВЭЯХ методика количественного определения рацемических смесей асалина в порошка и таблетках.

4. in vitro установ ""но, что гидролиз г.рколизина в З'лзиологйческоы растворе и безбелковоп части плазмы, изменение содергания неизмененного препарата в плазме крови мывея,<^,| при инкубации описываются кинетическими урвненмями 1-го порядка. Выявлена линейная зависимость между дозой и количеством связанного белками крови сарколизина в интервале концентрация 23-100 мкг/мл. Изучена степень связывания сарколизина 8 плазке <16X1 и в крови < 444).

5.Показано, что фармакокине--ка неизмене, jro сарколизина в плазме крови UMiutjR.d'.HDP, при однократной ретраорбитальнои введении в дозе 20 мг/кг, удовлетворительно описывается двухкамерной моделью (периоды полураспределения и полуэлиминации - 0.143 и 1,33 час соответственно 1.

Устанавлено, что в течение суток с мочой выводится ЗОХ от дозы, при этом 27х за первые 2 часа (ренальныя и общий клиренс - 11,9 и 39,6 мл/час соответственно!. (..Определено, что связывание и распределение аН-асалина в крови и плазме крови крыс,<f,wi%%*r и мышей,(^,bdf4 не зависит от концентрации в интервалах 1-65 мкг/мл для крыс и 1-25 ыкг/мл для мышей и времени инкубации в течение 1 часа. 7.Выявлено, что фармакокинетика 3Н-асалина в крови крыс и мышея при однократном пероральном введении в дозах 00 мг/кг (крысы) и 100 мг/кг (мыши) удовлетворительно описывается двухкамерной моделью со васыванием (периоды полувсасывания, полураспределеьия и полуэлиминации у крыс - 12,9; 17,1 и 201,5 час; у мышея - 0,26; 22,4 и 39,2 часа соответственно).

«И- Можно предположить, что рас лчия в метаболизме асалина у крыс и

мышея обуславливает разную противоопухолевую активность препарата у данных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

! 1араманов С.А., Яцевич О.В., Зимакова Н.И. и др. Получение

э

противоопухолевого препарата Н-асалина и изучение его биодоступности при пероральном применении.//iiI Всес. совещ. по проблеме "Физиологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами". Звенигорода. докл.-П., 1991.-С.36-37.

Z.Зимакова Н :., Караманов С.А., Глевич О.В. и др. Некоторые

аспекты экспериментального изуч' ия фармакокинетики и метаболиз-

э

ма противоопухолевого препарата Н-асалина.//Современное состояние и перспективы развития фармакокинегикиг ш Всес. .конф.' по Фарм?.кскинетики:Тез.докг -М. ,1991 .-C.5ß.

.Рудм<о А.П.. Гасан-Гусеянова З.Г., йневич O.E. и др. Разработка м->тг;;оп количественное определения асалина в растворе и

биоматериале.//Проблемы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Тез.докл. Всес.конф.-М.,1991.-Т.З.-С.39

4.Яиевич О.В., бдраэаков М.М., Зимакова Н.И. и др. Использование метода ВЭХХ в анализе лекарственной формы "Саркол^. ин-лно 0,02". //Человек - общество - наука« Тез.докл. и научно-практическоя н научно-методическоп конф. молодых ученых Казахстана с участием деятелей науки стран СНГ и зарубежья.-М.,1993.-Т.З.-С.124-125. З.Абдразаков М.М., Яиевич О.В., Зимакова Н.И. и др. Анализ сарколизина методом ВЭЖХ.//Тезистер хинауы нары^ зэие Казахстан гылымы мен техникасыныч даму ивселелер1.-Алматы,1992.-Б.З,-С.25.