Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование лабазника вязолистного как источника эффективного ноотропного средства

□□34455 18

На правах рукописи

АВДЕЕВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЛАБАЗНИКА ВЯЗОЛИСТНОГО КАК ИСТОЧНИКА ЭФФЕКТИВНОГО НООТРОПНОГО СРЕДСТВА

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

РГБ ОД

2 е АВГ 2008

Пермь-2008

003445518

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Росздрава»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Краснов Ефим Авраамович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

Петриченко Василий Михайлович, заведующий кафедрой ботаники и общей биологии ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава»

доктор фармацевтических наук, профессор

Бубенчикова Валентина Николаевна, заведующая кафедрой фармакогнозии ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава»

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 23 сентября 2008г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208 068 01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу 614990, г Пермь, ул Ленина, 48

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу 614070, г Пермь, ул Крупской, 46

Автореферат разослан 20 августа 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

Метелева Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Высокий уровень технического прогресса и высоких интеллектуальных достижений привел к резкому возрастанию роли умственного труда и психо-физиологических требований к человеческой личности, таких как способность быстро адаптироваться к постоянно меняющимся условиям и сложной социальной обстановке, экспрессно усваивать и обрабатывать значительный массив информации Кроме того, существенно возросло количество заболеваний ЦНС, что связано с воздействием неблагоприятных факторов внешней среды, высокими психоэмоциональными нагрузками и стрессовыми ситуациями в современном обществе. В связи с этим важное значение приобретают ноотропные лекарственные средства, нормализующие процессы обучения и памяти в условиях высокого психо-эмоционального напряжения, а так же при ослаблении интегративных и мнестических функций мозга, при их нарушении в результате воздействия ряда факторов физической и химической природы

Ассортимент синтетических ноотропных средств разнообразен, но все они обладают рядом побочных эффектов (головная боль, нарушение сна, аллергические реакции) Ноотропные фитопрепараты зарубежных фирм («Танакан», Франция; «Гинсана», Швейцария) имеют высокую стоимость, а сырьевая база для их получения недоступна отечественным производителям Поэтому актуальной является проблема разработки новых ноотропных фитопрепаратов на основе растений флоры Сибири

Перспективным в этом плане является лабазник вязолистный (Fillipendula ulmaria (L ) Maxim ), ресурсный потенциал которого велик на всей территории России Фармакологические исследования показали, что экстракты и фракции растения обладают выраженной ноотропной активностью Проведенные нами фитохимические исследования указывают на высокое содержание фенольных соединений в надземной части растения, антиоксидантное, антигипоксическое и гемореологическое действие которых широко известно

Таким образом, проблема изучения химического состава и фармакологических свойств лабазника вязолистного и создание на его основе нового эффективного ноотропного фитопрепарата является актуальной и перспективной

Цель работы: химико - фармакогностическое исследование перспективного растения флоры Сибири - лабазника вязолистного, как источника создания ноотропного препарата

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1 Исследовать состав основных групп биологически активных соединений лабазника вязолистного

2 На основании исследований ноотропной активности лабазника вязолистного осуществить разделение активных фракций на индивидуальные компоненты и установить их строение

3 Исследовать антиоксидантные свойства ряда экстрактов, фракций и индивидуальных соединений лабазника вязолистного

4 Установить динамику содержания основных групп биологически активных веществ лабазника по органам и фазам вегетации

5 Провести анатомо-морфологическое исследование надземной части лабазника вязолистного и установить диагностические признаки

6 Разработать методики стандартизации сырья и проект ФС на траву лабазника вязолистного

7 Разработать рациональную технологию жидкого экстракта лабазника и его стандартизацию

Научная новизна. Экспериментально обоснована возможность использования лабазника вязолистного в качестве источника создания ноотропного средства и целесообразность его стандартизации по флавоноидам Из надземной части лабазника вязолистного выделено новое флавоноидное соединение ранее не описанное в литературе, названное филимарин, структура которого установлена как 4-0-р-0-галактопиранозид кверцетина Впервые

определена динамика содержания основных групп биологически активных веществ (фенолокислот, флавоноидов) и изучены анатомо-диагностические признаки надземной части лабазника вязолистного.

Практическая значимость.

1 Результаты фитохимических исследований, в частности, изучение физико-химических свойств индивидуальных соединений, позволяют в соответствии с современными требованиями решить проблему стандартизации лекарственного растительного сырья (трава лабазника вязолистного) и полученного на его основе жидкого экстракта

2 Получен патент № 2310467 РФ на изобретение «Гепатопротекторное средство, обладающее антиоксидантной активностью и способ его получения»

3 Разработан проект ФС на траву лабазника вязолистного, внедрение на фармацевтический рынок лекарственного средства которого обеспечит расширение ассортимента фитопрепаратов ноотропного действия

Степень внедрения Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры фармацевтической химии и кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГОУ ВПО Сибирского государственного медицинского университета Подготовлен к рассмотрению проект ФС на лекарственное растительное сырье

На защиту выносятся:

- Результаты исследований по выделению и изучению фенольных соединений, обладающих ноотропной активностью

- Методики идентификации и стандартизации надземной части лабазника вязолистного

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 63-ей международной студенческой научной конференции им НИПирогова (Томск, 2004), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2007), II Международной научной конференции «Химия, технология и

медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, 2007), Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007), VI Всероссийском научном семинаре с Молодежной научной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), а так же на заседаниях кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Томск, 2004-2007)

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО АМН Российской федерации «Здоровье человека в Сибири (№ государственной регистрации 01 9 2002479)

По результатам работы опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 журнальные статьи и 1 патент на изобретение

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедрах фармацевтической химии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ г Томск, а так же в сотрудничестве с коллективами других научных организаций НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (лаборатория психофармакологии), НИИ органической химии СО РАН (г Новосибирск), Томский политехнический университет (кафедра аналитической химии, г Томск), Кубанский государственный университет (г Краснодар) Сотрудникам данных подразделений и научных учреждений выражаем искреннюю благодарность

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 39 таблицами, 30 рисунками и 3 схемами Библиографический указатель включает 261 источник литературы, из которых 66 зарубежных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектом исследования служила надземная часть лабазника вязолистного (Filipéndula ulmaria (L) Maxim), собранная в 2003-2007 гг. в Томской, Кемеровской областях и Алтайском крае

Для разделения сложных смесей веществ и выделения индивидуальных соединений применяли избирательную жидкостную экстракцию, хроматографию на колонках и метод дробной кристаллизации Для подбора элюентных систем, контроля за ходом элюации при разделении веществ на колонках и чистотой полученных соединений применяли метод восходящей хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента

При установлении структуры выделенных веществ использовали электронную спектроскопию, ИК- и масс-спектрометрию, ЯМР, хромато-масс спектрометрический анализ

АОА изучали хемилюминисцентным и вольтамперометрическим методоми, АРА - спектрофотометрическим методом

Изучение фармакологической активности проводили по существующим тестам на белых мышах и крысах Животных содержали в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI

Микроскопические признаки устанавливали на основании анатомического исследования частей растения Фотосъемку плоскостных препаратов осуществляли с помощью цифрового фотоаппарата Olympus С-4000 ZOOM Digital compact camera и оптико-механического согласователя при увеличениии 120х и 240х Снимки обрабатывали в Adobe Photoshop CS Central European Versión

При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500 05 001 -00 «Стандарты качества JIC Основные положения»

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили общепринятым методом с определением среднего арифметического значения (X) и средней квадратичной ошибки (5) Достоверность результатов оценивали, используя параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрический (критерии Вилкоксона и Манна-Уитни) методы Расчеты проводили с использованием программы «Statistica for Windows 7,0»

Результаты исследования Изучение нооторопной и аитиоксидантной активности лабазника вязолистного Скриннинговые исследования ноотропной активности надземной части л вязолистного были проведены в лаборатории патологической физиологии и экспериментальной терапии с группой психофармакологии ТНЦ СО РАМН НИИ фармакологии г.Томска под руководством профессора Суслова Н И На первых этапах скрининга потенциальных ноотропов важным прогностическим признаком является антигипоксический и адаптогенный эффект, поэтому были использованы тесты, отражающие указанные виды активности и тесты, выявляющие способность животных к обучению

Эксперименты проводили на беспородных мышах-самцах с массой тела 20-22 г Влияние на обучение и память изучали при выработке и воспроизведении УРПИ Антигипоксический эффект оценивали в условиях гипоксии гермообъема и ориентировочно-исследовательского поведения на модели «открытое поле» Влияние на физическую работоспособность изучали в условиях методики принудительного плавания в бассейне с водой комфортной температуры с утяжеляющим грузом (10% от массы)

Исследования показали, что выраженной антигипоксической и наибольшей адаптогенной активностью обладает экстракт растения на 70% водном этаноле Он же оказывает положительное влияние на память, на что указывает сохранность у животных УРПИ на 14 сутки эксперимента При фракционировании указанного экстракта (хлороформом, этилацетатом и бутанолом) наблюдали диссоциацию эффектов, отражающих ноотропную

активность антигипоксические и адаптогенные свойства в максимальной степени присущи хлороформной фракции, а непосредственно ноотропной активностью обладает этилацетатная фракция.

Специфическую фармакологическую активность экстракта л вязолистного на 70% водном этаноле изучали с помощью модели «Т-образный лабиринт» на белых крысах-самцах массой 250-350 г При этом влияние экстракта растения на выработку и воспроизведение сложного условного питьевого рефлекса оценивали у здоровых животных и у животных на фоне кофеиновой интоксикации Введение экстракта л вязолистного животным на фоне кофеиновой интоксикации нормализовало показатели памяти животных и приближало их к интактному контролю

На различных этапах изучения ноотропной активности используют ряд тестов, отражающих то или иное ее действие антигипоксическое, адаптогенное, антиоксидантное Более простым и не требующим большого количества вещества для исследования является тест на антиоксидантную активность Кроме того, известно, что ноотропные фитопрепараты проявляют активность за счет присущих им антиоксидантных, антирадикальных и гемореологических свойств Поэтому мы сочли целесообразным изучить антиоксидантную и антирадикальную активность экстрактов и фракций лабазника, для выявления возможного факта корреляции упомянутых видов активности с ноотропным действием

В результате определения АОА экстрактов растения хемилюминисцентным методом, выявили, что экстракты на 70 и 95 % водном этаноле угнетают ХЛ более чем на 50%, что указывает на их выраженную АОА Для оценки АРА экстрактов использовали реакцию со свободным стабильным радикалом ДФПГ В качестве характеристики АРА использовали процент интенсивности взаимодействия ДФПГ с соединениями, содержащимися в экстракте и время, за которое ДФПГ прореагирует на 50% (туг) По АРА экстракты растения на 70 и 95 % этаноле (т1/2 составило 5 и 3

минуты соответственно) приближаются к дигидрокверцетину (Т|/2 равно 2 мин)

(рис 1)

%

Рисунок 1 - Радикал-связывающая активность экстрактов лабазника

вязолистного

1 - экстракт на 95% этаноле,

2 - экстракт на 70% этаноле,

3 - экстракт на 40% этаноле,

4 - дигидрокверцетин

О 1 2 3 4 5 в 7 8 9 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80

Т, мин

АОА фракций экстракта лабазника на 70% водном этаноле изучали методом катодной вольтамперометрии, основанном на реакции электровосстановления кислорода В качестве фонового электролита использовали фосфатный буфер рН 6,86 Концентрация образца в ячейке составила 1 10"4 г/мл АОА фракций оценивали по кинетическому критерию АОА (К (мкМ/л мин)), который отражает количество прореагировавших с образцом кислородных форм Полученные результаты показали, что ЭАФ приближается по силе АОА к природному антиоксиданту дигидрокверцетину, а ХЛФ - к аскорбиновой кислоте (рис 2)

К мкМ/л мин

1 4

1 2 1

08 0,6 04

02 0

р.

•

Рисунок 2 - АОА фракций экстракта лабазника на 70% водном этаноле

1 - экстракт лабазника на 70% этаноле

2 - хлороформная фракция

3 - этилацетатная фракция

4 - бутанольная фракция

5 - водный остаток

6 - дигидрокверцетин

7 - аскорбиновая кислота

Таким образом, в результате экспериментов выявили факт корреляции антиоксидантных свойств л вязолистного с его ноотропной активностью

Исследование БАВ лабазника вязолистного

Для проведения химических исследований из надземной части растения получали экстракт на 70% водном этаноле (выход 31,9%), который затем фракционировали рядом растворителей с возрастающей полярностью (хлороформом, этилацетатом, бутанолом-1) Химический состав полученных фракций исследовали качественными реакциями и хроматографией в тонком слое и на бумаге с достоверными образцами В результате в активном экстракте обнаружили простые фенольные соединения в ХЛФ и ЭАФ, флавоноиды и органические кислоты в ХЛФ, ЭАФ, БФ, кумарины в ЭАФ и БФ, дубильные вещества во всех фракциях, кроме хлороформной, сапонины в ЭАФ, аминокислоты в БФ и водном остатке.

Учитывая результаты фармакологического исследования, для выявления носителей активности углубленному химическому изучению подвергли хлороформную и этилацетатную фракции экстракта лабазника на 70% этаноле

ХЛФ разделяли методом флэш-хроматографии, с последующей рехроматографией на колонках с силикагелем по схеме 1

Схема 1 - Разделение хлороформной фракции лабазника вязолистного

ХЛФ

Флэш-ХГ, сичикагель (Ь 5/40),

гексан, гексан-хлороформ (8 2,6 4,4 6,2 8),

хлороформ

фракции 1/1 2/1 3/1 4/1

КХ, силикагель (Ь 40/100), гексан, гексан - эти л ацетат (9 1, 8,5 1,5,8 2, 7,5 2,5, 7 3, 1 1), зтилацетат

ЛАВ-1

фракции 1/2 2/2

2/2 3/2 4/2

I ; I

ЛАВ-З | | ЛАВ-4 ||~ЛАВ-5

После перекристаллизации фракции 3/1 из бензола получили кристаллы кремового цвета с фруктовым запахом (ЛАВ-1, выход 20 мг), возгоняющиеся при 177-178 °С 252 нм (МеОН) ИК-спектр (КВг), v, см"1 3443, 2916, 2965, 2848, 1603, 1463 По данным масс-спектра соединение имеет формулу СвНвОз, М+152 В ПМР-спектре (DMSO-d6) вещества, записанном на спектрометре Bruker DRX-500 (рабочая частота 500, 13 МГц), наблюдались сигналы, 5, м д 3,86 (с, ЗН), 6,94 (с, Н-3, Н-5), 8,05 (с Н-2, Н-6) На основании спектральных данных полученное вещество идентифицировано с анисовой кислотой (4-метоксибензойная кислота)

Фракция 2/2 (J1AB-3) представляет собой жидкость желтого цвета с медовым запахом (выход 115 мг), легко растворимую в хлороформе Компонентный состав ее изучали методом ГЖХ-масс спектрометрии на приборе Trace DSQ (Thermoelectron corp, США), программное обеспечение Xcahbur 1 4 Условия анализа колонка ВРХ5, 25м, Тисп= 280°С, Vr/H= 1 мл/мин, растворитель - хлороформ, Ттсрмостата от 40 до 300°С, скорость нагрева 10 °/мин, задержка хроматограммы 5 мин, сканирование 33 - 650 а е м Компонентный состав фракции представлен преимущественно алифатическими кетонами, а так же ароматическими карбоновыми кислотами и их производными гексаналь (0,23%, tr 8,12 мин), бензойная кислота (0,56%, t, 14,78 мин), салициловая кислота (2,5%, tr 16,83 мин), 4-метоксибензойная кислота (0,63%, tr 18,78 мин), 4,4,7а-триметил-5,6,7,7а-тетрагидро-2(4Н)-бензофуранон (1,3%, tr 20,69 мин), диэтилфталат (16,32%, 20,86 tr мин), 6,10,14-триметил-2-пентадеканон (1,55%, 23,39 tr мин), бис-(2-метилпропил)-фталевая кислота (0,52%, tr 23,85 мин), 2-гептадеканон (0,97%, tr 24,06 мин), метиловый эфир 14-метил-пентадекановой кислоты (0,97%, tr 24,23 мин), бутилоктиловый эфир фталевой кислоты (7,67%, tr 24,88 мин), 2-нонадеканон (1,43%, tr 26,05 мин), (4-метоксифенил)метиловый эфир бензолуксусной кислоты (1,17%, tr 26,36 мин), диизооктиловый эфир фталевой кислоты (64,22%, tr 30,32 мин) (рис 3)

100-э

вен

85:

зо 32

754 70-. 63^

еск

5И

5СН 45Н 40-= 35-] 30^

2Н

2СН

Рисунок 3 -ГЖ-хроматограмма фракции 2/2 лабазника вязолистного

|СН

и

в 12

24

Ю

15

(п.... д-,;

20

Т1те (пг>Ш)

25

ЗО

Из фракции 3/2 после перекристаллизации из метанола получили белый мелкокристаллический порошок (ЛАЕМ, выход 43 мг) с тпл 306 - 308 °С Вещество хроматографически однородно и не обнаружило депрессии тпл в пробе смешения с достоверным образцом олеаноловой кислоты

Аналогичная обработка фракции 4/2 привела к получению мелкокристаллического порошка (ЛАВ-5, выход 8 мг) с т пл 285 - 287 °С На основании физико-химических свойств и сравнения с достоверным образцом вещество идентифицировано как урсоловая кислота

ЭАФ подвергали предварительному разделению с помощью флэш-хроматографии на полиамиде Из полученных подфракций в результате рехроматографии на колонках с силикагелем выделен ряд индивидуальных фенольных соединений (схема 2)

После перекристаллизации фракции 3/4 из смеси метанола с хлороформом (2 3) получили мелкокристаллический порошок лимонно-желтого цвета (ЛАВ-6, выход 56 мг) стпл 312-313 °С ^ах 256,371 нм (МеОН) Идентифицирован по отсутствию депрессии тпл пробы смешения вещества с заведомым образцом как кверцетин Значение ЛАВ-6 совпадает с аналогичным значением заведомо известного стандартного образца кверцетина

Схема 2 - Разделение этилацетатной фракции лабазника вязолистного

КХ, силикагечь I. 100/250 хлороформ, хлороформ метанол (98 2, 95 5, 93 7 90 10,85 15,50 50), метанол

Флэш-ХГ, полиамид "Woelm", хлороформ, хлороформ - этанол (9,5 0,5, 9 1, 8,5 1,5 8 2, 7,5 2,5, 7 3, 6 4, 1 1, 4 6, 3 7, 2 8), этанол

КХ, сшшка! ель Ь 40/100, хлороформ, хлороформ - ацетон (9 1,8 2,7 3 64, 1 1, 4 6 3 7) ацетон

КХ, полиамид, вода, вода -этанол (9,5 0,5, 9 1, 8,5 1,5, 8 2,7,52,5,73,1 1), этанол

КХ, силикагель Ь 40/100, этилацетат, этила цетаг -метанол (9 1,1 1)

/\

2/6 3/6

ЛАВ-8

ЛАВ-9

ЛАВ-13

ЛАВ-14

В результате перекристаллизации фракции 4/4 из смеси метанол-хлороформ (1 20) получили сфероидные кристаллы (ЛАВ-7, выход 120 мг), возгоняющиеся при 240 °С Хт„ 233, 251 нм (МеОН) ИК-спектр (КВг), V, см"1. 3500, 3277, 2915, 2857, 1615, 1650, 1670, 1543, 1428, 1386, 1320, 1100, 1023 Масс-спектр вещества совпадает с таковым галловой кислоты

Фракция 6/4 является доминирующей по массе Перекристаллизацией ее из смеси метанола с хлороформом (1 20) получили мелкокристаллический светло-желтый порошок (выход 2,0 г), с тпл 219-220 °С На БХ в 30% уксусной кислоте обнаруживаются два пятна с Яг 0,27 и 0,56 При просматривании хроматограмм в УФ-свете нижнее пятно флюоресцирует желтым цветом, а верхнее - темное После обработки 5% р-ром алюминия хлорида оба пятна окрашиваются в лимонно-желтый цвет При проведении цианидиновой реакции по Брианту наблюдали красное окрашивание водного слоя, что указывает на гликозидный характер вещества В результате проведения кислотного

гидролиза установили, что агликоном является кверцетин, а углеводными компонентами - О-глюкоза и Б-галактоза Разделение двух близких флавонольных гликозидов оказалось сложной экспериментальной задачей и было осуществлено путем рехроматографии на полиамиде, активированном 1 % раствором хлороводородной кислоты для селективности разделения.

В результате выделили желтый кристаллический порошок (ЛАВ-8, из 50% этанола т пл 224—225 °С) На основании физико-химических свойств и сравнении с заведомым образцом идентифицирован с изокверцитрином

При дальнейшем элюировании колонки получили желтые кристаллы (ЛАВ-9) Кислотный гидролиз показал, что вещество является монозидом, агликон которого идентифицирован с кверцетином, а сахарный остаток - с Э-галактозой ЛАВ-9 не является гиперозидом, стандартный образец которого имеет Иг 0,67 в тех же условиях

Для определения структуры ЛАВ-9 в кристаллической паре гликозидов кверцетина (ЛАВ-8 и ЛАВ-9) мы обратились к данным спектров ЯМР (табл 1,2,3). В спектрах, записанных в Ру-06 и в ЭМБО-Бб, видно, что компоненты смеси - два моно-О-гликозида кверцетина, находящиеся в соотношении 7 5 Согласно большой величине дублетного расщепления сигнала аномерного протона в ПМР-спектре (8 Гц) они являются р-гликозидами (при а-конфигурации аномерного центра, как известно, величина J равна нулю или незначительна) Один из них, как установлено методом БХ, является З-О-Р-О-глюкопиранозидом кверцетина и ему отвечает компонент смеси, находящийся в меньшем количестве Второй гликозид является, таким образом, О-р-Б-галактопранозидом кверцетина, а местом присоединения галактозы является атом кислорода при С-41 Это подтверждается неизменностью положения сигналов для атомов С-5 и С-7 в спектре ЯМР 13С по сравнению со спектром ЯМР 13С кверцетина, наблюдением выраженного орто-эффекта на сигнале атома Н-5' (и неизменностью положения сигнала Н-2' по сравнению с тем же спектром) в спектре ПМР и, наконец, наблюдением того же влияния на

кольцевые углеродные атомы флавонового ядра как при введении в положение С-4' молекулы изомерного сахарного остатка - глюкозы

Таблица 1 - Данные спектра ЯМР |3С кристаллической смеси 4 -О-галактопиранозида кверцетина (2) и З-О-глюкопиранозида кверцетина (3, изокверцитрина) (ЭМЗО-Пб, 0 - ТМС, 8, м. д.)

№ атома С Г 2

2 146 9 146 82 с 156 34 с

3 135 5 136 45 с 133 13 с

4 175 8 176 Юс 177 53 с

5 160 7 160 76 с 161 27 с

6 98 2 98 31 д 98 71 д

7 163 9 164 10 с 164 16 с

8 93 3 93 57д 93 57 д

9 156 2 156 28 с 156 28 с

10 103 1 103 15 с 103 96 с

2' 115 3" 115 97 д 115 23 д

1' 122 1 125 13 с 122 05 с

3 145 0 145 95 с 144 88 с

4 147 6 146 37 с 148 52 с

5' 115 6а 115 18 д 115 81 д

б' 120 0 119 58д 121 12 д

* Данные приведены для сравнния (кверцетин)

Таблица 2 - Данные углеводной части спектра ЯМР |3С глнкозидов 2 н 3 (ОШО-О,;, О-ГМС, 5, и д.)

Галактоза 2 3 Глюкоза

102 3 101 78 101 35 101 4

75 8 75 88 77 32 77 5

73 4 73 20 75 98 78 6

71 3 71 23 73 71 74 3

68 0 67 96 69 81 70 3

60 8 60 73 60 17 61 3

Таблица 3 - Химические сдвиги и константы спин-спинового взаимодействия {Л Гц) в спектрах ПМР кверцетина 1 и кристаллической смеси соединений 2 и 3 (ОМ80-06,0-ТМС)

Н 1 2 3

Н-б 6 18 (д, 2 0) 6 20 (д, 2 0) 6 21 (д, 2 0)

Н-8 6 40 (д, 2 0) 6 45 (д, 2 0) 642 (д, 2 0)

Н-2' 7 67 (д, 2 0) 7 70 (д, 2 0) 7 57 (д, 2 0)

Н-5' 6 88 (д, 9 0) 7 26(д, 90) 6 84 (д, 9 0)

Н-б' 7 54 (дд, 9 0,2 0) 7 62 (дд, 9 0,2 0) 7 65 (дд,90,20)

Информация о нахождении в растениях 4'-0-р-0-галактопиранозида кверцетина, названного нами филимарином, в литературе не найдена Соединение представляет собой желтый мелкокристаллический порошок с т пл 217-218 °С (из этанола), [a]D - 56,60 ° (С 0,53; этанол), Кгх 254, 364 нм ИК-спектр, v, см"1 (КВг). 3382 (ОН), 2928, 2900 (СН2), 1659 (СО), 1513, 1558, 1610 (бенз кольцо), 1009, 1040, 1088 (пираноид кольцо углевода), 997 (ß-гликозид связь) Спектр ЯМР 'Н, 5, м д (У,Гц)1 6 20 (Н-6, д, 2 0), 6 45 (Н-8, д, 2 0), 726 (Н-5 , д, 90), 762 (Н-6', дд, 9.0, 20), 7 70 (Н-2, д, 2 0) Спектр ЯМР 13С, 5, м д 146 82 с (С-2), 136 45 с (С-3), 170 10 с (С-4), 160 76 с (С-5), 98 31 д (С-6), 164 10 с (С-7), 93 57 д (С-8), 156 28 с (С-9), 103.15 с (С-10), 125 13 с (С-1 ), 115 97 д (С-2), 145 95 с (С-3 ), 146 37 с (С-4), 115 18 д (С-5), 11958 д (С-6'), углеводная часть- 101 78,75 88,73 20,71 23,67 96,60 73

После перекристаллизации фракции 7/4 из смеси ацетона с хлороформом (3 4) получили светло-желтого цвета кристаллический порошок (ЛАВ-10, выход 35 мг) с тпл 208 - 210 °С. Км 257, 360 нм Значение Rf ЛАВ-10 совпадает с аналогичным значением заведомо известного стандартного образца рутина

Фракцию 2/5 подвергали перекристаллизации из бензола В результате получили бесцветные игольчатые кристаллы (ЛАВ-11, выход 35 мг) с т пл 178 - 180 °С Кы 275 нм, m/z 138 (М+) 120, 92, 64, 60, 53, 45, 39, 31 По физико-химическим свойствам вещество идентично салициловой кислоте

Из фракции 4/5 перекристаллизацией из смеси метанол-хлороформ (2.3) выделили белый кристаллический порошок (ЛАВ-12, выход 25 мг) с т пл. 159 -160 °С Кгх 231, 305 нм, m/z 198 (М+) 183, 170, 153, 125, 79, 51, 39, 28 На основании спектральных данных полученное вещество идентифицировано с этиловым эфиром галловой кислоты

После нагревания фракции 2/6 со смесью метанол-хлороформ-гексан (1 1 1,5) по охлаждении выделен ярко-желтый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-13; выход 31 мг) с т пл 229-230 °С Кислотный гидролиз вещества привел к получению агликона, отождествленного с кверцетином и сахарного остатка,

идентичного L-арабинозе 257, 365 нм Идентифицирован по отсутствию депрессии т пл пробы смешения с заведомым образцом вещества как кверцетин-З-О-Ь-арабопиранозид (авикулярин)

Из фракции 3/6, в результате перекристаллизации из смеси ацетон-хлороформ (2 3) получили светло-розовый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-14, выход 18 мг) с т пл 177 -179 °С Кш 232,281 нм ИК-спектр (KBr), v, см"1. 3390, 1446, 1339 (ОН), 2924, 1200, 1127, 1055, 820, 788, 764 (СН2, СН3), 1742 (СООН); 1609,1524 (бенз кольцо); 1288 (СО).

При перекристаллизации фракции 3/3 из этанола выделили светло-желтые кристаллы (ЛАВ-15, выход 30 мг) с т.пл 350 - 352 °С Кы 254, 361 нм. ИК-спектр (KBr), V, см"1 3556 (ОН), 3075, 1195, 1055, 882 (СН2,СН3), 1698 (СООН); 1616 (бенз кольцо), 1340 (СО) Структура двух фенольных соединений (ЛАВ-14 и ЛАВ-15) до настоящего времени еще не установлена

Из фракции 8/4 выделили белый мелкокристаллический порошок (ЛАВ-16, из ацетона выход 30 мг) с т.пл 266-267 °С Я™* 222,276. ИК-спектр (KBr), v, см'1. 3396, 1614, 1716, 1352, 1321 По данным масс-спектра соединение имеет формулу Ci4H608 с m/z 302 (М+) и отождествлено с эллаговой кислотой.

Таким образом, из активных фракций л вязолистного выделены 14 индивидуальных соединений, структура 12 из которых установлена, олеаноловая, урсоловая, анисовая, салициловая, эллаговая кислоты, галловая кислота и ее этиловый эфир, кверцетин, изокверцитрин, авикулярин, рутин и ранее не описанный в литературе филимарин

Хроматографическими методами выявлено, что БАВ в органах растения распределены неравномерно. простые фенольные соединения преимущественно содержатся в стеблях (кофейная, салициловая, анисовая, гентизиновая, галловая, хлорогеновая кислоты) и цветках (этилгаллат, феруловая, м-гидроксибензойная, фумаровая кислоты) растения, филимарин - в цветках, изокверцитрин, рутин и галловая кислота - в листьях растения

Для выявления носителей фармакологической активности исследовали АОА выделенных индивидуальных соединений Результаты эксперимента

показали, что основной вклад в АОА лабазника вносят флавонолгликозиды и фенолокислоты При этом наибольшей активностью обладают изокверцитрин и филимарин, которые по силе действия в 1,6 раза превосходят стандартный природный антиоксидант дигидрокверцетин (0,650 мкМ/л мин) (табл 4) Учитывая тот факт, что антиоксидантное действие является одним из основных эффектов растительных ноотропов, можно предположить, что указанные гликозиды кверцетина вносят основной вклад в ноотропную активность лабазника вязолистного

Таблица 4 - АОА индивидуальных соединений лабазника вязолистного

Название соединения К, мкМ/л мин

Изокверцитрин и филимарин (ЛАВ-8, ЛАВ-9) 1 046

Эллаговая кислота (ЛАВ-16) 0 426

Галловая кислота (ЛАВ-7) 0 405

(ЛАВ-14) 0 356

Эгилгаллат (ЛАВ-12) 0 306

Авикулярин (ЛАВ-13) 0 297

Рутин (ЛАВ-10) 0 263

(ЛАВ-15) 0 251

Салициловая кислота (ЛАВ-11) 0 106

Динамика накопления БАВ в лабазнике вязолистном

Содержание фенолокислот определяли прямым спектрофотометрическим методом при X 271 нм с использованием PCO галловой кислоты Наибольшее содержание фенолокислот выявлено в фазу цветения в цветках (8,9±0,3%) и листьях (4,6±0,1%) Содержание галловой кислоты в надземной части растения, собранной в различных районах колеблется от 3,1±0,3 до 5,5±0,4%

Содержание флавоноидов определяли методом дифференциальной спектрофотометрии после реакции гидролизованного экстракта растения на 70% этаноле с р-ром А1С13 при к 425 нм с использованием ГСО кверцетина Наибольшее содержание флавоноидов выявлено в фазу цветения в цветках (8,1 ±0,3%) и листьях (7,2±0,2%) В надземной части л вязолистного, собранной в различных районах количество флавоноидов составляет от 2,8±0,2% до 5,6±0,3%

Разработка параметров стандартизации сырья лабазника вязолистного

В результате микроскопического исследования надземной части растения установили, что диагностическим признаком является наличие волосков различного типа простых одноклеточных толстостенных на эпидермисе стебля, верхнем эпидермисе листа и по краю листа, кнутовидных на нижнем эпидемисе листа и железистых на верхнем эпидемисе листа и лепестка венчика

Числовые показатели для цельного и измельченного сырья определяли в соответствии с методиками ГФ XI Влажность сырья составила 8,9±1,3%, зола общая 6,7±0,4%, зола не растворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты 0,8±0,2%, стеблей в тч отделенных при анализе 26,1 ±3,4%, количество почерневших, побуревших, пожелтевших частей растения 9,5±1,7%, экстрактивные вещества, извлекаемые 70% водным этанолом 25,2±2,7%, содержание флавоноидов 2,8±0,2%, органическая примесь 0,9±0,1%, минеральная примесь 0,3±0,1% Основная часть измельченного сырья проходит сквозь сита с диаметрами пор 1-4 мм (77,5 %) Сквозь сито с диаметром пор 7 мм не проходит 0,01±0,01% Через сито 0,25 отсеивается 2,7±0,6% сырья.

Подлинность и содержание действующих веществ определяли по флавоноидам При этом предварительно были подобраны оптимальная система растворителей для ТСХ и количество экстракта для нанесения на пластинку, отработаны условия проведения экстракции, гидролиза и реакции с А1СЦ

Установлено, что оптимальными условиями экстрагирования являются трехкратная экстракция 70% водным этанолом в соотношении 125, измельченность сырья от 0,5 до 3 мм (рис. 4)

—f

н =4- h

-»— I и

■ МО % ■ 1:15 Ш м 1:20 1 25 1 1:30

ш— 4 —

~ 1

-ц—1 ч

Рисунок 4 - Влияние условий извлечения на выход флавоноидов (%) из надземной части лабазника вязолистного: концентрация этанола (1), соотношение сырья и экстрагента (2), кратность экстракции (3), измельченность сырья (4)

Гидролиз гликозидов кверцетина проходит полностью при добавлении 5% конц. хлористоводородной кислоты и нагревании на кипящей водяной бане в течение 120 мин. Для полного проведения реакции необходимо вносить 3 мл 5% этанольного раствора А!С13 (рис. 5).

0,25

0.15

I I I I

13 5 7

ш

Рисунок 5 - Изменение оптической плотности в зависимости от условий проведения гидролиза и реакции с А1СЬ: содержание конц. HCl, % (1); время проведения гидролиза, мин (2); концентрация, % (3) и количество, мл этанольного р-ра AICI3 (4).

Методика качественного ТСХ-анализа надземной части л вязолистного Около 1,0г сырья (тн) измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагируют 70% водным этанолом трижды по 30 мин на водяной бане при 80 °С Извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр («красная лента») в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 70% этанолом до метки (раствор А, в последующем используют для колич анализа) На линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия) микропипеткой наносят 0,04 мл полученного извлечения Хроматографическую пластинку помещают в камеру, которую предварительно насыщают смесью растворителей хлороформ-этанол (6 3), и

хроматографируют восходящим способом Когда фронт растворителей пройдет около 8 см, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе и просматривают в УФ-свете Должны обнаруживаться два пятна темно-желтого цвета с величиной ЯГ около 0,61 и 0,40 (изокверцитрин и филимарин), которые после обработки 5% этанольным раствором А1С13 проявляются в виде хорошо заметных пятен желтого цвета, допускается наличие пятен других флавоноидов

Методика количественного определения действующих веществ в надземной части л вязолистного 20 мл раствора А, приготовленного как указано ранее, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100мл, добавляют 5% конц НС1 и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 120 мин 1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 3 мл 5% этанольного раствора А1С13 и доводят 95% этанолом до метки Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре через 45 мин при X 425 нм Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца кверцетина Для этого 1 мл 0,02% раствора кверцетин-стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 5% раствора А1СЬ и доводят до метки 95% этанолом

Приготовление р-ра ГСО кверцетина: 0,0100 г (т.н.) ГСО кверцетина, высушенного до постоянной массы при 100-105 °С, растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в небольшом количестве 95% этанола, добавляют ! каплю кони. HCl и доводят объем раствора тем же спиртом до метки. Содержание флавоноидов рассчитывают по формуле:

х(%)= Р-Мо- 100-25- 1 • 100- 100 = Р-Мо-20000 , Ро-М-1 • 50 • 25-(100-W) Ро • М • (100-W)

где Р- оптическая плотность испытуемого раствора;

Ро- оптическая плотность ГСО кверцетина (среднее из трех измерений);

Мо- масса ГСО кверцетина, г;

М- масса навески сырья, г;

W- влажность, %.

Создание лекарственной формы лабазника вязолнстного

На первом этапе технологии лекарственной формы растения предложен жидкий экстракт лабазника, полученный методом реперколяции с делением сырья на равные части, с использованием 5 перколяторов по 3 законченных цикла, экстрагент 70% этанол. Проводили 4 опыта, варьируя время экстракции (10, 14, 18 и 24 ч). В каждом из полученных экстрактов определяли выход экстрактивных веществ в соответствии с методикой ГФ XI изд., вып.2. Выявили, что оптимальное время контакта фаз составляет 14 часов (рис.6).

Рисунок 6 - Выход готового продукта в зависимости от временного фактора

Т. час

ЖЭ лабазника представляет собой темно-коричневую жидкость со специфическим приятным запахом. Его стандартизация проведена по методикам ГФ XI изд. по сквозной схеме. Определены сухой остаток, содержание этанола и количественное содержание действующих веществ (табл.

5) Качественный анализ ЖЭ лабазника проводили методом ТСХ по описанной выше методике Оптимальное количество ЖЭ для нанесения на пластинку составляет 0,002 мл

Методика количественного определения действующих веществ в ЖЭ лабазника 1,0 мл ЖЭ помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят 95% этанолом до метки (раствор А) 20 мл раствора А помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 5% конц НС1 и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч 1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 3 мл 5% этанольного раствора А1СЬ, доводят 95% этанолом до метки Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре через 45 мин при К 425 нм Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца кверцетина Содержание флавоноидов рассчитывают по формуле

х(%) - Р-Мо 25-25 1 100 = Р Мо 50 .

Ро А 1 50 25 Ро А

где Р- оптическая плотность испытуемого раствора,

Ро- оптическая плотность ГСО кверцетина (среднее из трех измерений),

Мо- масса ГСО кверцетина, г,

А- аликвота ЖЭ, мл

Таблица 5 - Параметры качества жидкого экстракта лабазника вязолистного

Серия ЖЭ ЖЭ (январь,2005 г) ЖЭ (октябрь,2005 г)

Сухой остаток, % 7,2±0,3 7,7±0,1

Содержание этанола, % 69,2±0,5 66,2±0,5

Содержание флавоноидов (Х,%), метрологические характеристики 30+0.01. аЧ).0001. <т=0,0070, ох=0,0040, 1р=0,0127, А=0,97% Х=1.31±0.01.а2=0.000\. о=0,0070, ох=0,0040, 1р=0,0127, А=0,96%

25

ВЫВОДЫ

1 Впервые осуществлено углубленное химико-фармакогностическое исследование надземной части лабазника вязолистного. Установлено, что растение содержит сложный комплекс фенольных соединений, состоящий из простых фенолов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, флавоноидов и танинов

2 На основании фармакологических исследований из активных фракций колоночной хроматографией на силикагеле и полиамиде выделено 14 индивидуальных соединений С помощью химических, хроматографических и спектральных методов установлена структура 12 веществ (олеаноловая, урсоловая, анисовая, салициловая, эллаговая кислоты, галловая кислота и ее этиловый эфир, кверцетин, авикулярин, рутин, изокверцитрин, филимарин). Методом ГЖХ-МС спектрометрии идентифицировано 10 соединений

3 Впервые выделен ранее не описанный в литературе флавонольный гликозид, названный филимарин (3,5,7,3/-тетрагидроксифлавон-4/-0-Р-В-галактопиранозида)

4 Выявлен факт корреляции антиоксидантных свойств лабазника вязолистного с его ноотропной активностью Установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью обладают гликозиды кверцетина (изокверцитрин и филимарин)

5 Изучена динамика содержания флавоноидов и фенолокислот в надземной части лабазника вязолистного Наибольшее их содержание выявлено в фазу цветения в цветках и листьях растения

6 Разработанные методики стандартизации сырья и на их основе проект ФС «Трава лабазника вязолистного», а также технология жидкого экстракта лабазника дают возможность его внедрения в качестве источника ноотропного фитопрепарата

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Химическое исследование активного экстракта лабазника вязолистного // Тез докл 63-й итог науч студенч конф им H И Пирогова - Томск, 2004-С 235-236 (соавт. О.П Слепушкина, M Г Нагаев)

2 Химическое исследование надземной части лабазника вязолистного // Лекарственные растения в фармакологии и фармации тез докл. науч конф , посвящ. 50 — летаю Алтайского гос мед университета — Барнаул, 2004. - С 306-307 (соавт Е А. Краснов, И В Шилова, О.П. Слепушкина)

3 Гепатопротекторное средство, обладающее антиоксидантной активностью и способ его получения (ЕА Краснов, ИВ Шилова, Т.Г Хоружая, ТП Новожеева,ТВ Жаворонок,НИ Суслов,ЕЮ Авдеева)/патент№2310467 РФ от 17 08 2005 г.

4 Фенольные соединения FILIPENDULA ULMARIA L(MAXIM) // Химия природ соедин. - 2006 - № 2 - С 122-124 (соавт ЕА Краснов, В А Рапдугин, И В Шилова)

5. Химический состав и антиоксидантные свойства растений рода лабазник и альфредия // Химия и технология растительных веществ тез докл IV Всеросс науч конф. ~ Сыктывкар, 2006 - С 217 (соавт И.В Шилова, Е.А Краснов, H В Кувачева, О П Слепушкина, Е И Короткова, А.Н Лукина).

6 Лабазник вязолистный - перспективное лекарственное растение флоры Сибири // Науки о человеке- матер VIII конгр молодых ученых и специал -Томск, 2007 - С 214-215 (соавт ИВ Шилова)

7 Содержание биологически активных веществ в лабазнике вязолистном // «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений»- матер II Междунар науч. конф - Алматы, 2007 - С 200 (соавт И В Шилова, Е А Краснов)

8 Изучение химического состава фракций лабазника вязолистного, обладающих антиоксидантной и гепатозащитной активностью // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья тез

докл Всеросс науч конф - Барнаул, 2007 - С 334-336 (соавт ИВ Шилова, Е А Краснов, В А Ралдугин)

9 Тритерпеновые и фенольные соединения лабазника вязолистного // «Химия и медицина» матер VI Всеросс науч семинара с Молодежной науч школой - Уфа, 2007 - С 122-123 (соавт. И В Шилова, Е А Краснов, В А Ралдугин).

10 Микроскопическая характеристика надземной части лабазника вязолистного // Фармация - 2008 - №2 - С 21-22 (соавт И В Шилова, Н Э Коломиец, Е А Краснов)

11 Компонентный состав фракции Filipéndula ulmaria (L) Maxim с высокой антиоксидантной активностью// Химия растительного сырья - 2008 - №3 -(соавт Е А Краснов, И В Шилова)

12 Антиоксидантные свойства биологически активных веществ лабазника вязолистного // Химия и технология растительных веществ тез докл V Всеросс науч конф - г Уфа, 2008 (соавт И В Шилова, Е А Краснов)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОА - антиоксидантная активность АРА - антирадикальная активность БАВ - биологически активные вещества БФ - бутанольная фракция БХ - бумажная хроматография ВФР - ванилин-фосфорный реактив ДФПГ - дифенилпикрилгидразил ЖЭ - жидкий экстракт ТСХ - тонкослойная хроматография УК - уксусная кислота

УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания ХЛ - хемилюминисценция ХЛФ - хлороформная фракция ЭАФ - этилацетатная фракция

Подписано в печать«? 0.06, 200$, г Уел печ листов ¿¡|оГ Печать на ризографе Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии СибГМУ 634050, г Томск, Московский тракт, 2, тел 53-04-08 Заказ № /,37-__Тираж/^ экземпляров