Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фитохимическое исследование видов рода Filipendula Mill. (Rosaceae), произрастающих в России

На правах рукописи

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВИДОВ РОДА Filipéndula Mili. (Rosaceae), ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РОССИИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Б ФЕВ 2014

Улан-Удэ - 2014 005544827

005544827

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном

учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский

государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Олейников Даниил Николаевич - доктор фармацевтических наук Официальные оппоненты:

Мирович Вера Михайловна - доктор фармацевтических наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации / кафедра фармакогнозии и ботаники, заведующий

Чирикова Надежда Константиновна - кандидат фармацевтических наук, доцент, Институт естественных наук, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Амосова» / кафедра биохимии и биотехнологии, доцент

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» Россельхозакадемии

Защита состоится « 28 » февраля 2014 г. в 1400 час. на заседании диссертационного совета Д 003.028.02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки "Институт общей и экспериментальной биологии" СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН по адресу: ул. Сахьяновой, 6, 670047, г. Улан-Удэ.

Автореферат разослан « 27 » января 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент

В.Б. Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Filipéndula Mili, (лабазник) — род многолетних травянистых растений семейства Rosaceae, насчитывающий около 30 видов, некоторые из которых произрастают в России. К числу наиболее изученных относится F. ulmaria (L.) Maxim, (л. вязолистный, meadowsweet) — официнальный растительный вид во многих странах мира (Krenn, 2011). Согласно исследованиям в F. ulmaria установлено присутствие производных салициловой кислоты (Blazics, 2010), 2-пирон-4,6-дикарбоновой кислоты (Wilkes, 2001), фенилпропаноидов (Okuda, 1992), флавоноидов (Рарр, 2004), таннинов (Fecka, 2009), эфирных масел (Саифулина, 1975). Фенольные компоненты являются действующей группой соединений, обусловливающей наличие у лекарственных средств из F. ulmaria иммуностимулирующей (Halkes, 1997), антимикробной (Barros, 20113), противоаллергической (Nitta, 2013) и др. видов активности. Востребованность применения официнального вида в качестве перспективного ноотропного средства (Авдеева, 2010) при одновременной недостаточности его сырьевых ресурсов в России приводят к необходимости проведения поисковых исследований с целью выявления викариантных и близких по химическому составу заменителей в пределах рода Filipéndula Mili. В связи с этим фотохимическое изучение видов рода Filipéndula Mili., произрастающих в России, является актуальной задачей.

Согласно ботаническим сведениям, в Российской Федерации встречаются 9 видов рода Filipéndula Mili., представители трех подродов: Aceraría (F. camtschatica, F. glaberrima, F. palmata, F. angustiloba, F. intermedia), Ulmaria (F. ulmaria, F. denudata, F. stepposa) и Eu-Filipendula (F. vulgaris) (Флора СССР, 1943). Степень изученности видов данного рода, кроме F. ulmaria, является недостаточной. Для ряда видов (F. camtschatica, F. glaberrima, F. angustiloba, F. intermedia, F. stepposa) химические исследования ранее не проводились, в связи с чем, сложно оценить их потенциальные полезные свойства.

Целью исследования явилось химическое изучение девяти видов рода Filipéndula Mili., произрастающих в России, и разработка унифицированных методических подходов для определения флавоноидов и эллаготаннинов.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить состав фенольных соединений, углеводных компонентов и эфирного масла в побегах девяти видов рода Filipéndula Mili., произрастающих в России.

2. Изучить орган-специфичное распределение фенольных соединений в девяти видах рода Filipéndula Mili.

3. Установить особенности накопления фенольных соединений, углеводных компонентов и эфирного масла в побегах Filipéndula ulmaria в течение вегетационного периода.

4. Создать унифицированную методику определения флавоноидов и эллаготаннинов в видах рода Filipéndula Mili, с применением метода микроколоночной ВЭЖХ-УФ. 1

5

г\;

Я V?

5. Определить показатели качества для нового вида растительного сырья

- "Лабазника вязолистного побеги цветущие".

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное химическое исследование представителей рода Filipéndula Mili., произрастающих в России, пять из которых ранее не изучались. Выделено около 50 соединений, причем 22 впервые для рода. Из цветков F. ulmaría выделено новое природное соединение

- ульмариозид, представляющий собой кверцетин-4'-Оа-рамнопиранозил-(1—>6)-/?-глюкопиранозида (кверцетин-4-О-рутинозид). Впервые определен состав водорастворимых полисахаридов рода Filipéndula Mili, и показано, что галактуронаны и арабиногалактаны являются доминирующими компонентами. Выявлена хемосистематическая роль состава эфирного масла цветков рода Filipéndula Mili, и ряда соединений (салициловый альдегид, метилсалицилат, ванилин, гекса- и гептадеканаль). Изучено орган-специфичное распределение фенольных соединений в видах Filipéndula и установлено, что для цветков характерно накопление флавоноидов и эллаготаннинов, для листьев -катехинов и процианидинов. Показана хемосистематическая роль спиреозида, кемпферол^4'-0-глюкозида и некоторых эллаготаннинов для характеристики рода Filipéndula Mili. Установлено, что олигомерные эллаготаннины ругозины D и Е в водной среде нестабильны и подвергаются гидролитическому распаду до мономерных составляющих.

Практическая значимость. Разработаны методики количественного определения флавоноидов и эллаготаннинов в видах Filipéndula с применением микроколоночной ВЭЖХ-УФ, характеризующиеся экспрессностью и удовлетворительными валидационными параметрами. Установлена роль ругозинов А и В, а также галлоилированных производных глюкозы и дилактона валониевой кислоты как индикаторов нарушенных условий хранения сырья. С целью рационального использования биомассы F. ulmaria предложен новый вид лекарственного сырья — "Лабазника вязолистного побеги цветущие" и разработан проект ФСП на него. Полученные данные по сезонной динамике накопления фенольных соединений, эфирного масла и полисахаридов подтвердили целесообразность проведения сбора растительного сырья в фазу цветения. В качестве перспективных заменителей F. ulmaria для дальнейшего практического применения рекомендованы виды F. denudata и F. stepposa.

Степень внедрения. Теоретические положения и результаты экспериментальных исследований, изложенные в диссертационной работе, используются в учебном процессе кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

На защиту выносятся:

1. Результаты исследования состава фенольных соединений видов рода Filipéndula Mili., произрастающих на территории России.

2. Характеристика нового природного соединения - ульмариозида, выделенного из цветков F. ulmaria.

3. Хемосистематическая роль фенольных соединений и компонентов эфирных масел для характеристики рода Filipéndula Mili.

4. Методы количественного анализа флавоноидов и эллаготаннинов с применением микроколоночной ВЭЖХ-УФ.

5. Показатели качества нового растительного сырья — "Лабазника вязолистного побеги цветущие"

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представлены на: Ежегодном конкурсе-конференции студентов и молодых ученых "Авиценна" (Новосибирск, 2006, 2007, 2008); XI и XII Международной экологической конференции "Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ" (Новосибирск, 2006, 2007); 66й и 67й Всероссийской итоговой студенческой научной конференции им. Н.И. Пирогова (Томск, 2007, 2008); II Международной научной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений" (Алматы, 2007); 61st International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research (Münster, 2013).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (государственная регистрация № 012000807420) и комплексной целевой программой СО РАМН «Здоровье человека в Сибири» (государственная регистрация № 01.9.2002479).

Личный вклад автора в получении научных результатов. Автором диссертационной работы проведен поиск и анализ данных по теме исследования, осуществлены планирование экспериментов, сбор данных; соискателем непосредственно проведены все химические и аналитические эксперименты. Согласно сформулированным задачам подготовлены доклады, тезисы и статьи, оформлена диссертация, автореферат, представленные к защите.

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 16 научных работ, в том числе 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК МОиН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, заключения, списка цитируемой литературы, состоящего из 144 источников, в том числе 56 на иностранных языках, и включает 41 рисунок, 29 таблиц и 1 приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Во введении обозначены актуальность темы, цель и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость исследований, сведения об апробации работы и основные положения, выносимые на защиту.

Глава 1. РОД ЛАБАЗНИК (.Filipéndula Mili.). ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

В главе дается обзор литературных данных по ботанической характеристике, химическому составу видов рода Filipéndula Mill., применению в народной медицине и фармакологической активности экстракционных препаратов и индивидуальных соединений рода Filipéndula Mill.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растительное сырье было собрано в Российской Федерации: F. angustiloba (Turcz.) Maxim. = л. узколопастный - окр. г. Шилка (ЗК, 14.VII.2012, 51°81'71" N, 116°07'47" Е); F. camtschatica (Pall.) Maxim. (F. kamtschatica auct.) = л. камчатский - пос. Заозерный (КК, 14.VII.2012, 53°01'75" N, 158°78'81" Е); F. denúdala (J.Presl & C.Presl) Fritsch. (F. ulmaria ssp. denudata (J. Presl & C. Presl) Hayek) = л. обнаженный - пос. Кремено (Гатчинский р-н, ЛО, 11.VII.2012, 59°35'81" N, 30°29'21" Е); F. glaberrima Nakai (F. glabra Nakai ex Kom, F. purpurea auct.) = л. гладчайший - пос. Горные Ключи (ПК, 11.VII.2012, 45°23'64" N, 133°54'43" Е); F. intermedia (Glehn) Juz. = л. средний - окр. г. Нерчинск (ЗК, 11.VII.2012, 51°90'53" N, 116°56'52" Е); F. palmata (Pall.) Maxim. {F. nuda Grubov) = л. дланевидный - пос. Ошурково (Иволгинский р-н, РБ, 6.VII.2012, 51°92'28" N, 107°51'19" Е); F. stepposa Juz. (F. ulmaria ssp. picbaueri (Podp.) Smejkal) = л. степной - пос. Сузун (Сузунский р-н, НСО, 5.VII.2012, 53°77'08" N, 82°28'07" Е); F. ulmaria (L.) Maxim. = л. вязолистный - пос. Тальцы (Заиграевский р-н, РБ, 3.VII.2011, 51°83'56" N, 107°77'48" Е); F. vulgaris Moench. (F. hexapetala Gilib.) = л. обыкновенный - окр. г. Тогучин (Тогучинский р-н, НСО, 25.VI.2012, 55°23'65" N, 84°36'92" Е).

ВЭТСХ проводили на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-АФ и ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.), препаративную ТСХ - на пластинах с силикагелем (Имид Ltd.), КХ - на силикагеле 100/400 (Woelm), полиамиде (Sigma), гель-хроматографию - на Sephadex LH-20 (Farmacia), Sephacryl 300-HR (Sigma-Aldrich). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре СФ-2000 (ОКБ Спектр). Оптическое вращение определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптико-механический завод). ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре ФТ-801 (Симекс). ГХ-МС анализ проводили на хромато-масс-спектрометре 6890N, соединенным с масс-квадрупольным детектором 5973N с использованием капиллярной колоноки HP-Innowax (Agilent Technologies; 30 м><0.25 ммх0.50 мкм; неподвижная фаза -полиэтиленгликоль). MC-анализ проводили на масс-спектрометре высокого разрешения МАТ 8200 (Finnigan). Спектры 'Н- и 13С-ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varían). ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова). Аминокислотный состав определяли методом ИО-ВЭЖХ на аминокислотном анализаторе 835 (Hitachi) на стальной колонке (0.26x15 см), заполненной катионно-обменной смолой марки 2619 (Hitachi Custon Ion-Exchange Resin), элементный состав - на масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Elan-DRC II (Perkin-Elmer). Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Statistica MS Excel.

Глава 3. ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ВИДОВ РОДА Filipéndula Mili., ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РОССИИ

Для химического исследования экстрактивных веществ цветущих побегов видов Filipéndula было проведено фракционирование и хроматографическое разделение спирторастворимых компонентов с применением жидкофазной экстракции, КХ на нормально- (SÍO2) и обращенно-фазовом силикагеле (ОФ-SÍO2), полиамиде, Сефадексе LH-20, твердофазной экстракции на полиамиде, препаративной ТСХ на SÍO2 и целлюлозе, флэш-хроматографии на Sto2, препаративной ВЭЖХ на ОФ-БЮг.

3.1. Фенольные соединения цветущих побегов F. ulmaria. В результате хроматографического разделения экстрактивных веществ цветков F. ulmaria было выделено и идентифицировано 41 соединение - одно новое вещество (33) и 40 известных компонентов, в т.ч. фенолокислоты и их эфиры: п-гидроксибензойная (1), сиреневая (2), п-кумаровая (3), салициловая (4), о-анисовая (6), коричная (8), галловая (9), эллаговая (29), 3-О- (16), 5-0-галлоилхинные кислоты (17), метилсалицилат (5), метил-о-анисат (7); фенилпропаноиды: кофейная кислота (14) 4-0- (10), 3-О- (11), 3,4-ди-О- (12), 3,4,5-три-О-кофеилхинные кислоты (13), 1-О-кофеилглюкоза (15); флавоноиды: гиперозид (19), изокверцитрин (20), авикулярин (21), кверцитрин (22), спиреозид (23), миквелианин (31), кверцетин-З-О-гентиобиозид (30), рутин (18), никотифлорин (32), астрагалин (24), кемпферол-4'-0-глюкозид (25), кверцетин (26), кемпферол (27), апигенин (28); эллаготаннины: теллимаграндин I, (34), 12 (35), II (36), ругозин Bi (37), В2 (38), D (39), Е, (40), Е2 (41).

Фракционирование листьев F. ulmaria привело к выделению 34 соединений - фенолокислоты и их эфиры-. 1, 3-5, 8, 16, 17, 29; фенилпропаноиды: 12, 14, 1,3-ди-О-кофеилхинная кислота (42); флавоноиды: 18-20, 22-25, 31, 32; эллаготаннины: 36, 39-41; катехины: (+)-катехин (43), (-)-эпикатехин (44), (-)-эпигаллокатехин (45), (-)-эпикатехингаллат (46), (-)-эпигаллокатехингаллат (47); процианидины: процианидин Bi (48) и В2 (49). Ранее наличие соединений 4-6, 8, 9, 11, 18-27, 29, 31, 32, 34-41 было установлено в F. ulmaria (Авдеева, 2008; Blazics, 2010; Fecka, 2009, Krasnov, 2006; Papp, 2004); присутствие 1-3, 7, 10, 12-17, 28, 30, 33, 42-49 выявлено впервые.

3.2. Идентификация ульмариозида (соединение 33). Из бутанольной фракции цветков F. ulmaria было выделено соединение 33, ранее не описанное в литературе. Соединение представляет собой аморфный порошок желтого цвета. Молекулярная формула согласно данным HR-ESI-MS — С27Нзо01б {m/z 633.594 ([M+Na]+; расч. 633.521)}. В результате кислотного гидролиза с 5% ТФУ образуется смесь веществ, в составе которой идентифицированы кверцетин, глюкоза и рамноза в соотношении 1:1:1. Спектр поглощения соединения содержит два максимума - 255 и 366 нм, что указывает на наличие в структуре флавоноидного скелета. Анализ спектров поглощения в присутствии ионизирующих добавок свидетельствует о наличии в структуре соединения свободных гидроксильных групп в положениях С-3, С-5, С-7 и замещенном положении С-4'. После полного метилирования 33 и формолиза

продукта перметилирования в составе гидролизата были обнаружены два метилированных углевода, которые согласно ГХ/МС представляют собой 2,3,4-три-О-метил-глюкозу и 2,3,4-три-О-метил-рамнозу в соотношении 1:1, что указывает на строение углеводной части в виде рамнозил-(1—>6)-глюкозы (рутинозы). В ESI-MC спектре 33 присутствует пик с м.м. 611 а.е.м., соответствующий молекулярному иону [М+Н]+, а также пики фрагментов с м.м. 465 [(M-Rha)+H]+ и 303 [(M-Rha-Glc)+H]+, свидетельствующих об удалении рамнозы и глюкозы.

В *Н ЯМР спектре 33 сигнал протона С-2' находится в более сильном поле (5 7.55 м.д.) в сравнении с сигналом С-6' (5 7.72 м.д.), что указывает на наличие замещения по положению С-4' (Andersen, Markham, 2006) (табл. 11. Положение сигналов аномерных протонов, а также значения констант спин-спинового взаимодействия глюкопиранозы (<5 5.91 м.д., J=7.5 Гц) и рамнопиранозы (54.48 м.д., J=1.8 Гц) свидетельствуют о /?- и а-конфигурациях аномерных центров, соответственно. Последнее обстоятельство также подтверждается значениями химических сдвигов атомов С-1 в С ЯМР спектрах (103.1 и 101.8 м.д., соответственно для глюкозы и рамнозы). О присутствии замещенного положения С-4' свидетельствует сдвиг сигнала в сильное поле (146.5 м.д.) в сравнении с агликоном кверцетином (147.8 м.д.). Характер связи в биозном остатке подтверждается расположением сигнала атома С-6" глюкозы (68.6 м.д.), который претерпевает смещение в слабое поле (+7.2 м.д.) относительно такового у кверцетин-4'-0-глюкозида - спиреозида (61.4 м.д.), а также сильнопольным сдвигом сигнала атома С-5" (-1.0 м.д.).

Таблица 1. Спектры ЯМР 'Н (500 Гц) и 13С (125 Гц) ульмариозида (ДМСО-d^, 8, м.д., J/Гц)

Атом С DEPT ¿1! ¿С Атом С DEPT ¿С

2 С Кверцетин 147.9 1" СН /З-Глюкопираноза 5.91 (1Н,д,1 = 7.5) 103.1

3 С 137.2 2" СН 3.75-4.12 (8Н,м) 75.6

4 С 177.9 3" СН 77.2

5 С 162.1 4" СН 71.4

6 7 СН С 6.18 (1Н, с) 99.3 165.6 5" 6" СН СН2 4.23 (1Н, дд, J= 11.2,1.4) 3.63 (1Н, ддЛ= 11.8,5.8) 78.4 68.6

8 9 СН С 6.35 (1Н, с) 94.6 158.1 1"' СН а-Рамнопираноза 4.48 (1Н, д, J= 1.8) 101.8

10 с 104.6 2"' СН 3.75-4.12 (8Н,м) 71.9

1' с 126.4 3"' СН 72.3

2' СН 7.55 (1Н, д, J = 1.8) 116.4 4"' СН 74.1

3' С 146.9 5"' СН 69.8

4' с 146.5 6"' СНз 1.08 (ЗН, AJ = 6.1) 17.9

5' СН 8.83 (lH,a,J = 8.9) 117.3

6' СН 7.72 (1Н, дд, J = 8.7,1.8) 121.8

Г^?

оно

Рис. 1. Структура ульмариозида

Ульмариозид (33). С27Н30О16. HR-ESI-MS, m/z: 633.594 [M+Na]+ (расч. 633.521). +ESI-MC, m/z: 611 [M+H]+, 465 [(M-Rha)+H]+, 303 [(M-Rha-Glc)+H]+. УФ-спектр, MeOH, X^, нм: 255, 309 пл., 366; + A1C13 263, 350, 419; + AICI3/HCI263, 351, 418; + NaOAc271, 309 пл., 373; + Na0Ac/H3B03 256, 309 пл., 367; + NaOMe 278, 328, 418. ИК-спектр, у,™*, см"1: 1656, 1618, 1599, 1564, 1506, 1369, 1313, 1251, 1202, 1167, 1088, 1045, 1010, 933, 894, 837. Спектр ЯМР 'H (500 Гц, MeOH-df): табл. 1. Спектр ЯМР 13С (125 Гц, МеОН-с/,): табл. 1.

Таким образом, проведенные исследования позволяют определить строение соединения 33, как кверцетин-4'-0-а-рамнопиранозил-(1—>6)-/?-глюкопиранозида (кверцетин-4'-Орутинозид), являющегося новым природным соединением, и названного нами ульмариозид (рис. 1). Для кверцетина известно четыре моногликозида, содержащих углеводный остаток по положению С-4' - 4-О-глюкозид (спиреозид), 4'-<9-галактозид, 4'-0-глюкуронид и 4'-0-(6"-галлоил)-глюкозид, а также два монорутинозида - З-О-рутинозид (рутин) и 7-0-рутинозид (Andersen, Markham, 2006); ульмариозид является пятым из известных 4'-0-моногликозидов и третьим рутинозидом кверцетина.

3.3. Фенольные соединения цветущих побегов восьми видов Filipéndula, произрастающих в России. С применением описанных выше методических подходов были изучены фенольные соединения восьми видов Filipéndula, произрастающих в России. Впервые в F. camtschatica и F. glaberrima обнаружено наличие 9-15,17-19, 21-27, 29, 31, 34-45; в F. angustiloba и F. intermedia - 9-15, 17-19, 21-27, 29, 31, 34-45; в F. denudata - 9-15,17-18, 22, 24, 27, 29, 33-45; в F. palmata - 10-15,17-19, 21-27, 29, 31, 35-45; в F. stepposa-9-15,17-19, 21-27, 29, 31, 33-45; в F. vulgaris -10-15,17, 25, 31, 34-45.

Ранее соединения 19, 21, 23, 25, 26, 31 были выявлены в F. denudata (Lamaison, 1992); 9, 34 - в F. palmata (Jin, 1994); 9,18,19, 21-24, 26, 27, 29 - в F. vulgaris (Bqczek, 1999). Для F. camtschatica, F. glaberrima, F. angustiloba, F. intermedia, F. stepposa химическое изучение проведено впервые.

3.4. Орган-специфичное распределение фенольных соединений в видах рода Filipéndula Mili. Способность морфологических групп растительного организма к различному накоплению метаболитов является общеизвестным фактом. Согласно данным количественного анализа флавоноиды и эллаготаннины являются доминирующими группами, содержание которых в цветках/листьях изученных видов составило 19.11/18.35-74.05/43.15 и 40.01/9.15-207.31/52.13 мг/г, соответственно (табл. 2). Присутствие катехинов и процианидинов отмечено только в листьях (20.31-37.05 и 18.63-103.14 мг/г соответственно).

Флавоноиды рода Filipéndula представлены в основном производными кверцетина и кемпферола, находящихся в растениях преимущественно в гликозидированной форме в виде моногликозидов (табл. 3. 4V 4'-ОГликозиды составляют основную часть флавоноидов цветков большинства изученных видов, за исключением F. palmata, в котором на долю З-О-гликозидов приходится более 80%.

Таблица 2. Групповой состав фенольных соединений морфологических групп F. ulmaria, мг/г__

Группа соединений Цветки Листья Стебли Корни Побеги

Простые фенолы 5.98±0.11 1.86±0.03 сл. 2.33±0.06 5.73±0.10

Флавоноиды 61.5fttl.23" 16.34±0.31б сл. сл. 22.19±0.42в

Катехины сл. 20.9Ш.62 1.04±0.03 119.68±3.71 3.16±0.09

Процианидины сл. 91.8fttl.83 4.32±0.09 204.05±4.48 20.01±0.44

Эллаготаннины 48.50±0.87 сл. сл. сл. 23.43±0.44

Общие фенолы 116.07 131.00 5.36 326.06 74.54

* в пересчете на спиреозид; в пересчете на гиперозид; * в пересчете на эквимолярнуго смесь спиреозид-гиперозид.

Для листьев отмечается обратное явление: концентрация 4-О-гликозидов в них не превышает 3.4 (F. ulmaria) - 36.5% (F. camtschatica) от суммы идентифицированных гликозидов. Доминирование кверцетина и его гликозидов отмечено в пяти видах, кроме F. camtschatica, в котором преобладают дериваты кемпферола (10.02-10.18 мг/г).

Основными флавоноидами цветков являются спиреозид и кемпферол-4-О-гликозид, кроме F. palmata [изокверцитрин, 12.52 мг/г), астрагалин (6.49 мг/г), гиперозид (4.81 мг/г)]. Присутствие ульмариозида было выявлено только в цветках представителей подрода Ulmaria - F. denudata, F. stepposa и F. ulmaria. В листьях наблюдается доминирование рутина (F. denudata, F. ulmaria), астрагалина (F. camtschatica, F. palmata), гиперозида (F. stepposa) или изокверцитрина (F. vulgaris). Состав эллаготаннинов изученных видов является типичным с преобладанием димерных форм над мономерными, причем к основным компонентам данного класса следует отнести ругозин D, содержание которого в цветках может составлять 16.51 (F. camtschatica) - 60.06 мг/г (F. ulmaria), а также ругозины Ei, Ег и теллимаграндин II. Фенилпропаноиды рода Filipéndula характеризуются превалированием 1-Окофеилглюкозы (F. camtschatica, F. denudata, F. palmata) или 3,4-ди-О-кофеилхинной кислоты (F. stepposa, F. ulmaria, F. vulgaris). Наибольшее содержание галловой и 5-0-галлоилхинной кислот отмечено в цветках F. vulgaris (21.05 и 7.18 мг/г, соответственно), эллаговой кислоты — в цветках F. palmata (7.40 мг/г).

Проведенные исследования показали, что для всех изученных видов Filipéndula характерна способность к накоплению фенольных соединений. К числу перспективных заменителей F. ulmaria необходимо отнести представителей подрода Ulmaria - F. denudata и F. stepposa, отличающихся высоким содержанием флавоноидов и эллаготаннинов. Следует отметить, что несмотря на недостаточную изученность химического состава видов Filipéndula, имеющиеся сведения позволяют высказать предположение о том, что в качестве хемотаксономических маркеров рода, помимо ранее предложенного димерного эллаготаннина ругозина D (Okuda, 1992), можно рассматривать мономер теллимаграндин 12, димеры ругозины Ei и Е2, а также флавонол-4'-Огликозиды - спиреозид и кем п ф е р о л-4'- О-гл и коз и д, встречаемость которых в подсемействе Rosoideae, вероятно, приурочена только к роду Filipéndula.

Таблица 3. Содержание фенольных соединений в морфологических группах видов Filipéndula подрода Aceraría, мг/г

Секция Schalameya_Секция Albicoma

Соединение F. camschatica F. glaberrima F. palmata F. angustiloba F. intermedia

Ц Л ц Л Ц Л ц Л ц Л

Галловая кислота (9) 0.45 0.54 0.31 0.63 0.87 0.35 0.63 0.94 1.11 1.24

5-0-Галяоилхинная кислота (17) 1.58 2.38 1.42 3.15 1.52 0.68 1.42 3.16 2.04 2.94

Эллаговая кислота (29) 1.05 3.77 0.95 3.42 7.40 2.46 5.18 1.43 4.19 3.31

Кофейная кислота (14) сл. сл. 0.04 сл. 0.77 сл. сл. сл. сл. сл.

З-О-Кофеилхшшая кислота (11) 0.16 0.20 0.41 сл. 0.50 сл. 0.09 0.12 0.14 сл.

4-О-Кофеилхинная кислота (10) сл. 0.35 сл. сл. сл. - сл. сл. сл. сл.

1-О-Кофеилглюкоза (15) 3.21 2.71 3.57 2.04 3.52 1.14 4.11 1.94 3.18 0.94

1,3-Ди-О-кофеилхшшая кислота (42) - сл. - - - 0.97 - - - -

3,4-Ди-О-кофеилхинная кислота (12) 2.64 6.26 1.94 3.10 2.08 1.49 1.63 4.53 2.06 5.19

3,4,5-Три-О-кофеилхиниая кислота (13) 2.88 сл. 1.53 сл. 3.01 сл. 3.03 0.93 1.63 сл.

(+)-Катехин (43) - 0.11 - 1.04 - 8.88 - 0.90 - 1.93

(-)-Эпикатехин (44) - 0.20 - 3.61 - 8.21 - 0.69 - 1.14

(-)-Эпигаллокатехин (45) - 27.48 - 28.16 - 19.87 - 25.07 - 28.60

Кверцетин (26) сл. сл. сл. - сл. сл. сл. сл. - -

Изокверцигрин (20) 0.27 0.51 5.17 1.49 12.52 1.44 1.18 5.63 0.09 3.50

Гиперозид (19) 0.33 3.08 3.11 3.03 4.81 1.26 сл. 6.39 0.57 5.18

Кверцитрин (22) 0.32 0.50 0.47 1.97 1.77 3.01 сл. 1.18 0.87 2.37

Авикупярин (21) сл. - сл. 0.61 1.15 1.75 сл. сл. - -

Миквслиаиин (31) сл. сл. сл. - 1.40 - 0.83 сл. 0.40 сл.

Рутин (18) 0.83 0.91 0.03 0.10 сл. 0.65 1.17 8.53 1.64 7.54

Спиреозид (23) 7.18 3.59 6.18 0.94 2.34 1.32 20.61 9.03 25.63 11.01

Ульмариозид (33) - - - - - - сл. - сл. -

Кемпферол (27) 0.12 сл. сл. сл. сл. сл. сл. - сл. -

Астрагалин (24) сл. 6.96 4.11 5.10 6.49 5.13 2.63 11.86 1.97 12.48

Кемпферол-4'-0-глюкозид (25) 10.06 3.06 8.27 1.03 3.42 3.79 9.52 3.38 9.94 5.18

Теллимагращдан I, (34) 2.28 0.31 3.31 0.10 5.02 0.88 2.31 1.61 6.84 1.67

Теллимаграидин 12 (35) 3.83 сл. 8.66 сл. 12.54 сл. 3.74 сл. 4.16 сл.

Теллимаграцдин П (36) 5.37 9.11 11.47 9.04 40.79 9.25 25.12 9.54 28.63 10.07

Рутозин В, (37) 1.21 сл. 2.39 сл. 5.68 сл. 3.03 сл. 2.95 сл.

Ругозин В2 (38) 3.35 сл. 2.15 сл. 8.08 сл. 6.19 сл. 5.16 сл.

Рутозин О (39) 16.51 18.82 63.18 9.14 59.64 12.90 39.64 11.84 42.14 12.80

Ругозин Е! (40) 3.26 5.17 9.14 5.16 28.98 6.34 11.69 9.15 24.10 16.27

Ругозин Е2 (41) 4.20 7.16 16.37 11.60 36.89 4.63 10.35 4.08 28.29 10.64

Идентифицированные соединения 71.09 103.18 154.18 94.46 251.19 96.40 154.10 121.93 197.73 144.00

Таблица 4. Содержание фенольных соединений в морфологических группах видов Filipéndula подродов Ulmaria и Eu-Filipendula, мг/г

Подрод Ulmaria _Подрод Eu-Filipendula

Соединение F. denudata F. stepposa F. ulmaria F. vulgaris

ц Л ц Л ц Л ц Л

Галловая кислота (9) 3.29 1.20 1.67 0.56 2.84 0.48 21.05 1.53

5-О-Галлоилхшшая кислота (17) 1.25 2.51 1.06 0.48 1.08 0.68 7.18 0.69

Эллаговая кислота (29) 4.78 3.50 6.07 2.06 6.54 2.98 2.03 1.09

Кофейная кислота (14) 0.81 сл. 1.06 0.63 1.05 0.43 0.92 0.76

3-0-Кофеилхшшая кислота (11) 1.05 2.56 сл. сл. 1.71 0.68 0.56 0.87

4-О-Кофеилхинная кислота (10) 0.61 0.59 сл. 0.44 0.40 0.32 0.80 2.57

1-О-Кофеилглюкоза (15) 3.07 1.60 1.80 2.03 3.44 2.00 1.32 4.76

1,3-Ди-О-кофеилхипная кислота (42) - 1.38 - 1.46 - сл. - 1.80

3,4-Ди-О-кофеилхинная кислота (12) 2.79 1.43 1.97 сл. 3.57 3.10 1.74 2.09

3,4,5-Три-О-кофеилхшшая кислота (13) 1.16 - 1.49 сл. 2.78 сл. сл. 0.96

(+)-Катехин (43) - 8.77 - 12.45 - 3.65 - 3.44

(-)-Эпикатехин (44) - 3.40 - 8.41 - 12.44 - 5.19

(-)-Эпигаллокатехии (45) - 14.57 - 16.19 - 15.46 - 11.68

Кверцетин (26) 1.96 сл. сл. сл. 0.67 сл. сл. сл.

Изокверцитрин (20) 3.52 9.86 0.15 0.82 3.79 14.01 5.43 10.79

Гиперозид (19) 2.19 8.19 6.90 12.15 4.42 5.31 2.87 6.16

Кверцитрин (22) 0.84 1.67 сл. 3.93 0.89 1.59 0.09 0.39

Авикулярин (21) 0.96 1.33 сл. - сл. 1.47 сл. 0.60

Миквелиаиин (31) 0.30 - 3.68 - сл. сл. 1.68 -

Рутин (18) 5.06 10.61 2.41 1.85 6.94 16.21 3.44 0.70

Спиреозид (23) 40.09 1.07 16.87 0.66 49.36 1.23 23.72 сл.

Ульмариозид (33) + - + - + - - -

Кемпферол (27) 0.28 сл. 0.05 сл. 0.12 сл. сл. сл.

Астрагалин (24) сл. 1.99 0.74 1.00 сл. 3.08 сл. сл.

Кемпферол-4'-0-гшокозид (25) 8.19 0.53 13.63 0.52 7.86 0.25 7.37 0.76

Теллимаграндин 11 (34) 7.35 2.57 6.46 1.23 6.32 сл. 4.46 сл.

Теллимаграндин I: (35) 13.55 сл. 13.94 сл. 14.39 сл. 8.03 сл.

Теллимаграндин II (36) 37.85 14.15 38.90 6.71 43.76 9.72 39.15 сл.

Руггаин В[ (37) 5.21 сл. 5.09 сл. 6.62 сл. 4.00 сл.

Ругозин Вг (38) 6.88 сл. 7.27 сл. 8.62 сл. 7.56 сл.

Ругозин О (39) 60.35 22.43 59.28 9.95 60.06 11.87 49.83 7.33

Ругозии Е1 (40) 22.07 8.00 29.73 6.52 27.37 7.47 8.48 сл.

Ругозин Ег(41) 32.54 7.55 40.00 6.28 40.17 4.07 2.45 1.82

Идетифицированные соединения 268.00 125.89 260.22 96.33 304.77 118.50 206.04 65.98

Глава 4. НЕФЕНОЛЬНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ВИДОВ РОДА Filipéndula Mili., ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РОССИИ

4.1. Углеводные компоненты видов Filipéndula. Исследование углеводных компонентов в морфологических группах видов Filipéndula показало, что они распределены в растениях неравномерно. На примере F. ulmaria можно отметить, что наибольшее содержание свободных углеводов и пектиновых веществ характерно для цветков и корней, водорастворимых полисахаридов - для цветков, гемицеллюлоз - для листьев (табл. 51. Данная особенность накопления углеводных групп типична для всех изученных видов Filipéndula.

Таблица 5. Групповой состав углеводов морфологических групп F. ulmaria, мг/г

Группа углеводов Цветки Листья Стебли Корни

Свободные углеводы 67.41 61.37 23.90 66.08

Водорастворимые полисахариды 65.94 47.72 38.14 53.12

Пектиновые вещества 29.15 18.45 5.94 25.81

Гемицеллюлозы 27.69 37.92 21.88 20.24

Суммарное содержание 180.19 185.46 88.86 165.25

Водорастворимые полисахариды (ВРПС) являются в настоящее время наиболее изучаемой группой углеводных полимеров. Данный факт обусловлен тем, что они являются обязательными компонентами комплекса экстрактивных веществ любой растительной ткани, а также обладают различной фармакологической активностью. В связи с этим было проведено сравнительное изучение содержания и качественного состава ВРПС цветков для всех изучаемых видов Filipéndula. ВРПС выделяли традиционным методом, с последующей деминерализацией на катионите, депротеинизацией по Севага и с проназой. Далее выявляли присутствие некоторых типов полисахаридов с применением качественных реакций и определяли моносахаридный состав после гидролиза с ТФУ методом ВЭЖХ (табл. 6).

Таблица 6. Характеристика ВРПС цветков видов Filipéndula

Вид W, % Моносахаридный состав, моль% ПС-тип

Ara Fue Gal Glc Man Rha Xyl UA G1 RG AGP

F. camschatica 3.7 12.8 0.1 14.7 10.3 4.1 4.8 2.4 50.7 + + +

F. glaberrima 3.2 16.3 0.2 14.9 9.4 4.1 4.5 1.9 48.6 + + +

F. palmata 2.8 18.4 0.1 12.2 7.6 3.8 3.3 2.2 52.3 + + +

F. angustiloba 3.7 12.6 сл. 18.4 7.3 1.4 5.9 0.7 53.6 ± + +

F. intermedia 3.9 12.2 сл. 19.4 8.2 0.9 6.3 1.0 51.9 ± + +

F. ulmaria 5.4 8.3 сл. 24.1 1.5 0.2 7.4 0.5 57.9 - + +

F. denudata 6.1 9.4 сл. 22.7 2.8 0.5 5.2 0.9 58.4 - + +

F. stepposa 5.8 9.3 сл. 26.0 3.6 0.4 7.7 0.8 52.1 - + +

F. hexapetala 2.4 2.7 сл. 14.7 22.3 11.3 2.2 12.7 34.0 + + +

Проведенные исследования показали, что, несмотря на близкие значения некоторых показателей, для представителей разных подродов характерен ряд особенностей. Так, для видов подрода Ulmaria отмечается наибольшее

содержание уроновых кислот, рамнозы и галактозы, более того, не выявлено наличие глюканов типа крахмала (отрицательная реакция с йодом). Для секции Schalameya подрода Aceraría напротив характерна выраженная реакция с йодом, а также высокое содержание арабинозы и маннозы. Виды секции Albicoma занимают промежуточное положение между упомянутыми выше подродами. ВРПС F. hexapetala отличаются наибольшим содержанием ксилозы и маннозы, что характерно при наличии водорастворимых ксиланов и маннанов. Согласно данным ИК-спектроскопии доминирующим типом полисахаридов являются полигалактуронаны (рамногалактуронаны), а положительная реакция с реактивом Yariv свидетельствует о присутствии арабино-галактан протеиновых комплексов (AGP), обладающих высокой биологической активностью.

4.2. Эфирные масла цветков видов Filipéndula. Компонентный профиль летучих компонентов, образующих эфирное масло цветков видов Filipéndula, типичен (табл. 7).

Таблица 7. Содержание некоторых соединений в эфирном масле цветков видов Filipéndula, % от суммы компонентов

Aceraría Ulmaria Eu-

Соединение Schalameya Albicoma Filipendula

F. F. F. F. F. F. F. F. F.

camschatica glaberrima palmata angustitoba intermedia áenudata stepposa ulmaria vulgaris

Фенолы

Бензальдегид 0.9 0.9 1.3 1.0 1.1 3.2 2.9 2.3 1.8

Бензиловый спирт 0.5 0.2 0.3 0.3 0.6 3.0 2.2 1.4 0.4

Эгилбензоат 0.3 0.2 сл. 0.6 0.3 0.8 0.9 0.3 0.3

Салициловый альд. 9.0 12.3 11.7 32.7 35.2 45.9 25.7 35.7 52.7

Метилсалицилат 73.9 66.9 65.3 35.4 37.9 20.7 14.2 18.4 1.8

Этилсалицилат 5.2 6.1 9.3 8.2 5.4 2.4 0.3 1.1 0.9

Бензилсалицилат 4.4 4.9 2.9 2.0 1.3 1.2 0.3 6.3 5.2

Ванилин сл. сл. сл. 0.3 0.5 0.3 5.9 0.9 0.3

Монотерпены

Линалоол 0.2 0.2 0.3 0.8 0.9 2.2 5.7 2.3 4.3

а-Тергшнеол 0.3 0.2 0.2 0.7 0.3 1.1 0.9 2.2 0.8

л-Мент-1 - ен-9-ол 0.1 0.1 сл. 0.3 0.5 0.9 0.9 0.3 0.4

Гераниол 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.5 1.3 0.3 0.2

Сесквитерпены

(5-Ионон 0.2 0.3 0.5 0.9 0.6 1.9 2.7 2.3 1.5

а-Азарон 0.1 0.1 сл. 0.3 0.3 0.2 0.3 0.6 3.2

р-Кариофиллен 0.4 0.9 1.1 0.4 0.9 1.5 1.9 1.6 0.6

Кариофиллен оксид сл. сл. сл. сл. 0.3 0.1 сл. сл. сл.

Гумулен 0.2 0.1 0.3 0.5 0.5 1.3 1.1 0.9 0.3

Гермакрен D 0.2 0.1 0.4 0.4 0.7 0.9 1.2 1.2 0.1

Д-Аморфен 0.3 0.5 0.3 0.3 0.1 0.4 0.3 0.4 0.4

Алифатические соединения

Тетрадеканаль сл. 0.1 0.1 0.6 0.3 0.3 0.9 0.4 0.8

Пентадеканаль 0.1 0.3 0.3 1.1 0.9 1.0 2.2 1.9 0.4

Гексадеканаль 2.9 4.1 3.3 1.8 1.2 1.3 6.3 5.2 0.4

Гептадеканаль 0.2 0.5 1.1 4.2 4.9 5.7 9.4 6.9 0.1

Деканаль сл. 0.1 0.1 0.4 0.3 0.9 2.9 1.6 0.9

Додеканаль сл. 0.1 0.1 0.3 0.2 0.2 1.3 0.3 0.5

н-Докозан сл. сл. сл. 0.3 0.2 0.2 0.9 0.3 0.9

«-Трикозаи сл. сл. сл. 0.1 0.1 0.1 1.2 0.2 10.9

«-Тетракозан сл. сл. сл. 0.3 сл. 0.1 0.3 0.7 0.4

н-Пентакозан сл. сл. сл. сл. сл. 0.2 0.9 0.3 0.7

Индентифидировано 99.5 99.3 99.0 94.3 95.6 98.5 95.0 96.3 91.2

Установлено присутствие четырех основных групп органических соединений, в т.ч. фенолы, моно- и сесквитерпены и алифатические соединения. Доминантные компоненты группы фенолов - это метилсалицилат и салициловый альдегид, на долю которых приходится более 50% массы эфирного масла. Суммарное содержание моно- и сесквитерпенов не превышает 20%, а на долю алифатических соединений может приходиться до 30% эфирного масла.

Сравнительный анализ содержания отдельных компонентов в видах, относящихся к различным подродам Filipéndula, показал, что для представителей подрода Aceraría секции Schalameya характерно доминирование метилсалицилата (65.3-73.9%) и гексадеканаля (2.9-4.1%). Виды подрода Ulmaria отличаются относительно высокой концентрацией салицилового альдегида (25.7-45.9%) и гептадеканаля (5.7-9.4%). Представители секции Albicoma занимают промежуточное положение между указанными трибами. Характерным признаком F. vulgaris является значительное содержание салицилового альдегида (52.7%) и н-трикозана (10.9%). Особенно следует отметить факт присутствия ванилина в эфирных маслах F. stepposa (5.9%) и F. ulmaria (0.9%), концентрация которого в родственном виде - F . denudata, значительно ниже (0.3%), что указывает на возможные отличия в биосинтезе внутри подрода Ulmaria.

4.3. Аминокислоты некоторых видов Filipéndula. При изучении аминокислотного состава (ИО-ВЭЖХ-УФ) установлено, что качественный состав аминокислот F. ulmaria и F. hexapetala сходен. Преобладающими компонентами являются глутаминовая и аспарагиновая кислоты.

4.4. Элементный состав некоторых видов Filipéndula. Для некоторых видов Filipéndula было проведено исследование элементного состава и показано, что качественный состав микроэлементов в нативном сырье и водных извлечениях близок.

Глава 5. ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОКОЛОНОЧНОЙ ВЭЖХ-УФ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ И ЭЛЛАГОТАННИНОВ В ВИДАХ РОДА

Filipéndula Mili.

Метод микроколоночной ВЭЖХ является в настоящее время наименее используемым, однако явные преимущества данного метода (экономичность, экспрессность) позволяют определить его в качестве перспективного аналитического инструмента. Для проведения количественного анализа видов Filipéndula были выбраны два класса соединений - флавоноиды и эллаготаннины, обуславливающие наличие биологической активности и составляющие до 10-15% от суммы экстрактивных веществ.

5.1. Анализ флавоноидов. Для анализа флавоноидов методом ВЭЖХ был выбран градиентный режим элюирования при 360 нм. Разработанная методика характеризуется стабильностью, правильностью и селективностью в определении основных компонентов, к которым отнесены спиреозид,

кемпферол^4 '-О-глюкозид и изокверцитрин. Типичные хроматограммы спиртовых извлечений из цветущих побегов К и1тапа приведены на рис. 2.

Рис. 2. Хроматограммы спиртовых извлечений побегов К гЛтаг'т. Образцы', а - Новосибирск, Ь - Бурятия, с -Томск, <1 - Москва. Соединения-. 1 - 4-0-кофеилхинная кислота, 2 - З-О-кофеилхинная кислота, 3 - кофейная кислота, 4 - 3,4-ди-О-кофеилхинная кислота, 5 - рутин, 6 -изокверцитрин, 7 - птерозид, 8 - авикулярин, 9 - миквелианин, 10 - астрагагалин, 11 -кверцитрин, 12 - спиреозид, 13 — кемпферол-4'-О-глюкозид, 14 - 3,4,5-три-О-кофеилхинная кислота, 15 - кверцетин, 16 - апигенин, 17 -кемпферол.

liiiii , -7 а

? , л: b

...........______ с

¡ ........■ A/WL . d

Таблица 8. Валидационная характеристика методики количественного определения содержания спиреозида методом МК-ВЭЖХ-УФ

Параметр

Критерий приемлемости

Определенная величина Требуемая величина _критерия_критерия_

Вывод

Специфичность

Правильность

Повторяемость Межоперационная точность Точность

Recovery = 97.1-104.3% ä= 1.24%

Recovery = 98.3-103.3% <5= 1.14% ÄS» = 1.74%

RSD = 2.01%

Recovery = 95-105% S <3%

Recovery = 97-103% <5<3% RSD <3%

RSD <3%

удовлетворяет

критерию приемлемости

согласно п.п. 3 и 4 - удовлетворяет критерию приемлемости

5.2. Анализ эллаготаннинов. Предварительные исследования по выбору оптимальных условий экстракции эллаготаннинов из побегов К иЫапа показали, что на состав данной группы соединений заметное влияние оказывают тип экстрагента и температура экстракции (рис. ЗА. Б).

А Б

Рис. 3. Хроматограммы извлечений из побегов F. ulmaria. А. Экстрагент - 60% этанол, а -исходный раствор, Ъ - исходный раствор после гидролиза в водной среде. Б. Ультразвуковая экстракция, импульсный режим, 40°С, 20 мин. а - экстрагент - вода, Ъ - экстрагент - ДМСО. Исходный раствор - линия, исходный раствор после гидролиза в водной среде - пунктир. Соединения'. GA - галловая кислота, RuA - ругозин A, RuBl - ругозин Bl, RuB2 - ругозин Bl, RuD - ругозин D, RuEl - ругозин El, RuE2 - ругозин Е2, Til - теллимаграндин I (a-изомер), TI2 -теллимаграндин I ф-изомер), TII - теллимаграндин II.

Так, применение водной экстракции при температуре выше 45 °С приводит к изменению качественного и количественного состава таннинов в сравнении с таковыми для извлечений, полученных в более щадящих условиях.

В экспериментах с чистыми образцами эллаготаннинов было доказано наличие гидролитической деструкции полимерных компонентов до олиго- и мономеров (рис. 4). Установлено, что димерные эллаготаннины ругозины БиЕ претерпевают распад до изомеров теллимаграндина I и ругозинов А и В, соответственно. Дальнейшее влияние воды и температуры приводит к более глубокому распаду ругозинов А и В до дилактона валониевой кислоты и 1,2,3-три-О-галлоилглюкозы и 2,3-ди-Огаллоилглюкозы, соответственно (рис. 5).

Рис. 4. Хроматограммы растворов ругозина D (RuD, линия) и его гидролизата (пунктир). RuA - ругозин A, Til -теллимаграндин I (a-изомер), TI2 -теллимаграндин I (Д-изомер).

Рис. 5. Схема гидролитического распада ругозинов D (RuD) и Е (RuE). DGG - 2,3-ди-О-галлоилглюкоза, RuA - ругозин А, RuB - ругозин В, TI - теллимаграндин I, TGG - 1,2,3-три-О-галлоилглюкоза, VADL

VADL

— дилактон валониевой кислоты. —>

Полученные данные свидетельствуют о том, что мономерные эллаготаннины (RuA и RuB), а также галлоилированные производные глюкозы и дилактон валониевой кислоты могут рассматриваться в качестве артефактных при обнаружении их в сырье или лекарственных формах из представителей рода Filipéndula. Более того, высокие концентрации данных компонентов могут являться критериями

несоблюдения условий хранения для сырья и готовых лекарственных средств (высокая влажность и повышенная температура) (рис. 6Ь).

Оптимальными условиями экстракции эллаготаннинов были выбраны следующие: экстрагент -ДМСО, соотношение

сырье :экстрагент 1:10, тип экстракции - ультразвуковая, импульсный режим, длительность

- 20 мин. Условия

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Рис 6. а. Хроматограмма ДМСО-излечения из побегов К и1тапа при 260 нм. Ь. Хроматограмма сухого экстракта побегов К и1тапа, хранившегося в условиях повышенной влажности.

хроматографического анализа: микроколоночный жидкостной хроматограф Милихром А-02 (Эконова); колонка Рго1йо81Ь-120-5-С18 АР (2 х 75 мм, 0 5 мкм; Ме^оЬш АО); подвижная фаза: 0.2 М 1лСЮ4 в 0.003 М НСЮ4 (А), МеСЫ (В); градиентный режим (% В): линейный градиент 0-20 мин 5-100%; V 200 мкл/мин; температура колонки 35°С; А, 260 нм. Типичная хроматограмма извлечения, полученного в оптимальных условиях, приведена на рис. 6а.

Валидационные исследования показали, что разработанные методики соответствует критериям приемлемости (табл. 8. 9).

Таблица 9. Валидационные параметры анализируемых фенодьных соединений_

Соединение

iiufttuaicJib GA ТГ TII RuB" RuD RuE"

аг 52.297 30.397 30.91 30.41 29.93 29.19

Ьг -337.716 -233.199 -176.12 -196.64 -167.15 -215.79

Линейность (г2) 0.9997 0.9994 0.9997 0.9996 0.9995 0.9996

Syx 354.52 397.93 223.31 206.25 230.052 224.86

LOD, мкг/мл 3.46 5.63 4.18 3.46 4.54 3.44

LOQ, мкг/мл 10.50 17.06 12.68 10.49 13.76 10.42

Диапазон, мкг/мл 12-1000 20-1200 15-1200 12-1000 15-1200 12-1000

Воспроизводимость", % 1.37 1.48 1.52 1.39 1.64 1.73

Правильность:

день-в-денье, % 1.52 1.44 1.64 1.30 1.75 1.94

день-через-денье, % 2.08 1.92 2.03 1.63 2.12 2.27

Точность е, % 99.92 101.97 100.27 101.64 100.93 98.25

а определено для a-изомера теллимаграндина I; определено для ругозина В2;fl определено для ругозина Е2;г коэффициенты в уравнении регрессии Y — а • Х+ Ь, где А"— концентрация, мкг/мл, Y— площадь пика, mAU; д п ~ 6;'п = 5.

Глава 6. РАЗРАБОТКА ФСП «ЛАБАЗНИКА ВЯЗОЛИСТНОГО ПОБЕГИ

ЦВЕТУЩИЕ»

Проведенные исследования показали, что использование цветков в качестве лекарственного сырья (ВФС 42-1777-87) не позволяет рационально использовать ресурсный потенциал природных ценопопуляций F. ulmaria. В этой связи нами предложен новый вид растительного сырья — "Лабазника вязолистного побеги цветущие".

6.1. Динамика изменения химического состава побегов Filipéndula ulmaria в течение вегетационного периода. В процессе развития побегов F. ulmaria химический профиль претерпевает значительные изменения (табл. 10). Наибольшее содержание групп соединений (общие фенолы, эфирное масло, полисахариды) характерно для фазы цветения. Рассматривая особенности накопления отдельных групп фенольных соединений можно заметить, что для катехинов и процианидинов характерно наличие двух периодов накопления в фазы начала цветения и плодоношения. Снижение концентраций указанных групп соединений в побегах F. ulmaria обусловлено тем, что в период цветения сырье представляет собой смесь листьев и цветков; содержание последних может составлять до 40-50% от массы сырья. Для морфологической группы цветки не характерно накопление катехинов и процианидинов, в связи с чем наблюдается уменьшение их концентрации. Исследование динамики изменения

химического состава листьев в течение вегетационного периода показало, что фаза массового цветения является периодом максимального содержания катехинов и процианидинов.

Таблица 10. Химический состав побегов К и1тапа в течение вегетационного периода, мг/г

Группа _Фаза вегетации_

соединений начало бутони- начало массовое плодоно-

зация

цветения

цветение

отмирание

Флавоноиды

Катехины

Процианидины

Эллаготаннины

Общие фенолы

Эфирное масло

Полисахариды

12.97 5.63 16.36 сл. 34.96 0.05 23.08

9.31

12.93

29.68

4.37

51.92

0.09

35.19

11.07 14.11 33.17 14.24 72.59 0.14 39.14

24.21 6.29 21.63 28.57 80.70 0.21 53.62

15.07 8.37 31.53 9.34 64.31 0.14 54.18

8.50 7.53 30.61 сл. 46.64

сл. 53.11

Характер накопления индивидуальных соединений повторяет таковой для групп соединений (рис. 7).

30 п 25 20 -15 10 -5 0

Л

□ Салициловый

альдегид ■ Метилсалицилат

ш

I

Ц III IV

VI

А Б

Рис. 7. Динамика изменения содержания некоторых фенольных соединений (А) и компонентов эфирного масла (Б) в побегах F. ulmaria в течение вегетационного периода. По оси абсцисс - фаза вегетации: I - начало вегетации, II - бутонизация, III - начало цветения, IV -массовое цветение, V - плодоношение, VI - отмирание. По оси ординат - содержание, мг/г (А), %

(Б).

6.2. Показатели ФСП «Лабазника вязолистного побеги цветущие». В

ходе товароведческого анализа были установлены основные показатели качества, включающие внешнее описание, подлинность (ГХ/МС, ВЭТСХ), потеря массы при высушивании, зола общая и сульфатная, органическая и минеральная примесь, количественное определение спиреозида (ВЭЖХ) и суммарного содержания эллаготаннинов (ВЭЖХ) и микробиологическая чистота (табл. 11).

Сравнительное фармакологическое исследование настоек из побегов F. stepposa и F . denudata, подтвердило правомерность использования двух последних видов в качестве заменителей фармакопейного сырья - F. ulmaria.

Таблица 11. Спецификация к ФСП "Лабазника вязолистного побеги цветущие"

Показатели Методы Нормы

Описание, внешние признаки Визуальн., органолепт. В соответствии с ФСП

Подлинность: - метилсалицилат и салициловый альдегид; - флавоноиды. ГХ/МС ВЭТСХ Площадь пиков на хроматограмме должна быть не менее 15% для салицилового альдегида и не менее 8% для метилсалицилата.

На хроматограмме должно быть не менее трех зон с желтой флуоресценцией, совпадающих по подвижности с PCO изокверцитрина, кверцитрина и спиреозида. Допускается присутствие дополнительной зоны выше спиреозида (кемпферол-4'-<Э-глюкозид).

Потеря в массе при высушивании Гравиметр ич. Не более 10%

Зола общая Гравиметрич. Не более 5%

Сульфатная зола Гравиметр ич. Не более 0.5%

Тяжелые металлы ГФХП Не более 0.01%

Органическая примесь ГФХП Не более 1%

Минеральная примесь ГФХП Не более 0.5%

Листья побуревшие и почерневшие Гравиметрич. Не более 7%

Количественное определение: - спиреозид; - сумма эллаготаннинов. ВЭЖХ ВЭЖХ Не менее 1.5% Не менее 5%

Микробиол. чистота ГФХП Категория ЗБ

Маркировка В соответствии с ФСП

Хранение В защищенном от света месте при 12-15°С

Срок годности 3 года

ВЫВОДЫ

1. Проведено расширенное химическое изучение девяти представителей рода Filipéndula Mili., произрастающих на территории России, в т.ч. F. palmata, F. ulmaria, F. denudata, F. vulgaris, а также впервые — F. camtschatica, F. glaberrima, F. angustiloba, F. intermedia и F. stepposa. Выделено 49 соединений, в т.ч. 22 впервые для рода. Установлено строение нового флавоноида -ульмариозида, представляющего собой кверцетин-4'-0-рутинозид. Дана характеристика водорастворимым полисахаридам и эфирным маслам из цветков изученных видов. Установлено, что доминирующими группами углеводных полимеров являются полигалактуронаны (рамногалактуронаны) и арабиногалактаны. Выявлено, что к числу основных компонентов комплекса эфирных масел рода Filipéndula Mili, относятся фенолы (салициловый альдегид, метилсалицилат) и алифатические альдегиды (гекса-, гептадеканаль). Показана ведущая роль некоторых флавоноидов и эллаготаннинов, а также простых фенолов эфирного масла в формировании хемосистематической структуры рода. Установлена перспективность дальнейшего практического применения близкородственных к F. ulmaria видов — F. denudata и F. stepposa.

2. Распределение фенольных соединений в морфологических группах рода Filipéndula Mili, обладает орган-специфической направленностью. Показана способность к накоплению флавоноидов и эллаготаннинов в цветках, а катехинов и процианидинов - в листьях для всех изученных видов.

3. Динамика накопления всех изученных групп соединений (фенолы, полисахариды, эфирные масла) в F. ulmaria обладает сходными особенностями и характеризуется наличием фазы максимального содержания в период массового цветения.

4. Впервые разработаны методики количественного анализа флавоноидов и эллаготаннинов в видах Filipéndula с применением микроколоночной ВЭЖХ-УФ. Разработанные методики отличаются от предложенных ранее экспрессностью, экономичностью, правильностью и точностью определения искомых соединений. Выявлена способность эллаготаннинов Filipéndula к гидролитической деградации, и установлена их индикаторная роль как маркеров качества сырья.

5. Определены показатели качества нового растительного сырья -"Лабазника вязолистного побеги цветущие", и разработан проект ФСП на него.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кудряшова (Кругло па). М.Ю. Лабазник вязолистный — перспективное лекарственное растение / М.Ю. Кудряшова // Авиценна-2006: мат-лы ежегодн. конкурс-конф. студ. и молод, учен. - Новосибирск, 2006. - С. 486.

2. Кудряшова (Круглова). М.Ю. Лабазник вязолистный - перспективное лекарственное растение флоры Сибири / М.Ю. Кудряшова // Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ: мат-лы XI международн. экологич. конф. — Новосибирск, 2006. - С. 142.

3. Кудряшова (Круглова). М.Ю. Сравнительное фармакогностическое исследование двух видов лабазника / М.Ю. Кудряшова // Авиценна-2007: мат-лы ежегодн. конкурс-конф. студ. и молод, учен. - Новосибирск, 2007. - С. 460.

4. Ханина, М.А. Перспективные лекарственные растения Флоры Сибири / М.А. Ханина, М.Г. Ханина, Р.И. Валов, М.Ю. Кудряшова (Круглова) // «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений»: мат-лы II Международн. научн. конф. - Алматы, 2007. - С. 214.

5. Кудряшова (Круглова"). М.Ю. Сравнительный фармакогностический анализ Filipéndula ulmaria и Filipéndula palmata / М.Ю. Кудряшова // Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ: мат-лы XII международн. экологич. конф. - Новосибирск, 2007. - С. 170.

6. Кудряшова (Круглова). М.Ю. Количественные показатели фенольного комплекса Filipéndula ulmaria (L.) Maxim. / М.Ю. Кудряшова // Авиценна-2008: мат-лы ежегодн. конкурс-конф. студ. и молод, учен. - Новосибирск, 2008. - С. 387.

7. Круглова. М.Ю. Исследование эфирного масла из надземной части Filipéndula ulmaria (L.) Maxim. / М.Ю. Круглова, М.А. Ханина, Д.Л. Макарова, Д.В. Домрачев // Медицина и образование в Сибири. - 2011. - № 5. - С. 13.

8. Круглова. М.Ю. Полисахаридный и аминокислотный состав наиболее распространенных видов лабазника / М.Ю. Круглова, Д.С. Круглов, М.А. Ханина, Н.С. Фурса // Медицина и образование в Сибири. - 2011. - № 5. - С. 14.

9. Круглов, Д.С. Исследование элементного состава распространённых видов лабазника флоры Сибири / Д.С. Круглов, М.Ю. Круглова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. -Пятигорск, 2012. - Вып. 67. - С. 54 - 56.

10. Круглова. М.Ю. Анализ фенольного комплекса двух видов лабазника / М.Ю. Круглова, Д.С. Круглов, Н.С. Фурса // Фармация. - 2012. - № 7. - С. 21 -23.

11. Круглов Д.С., Круглова М.Ю. Элементный состав надземной части лабазника вязолистного и суммарного извлечения из него / Д.С. Круглов, М.Ю. Круглова // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: мат-лы V Всеросс. конф. - Барнаул, 2012. - С. 335 - 337.

12. Kruglova. M.Yu. Phytochemical research of Filipéndula ulmaria and Filipéndula hexapetala / M.Yu. Kruglova, D.S. Kruglov, N.S. Fursa // Обзоры no клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2012. - Т. 10. - № 2.-С. 72.

13. Круглов, Д.С. Сравнительное микроморфологическое исследование листьев лабазника вязолистного и обыкновенного / Д.С. Круглов, М.Ю. Круглова. М.А. Ханина, Е.О. Кокорева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. научн. тр. — Пятигорск, 2013. — Вып. 68. - С. 60 - 62.

14. Kruglov, D.S. Trace element structure of widespread Filipéndula genus plants / D.S. Kruglov, M.Yu. Kruglova // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2013. - Т.11. - С. 57.

15. Kruglova. M.Yu. New flavonoid glucoside and other component from Filipéndula genus plants / M.Yu. Kruglova, D.N. Olennikov, D.S. Kruglov // Planta Medica. - 2013. - Vol. 79.-Nol3.-P.2116-2117.

16. Olennikov, D.N. New quercetin glucoside and other phenolic compounds from Filipéndula genus / D.N. Olennikov, M.Yu. Kruglova // Chemistry of Natural Compounds. - 2013. - Vol. 49. - No 4. - P. 524 - 529.

Список сокращений и аббревиатур: AGP - арабин-галактан протеиновые комплексы, Gl -глюкан, RG - рамногалакгуронан, ВРПС - водорастворимые полисахариды, ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография, ГФ - Государственная фармакопея, ГХ/МС — газовая хроматография/масс-спектрометрия, ДМСО - диметилсульфоксид, ДЭАЭ — целлюлоза — диэтиламиноэтилцеллюлоза, ИК - инфракрасный, КХ - колоночная хроматография, НСО -Новосибирская область, окр. - окрестности, пос. - поселок, респ. - республика, р-н - район, PCO - рабочий стандартный образец, ТСХ - тонкослойная хроматография, ТФУ -трифторуксусная кислота, УФ - ультрафиолетовый, ФСП - фармакопейная статья предприятия, ЯМР — ядерный магнитный резонанс.

Круглова Мария Юрьевна

Фитохимическое исследование видов рода Filipéndula Mili. (Rosaceae), произрастающих в России

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидат фармацевтических наук Специальность: 14.04.02-фармацевтическаяхимия, фармакогнозия

Подписано в печать 23.12.2013 г. Формат 60x84 7i6. Тираж 100 экз. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0 Бумага офсетная. Печать офсетная.