Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Синтез и фармакология композиций на основе пектиновых веществ

На правах рукописи Халикова Муатар Джурабоевна

СИНТЕЗ И ФАРМАКОЛОГИЯ КОМПОЗИЦИЙ НА ОСНОВЕ ПЕКТИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ

14.00.25 -фармакология, клиническая фармакология

2 2 ОПТ ет

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Душанбе-2009 г.

003480974

Работа выполнена в лабораториях «Фармакология» и «Химия высокомолекулярных соединений» Института химии им. В.И. Никитина Академии наук Республики Таджикистан

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, академик Академии наук РТ, профессор Хайдаров Карим Хайдарович доктор химических наук, Мухидинов Зайнидин Камарович

доктор медицинских наук Азонов Джахон

доктор медицинских наук, профессор Рахмонов Эркин Р&химович

Таджикский Государственный Медицинский Университет им. Абуали ибн Сино, кафедра фармакологии

Защита состоится: «10» ноября 2009 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета КМ 047.003.01 при Институте химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан по адресу: 734063 Республика Таджикистан г. Душанбе, ул. Айни, 299/2. E-mail: rif52@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химии им В.И. Никитина АН Республики Таджикистан.

Автореферат разослан «08» октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Рахимов И.Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Перспективы развития фармацевтической технологии определяются требованиями современной фармакотерапии, которые предполагают создание максимально эффективных с лечебной точки зрения лекарственных препаратов при содержании в них минимума лекарственных субстанций, не обладающих побочными действиями. Особую значимость в медицинской практике имеют лекарственные субстанции, полученные из растительного сырья, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с синтетическими веществами. Составление композиций комбинированных препаратов — один из путей поиска новых лекарств. В последнее время при выборе основного компонента значительное внимание оказывают биополимерам, в частности, пектиновым веществам (ПВ), благодаря их способности образовывать гель в присутствии ионов металла.

ПВ, являясь природным катионитом и одновременно компонентом пищи, обладают водоудерживающей способностью, и могут быть использованы самостоятельно при лечении желудочно-кишечных заболеваний, осложненных нарушением всасывания, дисбактериозом, запорами. С другой стороны ПВ, благодаря наличию отрицательно заряженных карбоксильных групп проявляют способность к связыванию положительно заряженных ионов металлов. Это позволяет с одной стороны использовать ПВ для выведения из организма ионов тяжелых и токсических элементов, а с другой - в качестве депо для доставки в организм различных ионов, в частности ионов кальция и цинка. Использование последнего обусловлено тем, что его роль пока мало изучена. Вместе с тем, именно аномалии в поведении ионов цинка в клетках являются первопричинами многих опаснейших заболеваний. Следует отметить также, что ПВ благодаря полифункциональности мономерных звеньев, способствующих межмолекулярному взаимодействию посредством водородных и гидрофобных связей, являются уникальным объектом при комплексо-образовании с органическими молекулами и биополимерами. Указанные свойства дают возможность включить ПВ в качестве незаменимых компонентов при изготовлении носителей лекарственных препаратов (ЛП), микрокапсул (МК) и систем для доставки лекарственных средств (СДЛ). В связи с этим постановка исследования по изучению механизма комплексообразова-ния ПВ с ионами металлов и белками, выявление физико-химических и биологических параметров, представляет собой актуальную научную задачу.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является изучение комплексообразуюшей способности ПВ различного происхождения с ионами металлов и белками, использование полученных композиций для создания носителей JIB, а также выявление биологической активности полученных систем.

В связи с поставленной целью задачами настоящего исследования были:

• изучение закономерности сорбции ионов кальция и цинка ПВ из раствора, механизма гелеобразования и расчет термодинамических параметров процесса;

• изучение механизма формирования тройной металло-пектино-белковой композиции и использование полученных результатов при создании носителей ЛВ, МК и СДЛ;

• изучение токсичности и общего характера фармакологического действия ПВ и композиции на их основе на лабораторных животных и в условиях клиники.

Работа проводилась в соответствии с планом НИР Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан «Поиск и создание новых полимерных материалов и биологически активных веществ на базе продуктов синтетического и растительного сырья» (ГР ЖН06ТД414) и «Синтез, выделение и исследование стериохимии и фармакологических свойств производных ацетилена, тиадолидинтионов, тиадиазолопиримидинов, а также природных растительных масел, являющихся перспективными для создания новых лекарственных средств» (ГР №0106ТД413). Научная новизна работы:

• Впервые установлено, что, несмотря на близкие свойства ионов кальция и цинка, механизм их взаимодействия с ПВ существенно отличается. Если в случаи ионов кальция ход процесса сорбции определяет его кооперативностью, то в системе с ионами цинка носит случайный характер, что имеет решающее значение при гелеобразовании и формирование МК;

• Впервые изучено воздействие ПВ и его комплексов с ионами цинка (гпПВ), зеинами и Р-лактоглобулинами молочной сыворотки (Р^) при внутрижелудочном введении на обшее состояние и поведенческую реакцию животных. Определены параметры острой токсичности гпПВ. Выявлено, что ПВ и их композиции являются практически нетоксичными соединениями и не оказывают воздействия на общее состояние животных;

» разработаны способы получения ЛВ в форме МК и СДЛ с использованием ПВ, зеина и Р-Ь§, изучена их биодоступность, позволившая получить длительный терапевтический эффект при однократном применении ЛС;

» показано, что ПВ усиливают желчевыделительную функцию печени, активно вмешиваются в химизм желчи, повышают синтез суммы желчных кислот (СХК), фосфолипидов, уменьшают образование холестерина и билирубина в составе желчи;

» экспериментально и клинически выявлено, что ПВ обладают способностью оказывать выраженное бактерицидное действие на возбудителей острых кишечных инфекций. ПВ в сочетании с антибиотиком ускоряет лечение кишечных инфекции, что является результатом их токсин -связывающего действия на кишечную микрофлору.

Практическая значимость работы. Гидрогели на основе комплекса пектина с ионами кальция совместно с витамином О, могут быть использованы в качестве депо ионов кальция при лечении остеопороза. Полученные в

настоящей работе физико-химические закономерности могут быть использованы при формировании различных видов пектинсодержащих носителей ЛВ, эмульсии, микро- и наносфер, СДЛ, которые могут найти применение в практической медицине. ПВ могут быть использованы при лечении острой кишечной инфекции и для усиления желчевыделительной функции печени.

Публикации. По теме диссертации имеется 20 публикации, из них 10 статей в реферируемых научных журналах и 10 материалов конференций.

Апробация работы. Основные результаты докладывались и обсуждались на научно-практической конференции с международным участием «Семейная медицина и здоровье человека», (Душанбе, 2005г.), научно-практической конференции «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» с международным участием (Душанбе, 2006г.), Международной научно-практической конференции «Современная химическая наука и ее прикладные аспекты» (Душанбе, 2006г.), 4-ой Конференции молодых ученых с международным участием. «Современные проблемы науки о полимерах», посвященной 60-летию Института высокомолекулярных соединений РАН. (Санкт-Петербург, 2008г.), Международной Конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение». (Ташкент, 2008г) и VI Нумановских чтениях. (Душанбе, 2009г.), «Полисахариды - источник современных материалов» (Финляндия -Турку, 2009).

Объем и структура работы. Диссертация представляет собой рукопись объемом 131 страницы, состоит из введения и 3 глав, посвященных обзору литературы, экспериментальной части, результатам исследований и их обсуждению, выводов. Иллюстрирована 17 рисунками, 12 таблицами. Список использованной литературы включает 142 наименования.

Во введении обосновывается актуальность темы, изложены цель и научная новизна диссертации, практическая ценность и ее структура.

В литературном обзоре (глава 1) изложены основные особенности процесса получения полимерных гидрогелей на основе пектиновых веществ, закономерности их комплексообразования с ионами металлов. Обсуждаются лечебные действия пищевых волокон при различных заболеваниях, раскрывается их роль в физиологии толстой кишки. Представлено современное состояние разработки носителей лекарственных средств на основе пектиновых веществ и их гепатопротекторное действие.

В экспериментальной части (глава 2) приведены химическая и физико-химическая характеристика объектов исследования, характеристика реагентов и рабочих растворов, количественные методы анализа функциональных групп и содержания ионов кальция в пектиновых веществах, методики выделения зеинов из растительного материала, Р-'лактоглобулина из молочной сыворотки и методики фармакологического исследования.

В главе 3 «Результаты и их обсуждение», приводятся экспериментальные данные, полученные автором, в соответствии с целью и задачами исследований и дана интерпретация полученных результатов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методики исследования

1. Пектиновые вещества. В табл. 1. приводятся основные характеристики использованных в работе ПВ.

Таблица 1.

Содержание остатков галактуроновой к-ты (ГК) в ПВ, степень этери-

фнкации (СЭ) и ММ (Mw) ПВ

Наименование пектинов ГК, % СЭ, % Mw, KD

Абрикосовый (Согдийская область) 67,2 52,87 718,0

Айвовый 67,20 57,14 98,00

Яблочный ВМ ( НМ-АМ, сорт Грофенштейнское красное, Муминабад) 68,00 52,00 134

Яблочный ( LM-AS, сорт Семеренка, Шахринав) 58,30 40,3 18,7

Корзинки подсолнечника 67,0 43,37 142,4

Цитрусовый НМ (LM-31, GENU 12CG-CP Kelco) 69,0 31,0 308,0

Цитрусовый НМ (LM-9, GENU L/200-CP Kelco) 69,6 9,0 466,0

Персиковый ВМ 66,0 94,6 65,0

2. Зеины получены из обезжиренной муки кукурузы, последовательной экстракцией 75% этанолом, дважды при комнатной температуре и третья при 60°С в таком же промежутке времени. Выход зеина при этом составляет более 3% (50% от общего содержания белков). Выделенные таким способом белки хорошо растворялись в 90% этаноле и не содержали примесей липидов и крахмала.

3. Выделение ß-Lg из MC. Инактивируют ферменты творожной MC (72°С 15 сек), охлаждают (5°С), центрифугируют (20 мин, 5000 об/мин) для удаления казеина. Деминерализацию и концентрирование MC проводят ультрафильтрацией на мембранах 0,2 мкм (р=1,4атм) и УАМ (0,175мкм). ß-лактоглобулин выделяют ионообменной хроматографией амберлитом ИРА-400 элюированием 1М раствором NaCI (v = 6 мл/мин), чистоту контролируют на гель-электрофорезе.

4. Лекарственные вещества. В качестве модельного лекарства использовали нестероидный противовоспалительный препарат пироксикам (РХ), фламин, преднизолон, метронидазол и тетрациклин. Определение РХ, связанного в комплексы проводилось по специальной методике, используя калибровочный график, построенный по стандартному РХ на спектрофотометре UV-1 Thermo Spectronic (UK) при 355 нм. Профиль распределения популяции микрокапсул измеряли на аппарате фирмы Inc. Santa Barbara, Калифорния, США.

5. Фармакологические эксперименты проводили на белых мышах, белых крысах, кроликах и кошках.

2. Комплексообразование ионов кальция и цинка с ПВ и формирование микрокапсул на их основе

В последнее время процессы комплексообразования различных лиган-дов, в особенности биополимеров с металлами, привлекают внимание многочисленных исследователей не только в целях получения новых данных о способах синтеза и свойствах металлокомплексов, но и в связи с поиском путей получения новых эффективных биологически активных веществ. Установлено, что комплексообразование лигандов с металлами повышает их терапевтическую активность, снижает токсичность, придает новые специфические свойства, обусловленные синергизмом действия металла и комплексообразо-вателя. В целях расширения числа биогенных металлов, включаемых в процессы комплексообразования, нами изучено взаимодействие пектиновых полисахаридов с ионами кальция и цинка. Ионы этих металлов выполняют различные жизненно важные функции в живых организмах, что явилось основой для получения новых биологически активных соединений в ряду пектиновых биополимеров при образовании комплексов с данными металлами.

2.1. Комплексы ионов кальция с ПВ. В работе были использованы ПВ выделенные из корзинки подсолнечника. Сорбция ионов кальция и цинка проводилась в статических условиях. Предварительно была изучена кинетика сорбции и установлена продолжительность процесса достижения условия равновесия. Равновесные концентрации ионов кальция и цинка устанавлива-

2

1,6 "

£ 1.2 У*

% */ \

0,8 У \

0,4 - X

0 0,01 0,02 0,03 0,04 Ср(СаС12), мэкв/мл

ис.1. Изотерма сорбции ионов кальция ПВ одсолнечника

солнечника при концентрации последнего в растворе 2 мг/мл. На рис. 1 видно, что изотерма сорбции ионов кальция ПВ имеет экстремальный характер. В то же время выход комплекса ПВ и ионов Са" с ростом концентрации последнего в растворе имеет тенденцию к насыщению (рис.2.). Следует отметить, что образование комплекса приводит к выделению ПВ из реакционной среды в виде набухшего гидрогеля, в расчете на сухой комплекс ПВ и ионов Са++ (рис.2).

ли путем титрования трилоном Б. Для контроля первоначального содержания ионов металлов проЕюдилось также титрование исходных растворов хлорида кальция и сульфата цинка трилоном Б. Количество сор-бированых ионов определяли по разности исходных и равновесных ионов металла в растворе. Сорбция проводилась при нескольких концентрациях ПВ. На рис.1 приводится изотерма сорбции ионов кальция пектиновыми веществами под-

При этом, с ростом равновесной концентрации ионов кальция, происходит практически полное выделение ПВ в новой фазе (рис.3), достигая практически 100% величины от исходного значения. В этом случае ионы кальция играют роль осадителя ПВ из раствора. Как видно из рис. 4 в области максимума ионы кальция высаживаются в виде комплекса около 15 %.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что ге-леобразующая способность пектиновых веществ в условиях проведенных экспериментов зависит, прежде всего, от наличия ионов кальция в растворе. При добавлении ионов кальция в раствор ПВ происходит постепенное связывание ионов участками полисахарида, содержащими последовательные поли-галактуроновые остатки, При этом селективность связывания ионов кальция ПВ возрастает с увеличением длины полигалактуроната, и, скорее всего, носит кооперативный характер. Свидетельством этого является выпадение в виде набухшего геля образовавшихся комплексов ПВ с ионами Са~+, количество которых возрастает с ростом равновесной концентрации СаСЬ. На рис. 4 показан экстремальный характер изотермы сорбции и экстремальный характер выделения ионов кальция пектиновыми веществами из раствора. При этом по аналогии с цепной димеризацией полнуронатов, можно предположить, что при соединении первого иона кальция, конформация соседних звеньев пектиновых макромолекул принимает такую форму, при которой вдоль полимерных цепей образуются пустоты, размером в точности совпадающих с диаметром ионов кальция. Это в свою очередь, приводит к последовательному и быстрому связыванию ионов кальция, вплоть до выпадения образующего комплекса в виде набухшего геля. Взаимодействие ионов кальция с сегментами ПВ приводит к внедрению ионов кальция подобно яйцам, занимающим ячейки в яичной коробке. Такой механизм связывания ионов кальция кислыми полисахаридами, названный моделью «яичной коробки», широко используется в литературе при описании селективных и кооперативных взаимодействий

Ср(СаСУ, мэкв/мл

Рис.2 Выход комплекса ПВ и ионов кальция в зависимости от разновесной концентрации СаСЬ

0,01 0,02 0,03 Ср(СаС12), мэкв/мл

0,04

Рис.3 Выделение ПВ в зависимости от равновесной концентрации СаСЬ

анионных полисахаридов с ионами металлов. Ионы кальция не просто механически внедряются в пустоты, а химически взаимодействуют посредством ионных и координационных связей с остатками анионных полисахаридов, что непосредственно вытекает из данных спектров кругового дихроизма, равновесного диализа и ионного обмена. Поэтому многие авторы при описании механизма гелеобразова-ния предпочитают интерпретировать экспериментальные данные на основании модели «яичной коробки», когда были использованы в качестве анионного полисахарида низкометилированный пектин, олигосаха-риды апьгинатов и полигалактуронаты пектинов. Такое межмолекулярное связывание ионов кальция с полигалактуроновой кислотой было подтверждено Кона, Лукнара, Раваната и Ринаудо.

Таким образом, в концентрированных растворах поведение ПВ в основном определяется интенсивностью межмолекулярных взаимодействий, которые стабилизируются ионами кальция. Структурообразование пектинов зависит от регулярности распределения свободных карбоксильных групп и молекулярной массы полимера. При соответствии конформационного состояния полимерных цепей в ди- и полимолекулярных агрегатах ионы металлов способствуют образованию прочных гелей, что имеет важное практическое значение, в частности, для концентрирования растворов пектина посредством ионов кальция и в последующем получении высокоочищенных ПВ.

2.2. Комплексы ионов цинка с ПВ. Целью данной части работы является изучение комплексообразующей способности пектина подсолнечника с ионами пинка, выявление вклада различных функциональных групп мономерного звена и макромолекул в целом в протекании данного процесса. Сорбция ионов цинка ПВ проводилась в условиях аналогичных сорбции ионов кальция. Для сорбции ионов цинка ПВ были использованы следующие параметры реакции: Со(ПВ) = 3,8 мг/мл; Со(2пБ04) = 0,05 мэкв/мл; Со(трБ) = 0,05 мэкв/мл; Уо(ПВ) = 10 мл, Уобщ = 15мл. Экспериментальные данные по сорбции ионов цинка ПВ подсолнечника при различных равновесных концентрациях 2п504 в растворе показали, что не-смотря на одинаковые заряды ионов кальция и цинка, отличия в размерах ионов приводят к существенному изменению сорбционных процессов в сис-теме ПВ и ионов Zn++, по сравнению с системой, где включен ион Са-н-.

0,01 0,02 0,03 Ср(СаС12), мэкв/мл

0,04

Рис.4 Выделение ионов кальция в зависимости от равновесной концентрации СаС12

£ 30

Рис.5. Изотерма сорбции ионов цинка ПВ подсолнечника

0,00 0,02 0,04 0,06 Ср(2п304), мэкв/мл

Рис.7 Выделение микрогеля в зависимости ог равновесном концентрации 7.п504

0,00 0,02 0,04 0,06 о,00 0,02 0,04 0,06 I

СрСгпБСМ), мзкв/мл Ср(2п504), мэкв/мп

Рис.6 Выход комплекса ПВ и ионов цинка в зависимости от равновесной концентрации ZnS04

Экспериментальные данные по сорбции ионов цинка ПВ подсолнечника при различных равновесных концентрациях 2пБ04 в растворе показали, что несмотря на одинаковые заряды ионов кальция и цинка, отличия в размерах ионов приводят к существенному изменению сорбцион-ных процессов в системе ПВ и ионов 7л*, по сравнению с системой, где включен ион Са+\ Для системы с ионом Ъп* изотерма сорбции не является экстремальной (рис.5). При возрастании концентрации ионов Ип++, достигают предельное значение выходы комплекса (рис.6) и микрогеля (рис. 7), хотя абсолютное количество последнего меньше, чем в случае ионов кальция.

При прочих равных условиях связывание ионов цинка в виде комплекса с ПВ меньше по сравнению с ионами кальция при одинаковой их равновесной концентрации в растворе (рис. 8). Следует отметить также, что в первом случае процесс сорбции не носит экстремальный характер, а происходит насыщение макромолекул пектина ионами цинка даже при очень высоких концентрациях этих ионов в растворе.

Таким образов, закономерность сорбции ионов цинка ПВ

0,00

0,02

0,04

0,06

Ср^пБОД мэкв/мл

Рис.8 Выделение ионов цинка в зависимости от равновесной концентрации

существенно отличается от процесса связывания ионов кальция. Если в последнем случае ход процесса определяется его кооперативностью, то в первом он носит случайный характер.

2.3. Микрокапсулы па основе низкометилированного пектина. В последнее время при создании носителей для направленной доставки J1C значительное внимание оказывают природным полимерам, в частности низко-метилированным (НМ) пектинам, благодаря их полианионной природе, биосовместимости и способности образовывать гель в присутствии ионов металлов. Однако эти системы проявляют ряд недостатков, связанных с низкой молекулярной массой, полимолекулярностью и гетерогенностью их структуры, что является следствием использования разнообразных источников растительного сырья и методами их получения. Для более эффективной доставки лекарственных средств в органы мишени и уменьшения их побочного действия в последние годы приобрела широкую популярность организация соответствующих систем в виде микро- и нанокапсул.

Целью настоящей части работы является сравнительное изучение яблочного и цитрусового НМ пектиноп в качестве.носителей при микрокапсулиро-вании. В качестве ЛВ был использован преднизолон.

Эмульсионную систему изготавливали на основе растительного масла, анионного ПАВ - лаурисульфата натрия (JICNa) и нейтрального - Span-80 в присутствии НМ пектина. Каждая система характеризуется содержанием масла, ПАВ, содержанием и типом пектина. В данной работе микрокапсулы были получены методом последовательной реакции отрицательно заряженных пектиновых цепей с ионами кальция и анионного ПАВ на поверхности масляных микрочастиц и методом эмульсионного гелеобразования НМП с кальцием в масле. Первоначально были получены эмульсии масла в воде, содержащие анионное ПАВ и ионы кальция, путем гомогенизации смеси. Во второй стадии при прибавлении анионного полисахарида - НМП формировалась полимерная пленка на поверхности эмульгированных частиц масла. Движущей силой процесса адсорбции полисахарида на поверхности эмульсии служило электростатистическое взаимодействие свободных карбоксильных групп пектина с ионами кальция, связанными с головной частью ПАВ.

Микрокапсулы достаточно хорошо получаются из разбавленного раствора пектина с наименьшим содержанием ПАВ (0.01-0.07%). Найдено, что критическая концентрация пектина в системе масло/вода равняется 0,15%, в масле- 0,70, а в системе вода/масло 0,15 и 45%, соответственно; выше этих точек вязкость эмульсии увеличивалась и привела к образованию геля.

Результаты представленные в данной работе, описывают влияние типа пектина и ПАВ на основные характеристики микрокапсул. Эти характеристики: размер частиц, их распределение и эффективность захвата JIB. Полученные микрокапсулы имели узкий профиль распределения по частицам. Минимальный средний диаметр частиц 1,65 мкм достигался для капсул, полученных эмульсионным способом масло в воде, с использованием реакции НМ яблочного пектина с ионами кальция и лаурилсульфата натрия. В тоже время наибольшее количество частиц (25198300 в мл) было получено с ис-

пользованием НМ цитрусового пектина способом эмульсионного гелеобра-зования пектина в присутствии нейтрального ПАВ - Span-80.

Причем удельная поверхность частиц и эффективность захвата ЛВ были максимштьными в случае с использованием НМЛ в качестве полимера. На физико-химические свойства микрокапсул в основном влияют тип НМ-пектина и способ их получения. Уменьшение количества анионного ПАВ привело к увеличению диаметра частиц и к резкому уменьшению количества захваченного ЛВ, что, видимо, связано с образованием слабо сшитой полимерной пленки на поверхности масляных частиц и диффузией ЛВ через ее большие поры. При этом происходит коагуляция частиц из-за избытка заряда полимерной цепи посредством ионов кальция, что уменьшает удельную поверхность и стабильность микрокапсул.

Таким образом, результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что НМ-пектины при соответствующих условиях способны формировать полимерную матрицу вокруг масляных микрочастиц в эмульсии масло/вода или образовывать микрогели в эмульсии вода в масле, эффективно захватывающие ЛВ.

3. Фармакологические свойства композиций на основе пектиновых веществ

В настоящее время все более актуальным становится поиск, разработка и внедрение менее токсичных и более эффективных способов доставки ЛВ в кишечник с использованием носителей на основе природного происхождения. Внедрение таких систем на практике требует фармакологических исследований в опытах на животных.

Нами изучена биологическая активность комплексов ПВ с цинком, зеи-ном и Р-лактоглобулином, как потенциальными компонентами формирующих трехмерную сетку и основ для носителей ЛВ в кишечное пространству. Для этой цели проводили исследования воздействия испытуемых комплексов на общее состояние и поведенческие реакции животных, а также проведено определение их острой токсичности.

3.1. Общее действие :< острая токсичность комплекса цинка ПВ (ZnllB) и белками.

Опыты были поставлены на беспородных белых мышах-самцах массой 18,0-20,0 г, распределены по группам по принципу парных аналогов, содержались в идентичных условиях кормления. В каждой серии опытов было сформировано 6 групп животных по 6 особей в группе.

Комплекс цинка с Г1В (ZnnB) вводили однократно в дозах 100; 300; 500; 700; 900; 1100 и 1300 мг /кг массы тела. ИпПВ в виде суспензии набухшего гидрогеля в изотоническом растворе натрия хлорида (0,89%), вводили мышам внутрижелудочно специальным металлическим зондом.

Среднелетальную дозу - LD50 - определяли аналитическим способом по методу Кербера, величины LD)6 и LD84 находили графически на основании пробитов и доз в мл/кг массы тела животных, показатель ошибки средней дозы эффекта - SLD50 - аналитически и графически.

Полученные данные позволили определить параметры острой токсичности ZnnB. Так для белых мышей МПД ZnnB составляет 100 мг/кг , LD]6 -ЗООмг/кг, LDso-700 мг/кг, LDg4 - 1100 мг/кг, LDioo-1300 мг/кг.

Аналогичные исследования были проведены также и для комплексов ПВ с зеинами и Р-лактоглобулинами молочной сыворогки, которые показали практически отсутствие токсического действия в доза); равной до 500мг/кг.

Следует также отметить, что согласно данным литературы (Выштака-люк и соавторы, 2002) для ZnnB найден довольно сильный иммуномодули-рующий эффект, проявляющийся в повышении фагоцитарной активности нейтрофилов.

Таким образом, практически отсутствие токсического действия изученных объектов, дает основание о возможности применения ионов цинка в качестве сшивающего агента ПВ, а исследованные белки для формирования оболочек носителей Л В в виде микро- и нанокапсул и систем для доставки лекарственных средств в кишечное пространство. В этом аспекте ион кальция по сравнению с ионом цинка является менее перспективным в связи с кооперативиостью механизма связывания его с ПВ, приводящий к высокой скорости выведения ПВ из сферы реакции.

Изучение влияния композиций ZníIB на нервную систему показало, что как ПВ, так и ZnnB в испытанных дозах на поведение и двигательную активность взятых в эксперимент животных, а также на температуру тела не оказывали влияния, так как поведение и двигательная активность опытных крыс ничем не отличалась от таковой картины контрольной группы.

Изучение влияния ZnnB на сердечно-сосудистую систему и дыхание показало, что введение ZnnB в дозах (25-50-100 мг/кг) не оказывало влияние на артериальное давление, дыхание и биоэлектрическую проводимость сердца экспериментальных животных, что иллюстрировано данными соответствующих кимограмм.

Исследование миотропнои спазмолитической активности ПВ. Учитывая, что все изученные композиции ПВ не обладают водорастворимостью, в экпериментах были использованы ПВ, выделенные из корзинки подсолнечника. Интактных животных декапитировали, из тонкого кишечника готовили отрезки длиной 2-2,5 см, которые прикрепляли к стеклянному крючку в аппарате для изолированных органов. Исследуемые вещества вводили в питательный раствор (ВаСЬ) в возрастающих концентрациях (1*10 7, 1*10^, 1*10' 5, 1*10'4 г/мл). Активность препаратов оценивали по их способности изменять тонус и амплитуду маятникообразных спонтанных сокращений отрезков кишки. Нами было выявлено, что все исследуемые вещества не оказывали влияния на спонтанную ритмику сокращений изолированного отрезка кишки (гладкую мускулатуру кишечника), то есть не обладали миотропной активностью, что иллюстрировано соответствующей килограммом.

Исследование мочегонного действия показало, что ZnnB не обладает влиянием на диурез, так как в испытанных дозах не оказывал существенного влияния на объём выделяемой мочи наркотизированных кошек.

Антимикробная активность. В ходе проведённых исследований было установлено, что ZnllB проявляют бактериостатическую активность в отношении стафиллококков, стрептококков, диплококков, тетракокков, палочек сине-зелёного гноя, кишечной палочки, дизентерийных микробов Зонне и Флекснера, протея, сарцин.

Желчегонное действие и хроническая токсичность ПВ. Для количественной оценки действия изученных композиций в сравнении с дегидрохо-левой кислотой, находили дозы, увеличивающие желчеотделение у животных на 50%. С этой целью, ПВ и дегидрохолевую кислоту, вводили животным в нескольких дозах - ПВ (10, 20, 30, 50 мг/кг), дегидрохолевую кислоту (1, 3, 5, 10 мг/кг), которые могли действовать на желчеотделение в границах от 16 до 84%, увеличивая его по сравнению с исходной величиной. Отдельно по результатам каждого опыта строили график, отражающий зависимость между логарифмами доз и величинами их эффектов, выраженными в % от исходной. Из графика находили ЭД50, вычислили среднюю арифметическую и её стандартную ошибку для изучаемого ПВ и дегидрохолевой кислоты, применявшейся для сравнения. Эффективная доза для ПВ вводимого кошкам получилась равной ЭД50 = 20 ± 0,5 мг/кг, в то время как для дегидрохе-левой кислоты она составила ЭД50 = 10,8 ± 0,2 мг/кг массы тела животных

Изучением влияние ZnllB на картину периферической крови1 было установлено, что ZnnB в испытанных дозах не оказывал существенного влияния как на картину красной, так и белой крови.

Патоморфологическне исследования животных. По окончании 78-дневного срока у крыс, получавших ZnnB в дозе 25 и 50 мг/кг массы, производили определение массы внутренних органов, макроскопическое и морфологическое изучение этих органов (слюнных желез, головного мозга, тимуса, лёгких, селезёнки, надпочечников, почек, печени, желудка, лимфоузлов).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что патологических изменений во внутренних органах и местно-раздражающего действия ZnnB при внутрижелудочном введении ZnnB в испытанных дозах 25-50 мг/кг не выявлено.

Таким образом, проведенные эксперименты выявили, что ПВ и композиции на их основе, являются практически нетоксичными соединениями и не оказывают воздействие на поведение, двигательную активность, терморегуляцию, сердечно-сосудистую систему, гладкую мускулатуру, диурез и нервно-мышечную проводимость.

3.2. Фармакологическое изучение носителей JIB на основе пектин-протеиновых гелей и микрокапсул в опытах in vivo на белых крысах.

Инкапсулирование лекарственных средств (ЛС) открывает возможность создания ЛП пролонгированного действия со сниженной токсичностью и аплергенностью. По данным эпидемиологических исследований ВОЗ, побочные эффекты лекарственной терапии в структуре смертности достигают до 17 и 25-30% всех побочных эффектов, обусловленных

' Гематологическое исследование проводилось в ящурном институте под рук-вом д м н. Аноятбекова М.

антибиотиками. Следовательно, контролируемая форма введения ЛС, особенно антибактериальных препаратов, по сравнению с обычной формой, дает возможность усиливать эффективность ЛС, уменьшает их токсичность и хорошо воспринимается больными, поскольку их применение не вызывает трудностей. В последние годы полисахариды и белки привлекают внимание ученых в плане создания биосовместимых систем доставки ЛС (СДЛ), стойких к действию ферментов верхнего отдела желудочно-кишечного тракта и преимущественно разрушающихся в кишечном пространстве. Пектиновые вещества относятся к одному из перспективных материалов для создания СДЛ. Способность низкометилированного (НМ) пектина образовывать гель в присутствии ионов металлов явилось основой при создании СДЛ в виде микросфер, микрокапсул и композиций. Высокометилированные (ВМ) пектины, образующие растворимые комплексы со многими белками, являются потенциальной полимерной системой для инкапсулирования ЛВ в эмульсионной среде и могут найти широкое применение в создании инъекционных и аэрозольных форм ЛВ.

Цель данного исследования - разработка способа определения дозы введения имобилизированного модельного лекарства - пироксикама, и оценка кинетики всасывания лекарства в желудке и кишечнике.

Для исследований использовали пектины, выделенные из следующих источников: цитрусовые низкометилированные (НМ) ЬМ-31 и ЬМ-9; высо-кометилированный (ВМ) яблочный НМ-АМ, НМ и низкомолекулярный яблочный (ЬМ-АБ). Зеин выделяли из обезжиренной муки кукурузы. В качестве модельного лекарства использовали нестероидный противовоспалительный препарат пирокслкам (РХ).

Зеин-пектиновые (3/П) микросферы формировались двумя способами: а) путём добавления раствора пектина (12 мл) к 75% спиртовому раствору зеина (15 мл), содержащему РХ и СаС12 (из расчета 30 мг Са2+ на 1 г пектина) при комнатной температуре при перемешивании; б) путем прикапывания раствора пектина (12 мл), содержащего РХ в 3 мл 75% спирта к 13 мл смеси 75% спиртового раствора зеина и солей двухвалентных металлов (СаСЬ, ZпS04), причем РХ и сшивающие металлы брали вдвое больше. Концентрация зеина варьировалась от 50 до 1000 мг, пектина от 200 до 350 мг, РХ ог 20 и 50 мг, во всех экспериментах, за исключением комплекса с соотношением 3/Т] 1.4:1, где РХ брали в избытке. Полученные комплексы промывали водой, 50 об.% этанолом, с целью удаления несвязанных компонентов и высушивали при 25-30°С до постоянной массы.

Для определения РХ, связанного в комплексы, к 15 мг сухого материала добавляли 10 мл 75 об.% этанола, содержащего 0,4 вес.% ЫаОН, 0,5 вес.% Твин-20 и термостатировали при 37°С в течение 18 ч. Общее содержание РХ в супернатанте после центрифугирования определяли по калибровочному графику, построенному по стандартному РХ на спектрофотометре и\М ТЬеппо Зреагогпс (Ь'К) при 355 нм.

В эксперимент были взяты лабораторные крысы-самцы линии Вистар с изначальной массой тела в 60-61 г. Адаптацию к пектин/зеиновым гелям и

микрокапсулам на эмульсионной основе животные проходили в течение 78 дней. Животные содержались в обменных клетках, без ограничения потребления корма и воды, практически с ежедневным взвешиванием, кроме трехдневного обменного периода, и с учетом съеденного корма. В дальнейшем из адаптированных крыс для исследования были выбраны животные с массой 180-200 г.

РХ, инкапсулированный в пектин/зеиновые гели и микрокапсулы на основе яблочного и цитрусового пектинов, вводили крысам несколькими способами: однократно, в/ж, то есть через зонд в желудок, и в виде корма. Разовые дозы РХ в эмульсии микрокапсул составляли 3.74-4.25 мг/кг, а в гелях 15.6-70 мг/кг.

По первому методу животные были разделены на 3 группы по 6 крыс в каждой. Крысы находились в индивидуальных обменных клетках. Первая группа служила контролем и получала ежедневный лабораторный рацион. Вторая содержалась на лабораторном рационе 1.5 мл эмульсии подсолнечного пектина и лактоглобулина на 100 г сухого корма, что обеспечивало среднесуточное поступление РХ 3.74 мг/кг. Третья группа получала лабораторный рацион + 1,5 мл эмульсии яблочного пектина и лактоглобулина на 100 г корма, что обеспечивало среднесуточное поступление в организм животного 4,25 мг/кг массы тела.

По второму способу животные (две группы rio 6 крыс) получали пектин/зеиновые гели как корм, при этом 65% от исходного геля было съедено, что составляет 15,6 и 70,0 мг/кг веса.

Через 6 и 24 ч. после введения и кормления у крыс брали образцы крови из хвостовой вены, затем их забивали эвтаназией в камере с двуокисью углерода. Желудок и кишечник отпрепаровывали и инкубировали в 50 мл хлороформа при 37°С в течение 60 мин. Раствор фильтровали через стеклянный фильтр, остаток ткани декантировали хлороформом, затем все растворы объединяли и измеряли оптическую плотность при 355 нм. Плазму крови (3 мл) отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при 10°С. К 2 мл полученной плазмы добавляли 5 мл этилового спирта, белки, выпавшие в осадок, отделяли центрифугированием. Концентрацию РХ в су-пернатанте (в сыворотке крови) определяли спектрофотометрически при 335 нм.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента. За достоверное принимали различие, вероятность которого составляла не менее 95% (р < 0.05). Динамика распределения активной формы РХ в кишечнике и в крови крыс после однократного введения различной формы СДЛ приведена в табл.2. Как видно из полученных результатов, РХ хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта. После приема препарата peros в форме эмульсии с дозой ЛВ 4,25 мг максимальная концентрация в плазме крови (в среднем - 68,0 мг/л) достигается через 6 ч. Через сутки его концентрация снизилась до 51,0. Количество РХ в тонком кишечнике было больше, чем в толстом кишечнике, что свидетельствует о том, что почти 30% РХ высвобождается в тонком кишечнике. После приема внутрь вса-

сывается 98% принятой дозы в кровь. После однократного приема РХ в другой эмульсионной СДЛ при дозе почти одинаковой (3,74 мг) его максимальная концентрация в плазме уменьшалась в 2 раза, пропорционально принятой дозе за 6 и 24 часа. Однако количество высвободившегося РХ в тонком и толстом кишечнике было значительно выше, чем количество РХ в первом случае. Это указывает на медленную скорость высвобождения РХ из микрокапсул на основе яблочного пектина.

Таблица 2.

Динамика распределения пироксикама в кишечнике и в крови крыс после од___ нократного введения различной формы СДЛ._______

№№ Форма СДЛ Доза РХ в тон- РХ в тол- РХ в РХ в

экспери- вве- ком ки- стом ки- крови крови

ментов денно- шечнике, шечнике, через 6 через

го РХ, мкг/кг мкг/кг часов. 24 ча-

мг/кг мг/л са, мг/л

1 Эмульсия (подсолнечный пек-тин/р-1^) 4,25 0,5 0,15 68,0 51,0

2 Эмульсия (яблочный псктин/р-Ьс) 3,74 97,5 22,5 34,0 24,3

з Микросферы (цитрусовый пектин/зеин) 70,00 442,5 0,25 95,0 42,8

4 Микросферы (яблочный пектин/зеин) 15,60 412,5 250,0 78,0 56,7

Форма доставки РХ в виде микросфер на основе цитрусового и яблочного пектинов с зеином, хотя и в большей дозе, также показала высокую биодоступность РХ. В данном случае микросферы, полученные на основе пектинов яблок, высвободили ЛВ раньше, чем микросферы на основе цитрусовых. Количество выделенного РХ в тонком кишечнике было таким же, как и с цитрусовым, но с меньшим количеством инкапсулированного РХ. Количество ЛВ в толстом кишечнике также было больше, чем в случае микросфер из цитрусового пектина.

Абсолютная биодоступность РХ в форме эмульсии после приема внутрь почти полная (86-89%) и не зависит от дозы: при приеме РХ в форме СДЛ на основе микрокапсул полученных из подсолнечного пектина составляет 98%, при приеме микрокапсул на основе яблочного пектина - 86%. биодоступность РХ при применении микросфер также была высокой, однако уступала по дозировке и скорости высвобождения ЛВ.

Таким образом, ЛВ, инкапсулированные в СДЛ в форме эмульсии в минимальной дозе 3-4 мг и в форме гидрогелевых микросфер-15-70 мг, представляют собой разновидность формы доставки ЛВ в кишечник. Данный

скрининг показал высокую биодоступность ЛВ в форме эмульсии и микросфер с использованием биополимеров пектина, зеина и лактоглобулина молочной сыворотки, которые позволяют: получить длительный терапевтический эффект при однократном применении ЛС; избежать колебаний концентрации ЛВ в крови, вызывающих нежелательные побочные явления, и снизить токсичность ЛВ по сравнению с обычной лекарственной формой.

3.3. Влияние пектиновых вешеств на химизм желчи2.

Известно, что пищевые волокна из разных источников растительного сырья применяются для регулирования метаболизма липидов. Они, адсорбируя желчные кислоты, способствуют их выделению через фекалии. Другая концепция заключается в том, что пищевые волокна, подвергаясь ферментации в толстой кишке, нормализируют химизм желчи в результате увеличения объема кишечной массы, изменения pH, окислительно-востановительного потенциала и улучшения кишечной моторики.

Целью настоящей работы является исследование желчегонной активности ПВ на фистулированных желчных протоках крыс.

В своих исследованиях определяли скорость секретируемой желчи (в мг/ мин на 100 г массы крыс в течение 1-3 ч) после однократного и многократного (в течение 14 сут) внутрижелудочного введения пектинов в дозах 20 мг/кг массы. О влиянии пектинов на химизм желчи судили по характеру их действия на обмен холестерина, билирубина, фосфолипидов и суммы желчных кислот (СЖК), а также по концентрации холевой кислоты (ХК). Фисту-лирование желчного протока производилось под барбамиловым наркозом, введенным внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг массы и повторно по 40 мг/кг массы через каждые 70-80 мин после начала операции. В опыте находилось 9 партий крыс, преимущественно самцов, весом 190-230 г. Первой контрольной партии за час до фистулирования желчного протока внутрижелудочно вводился физраствор из расчета 2 мг/кг массы 1 раз в сутки в течение 2 недель. Животные последующих серий подвергались фистулированию желчного протока через 18-19 ч после последнего введения испытуемой дозы. Крысам пятой партии, для сравнения, однократно, а девятой партии многократно вводили известный желчегонный препарат фламин.

Полученные результаты (табл.3.) показывают, что при однократном внутрижелудочном введении абрикосового пектина секреция желчи, по сравнению с контролем, возросла на 33%, а при введении айвового пектина - на 20%. Наиболее активным оказался персиковый пектин - при однократном его введении секреция желчи возросла на 80%, что на 50% выше, чем при введении фламина. При многократном введении персикового пектина секреция желчи, по сравнению с контролем, возросла на 48%, а айвового пектина -на 60%. Больший эффект наблюдался у абрикосового пектина при многократном его введении. При этом секреция желчи по сравнению с контролем возросла на 80%, что на 30% выше, чем при введении фламина. Кроме того,

' Исследование воздействия пектина на химизм желчи проводилось в институте гастрознрологии АН РТ пол р> ководстьом профессора Нурадиева Ю Н.

установлено активное влияние испытуемых пектинов на химизм желчи у подопытных крыс.

Как видно (табл.3.) при однократном введении пектинов в большей степени, чем при введении фламина, уменьшается концентрация билирубина и возрастает концентрация фосфолипидов и СЖК. В то же время концентрация холевой кислоты при введении фламина или абрикосового пектина была низкой, а при введении персикового или айвового - высокой. Концентрация холестерина при введении персикового, айвового пектинов или фламина практически не изменялась, а при введении абрикосового пектина уменьшилась на 30%.

При многократном введении персикового или айвового пектинов концентрация билирубина снижается в большей степени, чем при введении фламина, концентрация фосфолипидов и СЖК при многократном введении абрикосового или персикового пектинов возрастает в большей степени, чем при введении фламина. При сравнении природы ПВ, наиболее показательным является холано-холестериновый коэффициент ХХК = С(СЖК)/С(холест), которые принимает наибольшее значение как при однократном, так и многократном введение в случаи персикового пектина (Табл.3.).

Таким образом, данное исследование показывает, что ПВ, выделенные из персика, абрикоса или айвы по разному усиливают желчевыделительную функцию печени. Все они активно вмешиваются в химизм желчи, повышают синтез СЖК, фосфолипидов, уменьшают образование холестерина и билирубина в составе желчи. Данное исследование подтверждает различное влияние пектиновых веществ разного происхождения.

3.4. Фармакологическое воздействие ПВ при острых кишечных инфекциях в комбинации с антибиотиками3 Целью настоящей части работы является фармакологическое изучение влияния ПВ на флору кишечника.

Используя стандартную методику были установлены диагнозы больных бактериологическим и бактерископическим обнаружением патогенных микроорганизмов, включая Shigella, Salmonella, Echerishia coli, Entamoeba histolytica в кале. Температура тела, частота стула, присутствие муцина и крови в кале наблюдалось каждые четыре часа. Больные считались выздоровевшими при достижении нормальной температуры тела, нормализацией частоты стула, отсутствием крови и муцина. Растворы НМ ПВ были приготовлены в соответствии с инструкцией утвержденной Министерством Здравоохранения Республики Таджикистан. С целью обнаружения эффекта ПВ при лечении острых кишечных инфекций было проведено два эксперимента, в двух сравнительных группах.

Первый эксперимент. Тридцать два больных в возрасте от 18 до 41 года с кишечным амебиазом были разделены на две группы. Больные первой группы получали метронидазол по 500мг 4 раза в день и 200мл сахарного

Действие ПВ при острых кишечных инфекциях проводилось на кафедре инфекционной болезни ТГМУ им. Абуали ибн Сино под руководством профессора Камардинова X К

раствора (контроль). Больные второй группы получали метронидазол по 500мг и 200мл 1 % водного раствора пектина три раза в день перед едой.

Таблица 3.7.

Влияние однократного и многократного введения фруктовых пектинов на химизм желчи у _белых крыс___

Серия опытов и дозы Холестерин, 1 Билирубин, мг% | мг% Фосфолипиды, мг% Сумма желчных кислот, мг% Холевая к-та, мг% ххк

Однократное введение

Физ. раствор, 2 мл\кг массы 78± 1.3 9.0+ 0.6 7.8±1.3 1961±2.2 278.0±2.2 25

Персиковый пектин, 20 мг/кг 77.0+0.2 Р<0.05 5.0 ±0.6 Р<0.05 13.8+3.1 Р<0.01 3306±1.8 Р<0.001 416.0+1. Р<0.01 43

Абрикосовый пектин, 20 мг/кг 57.0+0.3 Р<0.05 5.1 ±0.6 Р<0.1 16.5±0.2 Р<0.05 - 235.0+22.0 Р>0.05 -

Айвовый пектин. 20 мг/кг 90.0+1.2 Р<0.05 5.0+0.7 Р<0.1 15.3+1.4 Р<0.05 1630+0.2 Р<0.05 320.0±2.4 Р<0.05 18

Фламин, 20 мг\кг 76. 0 ±2. 8 6.1+_0.1 12.1 +2.0 1596±10.0 291,0_+10.0 21

Многократное введение

Персиковый пектин, 20 мг/кг, 2 недели 60.0± 1.5 Р<0.05 6.4± 0.4 Р<0.05 16.2+ 1.7 Р<0.01 20.60± 1! Р<0 01 260.2± 7.2 Р<0.5 34

Абрикосовый пектин, 20 мг/кг, 2 недели.. 75.0+0.5 Р<001 8.0± 0.9 Р<0.05 14.8+2.5 Р<0.01 1862± 6.9 Р<0.05 335.0± 11 Р<0.5 25

Айвовый пектин, 20 мг/кг, 2 педели 71.0+0.4 Р< 0.1 6.5 ±0.4 Р< 0.05 12.6 ± 0.5 Р<0.01 151 1 + 1.6 Р< 0.05 274.0 ±3.9 Р< 0.5 21

Фламин, 20 мг/кг, 2 недели 75.0±0.6 6.9±1.1 13.4±|,1 1941 + 19.0 287.0±10 26

Р - показатель достоверности результатов по отношению к контролю

Второй эксперимент. Сорок больных с диагнозом дизентерия, в возрасте от 16 лет были подразделены на 2 группы. Больные в первой группе получали тетрациклин по 200мг четыре раза в день и 200мл сахарного раствора как контрольный. Больные второй группы получали тетрациклин по 200мг и 200мл водного раствора ПВ три раза в день. Между больными первой и второй группы не было большой возрастной разницы, а также не было и разницы в продолжительности пребывания их в больнице (8 дней). Несмотря на то, что 25% больных в первой группе и 75% во второй группе, в случае кишечного амебиаза, имели конституциональные симптомы (в тече-

ние 3-4 дней), они были оставлены для последующего наблюдения. Диагноз пациентов с кишечным амебиазом был определен бактериоскопией энтеро-патогенного Entamoeba histolytica. В случае с дизентерией диагноз 18 больным был поставлен в результате обнаружения Shigella flexneri в кале, а у остальных клинически. Хотя у больных и снизилась температура, но у них наблюдалось болезненное состояние, боли внизу живота, учащение стула, выделение кала со слизью и кровью. Возникли также своеобразные болевые ощущения- тенезмы (тянущие боли в области прямой кишки, отдающие в крестец, во время дефекации и в течение 5-15 мин после). В обоих случаях непрерывность диареи наблюдалась от 2-го до 7-го дня. Частота стула наблюдалась 10-15 раз в день у 6 больных, 15-20 раз - у 10 больных, 20-25 раз и более - у остальных. По результатам лечения больных кишечным амебиазом установление, что в первой группе нормализация частоты стула была отмечена у 2 больных на 2-3 день, у других 4 больных - на 2-4 день лечения. Общая нормализация стула у всех наблюдаемых больных произошла на 6-7 день лечения. У больных же второй группы при назначении пектина нормализация стула, у трех больных происходила уже на 1-2 день; у восьми- на 1-3 день, а у остальных - на 3-5 день лечения. В тоже время восстановление других симптомов наблюдалось на 1-2 дня раньше нормализации частоты стула. Необходимо отметить, что у шести больных рвота прекратилась в первый же день приема пектина, а остальные больные перестали жаловаться на рвоту на третий день.

Аналогичная картина наблюдалась и во втором эксперименте в случае с Shigella flexneri (обычным возбудителем эпидемии дизентерии и гастроэнтерита у детей). У больных значительно повышалась температура тела. В последующие дни в фекалиях наблюдалась примесь слизи и крови, что отличалось от больных, страдающих Entamoeba histolytica инфекцией. В этой ситуации температура повышалась (более 40 °С) в результате интоксикации организма. Выявлено, что лечение острой дизентерии антибиотиком в сочетании с ПВ способствует нормализации температуры тела и других симптомов за сравнительно более короткое время. Добавление ПВ значительно сокращает продолжительность заболевания и в случае с кишечным амебиазом, и с острой дизентерией. Кроме того, учитывая пролонгирующее действие ПВ, больным, как в первом, так и во втором эксперименте, антибиотики были назначены на одну дозу меньше. Несмотря на уменьшение дозы антибиотика, эффективность лечения не изменилось. По данным исследования использование ПВ в лечении больных, страдающих от Entamoeba histolytica и Shigella flexneri инфекций, значительно ускорило их выздоровление.

Экспериментальные исследования показали, что ПВ обладает способностью оказывать выраженное бактерицидное действие на возбудителей острых кишечных инфекций. Установлено, что шигеллы, сальмонеллы, возбудители холеры, протей, клебсиелла, синегнойная палочка, цитробактер и др. погибают в пектиновой среде в течение 3-5 часов. При этом отрицательного действия на представителей нормальной микрофлоры кишечника не выявлено. Более высокая устойчивость к пектину отмечена у граммположительных

микроорганизмов по сравнению с грамм- отрицательными. Пектин быстро купирует токсический и диарейный синдромы. Снижение интенсивности токсического синдрома обусловлено тем, что галактуроновая кислота и продукты её обратимой диссоциации, оказывают бактерицидное действие на микробную клетку. Введение пектина в лекарственные формы снижает токсичность амидопирина, повышает биодоступность и растворимость кверци-тина, бутадиона и амидопирина в 2 - 3 раза, улучшает их высвобождаемость из лекарственных форм. ПВ, попадая в желудочно-кишечный тракт, образует гели, увеличивается в объеме. За счет увеличения массы содержимого толстой кишки и укорочения времени кишечного транзита, продвигаясь по кишечнику пектины, захватывают токсичные вещества, тем самым, уменьшая опасность контактирования слизистой оболочки с токсинами.

Таким образом, сравнительное исследование лечения больных с диагнозом острой кишечной инфекции антибиотиками и ПВ в сочетании с антибиотиком, свидетельствует о преимуществе последнего метода, который ускоряет процесс лечение, что является очевидным результатом токсинсвязы-вающей, иммуностимулирующей и других полезных действий ПВ на кишечную микрофлору.

Выводы

1. Получены новые композиции на основе ПВ, выделенных из различных источников растительного сырья, в форме комплексов с ионами металлов и белков, формированных в виде нано- и микрокапсул и являющихся эффективными системами для доставки лекарственных средств в кишечное пространство. Изучены их фармакологические свойства в опытах на животных и в условиях клиники.

2. Проведено сравнительное изучение изотермы и кинетики сорбции ионов кальция и цинка ПВ подсолнечника при различных его концентрациях и содержании ионов металлов в растворе. Показан экстремальный характер изотермы сорбции ионов кальция ПВ и отсутствие такого эффекта в случае ионов цинка. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что если в случае ионов кальция ход процесса определяется его кооперативностью, то в системе с ионами цинка он носит случайный характер.

3. Проведено сравнительное изучение яблочного и цитрусового низкоме-тилированных ПВ, с использованием ионов кальция, анионного (лау-рисульфата натрия) и нейтрального (Span-80) ПАВ в реакции эмульсионного гелеобразования в системах вода-масло и масло-вода. Найдены оптимальные соотношения компонентов для получения микрокапсул с определенным размером частиц, их распределением и эффективностью захвата лекарственных веществ. При этом удельная поверхность частиц и эффективность захвата JIB были максимальными в случае использования НМ яблочного пектина в качестве носителя.

4. Изучено воздействие ПВ и его комплексов с ионами цинка, зеинами и Р-лактоглобулкнами при внутрижелудочном введении на общее состояние и поведенческую реакцию животных, определены параметры

острой токсичности гпПВ. Проведенные эксперименты выявили, что ПВ и композиции на их основе являются практически нетоксичными соединениями и не оказывают воздействия на поведение, двигательную активность, терморегуляцию, сердечно-сосудистую систему, гладкую мускулатуру, диурез и нервно-мышечную проводимость.

5. Практически отсутствие токсического действия изученных объектов, дает основание на возможность применения ионов цинка в качестве сшивающего агента, а исследованные белки для формирования оболочек носителей ЛВ в виде микро- и нанокапсул и систем доставки ЛС в кишечное пространство. Разработаны ЛВ инкапсулированные в СДЛ в форме эмульсий и гидрогелевых микросфер с использованием пирок-сикама и изучена их биодоступность, позволяющая получить длительный терапевтический эффект при однократном применении ЛС.

6. ПВ, выделенные из персика, абрикоса или айвы по разному усиливают желчевыделительную функцию печени. Все они активно вмешиваются в химизм желчи, повышают синтез суммы желчных кислот (СЖК), фосфолипидов, уменьшают образование холестерина и билирубина в составе желчи.

7. В условиях клиники проведено сравнительное исследование яблочного пектина как вспомогательного вещества, оберегающего слизистую оболочку кишечника от неблагоприятного действия токсических метаболитов и антибактериальных средств, на пациентах, страдающих аме-биазом кишечника и дизентерией. Показано, что ЯП обладает способностью оказывать выраженное бактерицидное действие на возбудителей острых кишечных инфекций. Сравнительное исследование лечения больных с диагнозом острой кишечной инфекции антибиотиками и пектином в сочетании с антибиотиком, свидетельствует о преимуществе последнего метода, который ускоряет лечение, что является очевидным результатом токсинсвязывающей, иммуностимулирующей и других полезных действий пектинового вещества на кишечную микрофлоРУ-

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мухнддинов З.К, Халикова М.Д., Камилова Г.И., Хайдаров К.Х. / Микрокапсулы на основе низкометилированного пектина. // Докл. АН РТ. 2005. -Т.48. -№1. -С.39-43.

2. Мухиддинов З.К., Халикова М.Д., Ходжаева Ф.Х., Бобокалонов Д.Т., Хайдаров К.Х./ Пектин -основа для носителей лекарственных средств. // Вестник Авеценны. 2006, № 1-2 (26-27), приложение к №1-2 - С.475-482

3. Мухиддинов З.К., Халикова М.Д. / О лечебно-профилактическом действии пищевых волокон на основе пектина. // Здравоохранение Таджикистана. 2005.-№ 3, приложение №3 С. 109-117.

4. Халикова М.Д., Авлоев X. X., Мухиддинов З.К. / Комплексообразо-вание ионов кальция с макромолекулами пектина. // Докл. АН РТ. 2005. -Т.48. -№2. -С.75-79.

5. Халикова М.Д., Авлоев X. X., Мухиддинов З.К. / Комплексообразо-вание ионов цинка с макромолекулами пектина. //Докл. АН РТ. 2005. -Т.48. -.Nal. -С.80-84.

6. Халикова М.Д. / Пектин -функциональный пишевой продукт. // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием «Семейная медицина и здоровье человека», Душанбе, 14-15 октября 2005г. С.361-364.

7. Халикова М.Д., Мухиддинов З.К, Авлоев X. X. / Комплексы ионов кальция и цинка с макромолекулами пектина. // Международная научно-практическая конференция «Современная химическая наука и ее прикладные аспекты», Материалы. Душанбе-2006 С. 146-147.

8. Касымова Г.Ф., Бобокалонов Д.Т., Мухидинов З.К., Халикова М. Д. / Выделение и характеристика зеинов кукурузы, произрастающей в Таджикистане.// Известия АН РТ-сер. физ-мат., хим., геологич. наук. 2007. -№2. -С.42-50.

9. Мухиддинов З.К., Джураева Ф.Н., Халикова М.Д., Бобокалонов Д.Т. / Equilibrium ionization in solution of low methoxy pectin and whey B-lactoglobulin. // Материалы 4-ой Санкт-Петербургской Конференции молодых ученых с международным участием. «Современные проблемы науки о полимерах», посвященной 60 -летию Института высокомолекулярных соединений РАН. Санкт-Петербург, 15-17 апреля, 2008г.-С.65.

10. Халикова М.Д., Джураева Ф.Н., Мухиддинов З.К., Халиков Д.Х., LinShu Liu. / Полиэлектролитические свойства водных растворов пектиновых веществ, полученных из различных источников растительных материалов. // Материалы Международной Конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение». Ташкент, 8-9 октября 2008г.-С. 171-174.

11. Мухиддинов З.К., Касымова Г.Ф., Джураева Ф.Н., Бобокалонов Д.Т., Халикова М.Д., Тешаев Х.И. / Белки молочной сыворотки: анализ компонентного состава в полиакриламидном геле, выделение основных сывороточных белков. // Известия АН РТ-сер. физ-мат., хим., геологич. наук. 2008г.- №1(130), С.52-57.

12. Бобокалонов Д.Т., Джураева Ф.Н., Халикова М.Д. Разделение белков молочной сыворотки методом мицеллярной электрокинетичекой хроматографии. // Материалы научно-практической конференции молодых ученых ТГМУ им. Абуали ибни Сино, посвящ. 1150 летию А.Рудаки. Душанбе 2008, С. 28.

13. Халикова М.Д, Саидов А.А, Бобокалонов Д.Т., Мухидинов З.К. / Фармакологическое изучение биологической активности новых комплексов пектина.// Материалы VI Нумановскнх чтений. Душанбе -2009. С. 45-47.

14. Мухидинов З.К., Касымова Г.Ф., Халикова М.Д., Бобокалонов Д.Т., Тешаев Х.И., Хапиков Д.Х., LinShu Liu. / Носители лекарственных препаратов на основе биополимеров. // Материалы VI Нумановских чтений. Душанбе 2009. С. 100-102.

15. Касымова Г.Ф., Мухидинов З.К, Бобокалонов Д.Т., Халикова М.Д., Джулиева Г.Д., Lin Shu Liu. / Кинетика высвобождения модельного лекарства-пироксикам из комплексов полученных на основе пектина и зеина // Материалы VI Нумановских чтений. Душанбе 2009. С. 102-104.

16. Бобокалонов Д.Т., Халикова М.Д, Джонмуродов А.С, Мухидинов З.К. / Характеристика лактоглобулинов молочной сыворотки методом капиллярного электрофореза. // Материалы VI Нумановских чтений. Душанбе 2009. С. 107-109.

17. Халикова М.Д., Мухиддинов З.К., Нуралиев Ю.Н., Хайдаров К.Х. / Влияние пектиновых веществ на химизм желчи. // Докл. АН РТ. 2009. -Т.52. -№ 3. -С.217-221.

18. Халикова М.Д., Рахимов И.Ф., Бобокалонов Д.Т., Ходжаева Ф.М., Лин-Шу Лиу, Мухиддинов З.К., Хайдаров К.Х. / Скрининг носителей лекарственных веществ на основе пектин-протеиновых гелей и микрокапсул в опытах in vivo на белых крысах // Докл. АН РТ. 2009. -Т.52. -№.5 -С.386-390.

19. Халикова М.Д., Камардинов Х.К., Мухиддинов З.К., Хайдаров К.Х. / Фармакологическое воздействие пектина при острых кишечных инфекциях в комбинации с антибиотиками. // Докл. АН РТ. 2009. -Т.52. -№7. -С.522-529.

20. Muhidinov Z.K., Sharifoya Z.B., Usmanov S.R., Bobokalonov D.T, Khalikova M.D., Liu LinShu / Pectin - ß-Lactoglobulins interaction in emulsion and gel for colon drug delivery system development //EPNOE 2009 «Polysaccharides as a Source of Advanced Materials» September 21-24, 2009 Turku/Abo, Finland, ABSTRACTS, ОС 19

Разрешено к печати 01.10.2009 Сдано в печать 02.10.2009 Бумага офсетная. Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Заказ _94._Тираж-100 экз. Отпечатано в типографии «Дониш», ул. Айни, 121, корп. 2

Актуальность проблемы. Перспективы развития фармацевтической технологии определяются требованиями современной фармакотерапии, которая предполагает создание максимально эффективных с лечебной точки зрения лекарственных препаратов при содержании в них минимума лекарственных субстанций, не обладающих побочными действиями. Особую значимость в медицинской практике имеют лекарственные субстанции, полученные из растительного сырья, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с синтетическими веществами. Составление композиций комбинированных препаратов — один из путей поиска новых лекарств. В последнее время при выборе основного компонента значительное внимание оказывают биополимерам, в частности, пектиновым веществам (ПВ), благодаря их способности образовывать гель в присутствии ионов металла.

ПВ являясь природным катионитом и одновременно компонентом пищи, обладают водоудерживающей способностью, и могут быть использованы самостоятельно при лечении желудочно-кишечных заболеваний, осложненных нарушением всасывания, дисбактериозом, запорами. С другой стороны ПВ благодаря наличию отрицательно заряженных карбоксильных групп проявляют способность к связыванию положительно заряженных ионов металлов. Это позволяет с одной стороны использовать ПВ для выведения из организма ионов тяжелых и токсических элементов, а с другой - в качестве депо для доставки в организм различных ионов, в частности ионов кальция и цинка. Использование последнего обусловлено тем, что его роль пока мало изучена. Вместе с тем, именно аномалии в поведении ионов цинка в клетках являются первопричинами многих опаснейших заболеваний. Следует отметить также, что ПВ благодаря полифункциональности мономерных звеньев, способствующих межмолекулярному взаимодействию посредством водородных и гидрофобных связей, являются уникальным объектом при комплексообразовании с органическими молекулами и биополимерами. Указанные свойства дают возможность включить ПВ в качестве незаменимых компонентов при изготовлении носителей лекарственных препаратов (ЛП), микрокапсул (МК) и систем доставки лекарственных средств (СДЛ). В связи с этим постановка исследования по изучению механизма комплексообразования ПВ с ионами металлов и белками, выявление физико-химических и биологических параметров, представляет собой актуальную научную задачу.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является изучение комплексообразующей способности ПВ различного происхождения с ионами металлов и белками, использование полученных композиций для создания носителей ЛВ, а также выявление биологической активности полученных систем.

В связи с поставленной целью задачами настоящего исследования были: изучение закономерности сорбции ионов кальция и цинка ПВ из раствора, механизма гелеобразования и расчет термодинамических параметров процесса; изучение механизма формирования тройной металло-пектино-белковой композиции и использование полученных результатов при создании носителей ЛВ, МК и СДЛ; изучение токсичности и общего характера фармакологического действия ПВ и композиций на их основе на лабораторных животных и в условиях клиники.

Работа проводилась в соответствии с планом НИР Института химии им. В.И. Никитина АН Республики Таджикистан «Поиск и создание новых полимерных материалов и биологически активных веществ на базе продуктов синтетического и растительного сырья» (ГР №0106ТД414) и

Синтез, выделение и исследование стереохимии и фармакологических свойств производных ацетилена, тиадолидинтионов, тиадиазолопиримидинов, а также природных растительных масел, являющихся перспективными для создания новых лекарственных средств» (ГР №0106ТД413).

Научная новизна работы:

Впервые установлено, что, несмотря на близкие свойства ионов кальция и цинка, механизм их взаимодействия с ПВ существенно отличается. Если в случаи ионов кальция ход процесса сорбции определяет его кооперативностью, то в системе с ионами цинка носит случайный характер, что имеет решающее значение при гелеобразовании и формирование МК;

Впервые изучено воздействие ПВ и его комплексов с ионами цинка (ZnTIB), зеинами и (3-лактоглобулинами молочной сыворотки ((3-Lg) при внутрижелудочном введении на общее состояние и поведенческую реакцию животных. Определены параметры острой токсичности ZnTDB. Выявлено, что ПВ и их композиции являются практически нетоксичными соединениями и не оказывают воздействия на общее состояние животных; разработаны способы получения JIB в форме МК и СДЛ с использованием ПВ, зеина и P-Lg, изучена их биодоступность, позволившая получить длительный терапевтический эффект при однократном применении ЛС; показано, что ПВ усиливают желчевыделительную функцию печени, активно вмешиваются в химизм желчи, повышают синтез суммы желчных кислот (СЖК), фосфолипидов, уменьшают образование холестерина и билирубина в составе желчи; экспериментально и клинически выявлено, что ПВ обладают способностью оказывать бактериостатическое действие на возбудителей острых кишечных инфекций. ПВ в сочетании с антибиотиком ускоряют лечение кишечных инфекции, что является результатом их токсин - связывающего действия на кишечную микрофлору.

Практическая значимость работы. Гидрогели на основе комплекса пектина с ионами кальция совместно с витамином D могут быть использованы в качестве депо ионов кальция при лечении остеопороза путем непосредственного введения в костную ткань. Комплексообразование ПВ с ионами кальция при последующей деионизации может быть использовано как способ получения высокоочищенного пектина.

Полученные в настоящей работе физико-химические закономерности могут быть использованы при формировании различных видов пектинсодержащих носителей JIB, эмульсии, микро- и наносфер, СДЛ, которые могут найти применение в практической медицине. ПВ могут быть использованы при лечении острой кишечной инфекции и для усиления желчевыделительной функции печени.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей в реферируемых научных журналах и 9 материалов конференций.

Апробация работы. Основные результаты докладывались и обсуждались на научно-практической конференции с международным участием «Семейная медицина и здоровье человека», (Душанбе, -2005г.), научно-практической конференции с международным участием «Основные достижения и перспективы развития фармацевтического сектора Таджикистана» (Душанбе, -2006г.), Международной научно-практической конференции «Современная химическая наука и ее прикладные аспекты» (Душанбе - 2006г.), 4-ой Конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах», посвященной 60-летию Института высокомолекулярных соединений РАН. (Санкт-Петербург, 2008г.), Международной Конференции «Наноструктуры в полисахаридах: формирование, структура, свойства, применение» (Ташкент, -2008г) и на VI Нумановском чтении. (Душанбе, -2009г.)

Объем и структура работы. Диссертация представляет собой рукопись объемом 105 страниц, состоит из введения и 3 глав, посвященных обзору литературы, экспериментальной части, результатам исследований, их обсуждениям и выводам. Иллюстрирована 12 рисунками, 11 таблицами. Список использованной литературы включает 135 наименований.

выводы

1. Получены новые композиции на основе ПВ, выделенных из различных источников растительного сырья, в форме комплексов с ионами металлов и белков, формированных в виде нано- и микрокапсул и являющихся эффективными системами для доставки лекарственных средств в кишечное пространство. Изучены их фармакологические свойства в опытах на животных и в условиях клиники.

2. Проведено сравнительное изучение изотермы и кинетики сорбции ионов кальция и цинка ПВ подсолнечника при различных его концентрациях и содержании ионов металлов в растворе. Показан экстремальный характер изотермы сорбции ионов кальция ПВ и отсутствие такого эффекта в случае ионов цинка. Совокупность полученных результатов свидетельствует о том, что если в случае ионов кальция ход процесса определяется его кооперативностью, то в системе с ионами цинка он носит случайный характер.

3. Проведено сравнительное изучение яблочного и цитрусового низкометилированных ПВ, с использованием ионов кальция, анионного (лаурисульфата натрия) и нейтрального (Span-80) ПАВ в реакции эмульсионного гелеобразования в системах вода-масло и масло-вода. Найдены оптимальные соотношения компонентов для получения микрокапсул с определенным размером частиц, их распределением и эффективностью захвата лекарственных веществ. При этом удельная поверхность частиц и эффективность захвата ЛВ были максимальными в случае использования НМ яблочного пектина в качестве носителя.

4. Изучено воздействие ПВ и его комплексов с ионами цинка, зеинами и Р-лактоглобулинами при внутрижелудочном введении на общее состояние и поведенческую реакцию животных, определены параметры острой токсичности ZnTIB. Проведенные эксперименты выявили, что ПВ и композиции на их основе являются практически нетоксичными соединениями и не оказывают воздействия на поведение, двигательную активность, терморегуляцию, сердечно-сосудистую систему, гладкую мускулатуру, диурез и нервно-мышечную проводимость.

5. Практически отсутствие токсического действия изученных объектов, дает основание на возможность применения ионов цинка в качестве сшивающего агента, а исследованные белки для формирования оболочек носителей JIB в виде микро- и нанокапсул и систем доставки JIC в кишечное пространство. Разработаны JIB инкапсулированные в СДЛ в форме эмульсий и гидрогелевых микросфер с использованием пироксикама и изучена их биодоступность, позволяющая получить длительный терапевтический эффект при однократном применении ЛС.

6. ПВ, выделенные из персика, абрикоса или айвы по разному усиливают желчевыделительную функцию печени. Все они активно вмешиваются в химизм желчи, повышают синтез суммы желчных кислот '' (СЖК), фосфолипидов, уменьшают образование холестерина и билирубина в составе желчи.

7. В условиях клиники проведено сравнительное исследование яблочного пектина как вспомогательного вещества, оберегающего слизистую оболочку, кишечника от неблагоприятного действия токсических метаболитов и антибактериальных средств, на пациентах, страдающих амебиазом кишечника и дизентерией. Показано, что ЯП обладает способностью оказывать выраженное бактерицидное действие на возбудителей острых кишечных инфекций. Сравнительное исследование лечения больных с диагнозом острой кишечной инфекции антибиотиками и пектином в сочетании с антибиотиком, свидетельствует о преимуществе последнего метода, который ускоряет лечение, что является очевидным результатом токсинсвязывающей, иммуностимулирующей и других полезных действий пектинового вещества на кишечную микрофлору.