Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Идентификация фенольных соединений растительного происхождения методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

РТ6 иа 2 4 НОЙ №

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

15.00.02 - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

На правах рукописи УДК 543.544:543.422:581.19

КОСМАН Вера Михайловна.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

[

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи УДК 543.544:543.422:581.19

КОСМАН Вера Михайловна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

15.00.02 - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ И ФАРМАКОГНОЗИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Диссертационная работа выполнена в секторе аналитических методов НИЛ и на кафедре фармакогнозии Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии (СПХФА) Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: доктор химических наук И. Г. ЗЕНКЕВИЧ кандидат фармацевтических наук, профессор К. Ф. БЛИНОВА

Официальные оппоненты: доктор фармецевтических наук В.Н.КУКЛИН кандидат химических наук И. К. ЖУРКОВИЧ

Ведущая организация: Ботанический Институт им. В.Л.Комарова РАН

Защита состоится 25 ноября 1997 года в ^ часов на заседании Диссертационного Совета Д 084.63.01 при Санкт-Петербургской Государственной Химико-Фармацевтической Академии по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии по адресу: Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 4/6.

Автореферат разослан октября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат фармацевтических наук

Е. М. СЕРГЕЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время все большее значение приобретают лекарственные средства растительного происхождения. Одними из наиболее перспективных и часто используемых являются лекарственные растения, содержащие природные фенольные соединения, в том числе, флавоноиды.

Введение в медицинскую практику новых видов лекарственных растений, стандартизация уже используемого растительного сырья и фитопрепаратов невозможны без знания их химического состава. "Традиционные" методы фитохимических исследований длительны и трудоемки, так как требуют препаративного выделения анализируемых компонентов методами колоночной хроматографии при нормальном давлении или препаративной бумажной хроматографии, а для дальнейшей хроматографической или спектральной идентификации необходимо применение стандартных образцов заведомо известных соединений. Однако, такие методы разделения и анализа веществ как газожидкостная (ГЖХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволяют упростить и ускорить анализ сложных смесей при наличии достаточно полных баз данных наиболее воспроизводимых аналитических параметров веществ.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка подходов к идентификации природных фенольных соединений в ВЭЖХ без использования стандартов и создание соответствующего информационного обеспечения.

Для достижения поставленной цели необходимо решение следующих задач:

• - выбор наиболее воспроизводимых аналитических параметров, характеризующих хроматографическое поведение веществ в ВЭЖХ и оценка их информативности;

• - выбор минимально' необходимой степени стандартизации условий проведения хроматографического анализа;

• - поиск дополнительных (спектральных) аналитических параметров, повышающих надежность и однозначность идентификации веществ, и характеристика ими фенольных соединений природного происхождения;

• - характеристика выбранными параметрами максимально возможного числа фенольных соединений природного происхождения и создание базы данных по аналитическим параметрам этих соединений в ВЭЖХ;

• - характеристика возможностей и особенностей практического применения предлагаемых подходов к идентификации на конкретных примерах.

Научная новизна. Выполненные исследования развивают концепцию представления хроматографических данных по удерживанию соединений в обращенно-фазовой ВЭЖХ в

форме индексов удерживания - параметров, обладающих наибольшей межлабораторной воспроизводимостью.

В качестве дополнительных аналитических параметров фенольных соединений в ВЭЖХ впервые предложены и использованы относительные оптические плотности при разных фиксированных длинах волн, являющиеся простыми и удобными в определении характеристиками не только индивидуальных веществ, но и соединений с одинаковыми хромофорами в составе молекул.

На примере фенольных соединений различных классов предложена концепция формирования баз аналитических параметров в обращенно-фазовой ВЭЖХ, предполагающая усреднение всех независимых значений этих параметров (индексов удерживания и относительных оптических плотностей), определяемых как экспериментально, так и на основе имеющихся в литературе данных.

Теоретическая и практическая значимость. Показаны преимущества использования индексов удерживания, позволяющих идентифицировать компоненты различных смесей без препаративного выделения входящих в их состав веществ и без использования стандартных образцов анализируемых соединений.

Предложенный подход к интерпретации УФ-спектральных данных в ВЭЖХ является отличным от общепринятых и не был использован ранее для характеристики органических соединений по типам хромофоров, присутствующих в молекуле, т.е., для групповой идентификации.

Определенные впервые инкременты индексов удерживания структурных преобразований в молекулах (для реакций ацетилирования и метилирования соединений с активными атомами водорода) характеризуют взаимосвязь вариаций структуры соединений и их параметров удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ, изучение и характеристика которых является одной из важнейших теоретических проблем. Полученные результаты позволяют подойти к решению задач оценки параметров удерживания соединений, отсутствующих в базах данных, т.е. имеют непосредственное практическое применение.

Возможности использования предложенных подходов рассмотрены на примерах нескольких растительных объектов, исследование состава которых представляет различные по степени сложности аналитические задачи. Впервые предложен метод стандартизации многокомпонентных смесей фяавоноидов по суммарному содержанию гликозидов, основанный на результатах элементного анализа образцов до и после полного кислотного гидролиза.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на VII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Москва, 1996), Втором

гаучном конгрессе "Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты" Чебоксары, 1996), Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы создания ювых лекарственных средств" (С.-Петербург, 1996), Международной конференции по талитической химии (Москва, 1997), 21-ом Международном симпозиуме по ¡ысокоэффективному жидкофазному разделению и родственным методам (Бирмингем, 997).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением Академии 'Разработка и совершенствование методов анализа лекарственных средств" и темой «ктора аналитических методов НИЛ "Разработка новых методов идентификации и :оличествешюго определения природных и синтетических биологически активных ¡еществ и лекарственных препаратов".

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 12 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, »писания материалов и методов исследования, четырех глав, содержащих результаты «¡следований и их обсуждение, выводов и списка литературы. Работа изложена на 150 границах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 12 рисунков, 2 схемы и 1риложение. Список литературы включает 200 источников.

Во введении сформулированы актуальность темы, цель и задачи исследования, научная говизна, теоретическая и практическая значимость выполненных исследований.

В первой главе (обзор литературы) рассмотрены различные хроматографические методы, используемые в современных исследованиях растительных фенольных »единений: колоночная хроматография при нормальном давлении, бумажная и тонкослойная хроматография (БХ и ТСХ), высокоэффективная жидкостная сроматография (ВЭЖХ) и газожидкостная хроматография (ГЖХ), а также варианты 1редставления параметров удерживания анализируемых соединений в хроматографии.

Во второй главе охарактеризованы материалы и методы исследований, описаны )бъекты и условия проведения экспериментов, приведены различные методики, гспользованные при выполнении работы.

В третьей главе представлена характеристика некоторых групп природных фенольных »единений (простых фенолов, кумаринов и флавоноидов) хроматографическими индексами удерживания - аналитическими параметрами, обладающими наибольшей аежлабораторной воспроизводимостью в ВЭЖХ.

В четвертой главе рассмотрены относительные оптические плотности при разных фиксированных длинах волн как дополнительные аналитические параметры, повышающие надежность и однозначность идентификации органических соединений в эбращенно-фазовой ВЭЖХ.

В пятой главе приведены результаты изучения закономерностей удерживаню соединений с активными атомами водорода в составе фенольных гидроксильных групп i продуктов их дериватизации путем ацетилирования и метилирования.

В шестой главе охарактеризованы возможности использования разработанны: подходов для идентификации природных полифенолов на примере нескольких реальны; растительных объектов, различающихся по сложности (количеству присутствующих в ни компонентов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы (экспериментальная часть)

Для исследования были использованы индивидуальные соединения, относящиеся j простым фенолам, кумаринам {коллекция кафедры фармакогнозии СПХФА, некоторы образцы любезно предоставлены Н.Ф.Комиссаренко (г. Харьков)] и флавоноида! (коллекция К.Ф.Блиновой), а также смеси фенольных соединений: образцы, полученные и корневищ с корнями гравилата городского, черешков листьев борщевика сибирского травы сабельника болотного, и некоторые препататы, содержащие кумариш ("Аммифурин", "Бероксан", "Псорален") и флавоноиды ("Рутин").

Параметры удерживания анализируемых соединений определяли на жидкостно] хроматографе фирмы "Waters" с двумя различными обращенно-фазовыми колонками i УФ-детектором с переменной длиной волны. В качестве подвижной фазы использовал смеси ацетошприла и фосфатного буфера с рН=4.7 ± 0.2 (10 ммоль/л КН2РО4 ил NaHiPO^. Основной режим анализа: линейный градиент от 10% ацетошприла в состав элюента, скорость увеличения концентрации 1.5% в минуту, расход эшоента 1 мл/мин.

По временам удерживания анализируемого соединения и так называемых реперны компонентов (в ВЭЖХ гомологичных алкилфенилкетонов) по общей интерполяционно формуле рассчитывали индексы удерживания (ИУ):

f(tx) - fltRs)

RI = 100 • n + 100 • (n+k)---------------------- (1),

f(Wi) - f(tR,.)

где tx, tRn и tRa+t - времена удерживания характеризуемого соединения и реперны компонентов с числом атомов углерода п и n+k. Наиболее общей является систем линейно-логарифмических ИУ, применимая для расчетов как в изократических, так и градиентных режимах анализа В соответствии с этой системой функция f(t) равна t+q*lg t где q - переменный параметр, обеспечивающий оптимальные условия интерполяции рассчитываемый по временам удерживания минимум трех реперных компонентов.

Для определения относительных оптических плотностей (Аотн.) при разных длинах вол равные по объему пробы анализируемых образцов последовательно анализировали пр разных длинах волн детектирования - 220, 254, 280, 246 нм и 360 или 317 нм (две последш

для флавоноидов и кумаринов соответственно). Значения Аота. расчитывали в соответствии с формулой:

Аота. = Ах, / Ах2 * / Бхз * Ни / Ни (2),

где 8x1 и 5x2 - площади (показатм интегратора), а Ну и Нхг - высоты пиков анализируемого соединения при детектировании на разных длинах волн.

Имеющиеся в литературных источниках спектры соединений рассматриваемой группы (в графическом или цифровом представлении) обрабатывали исходя из соотношения Аотн. = Ах1/Ая2 с учетом формы представления спектральных данных - линейной или логарифмической шкалы поглощения или экстгажции (А,.Е, г или ^ е).

Характеристика некоторых п>упп природных феиольных соединений хроматографическими индексами удерживания Представленные в табл. 1 данные по ИУ некоторых фенолов отражают известную закономерность удерживания в обращешю-фазовой жидкостной хроматографии: чем более гидрофильны соединения, тем меньше они удерживаются неподвижной фазой и тем быстрее элюируются из хроматографической колонки.

Таблица 1. Индексы удерживания некоторых соединений из группы простых фенолов

в об ращенно-фазовой ВЭЖХ

Соединение Индекс удерживания Относительные оптические плотности

ri ± Sri А(254/220) А(280/246)

Резорцин 520 ± 24 0.04 ±0.01

Гидрохинон 533 + 44 0.05 + 0.01 5.5 + 0.5

Пирокатехин 584 ±14 0.14*

Пирогаллол 610 ±37 0.02

Орцин 646 ±25 0.05 ±0.01 5.4 ±0.7

Фенол 691 ± 28 0.10 + 0.01 4.8

Гваякол 722 ± 30 0.12 3.8 + 0.1

п-Крезол 771+5 0.05 + 0.01 9.4

2-Хлорфенол 797 + 5 0.15

Анизол 887+1 0.10

2-Нафтол 898 + 16 0.12

1-Нафтол 920 ± 17 0.06

Карвакрол 1023 + 4 0.07

Тимол 1034 + 9 0.04 10.3

Средние значения Аотн. 0.08 + 0.04 6.0 ± 2.4

Примечание: * - здесь и далее во всех таблицах без стандартных отклонений приведены результаты единичных измерений (нет других независимых определений).

Представленные данные получены усреднением как экспериментальных значений, определенных в различных режимах элюирования на двух обрагценно-фазовых колонках, использовашплх в данной работе, так и литературных данных по ИУ или абсолютным параметрам удерживания рассматриваемых соединений, которые были пересчитаны в

систему ИУ. .Приведенные в таблице стандартные отклонения значений ИУ характеризуют не погрешность их определения в конкретных условиях, а межлабораторную воспроизводимость этих параметров. Среднее стандартное отклонение ИУ в ВЭЖХ для наиболее изученных соединений составляет около 17 ед.инд. При анализе представленных в табл. 1 данных можно выявить некоторую закономерность изменения значений вщ. Стандартные отклонения уменьшаются с увеличением значений ИУ, т.е., ИУ более гидрофильных соединений воспроизводятся хуже. Это связано с влиянием нескольких факторов:

• - наличием для некоторых гидрофильных соединений зависимости ИУ в изократических режимах элюирования от состава подвижной фазы - увеличение или уменьшение ИУ при варьировании концентрации ацетонитрила в элюенте.

• - особенностями начального этапа градиентного элюирования. В области малых времен удерживания, соответствующих коэффициенту емкости хроматографической колонки к'<1. взаимодействия сорбат: сорбент: подвижная фаза изучены недостаточно и могут не достигать равновесия. Следствием этого оказывается меньшая воспроизводимость времени индексов улаживания быстро элюируемых компонентов прк хорошей воспроизводимости времен удерживания реперных компонентов в области к'» 1 Несколько снизить влияние этого фактора можно, выбирая режим элюирования так чтобы времена удерживания соединений находились за пределами области с к'<1, т.е

• - трудно учитываемым влиянием степени старения хроматографической колонки Для стандартизации колонок и приведения получаемых на них значений ИУ I соответствие с базой данных рационально использование тест-смесей, состоящих из 3-! соединений близких к анализируемым по химической природе, и введен» соответствующих поправок значений ИУ.

Таблица 2. Индексы удерживания и относительные оптические плотности

Тривиальное название Индекс удерживания III ± ем Относительные оптические плотности

А(254/220) А(317/254) А(317/220)

Умбеялиферон 732 ±9 0.07 7.7 0.52

Ксантотоксол ифСХо он 781 ±21 0.73 ±0.05 0.77 0.56

Кумарин 796 ± 15 1.6 ±0.2 0.83 1.1

Гидрат оксипейцеданина он ОЙСХ 826 + 28 0.68 1.3 . 0.88

Герниарин сн3о-®С^Х0 852 ±26 0.26 + 0.03 9.1 1.7

Ксантогоксин а?а осн3 910 + 20 0.85 0.44 0.37

Изопимпинеллин осн3 да! оснз 939 ± 21 0.56 1.0 0.93

Бергаптен ОСНЗ рба 951 ±16 0.64 0.91 0.58

Ореоселон 7ЖХ . 993+15 1.8 0.23 0.41

Оксипейцеданин 13а 1010 ±37 0.78 0.77 0.60

Аллоимператорин 1078 + 30 0.59 0.96 0.94

Императорин 1139 ±33 0.68 + 0.13 0.51 0.36

Остол ЖХ 1158 ±7 0.58 2.4 1.4

Псйдеданин 1162 ±8 1.3 0.34 0.24

Изоимператорин 1193+5 0.91 0.66 0.60

В табл. 2 для некоторых наиболее распространенных природных кумаринов в порядке возрастания представлены значения ИУ в обращенно-фазовой ВЭЖХ, усредненные по всем данным, полученным в различных режимах. Значения ИУ варьируют в зависимости от структуры соединений и их гидрофильности в диапазоне 700 - 1200 ед. инд. Их среднее стандартное отклонение составляет 19 ед. инд., что соответствует современным оценкам межлабораторной воспроизводимости ИУ в ВЭЖХ.

Возможности экспериментального определения ИУ органических соединений ограничены набором имеющихся образцов известных веществ. В то же время в различных публикациях, посвященных, например, анализу флавоноидов, для большого числа соединений этого класса приведены абсолютные параметры удерживания, полученные в разных режимах элюирования. Концепция ИУ позволяет привести разнородные данные по удерживанию, имеющиеся в литературных источниках в единую систему воспроизводимых параметров.

Такой пересчет позволил увеличить число относящихся к группе флавоноидов соединений, охарактеризованных ИУ, от 15-20 (собственные экспериментальные данные) до почти двухсот.

В табл. 3 в порядке возрастания приведены значения ИУ 34 флавоноидных соединений, как агликонов, так и гликозидов, полученные объединением всех доступных независимых данных.

Таблица 3. Индексы удерживания и относительные оптические плотности некоторых флавоноидов в обращенно-фазовой ВЭЖХ_

Соединение Структурная формула Индекс удерживания Ш±8м Относительные оптические плотности

А(254/220) А(360/254) А(360/220)

Лютеолин 8-С-С1и! (Ориентин) 744 ±5 0.65 ±0.02 0.90 + 0.02 0.58 ±0.02

Кверцетин З-О-Са1 (Гиперозид, гиперин) 761 ±6 0.80 1.1 0.87

Кверцетин З-Ме. 5-0-01и (Стилозид) 766 ±3 1.1 0.83 0.93

Кверцетин З-О-01и (Изокверцитрин) 769 ±7 1.010.00 0.78 + 0.04 0.78 ±0.05

Лютеолин 7-0-Glu (Цинарозид) ^ÇÇr®» 774 ±12 0.83 0.73 0.61

Кверцетин 3-(6-0-Rham)-0-Glu (Рутин) ^N^^V^^oRhem Oau 780 ±20 1.0 0.85 0.85

Гесперитин 7-(2-0-Rham)-0-Glu (Неогсспиритин) он В 790 + 7 0.11 ± 0.01 0.39 ±0.04 0.04 ±0.00

Изорамнетин 3-(6-0-Rham)-0- Glu (Нарциссин) ^Ny^^sj^CRhtm OGki 798 + 30 1.0 0.93 0.93

Кверцетин З-О- Rham (Кверцитрин) ""ççd?" 805" 0.95 0.75 0.66

Флавон 3.5.7.3' .4'. 5'- (Мирицетин) он "-ÇÇr^ 818 ±28 0.68+0.08 1.0 ±0.2 0.71 ±0.24

Изофлавон 7,4'-(ОН)2 (Даидзеин) 834 ±5 1.6±0.1 0.01 0.07

Флавон 3,5,7,2',4'-(OH)s (Морин) ■да!0" 845 ±30 0.86 ±0.10 0.84 ±0.04 0.72 ±0.11

Флаванон 5,7,3',4'-(ОН)4 (Эриодгастаол) 861 ±15 0.14 0.50 0.07

Флавон 3.5.7.3',4'-ЮН)5 (Кверцетин) 869 ±20 0.98 ±0.06 0.93 ±0.08 0.91 ±0.02

Флаванон 5,7,4'-(ОН), (Нарингенин) 873" 0,08+0.05 0.47 ±0.04 0.05 ±0.02

Изофлавон 5,7,4'-(ОП)з (Генистеин) 876+6 1.7 0.06 0.10

Флзрон 5.7,3'.4'-(ОНЬ (Лютеолин) 88l±22 0.78 ±0.02 0.93 ±0.13 0.73 ±0.11

Флавон 5Л.УЛ'-ЮН)4 3-МеО 885±30 0.92 ±0.11 0.92 ±0.03 0.86 ±0.07

Флавон 3,5,7,4'-(ОН)4 (Кемпферол) 892±9 0.95 ±0.15 1.2 ±0.1 1.1 ±0.1

Флавон 3,5,7,4'-(ОН)4 З'-МеО (Изорамнетин) 895±20 0.87 0.91 0.77

Флавон 5.7.4'-(ОЦ>5 (Апигенин) Ж!®' 909±13 0.96 0.72 0.70

Флавон 5,7,4'-(ОН)з 3-МеО (Хризоэриол) ^ççjÂ, 9J8±14 0.60 1.0 0.63

Флавон 3.5.3'.4'-(OHb,7-MçO (Рамнетин) -iççc®' 961±20 0.84 0.87 0.70

Флавон 3,5,7- (ОН)з (Галантин) он 1 995" 1.0 0.76 0.79

Флавон 5,7-(ОН)2 (Хризин) OH l 995+23 0.98 0.22 0.22

Флавон 5,7-(ОН)г 4'-МЮ (Ахацетин) -ççro- 1019±19 0.49 0.88 0.44

Флавон 3,5,7-(ОН)з4'-МеО (Кемпферид) I028±l7 0.86 1.1 0.92

Флавон 4'-МеО 1055±12 0.56 0.46 0.26

Флавон 5-ОН (Примулетин) 1095±14 1.3 0.22 0.28

Флавон 5-ОН 7- МеО (Тектохризин) 1127+29 1.8 0.09 0.16

Примечания: * - названия построены на основе структур флавона, флаванона и изофлавона; наименования гликозидов составлены по названиям соответствующих агликонов; в скобках указаны тривиальные названия соединений; подчеркиванием выделены названия соединений, для которых значения ИУ были определены в том числе экспериментально;

** - значения ИУ, стандартные отклонения которых превышают 30 ед. инд., требуют дальнейшего уточнения.

При анализе полученных данных показано, что интервал изменения ИУ для столь многочисленной группы соединений как флавоноиды (в настоящее время известно около 2000 представителей) весьма невелик - приблизительно от 600 до 1100 ед. инд. Возрастание значений ИУ связано с увеличением гидрофобности соединений: наименьшими ИУ обладают гликозиды с тремя углеводными фрагментами в молекуле, а наибольшими - агликоны с метоксигруппами или без гидроксильных заместителей. Область ИУ большей части агликонов ограничена значениями от 800 до 1100 ед. инд., и лишь отдельные представители имеют ИУ менее 800. Для более гидрофильных по своим свойствам гликозидов характерны ИУ в области 600 - 800 ед. инд., единичные соединения имеют ИУ до 900 ед. инд. Интервал от 750 до 900 ед. инд. является областью, характерной как для агликонов, так и для гликозидов. Среднее стандартное отклонение ИУ, рассчитанное по данным для 38 наиболее надежно охарактеризованных соединений составляет 13 единиц индекса, что совпадает с современными оценками межлабораторной воспроизводимости ИУ в ВЭЖХ.

Более детальное рассмотрение полученных данных показывает, что наличие двойных связей в положении 2,3 и гидроксильных групп в положении 3, слабо влияет на характеристики удерживания флавонов, флавонолов и флаванонов в обрашенно-фазовой ВЭЖХ.

Система ИУ допускает использование аддитивных схем для оценки их значений на основе инкрементов, характеризующих различные структурные фрагменты молекул.

Имеющиеся данные для флавоноидов позволяют рассмотреть разности ИУ некоторых пар агликон - гликозид с целью оценки инкрементов соответствующих структурных фрагментов. Так, например, инкремент ИУ глюкозидного остатка, составляет 107 ± 8 ед. индекса. Этот параметр может быть использован далее для оценки ИУ соединений, отсутствующих в базе данных. Показано, что замещение двух активных атомов водорода ОН-групп на остатки глюкозы в различных положениях молекулы (по крайней мере в 3 и 7) практически аддитивно. В тоже время присоединение второго углеводного остатка к уже имеющемуся (3-рутинозиды) лишь незначительно (статистически незначимо) влияет на ИУ. Последний факт связан, по-видимому, с наличием в молекуле большого количества щцроксильных групп, обусловливающих неаддитивное увеличение числа возможных внутримолекулярных водородных связей, влияние которых сказывается на хроматографическом поведении таких соединений.

Оценка информативности ИУ и однозначности идентификации с использованием эти? параметров, проведенная на примере флавоноидов, показала, что одних только Ш недостаточно для однозначной идентификации в обращенно-фазовой ВЭЖХ. Дго повышения надежности и однозначности идентификации необходимо привлечен» дополнительных параметров, не связанных по физико-химической природе с индексам! удержи ваиия.При УФ-детектировании аналитов наиболее рационально использовать и; УФ-спектральные характеристики.

Относительные оптические плотности при разных фиксированных длинах волн -дополнительные аналитические параметры в ВЭЖХ Полные УФ-спектры являются достаточно сложными ддля обработки аналитическим] сигналами и содержат избыточную информацию, которая часто не может быт эффективно использована. По этой причине проще и удобнее применять да идентификации соответствующие одномерные параметры - отношения оптически плотностей при разных длинах волн Аотн. = А(Х])/А(Яг). Такой прием, реализуемый н любых приборах с перестраиваемыми УФ-детекторами, известен с конца 70-х г.г., но настоящему времени не получил достаточного распространения. Одной их основны проблем, ограничивающих применение и распространение данного подхода является, пс видимому, выбор длин волн детектирования.

В качестве наиболее универсальных длин волн целесообразно выбрать 254 Н1 (международный стандарт УФ-детектирования) и длину волны в области неселективног поглощения органических соединений на границе ближнего ультрафиолета, например, 22 нм. При этой длине волны не наблюдается заметного поглощения растворителей чад. всего используемых в обращенно-фазовой ВЭЖХ (ацетонитрил, метано.] тетрагидрофуран и др.). Хемометрическая оценка корреляции относительных оптически

плотностей при различных сочетаниях Х1 и Хг показала, что измерения Аотн. при малых ДХ, ^информативны. Оптимальной разностью длин волн для расчета относительных этических плотностей оказывается интервал значений ЛЯ от 30 до 40 им. Выбранная пара длин волн - 254 и 220 нм с ДХ, = 34 нм - соответствует оптимальному диапазону. Наибольшей информативности можно ожидать от сочетания двух оптических отношений к(Х\)1А(Хг) и А(Ъ)/А(?и) при условии, что значение АХ в обоих случаях принадлежит интервалу от 30 до 40 нм. Таким образом, выбор еще одной пары длин волн с той же разницей (ДХ. = 34 нм) в более длинноволновой области спектра позволит повысить вероятность однозначной и правильной идентификации соединений. Изложенное объясняет выбор второй пары длин волн - 280 и 246 нм.

Особенно интересным представляется применение А^н. не для индивидуальной, а для групповой идентификации органических соединений. Можно ожидать, что соединения с одинаковыми хромофорами в молекулах будут иметь близкие значения спектральных отношений, т.е., эти параметры можно использовать для определения типов хромофоров, имеющихся в структуре молекул. На основе баз данных по значениям этих параметров теоретически становится возможной идентификация веществ, не только не представленных в таких, базах, но и даже еще не охарактеризованных УФ-спектрами.

В табл. 1 представлены значения двух выбранных спектральных отношений для некоторых фенолов. Средние значения, приведенные в последней строке таблицы, являются групповыми характеристиками или инвариантами соединений с такими же хромофорами в молекуле.

Логическим развитием метода идентификации, основанного на отношениях интенсивностей сигналов А(Х})/А(Х>), является измерение поглощения на трех длинах волн с расчетом трех отношений указанного вида (только два из них независимы). При этом существует возможность использования кроме двух длин волн, выбираемых постоянными для различных веществ, переменной третьей, варьируемой в зависимости от химической природы определяемых веществ и необходимой для повышения надежности подтверждающего анализа. Этот подход был использован для характеристики природных кумаринов и флавоноидов. В табл. 2 представлены значения трех спектральных отношений А(254/220), А(317/254) и А(317/220) для некоторых кумаринов. Третья длина волны - 317 нм - соответствует максимуму поглощения соединений этой группы в длинноволновой области (317 ± 13 нм).

При рассмотрении спектральных отношений кумаринов по типам хромофоров можно выделить несколько групп соединений, характеризуемых неодинаковыми групповыми значениями относительных оптических плотностей (табл. 4). По этим параметрам можно с достаточной вероятностью отличать друг от друга кумарины, фурокумарины, 4'-

замещенные фурокумарины, 5- и/или 8-замещенные фурокумарины (из всех заместителе] влияющих на спектральные параметры охарактеризованных в настоящей работе струкгу (табл. 2) ауксохромами являются только гидрокси- и алкоксигруппы). Из рассмотрении групп соединений только 5- и 8- замещенные фурокумарины характеризуются близким значениями всех трех спектральных отношений. Положение гидрокси- и/или алкока заместителей в рассматриваемых соединениях, по-видимому, не оказывает существенног влияния на спектральные характеристики хромофора, и эти подгруппы замещении фурокумаринов не могут быть дифференцированы по значениям А0тк-

Таблица 4. Групповые значения относительных оптических плотностей для __кумаринов и фурокумаринов с различными типами хромофоров_

Относительные оптические плотности

по типу хромофора А(254/220) А(317/254) А(317/220)

7-замещенные кумарины * 0.3 ±0.3 6.4 ±6.0 1.2 + 0.6

—Чэ'Цз

4'-замещенные фурокумарины т 1.6 ±0.4 0.29 ±0.08 0.33 ±0.12

5-замещенные фурокумарины он 0.71 ±0.14 0.93 + 0.24 0.72 ±0.17

8-замещенные фурокумарины оя 0.68 ±0.12 0.74 + 0.24 0.63 + 0.28

5- и/или 8-замещенные фурокумарины 0.70 ±0.12 0.84 ±0.25 0.68 ± 0.22

Примечание: * - Л=Н, СНз, З-метил-З-бутешш (пентенил).

Для характеристики флавоноидов были использованы три спектральных отношени

А(254/220), А(360/254) и А(360/220), значе1шя которых, для отдельных соединений эт< группы приведены в табл. 3. Выбор длины волны 360 им согласован с максимуме поглощения в длинноволновой области, характерным для большинства флавоноидов, 360 ± 14 нм.

На основании имеющихся данных можно рассмотреть относительные оптическ плотности как групповые УФ-спектральные инварианты веществ, относящихся различным классам флавоноидных соединений. В табл. 5 приведены значения тр рассматриваемых спектральных отношений для важнейших классов флавоноидов родственных соединений. Число охарактеризованных представителей каждого клас

(графа 2) в некоторой степени характеризует его изученность и частоту обнаружения конкретных веществ в реальных объектах. Близкими значениями всех трех параметров Аоти. характеризуются только флавоны и флавонолы, отличающиеся наличием гидроксильной группы в положении 3, которая не оказывает существенного влияния на спектральные параметры хромофора. Все остальные классы соединений могут быть с достаточно высокими надежностью и однозначностью идентифицированы по совокупности всех трех спектральных параметров или даже одному из них.

Таблица 5. Относительные оптические плотности как УФ-спектральные инварианты

Класс соединений, структурная формула простейшего конгенера Количество охарактеризованных соединений А(254/220) А(360/254) А(360/220)

Ауроны ОС>~Н2-0 10 0.55 ±0.09 1.6 ±0.5 0.85 ±0.23

Изофлавоны 19 1.6 ±0.4 0.06 ±0.03 0.08 ±0.05

Флаваны 4 0.05 ±0.02 <0.01 <0.01

Флаваноны и флаванонолы 10 0.19 ±0.11 0.18 ±0.20 0.03 ±0.03

Флавоны осУ® о 50 0.62 ±0.27 0.77 ±0.39 0,41 ±0.22

Флавонолы О^Х? о 55 0.83 ±0.20 0.91 ±0.22 0.71 ±0.19

Халконы 7 0.30 ±0.18 2.4 ±0.9 1.0 ±0.5

Закономерности удерживания соединений с активными атомами водорода и некоторых их

химических производных

Один из возможных подходов, позволяющих расширить круг инвариантов удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖХ, предполагает сравнение ИУ для соединений, отличающихся

лишь отдельными функциональными грушами, в частности, различных производных веществ с активными атомами водорода. Можно полагать, что разности индексов, соответствующих исходным веществам и продуктам реакций дериватизации, окажутся более воспроизводимыми хроматографическими параметрами, нежели сами ИУ. Вариации индексов удерживания за счет влияния различных условий анализа в этом случае должны в существенной степени взаимно взаимно компенсироваться.

Для схемы реакции общего вида А + ... -> В + ... можно записать ARI = Rl„ - RIa. Можно ожидать, что одинаковые структурные преобразования различных молекул будут характеризоваться близкими разностями индексов удерживания исходных соединений и соответствующих им продуктов реакций. Тогда статистически обработанные значения ARI ± sri являются уже не характеристикой отдельных пар веществ, а, фактически, хроматографическими параметрами рассматриваемых преобразований структуры.

В данной работе рассмотрены два вида реакций дериватизации для соединений с активными атомами водорода в составе гидроксильных групп в молекуле - получение ацетильных производных и метиловых эфиров. Табл. 6 содержит данные об ИУ различных соединений с фенольными гидроксильными группами, включая одно- и полиатомные фенолы и их производные, не имеющие внутримолекулярных водородных связей (группа

I), а также полифункциональных производных фенолов с водородными связями (группа

II). Сравнение величин ARI для всех веществ группы 1 и некоторых соединений группы II показывает, что они характеризуются достаточно высокой воспроизводимостью (среднее значение ARI для ацетильных производных равно 126 ± 15, для метиловых эфиров 185 ± 29). Наиболее интересен факт аддитивности подобных инкрементов ИУ для полиатомных фенолов с гидроксильными группами в положениях 1,3 или 1,4, либо в изолированных ароматических системах, когда образование внутримолекулярных водородных связей заведомо невозможно.

Приведенные в табл. 6 относительные оптические плотности А(254/220) являются важными дополнительными аналитическими параметрами для идентификации анализируемых соединений. В случае ароматических фенолов переход к О-ацегильныы производным или метиловым эфирам слабо влияет на характеристики хромофора.

Оценка степени протекания реакции, необходимая для характеристики hs использовавшейся ранее методики метилирования диметилсульфатом в водном раствор! исходных соединений и продуктов реакции щелочи, проведена на основании определена мольной доли метилированных продуктов в реакционной смеси фенолов, рассчитываемо? по площадям хроматографических пиков. Степень превращения в расчете на ода; гидроксильную группу составила 75+ 13%.

Таблица 6. Сравнение индексов удерживания и относительных оптических плотностей А(254/220) некоторых фенолов и их

ацетильных производных и метиловых эфиров.

Соединение АгОН АЮСОСНз АгОМе

Ш±8кг А(254/220) К1±5ш А(254/220) ЛШ Я1±ям А(254/220) ЛЯ!

I. Соединения без внутримолекулярных водородных связей

Фенол 678 ±18 0.09 814±8 0.32 136 887 ± 1 0.10 196

п-Крезол 767 ±7 0.04 919± 11 0.21 152 989* 0.04 218

2-Хлорфенол 795 + 5 0.15 936 ±1 0.12 141 980 0.07 183

а-Нафтол 930 ±3 0.06 1024 ±8 0.10 94 1103 ± 2 0.03 183

Р-Нафтол 911 ±9 0.12 1042 ±14 0.14 131 1107 ±7 0.05 209

Тимол 1045 ±4 0.15 1160 ±2 0.16 115 1279 ±8 0.05 .245

Карвакрол 1023 ±4 0.07 1126 ±2 0.05 103

Парацетамол (4-ацет-аминофенол) 587 ±6 1.6 744 1.6 157

2,3-Дихлорфенол 947 ±1 0.05 1068 0.02 121

Шиконин * 1110±13 - 1205 + 4 - 155

Метил-п-гидроксибензоат 926 + 9 0.26 1086 - 160

Полиатомные фенолы

Гидрохинон 580 ±23 0.06 824± 12 0.06 244 = 2-122 715 870 0.05 182 155

Резорцин 582 ±6 0.06 837 ±9 0.25 255 = 2*128 725 ± 11 902 ±2 0.09 0.05 205 177

Орцин 676 ±4 0.06 910 ± 15 0.10 234 = 2-117 789 ±2 983 ±2 0.02 0.04 143 194

Флороппоцин 506 ±20 0.10 882 ±10 0.37 376 = 3-125 многокомпонентная смесь

Фенолфталеин 891 ±0.01 0.01 1125 ±8 0.02 234 = 2-117

Среднее значение ДШ | 185 ±29

II. Полифункциональные фенолы с внутримолекулярными водородными связями

Пирокатехин 584 ±14 0.14 722 ±30 805 ±8 0.12 0.09 138 83

Пирогаллол 610 ±37 0.02 673 ±3 745 ± 11 814±8 0.10 0.07 0.05 63 ' 72 69

Эвгенол 917 ±4 0.02 1046 ±7 0.09 129 1012 ±11 0.08 105

Изоэвгенол 947 ± 11 1.3 1059 ±1 0.90 112 1051±25 0.84 119

Гваякол 722 ±30 0.12 874 ± 152

Среднее значение АИ 126±15 1

Метил-салицилат (метил-о-гидроксибензоат) 916 ± 6 0.25 836 ±2 0.26 -80

Этил-салипилат (этил-о-гидроксибензоат) 1030 ±7 0.28 910±2 0.24 -120

4-трет.-Бутил-пирокатехин 932 ± 25 0.08 1084 + 27 0.06 152 (2 ОН)

Лютеолин 882+ 14 0.78 1224 ±8 0.81 342 = 4*86

Кверцетин 883 ±15 0.98 1108 ±13 0.95 225 (5 ОН) 1329 ± 5 0.82 463 = 5» 93

Среднее значение ЛМ 93 ±28

Примечания: * - образец шиконина - 2-(1-гидрокси-4-метил-4-пентенил)-5,8-дигидрокси-1,4-бензохинона - предоставлен сотрудником каф. фармакогнозии СПХФА В.Й.Соха; приведены данные для исходного соединения и моноацеггильного производного шиконина по алифатической гидроксильной группе.

Возможности использования предлагаемых подходов к исследованию природных фенольных соединений на примере реальных объектов

В данной главе на примерах различных по сложности образцов рассмотрены возможности идентификации фенольных соединений растительного происхождения с использованием метода обращенно-фазовой ВЭЖХ. В случаях сравнительно малокомпонентых смесей (компоненты эфирного масла гравилата городского и кумаринсодержащих препаратов) представление параметров удерживания соединений в форме индексов удерживания и привлечение соответствующих баз данных по ИУ и спектральным отношениям позволяет идентифицировать компоненты этих смесей без использования стандартных образцов и без препаративного выделения индивидуальных соединений. В случаях, когда при выделении эфирных масел из растений перегонкой с водяным паром не образуется отдельного стоя и компоненты находятся в разбавленных водных растворах, преимущества обращенно-фазовой ВЭЖХ очевидны. С помощью этого метода можно легко идентифицировать компоненты, поглощающие в ближнем ультрафиолете, без какой-либо дополнительной пробоподготовки. Так, вконденсате паров воды, полученном из подземных органов гравилата городского как основной компонент был идентифицирован эвгенол, который по значениям параметров А(254/220) и/или А(280/246) можно однозначно отличить от изомерного изоэвгенола Кроме того, в данном образце был идентифицирован один из минорных компонентов - анетол.

При анализе сложных по составу суммарных растительных экстрактов, не содержащих преобладающих компонентов (экстракт травы сабельника болотного), возможности идентификации без препаративного выделения соединений ограничены эффективностью хроматографического разделения исходной смеси. Такая идентификация оказывается возможной для индивидуально детектируемых компонентов. Так, присутствие кверцетина в экстракте сабельника болотного было определено сразу же по результатам ВЭЖХ-анализа и подтверждено последующим выделением этого соединения, близких по химической природе и свойствам соединений, плохо разделяемых в ВЭЖХ, препаративное выделение оказывается столь же неэффективным, а следовательно, возможна только их групповая идентификация.

Следует однако отметить, что в подобных ситуациях полная расшифровка состава возможно не является целесообразной и обязательной. Более простой и достаточной представляется характеристика таких объектов некоторыми "интегральными" параметрами, в частности, суммарным содержанием гликозидов, методика определения которого по результатам элементного анализа образцов до и после кислотного гидролиза предложена в данной работе. Установлено, что экстракт травы сабельника болотного (Cómarum palustre L) содержит около 63% гликозидов и, соответственно, 37% агликонов.

Í

В ходе исследований растительного сырья сабельника болотного, как объекта представлявшего особый интерес, проведен анализ травы и корневищ этого растения н; содержание различных групп действующих веществ, определены некоторьп товароведческие показатели (зола, влажность, содержание экстрактивных веществ экстрагируемых этиловыми спиртами различной крепости), рассмотрены анатомически диагностические признаки на поверхностных препаратах листа и стебля, а такж поперечном срезе стебля.

В заключение необходимо подчеркнуть что, эффективное использование предложенны: подходов к идентификации фенольных соединений в ВЭЖХ предполагает расширен» созданных в настоящей работе баз аналитических параметров этих веществ, включающи: индексы удерживания и относительные оптические плотности.

ВЫВОДЫ

1. На примере фенольных соединений растительного происхождения показан; целесообразность создания информационного обеспечения для их идентификации : обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ] основанного на представлении хроматографических параметров в форме индексо удерживания в шкале алкилфенилкетонов.

2. В качестве дополнительных аналитических параметров фенольных соединенш повышающих надежность и однозначность их идентификации в оьращенно-фазовой ВЭЖХ предложены и использованы относительные оптические плотности при разны фиксированных длинах волн. В качестве стандартных для всех органических соединени; параметров рекомендованы спектральные отношения - А(254/220), А(280/246) -сочетании со специфическими отношениями для конкретных групп веществ - А(317/254 А(317/220) для природных кумаринов и А(360/254), А(360/220) - для различных классо флавоноидов.

3. На основе разработанных подходов впервые создана база данных для идентификаци некоторых групп фенольных соединений в обращенно-фазовой высокоэффективно жидкостной хроматографии, включащая их индексы удерживания и относительны оптические плотности, сформированная на основе объединения собственны экспериментальных значений этих параеметров, а также пересчитанных имеющихся литературе данных.

4. На основании изучения закономерностей удерживания в обращенно-фазовой ВЭЖ фенольных соединений с активными атомами водорода и их производных определен соответствующие инкременты ИУ для реакций ацетилирования и метилировани Показана аддитивность этих параметров для соединений, не образующ* внутримолекулярных водородных связей.

5. Предлагаемые подходы использованы для идентификации сеодинений выделяемых из зличных растительных объектов. В частости, в дистилляте из корневищ гравилата родского идентифицированы эвгенол и анетол, при анализе кумаринсодержащих еггаратов в "Аммифурине" подтверждено присутствие ксантотоксина, бергаптена и опимпинеллина; в препарате "Бероксан" - ксантотоксина, бергаптена и «дположительно изобергаптена; в препарате "Псорален" - псоралена или его смеси с опсораленом; в спиртовой вытяжке из черешков листьев борщевика сибирского ентифицирсваны ксантотоксин и бфгаптен.

6. Показано, что экстракт травы сабельника болотного содержит многокомпонентную :есь фенольных соединений без преобладающих веществ. С помощью различных оматографических методов удалось выделить и идентифицировать только три ¡авоноидных соединения: кверцегин и два его гликозида - кверцетин-З-О-глюкозид зокверцитрин) и кверцетин-3-(6-0-рамнозил)-0-глюкозид (рутин).

7. Для характеристики природных образцов, содержащих сложные смеси близких по мической природе компонентов, более рационален подход, основанный на определении зличных "интегральных" параметров. С учетом этого, впервые предложена методика редел ения суммарного содержания гликозидоз в экстрактах флавоноидов, зработанная на примере анализа препарата "Рутин" (содержание гликозидов в пересчете моногликозиды составило 1.95 при теоретически ожидаемом значении 2.0) и экстракта

авы сабельника болотного, в котором мольная доля гликозидов составила около 0.63.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Косман В.М., Блинова К.Ф., Зенкевич И.Г. Идентификация и количественное ределение эвгенола в подземных органах Сеит игЬапит Ь. // Растит. Ресурсы. - 1995, Т. , Вып. 3. - С. 93-97.

2. Зенкевич И.Г., Косман В.М. Относительное поглощение при разных длинах волн -полнительный УФ-спектральный параметр для идентификации органических единений в обращенно-фазовой ВЭЖХ // ЖАХ. - 1996, Т. 51, Вып. 8. - С. 870-874.

3. Зенкевич И.Г., Косман В.М. Закономерности удерживания в обращенно-фазовой )ЖХ соединений с активным! атомами водорода и их ацетильных производных // зисы VII Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии. -., 1996. - С. 49.

4. Косман В.М., Зенкевич И.Г., Блинова К.Ф. Закономерности удерживания и упповая идентификация флазонов, флаванонов и флавонолов в обращенно-фазовой ЭЖХ // Тезисы VII Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной оматографии. - М., 1996. - С. 107.

5. Косман В.М., Зенкевич И.Г., Блинова К.Ф. Применение индексов удерживания да идентификации биологически активных веществ растительного происхождения ) обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на пример! флавоноидов Н Материалы Второго научного конгресса "Традиционная медицина теоретические и практические аспекты". - Чебоксары, 1996, Т. 1. - С. 81-82.

6. Косман В.М., Зенкевич И.Г., Блинова К.Ф. Идентификация флавоноидов i обращенно-фазовой ВЭЖХ. Использование параметров удерживания, обладаюхци: межлабораторной воспроизводимостью // Тезисы докладов Всероссийской научно! конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств". - С.-Пб. 1996.-С. 51.

7. Зенкевич И.Г.,Косман В.М. Закономерности удерживания в обращенно-фазово] ВЭЖХ соединений с активными атомами водорода и их ацетильных производных // ЖФХ - 1997,T.71.N.7.-С. 1293-1297.

8. Косман В.М, Зенкевич И .Г. Информационное обеспечение для идентификаци фенольных соединений растительного происхождения в обращенно-фазовой ВЭЖХ Флавоны, флавонолы, флаваноны и их гликозиды И Растит, ресурсы. - 1997, Т. 33, Вып. 2. С. 14-26.

9. Зенкевич И.Г., Косман В.М., Зиновьева С.П. Метод определения содержали гликозидов в суммарных экстрактах флавоноидов // Растит. Ресурсы. -1997, Т. 33, Вып. 2. С. 91-97.

10. Косман В.М., Зенкевич И.Г., Комисеаренко Н.Ф. Информационное обеспечени для идентификации фенольных соединений растительного происхождения в обращение фазовой ВЭЖХ. Природные кумарины и фурокумарины // Растит. Ресурсы. - 1997, Т. У: Вып. 3. - С. 32-37.

11.I.GZenkevich, V.M.Kosman, N.F.Komissarenko. The systematic characterisation с natural phenolic compounds in reversed phase HPLC. Coumarines and furocoumarines Abstracts of International congress on analytical chemisry. - Moscow, Russia, 1997, Vol. 1. -1 E-54.

12.I.G.Zenkevich, V.M.Kosman. Retention indiccs and relative absorbencies as analytic: parameters for identification of flavonoids in reversed-phase HPLC II Papers of 21-: International Symposium on high performance liquid phase separations and related techniques. Birmingham, United Kingdom, 1997, Vol В.-P. 141.