Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование оксибензола и его монометильных производных

На правах рукописи

Елизарова РГВ ОД Мадина Камбулатовна 1 5 ЯНВ 2Ш

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОКСИБЕНЗОЛА И ЕГО МОНОМЕТИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск - 2003

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Шорманов Владимир Камбулатович Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Квач Александр Сергеевич доктор фармацевтических наук Саломатин Евгений Михайлович

Ведущая организация: государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита состоится" " ^^¿^¿--¿а: 2004 г. в/й'— часов на заседании диссертационного совета 1^08.039.01 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Курск, ул. К.Маркса, д. 3.)

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Оксибензол и его монометильные производные широко применяются в качестве полупродуктов в ряде важнейших органических синтезов, известны как лекарственные средства, стабилизаторы, реактивы. Данная группа соединений является побочными продуктами коксо-газовой промышленности.

Оксибензол и его монометильные производные обладают значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны многочисленные случаи отравления оксиаренами, в том числе и с летальным исходом. Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе их производства, хранения, применения, вследствие аварий, техногенных катастроф, в условиях згрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, употребления недоброкачественных продуктов питания, а также при суицидных попытках.

Имеются данные, согласно которым LD50 оксибензола и его монометильных производных для мышей и крыс составляет приблизительно 400-500 мг/кг, летальные дозы оксибензола и крезолов для человека - соответственно 14 и 150 мг/кг. Большие объемы промышленного синтеза, широкое применение оксибензола и его монометильных производных, высокая токсичность, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования оксибензола и монометилоксибензолов из объектов биологического происхождения , их очистки, обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых соединений в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертации является разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить особенности хроматографической активности исследуемых веществ и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов. Выявить оптимальные условия идентификации и

количественного определения оксибензола, его монометильны> производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ.

2. Изучить возможность применения спектрофотомстрии в УФ-ввдимой и ИК- областях для идентификации рассматриваемых соединений в субстанциях и извлечениях из биологических объектов;

3. Исследовать особенности взаимодействия оксибензола и егс монометильных производных с рядом цветореагентов. Покачан; возможность применения отдельных реакций электрофильного замещенш и образования молекулярных продуктов типа n-донор—л-акцептор £ условиях анализа рассматриваемых соединений.

4. Провести изучение возможности применения жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии . для концентрирования разделения и очистки объектов исследования.

5. Исследовать особенности изолирования рассматриваемых веществ различными группами изолирующих агентов из биологическогс материала, разработать схему очистки извлечений.

6. Изучить характер распределения объектов исследования е организме теплокровных животных.

7. Исследовать сохраняемость рассматриваемых соединений е гнилостно разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Изучены особенности хроматографической активности оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов в сорбентах с гидроксилированной поверхностью и привитыми алкилъными радикалами, выявлены оптимальные условия и рассчитаны отдельные параметры хроматографирования рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов.

По результатам исследований разработаны методики идентификации и количественного определения оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ГСХ и ВЭЖХ.

Исследованы некоторые особенности электронных и ИК-спектров рассматриваемых соединений. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров для повышения селективности качественного спекгрофотометричёского определения исследуемых веществ.

Показана возможность идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе образования молекулярных продуктов и ионных ассоциатов в хромогенных реакциях с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, родамином Ж после предварительного переведения анализируемых веществ в их полинитропроизводные.

Исследованы особенности экстрагирования рассматриваемых соединений из водных растворов в зависимости от рН среды, природы органических экстрагентов, насыщения экстрагентов водой, присутствия электролитов в водном слое.

Для извлечения оксибензола и его монометильных производных из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен этилацетат. На основе использования в качестве изолирующего агента этилацетата и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии разработаны методики определения рассматриваемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях, приемлемые для исследования свежего и гнилостно измененного трупного материала.

На примере оксибензола и его 4-монометильного производного показаны особенности распределения монооксиаренов в органах и биожидкостях теплокровных (кролики).

Изучена сохраняемость рассматриваемых соединений в трупном материале в зависимости от продолжительности процесса сохранения.

На основании проведенных исследований разработана общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометильными производными.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методики изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения моно- и динитропроизводных 2- и 4-метилоксибензолов (информационное письмо "Об определении нитрафена при судебно-химическом исследовании биологического материала"( утверждено Российским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ, № 330 от 19.0б.2000).-Москва, 2000);

- методики идентификации оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методом ТСХ и ВЭЖХ (внедрены в химико-токсикологической лаборатории Ейской больницы (г. Ейск, Краснодарский край), акты внедрения № 235 и № 236 от 21 октября 2003 г.;

- методики идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе хромогенных реакций с производными ксантена и тетразолия после предварительного введения в структуру анализируемых веществ электроф ильных заместителелй (нитрогруппы) (внедрены в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической химии, акты внедрения № 219 и № 220 от 2 ноября 2003 г., и кафедры органической химии, акты внедрения № 224 и № 225 от 7 октября 2003 г., Курского государственного медицинского университета);

- методика идентификации и количественного определения оксиароматических соединений по реакции с гидроксидом натрия после предварительного нитрования (методические рекомендации "'Идентификация и количественное определение лекарственных средств производных 8-оксихинолина" (разрешены к опубликованию цикловой методической комиссией физико-химических и фармацевтических

дисциплин Курского государственного медицинского университета с 1.12.99 г., протокол №2).- Курск, 1999.).

На защиту выносятся:

- результаты исследования хроматографической подвижное! оксибензола, его монометилышх производных и их основпы метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной привитой поверхностью;

- особенности светопоглощения исследуемых веществ в УФ видимой и ИК- областях спектра;

- оптимальные условия взаимодействия оксибензола и ег монометильных производных с рядом цветореагентов;

- методики идентификации и количественного определена рассматриваемых соединений хроматографическими и фотометрическим методами; -

- результаты изучения особенностей экстракции исследуемы веществ из водных растворов;

- методики изолирования из биологического материала и очистк оксибензола и его монометильных производных ;' •

- особенности распределения оксибензола и его 4-метильног производного в организме теплокровных;

- сохраняемость монооксиаренов и их метаболитов в труп но материале;

Апробация работ ы. Основные положения работы апробированы я III Всероссийской конференции "Экоаналитика-98" с- международны участием (Краснодар, 1998 г.); на V Всероссийском съезде судебны медиков (Москва-Астрахань, 2000 г.); на Всероссийской конференци "Экоаналитика-2000" с международным участием (Краснодар, 2000 г.); н Всероссийской конференции "Человек и лекарство" (Москва, 2003 г.); н Международном Форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003 г.).

Связь задач исследования с проблемным плано! фармацевтических наук. Работа выполнялась в соответствии с плано научных исследований кафедры фармацевтической химии Курског государственного медицинского университета (номер государственно регистрации 01.20.0004473), отраслевой научно-исследовательско программой № 35 МЗ РФ.

Публикации. Основное содержание работ отражено в 1 публикациях, одна из которых - патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит и введения, пяти глав, общих выводов, общей схемы исследования и списк цитируемой литературы. Работа изложена на 200 страницах, содержит 1 рисунков, 52 таблицы. Список цитируемой литературы включет 22 источника, из которых 121 - на русском и 101 - на иностранных языках.

В первой главе (обзор литературы) приводятся известные данные о оксибензоле, его монометильных производных, их основных метаболита

и ряде других близких по структуре веществ как объектах химического и химико-токсикологического исследования.

Во второй главе рассмотрены вопросы идентификации анализируемых веществ хроматограф ическими, спектральными методами, а также хромогенными реакциями.

В третьей главе представлены результаты исследований по количественному определению рассматриваемых веществ.

Четвертая глава посвящена вопросам выделения и очистки анализируемых соединений методами экстракции и хроматографии.

В пятой главе приведены результаты изучения особенностей изолирования рассматриваемых оксиаренов из биологического материала и их последующего определения в получаемых извлечениях, рассмотрены вопросы распределения в организме теплокровных и сохраняемости анализируемых веществ в биологических объектах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основными объектами исследования явились оксибензол и его монометильные производные. Исследованы также их основные метаболиты - ряд 1,2- и 1,4-диоксиаренов и 4-оксибензойная кислота.

В процессе исследования рассмотрены условия хроматографирования изучаемых соединений в тонких слоях и колонках нормальнофазных ( "БНреаг!", "Силасорб-600", силикагель Ь 40/100ц ) и обращеннофазных ("БПреагГ', обработанный вазелиновым маслом, "Сепарон С-18") сорбентов. В качестве элюентов применялись отдельные растворители различной полярности и их различные комбинации.

Для характеристики хроматографической подвижности и особенностей разделения анализируемых соединений в тонких слоях рассчитывались значения Яэ, условного удерживания ( В),

относительного коэффициента емкости тонкого слоя (Бк), относительного изменения свободной энергии при адсорбции в тонком слое сорбента (Д(ДО)), для оценки особенностей хроматографирования методом ВЭЖХ -значения времени удерживания (1я), относительного удерживания, числа эффективных теоретических тарелок (Ы), коэффициента емкости (к), относительного коэффициента емкости (Б^) и относительного изменения свободной энергии при адсорбции (Д(ДО)).

Проведенные исследования показали, что оптимальными подвижными фазами при хроматографировании монооксиаренов и их метаболитов в тонком слое нормальнофазного сорбента "ЗПреагГ можно считать системы растворителей гексан-диокеан-пропанол-2 (20:5:1), гексан-диоксан-хлороформ (20:10:4), гексан-пропанол-2 (20:1). При этом у монооксиаренов отмечается более высокая хроматографическая подвижность, чем у диоксиаренов и 4-оксибензойной кислоты.

Для повышения селективности и чувствительности хроматографического определения оксибензола и изомеров монометилоксибензола анализируемые вещества переводили в их

соответствующие полинитропроизводные путем обработки растворо нитрата калия в концентрированной серной кислоте при нагревании I водяной бане (98-1000 С).

Оптимальные условия разделения полинитропроизводных 2- и ' метилоксибензола (соответственно 2-метил-4,6-динитрооксибензола и < метил-2,6-динитрооксибензола) достигаются с использованием подвижне фазы гексан-диоксан (7:3), а полинитропроизводных оксибензола и ! метилоксибензола (соответственно 2,4,6-тринитрооксибензола и З-мсти: 2,4,6-тринитрооксибензола) - с использованием подвижной фазы гекса! диоксан- муравьиная кислота (5:3:0,2) (табл. 1).

Системы гексан-диоксан-хлороформ (20:10:4) и гексан-пропанол-(20:1) применимы также для определения монооксиаренов и и метаболитов методом ВЭЖХ с использованием сорбента "Силасорб-бОС (табл. 2). Характер хроматографической подвижности монооксиарено диоксиаренов и 4-оксибензойной кистоты в принципе остается таким » как и в тонком слое сорбента "ВПреагГ.

Как свидетельствуют данные таблицы 3, в колонках с сорбенто "Силасорб-600" при использовании малополярной подвижной фаз гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) возможно селективное определен!: полинитропроизводных 2- и 4- метилоксибензола (соответственно ^ метил-4,6-динитрооксибензола и 4-метил-2,6-динитрооксибензола), пр использовании подвижной фазы гексан-диоксан-муравьиная кисло! (5:3:0,2) - полинитропроизводных оксибензола и 3-метилоксибензол (соответственно 2,4,6-тринитрооксибензола и 3-метил-2,4,б тринитрооксибензола).

Применение обращеннофазного варианта хроматографирования тонком слое сорбента "БПреагГ, обработанного вазелиновым масло: (модель привитой фазы С ю- Си ), с использованием подвижной фаз] ацетонитрил-вода (1:9) позволяет достичь полного разделения оксибензол и его монометильных производных в виде соответствующи полинитропроизводных. При этом по хроматографической подвижност полинитропроизводные рассматриваемых монооксиаренов располагаютс в ряду : 2-метил-4,6-динитрооксибензол< 4-метил-2,6-динитрооксибензо < 3-метил-2,4,6-тринитрооксибензол< 2,4,6-тринитрооксибензол.

Результаты изучения хроматографических свойств рассматриваемы соединений указывают на возможность их идентификации методами ТС и ВЭЖХ.

Открываемый минимум при идентификации методом ТС) составляет 0,1 -1,2 мкг, методом ВЭЖХ - 0,01 -0,24 мкг.

Разработаны методики количественного определения исследуемы: веществ непосредственно и в виде их полинитропроизводных методо> ВЭЖХ. Методики характеризуются достаточной воспроизводимостью 1 правильностью. Относительная ошибка среднего результата не превышае 2,5%.

Параметры хроматографировання лолшштропроизводиых монооксиаренов в тонком слое сорбента «й11реаг1» (пластины «Силуфол» иУ-254) с использованием оптимальных элюентов

Подвижная Анализируемое вещество Параметры хроматографирования

ЯГ ■ Яэ В А(АС)

Гексан- 2-Метнл-4,6-диннтрооксибензол 0,63 ЧА 1,587 0,612 1171, 099

диоксан (7:3) 2,6-Дшнп ро-4-метилоксибензол 0,51 1,00 1,960 1,000 0,000

2,4,6-Тринитроокснбетол 0,04 0,08 25,000 25,263 -7702,043

Оксибензол 0,51 1,00 1,960 1,000 0,000

Гексап- 2,4,6-Тришггрооксибензол 0,43 0,61 2,325 3,239 -2803,030

дноксан- З-метил-2,4,6-1 рмнитрооксибензол 0,66 0,93 1,515 1,259 -549,312

муравьиная Оксибензол 0,71 1,00 1,408 1,000 0,000

кислота

(5:3:0,2)

Таблица 2

Отдельные параметры хроматографирования рассматриваемых оксиаренов методом ВЭЖХ в колонках с сорбентом «Силасорб-600»

Анализируемые вещества (я Относительное (по отношению к ^ оксибензола) удерживание N к' Л(ДС)

1 2 3 4 5 6 7

Элюент - гексан-диоксан-х лорофррм (20:10:4)

Оксибензол 2-метилоксибензол 3-метилоксибензол 4-метилоксибензол 1,2-диоксибензол 1,4-диоксибензол 1 -метил-3,4-диоксибензол 1 -метил-2,5-диоксибензол 4-оксибензойная кислота 2,41 2,15 2,27 2,32 4,26 7,10 3,78 5,15 5,26 1,000 ' 0,892 0,942 0,963 1,768 2,946 1,568 2,137 2,183 2056 2137 1920 2475 1341 1267 1489 1504 1417 0,42 0,27 0,34 0,36 1,51 3,18 1,22 2,03 2,10 1,00 0,63 0,80 0,86 3,60 7,60 2,93 4,85 5,01 0,000 1109,552 540,275 368,709 -3120,965 -4937,555 -2615,786 -3846,552 -3923,573

Эл юент - гексан-пропанол-2 (20:1 )

Оксибензол 2-метилоксибензол 3-метилоксибензол 4-метилоксибензол 6,40 5,80 6,08 6,12 1,000 0,906 1,888 0,956 2500 2240 2046 1740 0,94 0,76 0,84 0,85 1,00 0,81 0,89 0,90 0,000 513,070 283,740 256,534

Отдельные параметры хроматографирования полинитропроизводных рассматриваемых

монооксиаренов методом ВЭЖХ

Отностельное (по отношению к

Анализируемые вещества оксибензола) удерживание N к' Ру Д(АО

Элюент-гексан-диоксан-муравьиная к-та (5 :3 :0,2)(сорбент "Силасорб 600"),уэл. = 50 мкл/мип

2,4,6-тринитрооксибензол 9,12 2,158 1377 9,729 3,040 -2707,184

3-мстил-2,4,6-тринитрооксибензол 3,77 1,068 1908 3,302 1,032 -71,971

Элюент - гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) (сорбент-"Силасорб-600"), уэл =50 мкл/млн

2-метил-4,6-динитрооксибензол 7,40 0,979 638 0,90 0,96 99,395

4-ме1ил-4,6-динитрооксибензол 9,88 1,307 1285 1,53 1,64 -1204,501

Изучено светопоглощение рассматриваемых соединений в УФ- , видимой областях спектра. В электронных спектрах монооксиаренов и и метаболитов отмечается присутствие полос (в основном п -л* полярных неполярных переходов) достаточно высокой интенсивности. При это; полоса тс -~.*-неполярного перехода в среде неполярных и малополярны растворителей имеет колебательную структуру. В ИК-спектра: исследуемых веществ (табл. 4) выявлены характеристические лолоа поглощения, соответствующие колебаниям различного вида: валентным О

H, С-Н, С=С, ==С-0, деформационным О-Н, =С-Н (плоскостным внеплоскостным), колебаниям С=0. Как свидетельствуют полученны результаты, присутствие полос, соответствующих тем или иным вида! колебаний и положение этих полос индивидуально для каждого и исследуемых оксиаренов.

Получение результаты свидетельствуют о возможност идентификации оксибензола, его монометильных производных и и основных метаболитов по УФ- , видимым и ИК-спектрам поглошенш Исследованы возможности получения окрашенных продукто анализируемых оксиаренов в ряде реакций: электрофильного замещени (нитрование) с последующим получением аци-нитросолей, образовани ионных ассоциатов (с родамином Ж) и молекулярных комплексов ( хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, ДМФА, пирроксаном) поел предварительного нитрования, а также окисления хлоридом 2,3,5 трифенилтетразолия.

Образование молекулярных комплексов происходит в данном случа как за счет сил электростатического притяжения, так и за счет перенос электронной плотности (по типу п-донор - 71-акцептор) с молекул! реагента (избыток электронной плотности обусловлен свободными парам: электронов атома азота или кислорода ) на молекул полинитропроизводного оксиарена (недостаток электронной плотност обусловлен смещением я-электронного облака с ароматического ядра сторону электрофильных заместителей - нитрогрупп ).

Реакция окисления хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия позволяе селективно определять полиоксиарены в присутствии монооксиаренов.

На основе рассмотренных реакций разработаны методик: идентификации анализируемых веществ. Открываемый минимум - 0,08

I,0 мкг/мл.

Разработаны методики количественного фотометрического определения исследуемых веществ. Относительная ошибка средней результата во всех случаях не превышает 2%.

Для очистки исследуемых оксиаренов рассмотрена возможност применения методов экстракции и хроматографии. В частност! исследованы особенности экстрагирования анализируемых веществ и водных растворов органическими растворителями.

Таблица 4

Особенности поглощения рассматриваемых оксиаренов в ИК-области спектра (4000-400 см'1)

Максимум характеристических полос, см"1

Вид колебаний Окси-бензол 2-метил-окси-бензол 3-метил-окси-бензол 4-метил- окси- бензол 1,2-диок-сибензол 1,4-диок-сибензол 1-метил-3,4-диок-сибензол 1-метил-2,5-диок-сибензол 4-окси-бензойкая хислота

Валент. О-Н 3406 3432 3331 3402 3263 3306 3298 3315 3292 3166?

Деформ. О-Н 1377 1378 1342? 1364 1360 1355 1357 1389 1361

Валент. С-Н 2922 ' 2860 3026 2924 3052 3031

Валент. С—С 1596 1595 1614 1615 1623 1518 1604 1626

1500 1497 1590 1600 1602 1470? 1520 1607

1474 1466 1491 1463? 1514 1518 1510

Валент. —С-О 1241 1244 1247? 1239 1231 1233 1244

Деформ. ПЛОСК. 1168 1176 1156 1105 1190 1218 1110 1199 1114

1071 1110 1084 1043 1095 1118 1037 1109 1000

1046 1040 1000 842 1041 1097 1009 1004 1047 1002

Деформ. внеплоск. ~С-Н 754 753 775 816 722 831 865 876 829

692 713 689 808 859 801 818

Колебания С=0 1724

ИК-спектры стандарта оксибензола (А) и оксибензола, изолированного из биоматериала и очищенного в соответствии с предлагаемой схемой (Б)

УЧ«у«питЬ|г» (сп-П

Рис. 1

Показано, что наиболее полно рассматриваемые монооксиареиы извлекаются из кислых, нейтральных и слабо-щелочных сред диэтиловым эфиром и этилацетатом, полиоксиарены и 4-оксибензойная кислота -этилацетатом и прспаиолом-2 из растворов с кислой и нейтральной реакцией среды.

Основываясь на результатах изучения хроматографической активности анализируемых соединений, предложены способы их очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонках с силикагелем Ь40/100 р и в тонком слое сорбента "8НреагГ на пластинах "Силуфол ЦУ-254". Потери оксибензола, изомеров метилоксибензола и их полинитропроизводных не превысили 1%, потери диоксиаренов и 4-оксибензойной кислоты - 2%.

В серии контрольных опытов показана достаточная эффективность предлагаемых схем очистки извлечений с применением методов экстракции и хроматографии. Высокая степень очистки монооксиаренов и их метаболитов сочетанием экстракции и макроколоночной хроматографии подтверждается, в частности, практически полным совпадением положения основных характеристических полос в ИК-спектрах анализируемых веществ с положением соответствующих полос в ИК- спектрах стандартных веществ. Предложенный вариант очистки позволяет использовать для идентификации рассматриваемых оксиаренов колебательную спектрофотометрию в диапазоне частот 4000-400 см

Проведено сравнительное изучение изолирования рассматриваемых веществ из биологического материала более чем десятью изолирующими агентами, относящимися к низшим алканам (гексан), аренам (толуол), алифатическим спиртам (этанол), кетонам (ацетон), сложным эфирам (этилацетат), алифатическим кислотам ( уксусная кислота), нитрилам (ацетонитрил), галогеналканам (хлороформ), производным кислородсодержащих гетероциклов (диоксан-1,4), алкиламидов кислот (ДМФА), а также водой и водными растворами (0,1 н. раствор гидроксида натрия и 8 % раствор уксусной кислоты).

Наиболее высокий процент извлечения анализируемых соединений достигается при изолировании их этилацетатом.

Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемых веществ этилацетатом от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого настативания.

Установлено, что оптимальные условия изолирования шализируемых веществ могут быть достигнуты уже при двукратном шстаивании при условии, что соотношение изолирующей жидкости и 5иоматериала составляет как минимум 2:1, а продолжительность каждого гастаивания по крайней мере полчаса.

На основании предварительных исследований разработаны методики определения оксибензола, его монометильных производных и их основных 1етаболитов в тканях трупных органов, крови и моче после изолирования

этилацетатом и очистки извлечённых веществ методами экстракции и хроматографии. Результаты определения представлены на рис. 2 и 3.

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании рассматриваемых соединений в биологическом материале в количестве ЮС мг в 100 г трупного органа (в 100 мл биожидкости) разработанные методики позволяют определить в ткани печени 67,21-84,85 °/< монооксиаренов и 67,13-81,77 % их метаболитов, в крови - соответственнс 68,29-86,24 % и 68,97-79,56 %, в моче -соответственно 70,38-88,93 % í 71,16-88,26 % этих соединений.

Предложенные методики характеризуются достаточными дл: подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью Значения стандартного отклонения и полуширины доверительно г< интервала (п=5; Р=0,95) не превышают соответственно 3,42 и 4,24 определение в ткани печени), 3,31 и 4,12 (определение в крови), 3,14 и 3,9 ( определение в моче) при условии содержания исследуемых веществ количестве 100 мг в 100 г (100 мл биологического материала).

Определяемый минимум рассматриваемых монооксиаренов и ряд их метаболитов составляет 0,4-1,2 мг в 100 г ткани трупного органа, 0,3-1, мг в 100 мл крови и 0,15-0,50 мг в 100 мл мочи.

Показана возможность применения разработанных методик пр исследовании гнилостно изменённого трупного материала. Определяемы минимум анализируемых соединений в ткани трупной печен подвергшейся гнилостным изменениям, составляет 0,8-1,6 мг в 100 биоматериала.

На примере оксибензола и 4-метилоксибензола изучек особенности распределения рассматриваемых монооксиаренов в организ; теплокровных животных (кролики). Подопытным животным в состоящ общей анестезии вводили внутрижелудочно отравляющее вещество в ви водного раствора или смеси водного раствора и суспензии из расчёта 4 мг на 1 кг массы. После гибели животных, которая наступала через 2 часа, трупы вскрывали и исследовали внутренние органы и биологическ жидкости на наличие в них отравляющего вещества (суммы свободно? связанной форм), применяя разработанные методики.

Как свидетельствуют полученные данные, монооксиарены наибольших количествах обнаруживаются в моче, печени и пот отравленных животных.

Исследованы особенности сохранения оксибензола, i монометильных производных и ряда их метаболитов в трупном материа Результаты исследований представлены на рис. 4 и 5.

Как свидетельствуют полученные данные, рассматривав ¡v монооксиарены и их метаболиты могут быть обнаружены в сохранясь трупном материале в течение 8-12 недель.

По результатам проведённых исследований предложена o6i схема химико-токсикологического анализа рассматриваеь монооксиаренов и их метаболитов. Предлагаемая схема позвох

Результаты определения монооксиаренов в биологическом материале методом ВЭЖХ

% а) Свободные

ОБ 2-МОБ З-МОБ 4-МОБ

|э Ткани трупного органа (пачени)ОКроаь «Моча | б) Связанные

100

ОБ 2-МОБ З-МОБ 4-МОБ

а Ткани трупного органа (печени) □ Кровь и Моча

Рис.2

Результаты определения метаболитов монооксиаренов в биологическом материале методом ВЭЖХ

% а) Свободные

100

1,2-ДОБ 1,4-ДОБ 1-М-3.4-ДОБ 1-М-2.5-ДОБ 4-ОБК

[и Ткани трупного органа (печени? пКроаь мМоча [

б) Связанные

100

1,2-ДОБ 1,4-ДОБ 1-М-3.4-ДОБ 1-М-2.5-ДОБ 4-ОБК

¡яТкани трупного органа (печени) □ Кровь иМочТ]

Рис.3

Сохраняемость рассматриваемых монооксиаренов в трупном материале

1-4-метилоксибензол; 2- 1 -метилоксибепзол; 3- 3- метилоксибензол; 4- оксибензол

Рис.4

Сохраняемость метаболитов рассматриваемых монооксиаренов в трупном материале

1- 1,2-диоксибензол; 2- 1-метил-3,4-диоксибензол; 3- 4-оксибензойная кислота; 4- 1,4.диоксибензол; 5- 1-метил-2,5-диоксибензол

Рис. 5

изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определит каждое из исследуемых веществ при их совместном присутствии.

ВЫВОДЫ

1. При хроматографировании оксибензола, изомеро метилоксибензола и их метаболитов в тонких слоях и колонка: нормальнофазных сорбентов (соответственно «8Иреаг1» и «Силасорб-600» оптимальными элюентами являются системы растворителей гексан диоксан-хлороформ (20:10:4), гексан-пропанол-2 (20:1), и гексан-диоксан пропанол-2 (20:5:1), при хроматографировании 2,4,6 тринитропроизводных оксибензола и 3-метилоксибензола - систем! гексан-диоксан (7:3) и гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2), пр хроматографировании 4,6- и 2,6-динитропроизводных соответственно 24- метилоксибензола - система гексан-диоксан-пропанол-2 (40:50:1).

Оксибензол и изомеры монометилоксибензола могут быт полностью разделены в виде соответствующих полинитропроизводных тонком слое сорбента «851реаг1», обработанном вазелиновым масло (модель привитой фазы Сю-Сц), с использованием элюента ацетонитрш вода (1 : 9). При этом хроматографическая подвижное! полинитропроизводных увеличивается в ряду: 2-метил-4,( динитрооксибензол < 4-метил-2,6-динитрооксибензол < 3-метил-2,4,( тринитрооксибензол < 2,4,6-тринитрооксибензол.

Разработаны методики количественного определена анализируемых соединений непосредственно или в виде соответствующе полинитропроизводных методом ВЭЖХ. Относительная ошибка средни результата не превышает 2,5%.

2. Изучены особенности поглощения электромагнитного излучен} рассматриваемым рядом соединений в различных областях спектра.

Наличие специфических особенностей в поглощении отдельным соединениями УФ-, видимого и ИК-света обусловливает возможное: использования методов электронной и колебательной спектрофотометр« для их идентификации.

На основе особенностей поглощения исследуемыми веществами У <3 излучения в среде 95% этанола разработаны методики их количественно! определения спектрофотометрическим методом. Относительная ошиб! среднего результата не превышает 1%.

3. Исследованы особенности нитрования (электрофильнс замещение) исследуемых монооксиаренов и их метаболитов последующим получением окрашенных продуктов в реакциях образоваш аци-нитросолей (с гидроксидом натрия), ионных ассоциатов (с родамине Ж), молекулярных комплексов (с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразоли ДМФА, пирроксаном), а также особенности реакции окисления объект* исследования хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия.

На основе изученных хромогенньзх реакций разработаны методш идентификации и количественного фотометрического определен)

анализируемых веществ. Относительная ошибка среднего результата при количественном определении не превышает 2%.

4. Изучена экстрагируемость оксибензола, его монометильных производных и их метаболитов из водных растворов органическими растворителями в зависимости от природы эксграгента, рН среды и присутствия электролитов.

Установлено, что монооксиарены наиболее полно извлекаются из кислых, нейтральных, и слабощелочных раствороз, их метаболиты - из растворов с кислой и нейтральной реакцией среды.

5. Определены особенности препаративного хроматографирования рассматриваемых веществ в колонке с силикагелем Ь 40/1 ОО^х при последовательном использовании подвижных фаз гексан-диэтиловый эфир (6:4) и гексан-диэтиловый эфир (2:8).

Установлено, что потери исследуемых оксиаренов в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов незначительны и не превышают соответственно 2 и 1,5%.

С использованием методов электронной и ИК-спектрофотометрии показана достаточная эффективность предлагаемых схем очистки исследуемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала.

6. Проведено сравнительное изучение изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала изолирующими агентами различной химической природы.

Установлено, что наибольшие значения степени извлечения исследуемых оксиаренов достигаются при использовании в, качестве изолирующего агента этилацетата.

Определены оптимальные условия изолирования объектов исследования этилацетатом.

Разработаны методики определения монооксиаренов я их метаболитов в ткани трупных органов (печени), крови и моче на основе изолирования этилацетатом и очистки методами экстракции и хроматографии.

7. При содержании рассматриваемых соединений в биологическом материале в количестве 100 мг в 100 г (100 мл) биологического материала разработанные методики позволяют определить в ткани печени 67,2184,85% монооксиаренов и 67,13-87,77% их метаболитов, в крови -:оответственно 68,29-86,21% и 68,97-79,56%, в моче - соответственно 70,38-88,93% и 71,16-88,26% этих соединений.

Предложенные методики отличаются достаточными для подобного эода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемых монооксиаренов и их основных метаболитов составляет 0,4-1,2 мг в 100 гткани трупного органа, ),3-1,0 мг в 100 мл крови и 0,15-0,50 мгв 100 мл мочи.

Показано, что разработанные методики применимы для определения исследуемых веществ в гнилостно изменённом биологическом материале.

8. На примере оксибензола и 4-метилоксибензола исследовав особенности распределения монооксиаренов в организме теплокровш животных при внутрижелудочном введении отравляющего вещества.

Установлено, что монооксиарены в наибольших количеств, обнаруживаются в моче, печени и почках отравленных животных,

9. Изучена сохраняемость рассматриваемых монооксиаренов и I метаболитов в трупном материале. Показано, что данные соединен] могут быть обнаружены в сохраняемом трупном материале по крайн мере в течение 8-12 недель.

10. На основе проведенных исследований предложена общая схе! исследования биологического материала при отравлении оксибензолом его монометильными производными.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Елизарова М.К. Распределение 4-метилфенола в организ! теплокровных животных / М.К.Елизарова, В.К.Шорманов // Судебн медицинская экспертиза.-2001.-Т. 44, № 6.-С. 30-33.

2. Елизарова М.К. Идентификация 4-метилоксибензола в трупнс материале методом ИК- спектрофотометрии / М.К.Елизаро! В.К.Шорманов // Сб. Работ 68-ой науч. сессии КГМУ и отделения медик биологических наук Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН. И.-Курск, 2002.-С. 219.

3. Определение примеси 1,4-диоксибензола в этамзилате / В.К.Шорманс В.С.Удалов, М.К.Елизарова и др. // X Всерос. нац. конгр. «Человек лекарство» (7-11 апреля 2003 г., г. Москва).-Москва, 2003.-С. 770.

4. С 1 2153168 1Ш7 ООШЗЗ/48. Способ определения сложно нитрофенольного препарата «Нитрафен» / В.К.Шорманов, ЛЕ.Сипливс М.К.Елизарова и др. (Курский гос. мед. ун-т.-№ 99105092/13, Зая£ 15.03.99 //Изобретения (Заявки и патенты).-2000.-№ 20.-С. 201.

5. Шорманов, В.К. Определение алкилдинитрофениловых эфир алифатических кислот и их отдельных метаболитов в биологическс материале / ВХШормапов, М.К.Елизарова // Всерос. науч. кон «Экоаналитика-98» (1-6 окт. 1998 г., г. Краснодар).- Краснодар, 1998.452-453.

6. Шорманов, В.К. Определение оксибензола и его алкильш производных в природных водоёмах / В.К.Шорманов, М.К.Елизарова Всерос. науч. конф. «Экоаналитика-2000» (17-23 сект. 2000 г., Краснодар).-Краснодар, 2000.-С. 375-376.

7. Шорманов В.К. Особенности распределения оксибензола в организ] теплокровных животных / В.КШорманов, М.К.Елизарова // Материалы съезда судебных медиков Российской Федерации (2000 г., г. Астрахань Астрахань, 2000.-С. 338-339.

8. Шорманов В.К. Особенности экстрагирования фенола и 4-метилфено из водных растворов / В.К.Шорманов, М.К.Елизарова, С.В.Григорье!

Е.А.Агаркова // Судебно-медицинская экспертиза.-2001.-Т. 44, № 1.-С.26-28.

9. Шорманов В.К. Определение феяилсалицияата и его метаболитов а субстанциях, таблетках и биологическом материале методом ТСХ / В.К.Шорманов, М.К.Елизарова, М.В.Полонская II Региональная науч.-практ. конф. «Вопросы медицинской науки, практики и подготовки кадров в Черноземье» (2001 г., г. Белгород).-Белгород, 2001 .-С. 63-64.

10. Шорманов В.К. Информационное письмо об определении нитрафена при судебно-химическом исследовании биологического материала / В.К.Шорманов, М.К.Елизарова.-М., 2000.-40 с.

11. Шорманов В.К. Определение оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов в биологическом материале / В.К.Шорманов, М.К.Елизарова // Межд. Форум «Аналитика и аналитики» (2-6 июня 2003 г., г. Воронеж).-Воронеж, 2003.- С. 565.

12. Экстрагирование 1,2- и 1,4-диоксибензола из водных растворов / М-К.Елизарова, В.С.Удалов, Н.Н.Карамышев, В.К.Шорманов // Судебно-медицинская экспертиза.-2003.-Т. 46.-№ 4.-С.32-35.

Сдано в набор 05.12.2003 г. Подписано в печать 05.12.2003 г. Формат 60x84 1/1 б. Бумага Айсберг. Объем 1,0 усл. печ. л. Гарнитура Тайме. Тираж 100 экз. Заказ № 175.

Отпечатано в МУ «Издательский центр «ЮМЭКС»,' 305000, г. Курск, ул. Володарского, 44а Лицензии: ПД № 01068 от 18.05.2001 г.

ИД №04804 от 21.05.2001 г.

Актуальность темы. Оксибензол и его монометильные производные широко применяются в качестве полупродуктов в ряде важнейших органических синтезов, известны как лекарственные средства, стабилизаторы, реактивы. Данная группа соединений является побочными продуктами коксово-газовой промышленности.

Оксибензол и его монометильные производные обладают значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны многочисленные случаи отравления оксиаренами, в том числе и с летальным исходом. Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе производства , хранения и применения, вследствие аварий , техногенных катастроф, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий , употребления недоброкачественных продуктов питания, а также при суицидных попытках.

Имеются данные, согласно которым LD50 оксибензола и его монометильных производных для мышей и крыс составляет приблизительно 400-500 мг/кг, летальные дозы оксибензола и крезолов для человека соответственно около 14 мг/кг и 150 мг/кг . Большие объемы промышленного синтеза, широкое применеие оксибензола и его метальных производных , их высокая токсичность, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования оксибензола и монометилоксибензолов из объектов биологического происхождения , их обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемых соединений в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертации является разработка методики химико-токсикологического исследования оксибензола и его монометильных производных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: I

1. Определить особенности хроматографической активности исследуемых веществ и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов. Выявить оптимальные условия идентификации и количественного определения оксибензола , его монометильных производных и их основных метаболитов методом ТСХ и ВЭЖХ .

2. Изучить возможность применения спектрофотометрии в УФ-, видимой, и ИК-областях для идентификации рассматриваемых соединений в субстанциях и в извлечениях из биологических объектов. I

3. Исследовать особенности взаимодействия оксибензола и его монометильных производных с рядом цветореагентов. Показать возможность применения отдельных реакций электрофильного замещения и образования молекулярных продуктов типа п-донор - п-акцептор в условиях анализа рассматриваемых соединений.

4. Провести изучение возможности применения жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии для концентрирования, разделения и очистки объектов исследования.

5. Исследовать особенности изолирования рассматриваемых веществ различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

6. Изучить характер распределения объектов исследования в организме теплокровных животных.

7. Исследовать сохраняемость рассматриваемых соединений в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Изучены особенности хроматографической активности оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов в сорбентах с гидроксилированной поверхностью и поверхностью с привитыми алкильными радикалами , выявлены оптимальные условия и расчитаны отдельные параметры хроматографирования рассматриваемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов.

По результатам исследования разработаны методики идентификации и количественного определения оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ.

Исследованы некоторые особенности электронных и ИК-спектров рассматриваемых соединений. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения исследуемых веществ.

Показана возможность идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе образования молекулярных продуктов и ионных ассоциатов в хромогенных реакциях с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, родамином Ж после предварительного переведения анализируемых веществ в их полинитропроизводные.

Исследованы особенности экстрагирования рассматриваемых веществ из водных растворов в зависимости от рН среды, природы органических экстрагентов, насыщения экстрагентов водой, присутствия электролитов в водном слое.

Для извлечения оксибензола и его монометильных производных из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен этилацетат. На основе использования в качестве изолирующего агента этилацетата и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии разработаны методики определения рассматриваемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях, приемлемые для исследования свежего и гнилостно измененного трупного материала.

На примере оксибензола и его 4-монометильного производного показаны особенности распределения монооксиаренов в органах и биожидкостях теплокровных (кролики).

Изучена сохраняемость рассматриваемых соединений в трупном материале в зависимости от продолжительности процесса сохранения .

На основании проведенных исследований разработана общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометильными производными.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

-методики изолирования из биологического материала, очистки, идентификации, и количественного определения моно- и динитропроизводных 2- и 4-метилоксибензолов (информационное письмо «Об определении нитрафена при судебно-химическом исследовании биологического материала» (утверждено Российским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ РФ, № 330 от 19. 06. 2000).- Москва, 2000;

-методики идентификации оксибензола, его монометильных производных и их основных метаболитов методами ТСХ и ВЭЖХ (внедрены в.токсикологической лаборатории Ейской больницы (г.Ейск, Краснодарский край), акты внедрения № 235 и № 236 от 21 октября 2003 г.;

-методики идентификации и количественного определения оксибензола и его монометильных производных на основе хромогенных реакций с производными ксантена и тетразолия после предварительного введения в структуру анализируемых веществ электрофильных заместитетелей (нитрогруппы) (внедрены в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической химии, акты внедрения № 219 и № 220 от 2 ноября 2003 г., и кафедры органической химии, акты внедрения № 224 и № 225 от 7 октября 2003 г., Курского государственного медицинского университета;

-методика идентификации и количественного определения оксиароматических соединений по реакции с гидроксидом натрия после предварительного нитрования (методические рекомендации

Идентификация и количественное определение лекарственных средств производных 8-оксихинолина» (разрешены к опубликованию цикловой методической комиссией физико-химических и фармацевтических дисциплин Курского государственного медицинского университета от 01.12.99 г., протокол № 2).-Курск, 1999.

На защиту выносятся:

-результаты исследования хроматографической подвижности оксибензола и его монометильных производных и их основных метаболитов в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностью;

-особенности светопоглощения исследуемых веществ в УФ-видимой и ИК-областях спектра;

-оптимальные условия взаимодействия оксибензола и его монометильных производных с рядом цветореагентов;

-методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений хроматографическими и фотометрическими методами;

-результаты изучения особенностей экстракции исследуемых веществ из водных растворов;

-методики изолирования из биологического материала и очистки оксибензола и его монометильных производных;

-особенности распределения оксибензола и его 4-метилпроизводного в организме теплокровных;

-сохраняемость монооксиаренов и их основных метаболитов в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы апробированы на III Всероссийской конференции «Экоаналитика-98» с международным участием (Краснодар, 1998 г); на V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000 г); на Всероссийской конференции «Экоаналитика -2000» с международным участием (Краснодар, 2000 г); на Всероссийской конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2003 г); на Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003г).

Связь задач исследования с проблемным плано м фармацевтических наук. Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01. 20. 0004473), отраслевой научно-исследовательской программой № 35 МЗ РФ.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 публикациях , одна из которых - патент на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, общих выводов, общей схемы исследования и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 198 страницах, содержит 18 рисунков, 52 таблицы. Список цитируемой литературы включает 222 источника, из которых 121 на русском и 101 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. При хроматографировании оксибензола, изомеров метилоксибензола и их метаболитов в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов (соответственно "Silpearl" и "Силасорб-600") оптимальными элюентами являются системы растворителей гексан-диоксан-хлороформ (20:10:4), гексан-пропанол-2 (20:1), и гексан-диоксан-пропанол-2 (20:5:1), при хроматографировании 2,4,6-тринитропроизводных оксибензола и 3-метилоксибензола - системы гексан-диоксан (7:3) и гексан-диоксан-муравьиная кислота (5:3:0,2), при хроматографировании 4,6- и 2,6-динитропроизводных соответственно 2- и 4- метилоксибензола - система гексан-диоксан-пропанол-2 (40:50:1).

Оксибензол и изомеры монометилоксибензола могут быть полностью разделены в виде соответствующих полинитропроизводных в тонком слое сорбента "Silpearl", обработанном вазелиновым маслом (модель привитой фазы С10-С15), с использованием элюента ацетонитрил-вода (1 : 9). При этом хроматографическая подвижность полинитропроизводных увеличивается в ряду: 2-метил-4,6-динитрооксибензол < 4-метил-2,6-динитрооксибензол < З-метил-2,4,6-тринитрооксибензол < 2,4,6-тринитрооксибензол.

Разработаны методики количественного определения анализируемых соединений непосредственно или в виде соответствующих полинитропроизводных методом ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата не превышает 2,5%.

2. Изучены особенности поглощения электромагнитного излучения рассматриваемым рядом соединений в различных областях спектра.

Наличие специфических особенностей в поглощении отдельными соединениями УФ-, видимого и ИК-света обусловливает возможность использования методов электронной и колебательной спектрофотометрии для их идентификации.

На основе особенностей поглощения исследуемыми веществами УФ-излучения в среде 95% этанола разработаны методики их количественного определения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает 1%.

3. Исследованы особенности нитрования (электрофильное замещение) исследуемых монооксиаренов и их метаболитов с последующим получением окрашенных продуктов в реакциях образования аци-нитросолей (с гидроксидом натрия), ионных ассоциатов (с родамином Ж), молекулярных комплексов (с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия, ДМФА, пирроксаном), а также особенности реакции окисления объектов исследования хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия.

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации и количественного фотометрического определения анализируемых веществ. Относительная ошибка среднего результата при количественном определении не превышает 2%.

4. Изучена экстрагируемость оксибензола, его монометильных производных и их метаболитов из водных растворов органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды и присутствия электролитов.

Установлено, что монооксиарены наиболее полно извлекаются из кислых, нейтральных, и слабощелочных растворов, их метаболиты - из растворов с кислой и нейтральной реакцией среды.

5. Определены особенности препаративного хроматографирования рассматриваемых веществ в колонке с силикагелем L 40/100ц при последовательном использовании подвижных фаз гексан-диэтиловый эфир (6:4) и гексан-диэтиловый эфир (2:8).

Установлено, что потери исследуемых оксиаренов в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов незначительны и не превышают соответственно 2 и 1,5%.

С использованием методов электронной и ИК-спектрофотометрии показана достаточная эффективность предлагаемых схем очистки исследуемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала.

6. Проведено сравнительное изучение изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала изолирующими агентами различной химической природы.

Установлено, что наибольшие значения степени извлечения исследуемых оксиаренов достигаются при использовании в качестве изолирующего агента этилацетата.

Определены оптимальные условия изолирования объектов исследования этилацетатом.

Разработаны методики определения монооксиаренов и их метаболитов в ткани трупных органов (печени), крови и моче на основе изолирования этилацетатом и очистки методами экстракции и хроматографии.

7. При содержании рассматриваемых соединений в биологическом материале в количестве 100 мг в 100 г (100 мл) биологического материала разработанные методики позволяют определить в ткани печени 67,2184,85%, монооксиаренов и 67,13-87,77% их метаболитов, в крови -соответственно 68,29-86,21% и 68,97-79,56%, в моче - соответственно 70,38-88,93% и 71,16-88,26% этих соединений.

Предложенные методики отличаются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемых монооксиаренов и их основных метаболитов составляет 0,4-1,2 мг в 100 г ткани трупного органа, 0,3-1,0 мг в 100 мл крови и 0,15-0,50 мг в 100 мл мочи.

Показано, что разработанные методики применимы для определения исследуемых веществ в гнилостно изменённом биологическом материале.

8. На примере оксибензола и 4-метилоксибензола исследованы особенности распределения монооксиаренов в организме теплокровных животных при внутрижелудочном введении отравляющего вещества.

Установлено, что монооксиарены в наибольших количествах обнаруживаются в моче, печени и почках отравленных животных.

9. Изучена сохраняемость рассматриваемых монооксиаренов и их метаболитов в трупном материале. Показано, что данные соединения могут быть обнаружены в сохраняемом трупном материале по крайней мере в течение 8-12 недель.

10. На основе проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении оксибензолом и его монометцльными производными.