Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Разработка методологии химико-токсикологического и судебно-химического определения нейролептиков производных бензамида

На правах рукописи

КАЛЁКИН РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО И СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОЛЕПТИКОВ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗАМИДА

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

2 5 ОКТ 2012

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора фармацевтических наук

Москва-2012

005053997

005053997

Работа выполнена в ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

доктор фармацевтических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая кафедрой фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России

доктор фармацевтических наук, профессор, руководитель курса по токсикологической химии ГБОУ ВПО Курский Государственный Медицинский Университет Минздравсоцразвития России

доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова Минздравсоцразвития России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»

Защита состоится «26» декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ (119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан «-3 » ОСМЛХМ 2012 г.

Саломатин Евгений Михайлович

Раменская Галина Владиславовна

Шорманов Владимир Камбулатович

Берлянд Александр Семёнович

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В связи со значительным ростом числа психических заболеваний в медицинской практике растет и потребность в психотропных препаратах, в том числе в нейролептиках. Вместе с тем нейролептики при передозировке, взаимодействии с другими лекарственными средствами, злоупотреблении ими, повышенной чувствительности организма, могут привести к отравлениям.

Отравления нейролептиками, в том числе производными бензамида, антипсихотического действия прочно занимают 3-4 место среди отравлений лекарственными препаратами. В медицинской практике отравления лекарственными препаратами этой группы занимают 10-15%. Отравления у детей младшего возраста являются случайными, подростки часто применяют антипсихотические нейролептики в смесях с целью получения наркотического эффекта, так как они потенцируют действие наркотических анальгетиков, снотворных и других седативных средств.

К нейролептикам также относится группа производных бензамида. К этой группе относятся такие лекарственные препараты - амисульприд, сульпирид и-тиаприд. Структура производных бензамида представлена на рисунке 1.

одинаковая структура молекулы для всех замещенных бензамида

Рисунок 1 - Структура молекул замещенных бензамида (амисульприд -С4Н71Ч-СНз, И2 - СН2-СН3, Я3 - >1Н2; сульпирид И., - С4Н7Ш:2Н5, Я2 - >Ш2, Я3 - отсутствует; тиаприд Я, - СН2-М-С4Н10, Я2 - СН3 И3 - отсутствует)

В настоящее время группа производных бензамида является перспективным направлением для разработки новых лекарственных средств для целей и задач современной медицины и производится их синтез уже нескольких десятков соединений. Группы новых синтезируемых производных лежат в сфере ангиотензивного направления. Ангиотензивные лекарственные средства обладают различными побочными эффектами иногда приводящими к летальному исходу. Таким образом, группа лекарственных средств производных бензамида постоянно расширяется. На основании структурных модификаций молекулы бензамида в Башкирском

государственном медицинском университете предложены 36 производных бензамида, которые в будущем будут промышленно синтезироваться и применяться в медицине.

Бесконтрольное и длительное применение производных бензамида сопровождается развитием побочных явлений. При употреблении лекарственных препаратов этой группы в больших дозах (передозировка) наблюдаются: выраженный седативный эффект; нарушение сознания (вплоть до комы); экстрапирамидальные расстройства, остановка сердца, приводящая к так называемому синдрому «внезапной смерти». В связи, с этим сульпирид и тиаприд включены в «Перечень наименований токсичных веществ, наиболее часто встречающихся при острых отравлениях» - приказ МЗ РФ №460 от 29 декабря 2000 г. «Об утверждении учетной документации токсикологического мониторинга».

Анализ отечественной и зарубежной литературы свидетельствует о том, что не были произведены систематические исследования по разработке методик изолирования, идентификации и количественного определения производных бензамида в биологических объектах. Имеются разрозненные работы по исследованию производных бензамида в области судебно-химического или химико-токсикологического анализа. В работе E.H. Степановой и В.В. Бажанова изложены данные по идентификации эглонила (сульпирид), содержащегося в извлечении из трупного материала, по сопоставлению его ИК-спектров поглощения с образцом сравнения. Опубликованы тезисы (Скрипниковой Н.В. с соавторами), в которых приведены подходы по судебно-химическому анализу тиаприда в трупном материале хроматографическими и спектральными методами, с установлением факта летального исхода специалистами Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области исследуемым лекарственным средством. В работе Ю.П. Калинина, Р.Г. Мансуровой и C.J1. Шашина описан способ идентификации хромато-масс-спектрометрическим методом большой группы наркотических и психотропных веществ, в том числе и производных бензамида. Также данная проблема не осталось без внимания зарубежных коллег - судебных токсикологов. Французскими экспертами научной лаборатории полиции Марселя Рок P. Rop, Marie H. Sournac, Isabelle Elie, Joëlle Burle и Monique Fornaris приведен случай летального исхода сульпиридом при исследовании трупной крови методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Также полицией Европы (Франции и Великобритании) установлен факт употребления тиаприда Анри Полем водителем принцессы Дианы и который является одной из официальных версий в причине автоаварии машин Дианы «Мерседес» и «Фиат Уно» папарацци Джеймса Андансона, в которой погибли принцесса и Доди Аль-Файед.

Отсутствуют данные о систематическом подходе к исследованию группы нейролептиков производных бензамида и их дифференциация между собой в условиях проведения судебно-химического и химико-токсикологического исследования.

Судебно-химическое и судебно-медицинское исследование нейролептиков производных бензамида позволит точно установить факт интоксикации и смертельного отравления вышеуказанными лекарственными средствами, а химико-токсикологический анализ, в том числе в области аналитической токсикологии, таких средств позволяет своевременно диагностировать отравления (острое, хроническое) и является одним из способов борьбы с наркоманией, токсикоманией, так как клиническая картина течения отравлений, результаты патологоанатомических, гистологических и других исследований не позволяют установить и дифференцировать отравления соединениями относящиеся к психотропным лекарственным средствам производным бензамида. Для этого необходима разработка и проведение судебно-химических и химико-токсикологических исследований биологического и трупного на наличие этих соединений для целей и задач судебно-химической практики.

Цель работы. По итогам настоящего комплексного исследования разработать методологический подход в плане систематического анализа к изолированию, обнаружению и количественному определению амисульприда, сульпирида и тиаприда для проведения анализа с использованием современных физико-химических методов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• установить на основании социологических и медицинских исследований частоту использования в медицинской практике нейролептиков производных бензамида, частоту злоупотреблений пациентами, как часто и какие побочные эффекты встречаются и с какими препаратами других групп они совместно применяются;

• предложить на основе практических результатов и теоретического обоснования рекомендации к выбору биологических объектов исследования;

• разработать методологический подход к стадии пробоподготовки и изолированию производных бензамида, основываясь на результатах практических исследований и теоретических обоснований;

• разработать методологический подход к систематическому анализу амисульприда, сульпирида и тиаприда на стадии качественного определения в извлечениях из биологических жидкостей и тканей трупов;

• разработать методологический подход к систематическому анализу амисульприда, сульпирида и тиаприда на стадии количественного определения в извлечениях из биологических жидкостей и объектов;

• предложить на основе результатов исследований методологический системный подход к общей схеме судебно-химического и химико-токсикологического анализа данных лекарственных средств, так как клиническая картина течения отравлений, результаты

патологоанатомических, гистологических и других исследований не позволяют установить и дифференцировать отравления нейролептиками производными бензамида.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. На основании полученных результатов настоящего исследования, их систематизации и анализа предложен методологический подход к систематическому анализу амисульприда, сульпирида и тиаприда для судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Впервые теоретически обоснованы условия экстракции производных бензамида из водных растворов (значение рН среды, природа органического растворителя, присутствие электролита, продолжительность экстракции).

Впервые на основе теоретических и практических обоснований рекомендованы в порядке приоритета биологические объекты.

Установлены оптимальные условия изолирования и разработаны методики для всей группы нейролептиков производных бензамида для изолирования из биологических объектов.

Впервые предложен коэффициент для расчетов ориентировочного истинного содержания исследуемых веществ в биологических жидкостях и объектах.

Впервые предложен методологический подход к судебно-химическому и химико-токсикологическому исследованию всей группы нейролептиков производных бензамида, применяющихся в настоящее время в медицинской практике.

Предложены условия идентификации амисульприда, сульпирида и тиаприда в извлечениях из биологических жидкостей и объектов и их последующая дифференциация между собой различными химическими методами - хромогенными и микрокристаллоскопическими реакциями, физико-химическими методами анализа - тонкослойной хроматографией, газожидкостной, высокоэффективной жидкостной хроматографией, оптическими методами (УФ-, ИК-спектрофотометрии), а также при использовании современного метода хромато-масс-спектрометрии. Также разработаны условия количественного определения современными физико-химическими методами для всей группы нейролептиков производных бензамида.

Установлена степень токсичности для изученных нейролептиков группы производных бензамида, дозы ЛД50 и ЛДюо при пероральном введении мышам. Впервые описана картина интоксикации производными бензамида на животных.

Впервые экспериментальными методами установлены рекомендации к выбору внутренних органов в качестве биологических объектов при проведении судебно-химического исследования на производные бензамида.

Практическая значимость работы. Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены методики изолирования, идентификации и количественного определения группы нейролептиков производных

бензамида (амисульприд, сульпирид и тиаприд) в биологических жидкостях (кровь, моча, желчь, слюна) и трупном материале (печень), которые позволили разработать методологический системный подход к исследованию данной группы лекарственных средств при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Использование данных схем анализа производных бензамида позволяет диагностировать острые отравления ими в плане оказания своевременной помощи пострадавшим или установить факт отравления при интоксикации и летальном исходе.

Результаты экспериментальных исследований использованы в подготовке новой медицинской технологии, методических рекомендациях, монографии «Судебно-медицинская (химическая) оценка нейролептиков», а также легли в основу цикла лекций для ординаторов ФГБУ РЦ СМЭ Минздравсоцразвития РФ по теме «Судебно-медицинская диагностика отравлений» и использованы в подготовке монографии «Судебная медицина» раздел «Химическая травма».

Материалы внедрения. По результатам проведенных экспериментальных исследований и теоретически обоснованных и разработанных методик изолирования производных бензамида из биологических объектов, их идентификации и количественного определения составлены новые медицинские технологии. На наиболее распространенный нейролептик группы производных бензамида - тиаприд получено разрешение к применению новой медицинской технологии (ФС №2009/057 от 31.03.2009) - «Определение тиаприда в биологических объектах при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа», разработаны и опубликованы Методические рекомендации - «Определение нейролептиков производных бензамида (амисульприда, сульпирида и тиаприда) при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследований» (от 02.02.2012г.).

Результаты разработанного методологического подхода к судебно-химическому и химико-токсикологическому исследованию нейролептиков производных бензамида внедрены в учебный процесс цикла лекций для ординаторов ФГБУ РЦ СМЭ Минздравсоцразвития РФ по теме «Судебно-медицинская диагностика отравлений» и в практику работы судебно-химического отделения ФГБУ РЦ СМЭ Минздравсоцразвития РФ.

По материалам диссертационного исследования опубликована монография «Судебно-медицинская (химическая) оценка нейролептиков» (Москва, 2012). Также подготовлена монография «Судебная медицина» раздел «Химическая травма» и сдана ответственному за издание заведующему кафедрой судебной медицины Первого Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, член-корр. РАМН, профессору Ю.И. Пиголкину.

Положения, выдвигаемые на защиту:

• Результаты изучения актуальности разработки методологии химико-токсикологического и судебно-химического определения нейролептиков производных бензамида в современное время и реальных условиях.

• Данные по изучению токсичности нейролептиков группы производных бензамида, установлению некоторых фармакокинетических показателей, рекомендации по целесообразности исследования органов для целей и задач судебно-химического и химико-токсикологического анализа на амисульприд, сульпирид и тиаприд в качестве биологических объектов.

• Результаты теоретического и экспериментального обоснования условий экстракции нейролептиков производных бензамида из водных растворов с учетом влияния следующих факторов: значения рН среды, природы органического растворителя, присутствия электролита и времени экстракции.

• Результаты разработки методик пробоподготовки биологических жидкостей (кровь, моча, желчь, слюна) и трупного материала (печень) для изолирования амисульприда, сульпирида и тиаприда.

• Результаты экспериментальных исследований по разработке методик идентификации и количественного определения амисульприда, сульпирида и тиаприда в извлечениях из биологических жидкостей и тканей трупа с использованием различных физико-химических методов анализа.

• Схема и принципы методологии химико-токсикологического и судебно-химического определения нейролептиков производных бензамида.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 75-летию Российского центра судебно-медицинской экспертизы «Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном этапе» (г.Москва, 2006г.); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (г.Москва, 2007г.); 15-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 2008г.); научно-практической конференции «Материалы Всероссийского совещания судебно-медицинских экспертов по применению правил и медицинских критериев определения степени тяжести вреда, причиненного здоровью человека» (г.Москва, 2008г.); 16-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 2009г.); межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы теории и практики судебно-химической экспертизы» (г.Санкт-Петербург, 2009г); Всероссийской научно-практической конференции «О проблемных вопросах в организации производства судебно-медицинских экспертиз» (г.Москва, 2009г.); в виде стендового доклада на 48-й Ежегодной конференции Международной Ассоциации Судебных Токсикологов (Т1АРТ) (Германия, г.Бонн, 2010г.); 18-ом Российском национальном

конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 2011г.); Научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (г.Москва, 2012г.); II Международной научной конференции «Наука в современном обществе» (г.Ставрополь, 2012г.).

Разработанные методики апробированы на базе химико-токсикологической лаборатории Республиканского наркологического диспансера РСО-Алания в г.Владикавказе; судебно-химического отделения Бюро судебно-медицинской экспертизы Ставропольского края в г.Ставрополь и в химико-токсикологической лаборатории в г.Ростов-на-Дону.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проведены химические, физико-химические и фармакологические эксперименты. В выполненной работе автором непосредственно осуществлена аналитическая и статистическая обработка полученных результатов, представлено научное обоснование с выводами и практическая реализация. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ Федерального государственного бюджетного учреждения "Российский центр судебно-медицинской экспертизы" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в рамках НИР Лаборатории судебно-химических и химико-токсикологических исследований «Совершенствование методов судебно-химического исследования наркотических и психотропных веществ в биологическом и трупном материале» (номер гос. регистрации №01200961795).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 10 - в изданиях, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендуемых ВАК, 1 монография, 1 новая медицинская технология, 1 методическая рекомендация.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 326 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка литературы и приложения. В тексте содержится 102 таблицы, 58 рисунков. Список цитируемой литературы включает 367 источников, из них - 105 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Методология проведения судебно-химического и химико-токсикологического исследования на нейролептики производные бензамида

Во время проведения судебно-химического и химико-токсикологического исследования на амисульприд, сульпирид и тиаприд рекомендуется придерживаться приведенной на рисунке 2 схемы анализа, которая позволит достоверно обнаружить эти соединения.

Биологическая жидкость или/и ткань трупа

I

Пробоподготовка

Предварительный метод исследования

(ТСХ, хромогенныереакции, микрокристаллоскопические реакции)

Положительный результат

Подтверждающий

метод (ВЭЖХ, УФ, ПК, ГХ-МС, ГЖХ)

Отрицательный результат

I

Вывод -соединения не обнаружены

Положительный результат

Отрицательный результат

Вывод - соединение обнаружено

(Определение коли чественного содержания

Вывод - соединения не обнаружены

Метод (ВЭЖХ, УФ, ГХ-МС, ГЖХ)

Выдача заключения об обнаружении и коли чественном содержании

Рисунок 2 - Схема проведения судебно-химического (химико-токсикологического) исследования на нейролептики производные бензамида

Интерпретация результатов судебно-химического исследования В акте судебно-химического исследования или заключении эксперта об обнаружении нейролептика производного бензамида

(амисульприда/сульпирида/тиаприда) необходимо придерживаться приказа Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации №346н от 12 мая 2010 года «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» п.п.87.9.1 и 87.9.3 и для обнаружения и идентификации химических и лекарственных веществ применяются предварительные методы (цветные реакции, тонкослойная хроматография, иммуноферментные методы) и подтверждающие инструментальные (спектрофотометрия в видимой, УФ- и ИК-областях, атомно-абсорбционная спектрофотометрия, газожидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, хроматомасс-спектрометрия), в также в зависимости от поставленных задач разрабатывают соответствующую схему анализа. По возможности должно быть применено не менее двух независимых методов, причем каждый из них должен быть основан на различных физических или химических принципах. При положительном результате исследования предварительными методами на нейролептики производные бензамида (тонкослойная хроматография, хромогенные реакции, микрокристаллоскопические реакции) и подтверждении методом ВЭЖХ или ГХ-МС дается заключение об обнаружении найденного соединения. При получении положительного результата обнаружения производится количественное определение одним из подтверждающих методов УФ-спектрофотометрией, ВЭЖХ или ГХ-МС.

Для установления истинного количественного содержания найденного нейролептика производного бензамида необходимо применять впервые предложенный нами коэффициент для каждого вида биологического объекта.

В случае обнаружения одного из представителей группы нейролептиков производных бензамида заключение об отравлении ставится в зависимости от количественного содержания его в биологических жидкостях и внутренних органах. В случае обнаружения амисульприда или сульпирида или тиаприда с еще одним или несколькими соединениями, то в зависимости от количественного определения и их фармакологического взаимодействия делается заключение о комбинированном отравлении.

Подход к проведению исследования на нейролептики производные бензамида Установлено, что в 39% случаев нейролептики группы производные бензамида назначаются в монотерапии, поэтому при обнаружении только одного из представителей этой группы соединений можно утверждать о присутствии этого лекарственного препарата. В случае обнаружения еще других соединений, возможно, предположить наличие следующих представителей или групп лекарственных средств (рисунок 3).

Рисунок 3 - Предполагаемое совместное присутствие других соединений с нейролептиками производными бензамида

В рисунке 3 приведены наиболее частые совместные применения амисульприда, сульпирида и тиаприда с другими лекарственными средствами.

Клиническая симптоматика побочных эффектов и острых отравлений нейролептиками производными бензамида

В случае отравления, передозировки, злоупотребления или непереносимости группы нейролептиков производных бензамида чаще встречаются следующие побочные эффекты: слабость; сонливость; выраженное снижение артериального давления; нарушение ритмов сердца; выраженная сухость во рту; тошнота; развитие седации; головокружение.

В случае описания клинических симптомов отравления исследуемой группы лекарственных средств следует обратить внимание на следующие, которые могут принадлежать амисульприду, сульпириду и тиаприду: наличие тетанических судорог; снижение координации движений; снижение тонуса скелетных мышц; снижение реакции на тактильные раздражители; снижение реакции на болевые раздражители; снижение реакции на звуковые раздражители; снижение реакции на световые раздражители; снижена частота дыхательных движений; увеличена глубина дыхательных движений; происходит сужение размера зрачка; отсутствие или снижение частоты мочеиспусканий и дефекаций; полное отсутствие к желанию приема пищи и воды (жидкостей).

Рекомендации к выбору внутренних органов трупа в случае отравления нейролептиками производными бензамида

При проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследования на нейролептики производные бензамида при выборе биологического объекта необходимо придерживаться приказа Министерства

здравоохранения и социального развития Российской Федерации №346н от 12 мая 2010 года «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» пункт 73 «Особенности взятия объектов для производства судебно-химической экспертизы». Однако в целях более глубокого и достоверного анализа на данную группу соединений также рекомендуется брать в случае отравления в течение прошедших суток на исследование в первую очередь - почки, желудок с содержимым, легкие, селезенку и печень. Во вторую очередь (менее значимы в количественном содержании) являются - тонкий кишечник, сердце и головной мозг.

В случае исследования биологических жидкостей на нейролептики производные бензамида можно подтвердить их наличие и количественно достоверно определить в течение суток в крови, моче и слюне. Поскольку острое отравление нейролептиками производными бензамида чаще происходит по истечении первых суток.

Изучение актуальности проблемы разработки научно-методического подхода к судебно-химическому и химико-токсикологическому исследованию нейролептиков производных бензамида

Социологическо-медицинское исследование проводилось в виде индивидуального очного экспертного опроса, используя анкетирование врачей следующих специальностей - наркологов и психиатров. Исследование проводили с целью изучения проблемы на современном этапе использования нейролептиков производных бензамида, носящих характер токсического воздействия на организм человека, в том числе острых и смертельных отравлений.

В опросе приняло участие 48 врачей. Генеральная совокупность (14) составляла 75 врачей, доверительный интервал (уровень достоверности) -использовали обычный для таких исследований - 95%, а доверительный уровень выборки (погрешность) составил 4,3%.

Врачи в количестве 16,7% очень часто назначают производные бензамида - более 10 назначений за прием (рабочий день), 37,5% респондентов ответили, что делают от 6 до 10 назначений за один прием пациентов, а 45,8% - в пределах от 1 до 5 назначений, что представлено на рисунке 4.

16,7%

37,5%

^^ более 10 ¡■•■•■•■•■I от 6 до 10 ГТТП от 1 до 5

Рисунок 4 - Частота использования (назначения пациентам) нейролептиков производных бензамида врачами за прием (один рабочий день)

Врачей, не назначающих производные бензамида среди анкетируемых специалистов не встречалось. По результатам ответа на данный вопрос видно, что все врачи психиатры и наркологи всегда в своей практике используют нейролептики, производные бензамида, причем значительная часть специалистов широко их применяет.

Наиболее частые побочные эффекты, которые врачи встречали в своей практике представлены на рисунке 5, а именно: слабость, сонливость, выраженное снижение артериального давления, нарушение ритмов сердца, выраженная сухость во рту, тошнота, развитие седации, головокружение.

] Нарушение ритма сердца

Выраженное снижение „ артериального А давления

Рисунок 5 - Наиболее часто встречаемые побочные эффекты при приеме производных бензамида (в количественном соотношении между собой)

В результате исследования вышеизложенные побочные эффекты установлены при назначении пациентам производных бензамида как неотъемлемая часть терапии. У 1,2 (в 11,7% случаев) из 10 пациентов, у которых наблюдаются побочные эффекты, то есть 12% пациентам приходится отменять это лечение ввиду сильного проявления побочных эффектов.

Установлено по опросу врачей, что они встречают злоупотребление производными бензамида в 20,8% случаях у пациентов.

Изучение токсичности нейролептиков производных бензамида и определение некоторых показателей фармакокинетики

Данные о токсическом влиянии на организм изучаемых лекарственных веществ являются необходимыми и полезными как для специалистов-медиков (врачей), так и для сотрудников правоохранительных органов, органов следствия, суда и прокуратуры.

Определение ЛД50 и ЛДюо проводили на белых взрослых мышах (Mus musculus L.) инбредной линии, разведение которых проводилось строго по специальным правилам в условиях вивария. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Определение ЛД50 производных бензамида по методу Кербера и установление ЛД100_

Исследуемое вещество ЛД50, мг/кг Д X, мг/кг ЛД,оо, мг/кг

Амисульприд 4125 ±296 4800

Сульпирид 3083 ±288 3650

Тиаприд 2313 ±82 3000

Согласно классификации опасности веществ (по К.К. Сидорову) по степени воздействия на организм производные бензамида относятся к III классу опасности, т.е. являются умеренно опасными веществами.

Клиническая картина острого отравления, в которую также входит внешний вид и первичный осмотр больного (пациента), позволяет правильно интерпретировать результаты анализов химико-токсикологической либо судебно-химической лаборатории, а также поставить правильный диагноз при отравлении нейролептиками - амисульпридом, сульпиридом или тиапридом.

Оценку общего состояния при введении производных бензамида проводили на интактных лабораторных животных (на белых взрослых мышах в возрасте 2,0-2,5 месяца массой 18-22 г) по изменению поведенческих реакций, нервно-мышечной возбудимости и некоторым вегетативным эффектам.

Результаты проведенного исследования позволили высказаться о характере токсического действия, наблюдаемого при интоксикации нейролептиками производными бензамида. Систематизирована клиническая картина острого отравления лекарственными веществами этой группы. У амисульприда, сульпирида и тиаприда клиническая картина интоксикации идентична при введении токсических доз исследуемых веществ. Однако, следует отметить, что наиболее токсичней эти проявления наблюдаются у тиаприда, у сульпирида - только по нескольким параметрам, чуть менее выражены токсические проявления, а у амисульприда - по ряду показателей меньше токсические проявления, но не в значительной мере и носят недостоверный характер.

Изучение распределения нейролептиков производных бензамида в органах при введении токсических доз позволит обосновать выбор внутренних органов трупа для проведения судебно-химического исследования при отравлении ими. Согласно приказу Минздрава России №346н от 12 мая 2010 года «Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации», для судебно-химического исследования изымают и направляют различные внутренние органы с учетом распределения, скорости выведения и других кинетических особенностей химических веществ.

Исходя из полученных данных нами рекомендовано в случае отравления нейролептиками группы производных бензамида для изъятия биологических объектов из трупов при направлении на судебно-химическое исследования в порядке наименьшей значимости биологического объекта, что схематично представлено на рисунке 5, где наибольшее значение принято за 100%. Данные

были взяты при исследовании органов через сутки после перорального введения нейролептика, ввиду того, что эти данные наиболее соответствуют реальной действительности. Поскольку острое отравление нейролептиками производными бензамида чаще происходит в течение первых суток.

%

80 60 40 20 0 \

\

\

почки желудок с легки» селезенка печень тонкий сердце головной содержимом кишечник МО

Рисунок 6 - Зависимость наличия обнаруженного производного бензамида (тиаприда) относительно внутренних органов в % отношении

Установлено, что оптимальным биологическим объектом при исследовании производных бензамидов являются почки, также достаточно информативными являются желудок с содержимым, легкие и селезенка, а уступающими по информативности на порядок биологические объекты и внутренние органы трупа - печень, тонкий кишечник, сердце и головной мозг.

В качестве биологических жидкостей при исследовании динамики изменения концентрации нейролептиков производных бензамида (на примере тиаприда) были взяты кровь, моча и слюна. Поскольку именно они являются теми биологическими жидкостями, которые поступают на судебно-химическое или химико-токсикологическое исследование. Крыс, находящихся в состоянии угнетения под действием препарата и легким эфирным наркозом декапитировали. Первую группу животных декапитировали через 1 час, вторую - через 2 часа, третью - через 3 часа, четвёртую - через 24 часа и исследовали указанные биологические жидкости. Экспериментально установлено, что возможна идентификация и количественное определение нейролептиков производных бензамида во внутренних органах трупа в течение суток после их перорального приёма в случаях интоксикации со смертельным исходом.

Разработка качественного анализа нейролептиков производных бензамида в извлечениях из биологических объектов и в лекарственных формах

Хромогенные реакции отличаются простотой и наглядностью процесса обнаружения, при взаимодействии с разными химическими реагентами большинство веществ даёт определенную окраску. В некоторых случаях развивающаяся окраска специфична для данного исследуемого соединения, но

в большинстве случаев цвет характеризует целый ряд соединений сходной химической структуры исходя из их функциональных групп молекулы.

Результаты исследования производных бензамида хромогенными реакциями представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты хромогенных реакций на производные бензамида

Реактив Амисульприд Сульпирид Тиаприд

Марки бледно-розовый бледно-розовый телесный

Фреде тёмно-фиолетовый из фиолетового в розовый через 5 мин нет

Манделина тёмно-жёлтый тёмно-жёлтый с переходом в лимонно-жёлтый тёмно-жёлтый

Кислота серная концентрированная нет нет грязно-розовый

Определены характеристики цвета продуктов хромогенных реакций нейролептиков производных бензамида по атласу цветов (по Е.Б. Рабкину), по показателям: коэффициенты, светлота, цветовой фон, чистота.

Таблица 3 - Предел обнаружения нейролептиков производных бензамида хромогенными реакциями_

Реактив Предел обнаружения, мг

Амисульприд Сульпирид Тиаприд

Марки 1,0 1,2 1,2

Фреде 0,8 1,2 -

Манделина 0,6 0,8 0,6

Кислота серная концентрированная - - 0,6

В связи с недостаточной чувствительностью обнаружения производных бензамида общеалкалоидными реактивами, рекомендовано проводить микрокристаллоскопические реакции.

Микрокристаллоскопические реакции выполняли на чистых предметных стёклах, на которые наносили водный раствор субстанций амисульприда, сульпирида и тиаприда, добавляли к ним растворы соответствующих реактивов, а затем под микроскопом через 15-20 минут наблюдали форму и окраску образовавшихся кристаллов

Форма и окраска кристаллов сульпирида и тиаприда представлена на фотографиях (рисунок 6).

продукт реакции сульпирида продукт реакции тиаприда

(х56) (х56)

Рисунок 7 - Микрокристаллические продукты реакции образования сульпирида и тиаприда

Цвет кристаллов продукта реакции сульпирида обусловлен окраской реактива и видимо продукт реакции (кристаллы) не имеют самостоятельного цветового фона, либо он подавлен цветовой гаммой реактива. Кристаллы крупного размера (х56) и имеют форму продолговатого прямоугольника неправильной формы - ассиметричны. Тиаприд образует характерные кристаллы с ртути дихлоридом. На фотографиях видно, что кристаллы имеют форму иголок, обладающих симметрией. Они расположены в определённом, периодически повторяющемся порядке, образуя кристаллическую решётку, являются идеальными кристаллами, поскольку всё пространство структуры представляет собой единую решетку, элементарные ячейки их тождественны, грани по внешнему виду и величине одинаковы и т.д. Кристаллы не имеют характерной окраски - иглы в основном тёмно-серого цвета с голубоватым оттенком в центре.

Предел обнаружения для сульпирида в пробе с 2% раствором йода в калия йодиде, который составил 10 мкг исследуемого вещества, а тиаприда в пробе с помощью раствора ртути дихлорида - 8 мкг исследуемого вещества в пробе.

Тонкослойная хроматография является базовым методом благодаря своей доступности, простоте выполнения, достаточной чувствительности и избирательности и используется в скрининге отдельных групп токсикологически значимых веществ

Результаты хроматографической подвижности исследуемых веществ в оптимальных подвижных фазах представлены в нижеприведенной таблице 4.

Таблица 4 - Результаты хроматографирования производных бензамида

Состав подвижной фазы Соотношение растворителем Значение ЬИТ (п=6)

амисульприд сульпирид тиаприд

Толуол - ацетон - диэтиламин (Б!) 50:10:10 63,8 35,4 55,0

Изопропанол - диэтиламин (52) 90:10 74,3 54,2 63,5

Толуол — диэтиловый эфир — диэтиламин (Бз) 30:20:10 44,4 21,7 35,2

Представленные данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что в найденных оптимальных условиях хроматографирования в используемых трех системах растворителей значения ЬЯГ у производных бензамида находятся в интервале 21,7 - 74,3. Это позволяет использовать разработанные методики для обнаружения амисульприда. сульпирида и тиаприда после изолирования из биологических объектов при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа.

Для оценки пригодности хроматографической системы, при использовании метода тонкослойной хроматографии, нами был впервые предложен (ранее научных и практических данных об этом в доступной отечественной и зарубежной литературе не встречалось), который впоследствии мы использовали, коэффициент разделения пятен для установления критерия разделяющей способности хроматографической системы с последующей возможностью ее использования без получения ошибочных результатов.

Кк/ =Т"' м

где: // и 12 - расстояние, пройденное рядом находящимися веществами, мм.

Оптимальным значением коэффициента разделения нами предложено считать > 1,2, при котором визуально возможно разделить пятна между собой и также получить достоверные значения Ы1£

Результаты определения предела обнаружения исследуемого вещества при хроматографировании в найденных оптимальных условиях представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Предел обнаружения амисульприда, сульпирида и тиаприда

Проявители Предел обнаружения, мкг (в пробе, наносимой на пластинку)

Амисульприд Сульпирид Тиаприд

УФ-свет при длине волны 254 нм 0,5 0,7 0,3

Реактив Драгендорфа в модификации по Мунье 0,1 0,1 0,1

Реактив Драгендорфа в модификации по Мунье после обработки 10% раствором серной кислоты 0,1 0,1 0,1

Пары йода 15,0 10,0 15,0

В разработанных хроматографических системах для обнаружения амисульприда, сульпирида и тиаприда происходит достаточно четкое разделение исследуемых веществ от эндогенных соединений, переходящих из биологического объекта в извлечение при изолировании разработанными методиками. Данные представлены на рисунке 8.

о 9 0

ф

0

0

о

•

•

о ^ о О

о

о

а б в где

о о

0

0

° о О • • 0

о © •

о о о

а 6 в г л е

хроматографическая система 8, хроматографическая система 82 хроматографическая система Бз

Обозначения: 1 - амисульприд, 2 - тиаприд, 3 - сулъпирид; соэкстрактивные вещества: а - мочи, 6 - крови, в - слюны, г — желчи, д - печени (по предложенному методу), е - печени (по методу Стаса-Отто).

Рисунок 8 - Результаты хроматографирования амисульприда, тиаприда, сульпирида и соэкстрактивных веществ в различных системах растворителей

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, имея ряд преимуществ, достаточно широко применяется в химико-токсикологическом и судебно-химическом анализе для идентификации и количественного определения лекарственных веществ при отравлениях.

Исследования проводились на отечественном микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» с УФ-детектором производства ЗАО «ЭкоНова» (Россия). Полностью автоматическое устройство позволяло в соответствии с заданной программой обеспечивать выполнение всех циклов: промывки колонки, набор и ввод пробы. Исследование осуществляли при 286 нм на хроматографической колонке размерами 2x75 мм, заполненной обращенно-фазовым сорбентом «Силасорб С18». В качестве элюента применяли 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (А), ацетонитрил (Б) в градиентном режиме от 10% элюента Б до 80% за 30 минут. Скорость подачи подвижной фазы составляла 100 мкл/мин. Время измерения - 0,18 сек, а температура термостата колонки была равна 35°С. Исследованию подвергали смесь трех вышеописанных лекарственных веществ с концентрацией каждого 0,003% в водном растворе. Результаты хроматографирования представлены на рисунке 9.

AU 1«одп

I 1

_!а_

¡1

LL

Рисунок 9 - Хроматограмма лекарственных веществ группы нейролептиков производных бензамида при совместном присутствии методом ВЭЖХ

Таблица 6 - Результаты хроматографирования амисульприда, сульпирида,

Исследуемый лекарственный препарат Абсолютное время удерживания, мин (п=6)

Амисульприд 10,40±0,28

Сульпирид 7,59±0,21

Тиаприд 8,40±0,26

Следовательно, время удерживания исследуемых веществ при данных условиях хроматографирования составляет от 7 до 11 минут, что позволяет предложить оптимальное время анализа не более 15 минут.

Спектроскопию в ультрафиолетовой области широко используют в фармацевтическом и биофармацевтическом анализах. Метод УФ-спектроскопии (анализ по электронным спектрам абсорбции веществ) использовали для повышения избирательности и надежности доказательства амисульприда, сульпирида или тиаприда как соединений, имеющих в своей структуре хромофорные группы (-К=Н2? -N=0 и др.).

Измерение спектральных характеристик в УФ-области поглощения амисульприда, сульпирида и тиаприда в интервале 220-320 нм при концентрации 10 мкг/мл с интервалом сканирования 1 нм в кювете с толщиной слоя 1 см показало, что характерные спектры для веществ этой группы наблюдались от 230 нм, а в интервале 220-230 нм происходило «зазубривание» спектров исследуемых веществ. Раствором сравнения служил соответствующий растворитель. Спектры исследуемых веществ в водных растворах представлены на рисунках 10-12. Для полноты получения объективных данных об УФ-спектрах производных бензамида запись спектра велась при величине оптической плотности А > 2,5-3,5.

Рисунок 11 - УФ-спектр 0,01% водного раствора сульпирида

Анализ электронных спектров в данных растворителях показал, что нейролептики производные бензамида имеют УФ-спектры, характеризующиеся одной полосой поглощения с одним максимумом и одним минимумом.

ИК-спектроскопия - это метод исследования, основанный на поглощении Ж -излучения определенными функциональными группами производных бензамида. ИК-спектры молекул отличаются большой сложностью и содержат много полос поглощения, причем атомные группы или определенные связи характеризуются поглощением при определенных частотах. Использование этого метода при анализе производных бензамида позволяет идентифицировать их, поскольку имеет место удлинение дипольного момента молекул.

Метод ИК-спектрофотометрии в ближней области. Исследование ИК-спектра проводилось на приборе марки Nicolet Antaris Near-IR Analyser (США) при условиях: температура воздуха - 21,7°С, влажность воздуха - 16,7% (термогидрометр ИВА-6, Россия). Данные получали и обрабатывали с помощью операторского программного пакета RESALT, хемометрического пакета TQ Analyst и валидационного пакета ValPro, устанавливаемых в стандартной комплектации к прибору. Прибор выдает средние результаты спектра более, чем по 3-м десяткам измерений в течение анализа. Исследование проводилось в шести повторностях и было статистически достоверно.

сульпирида(3)

Нами в области 7000-6000 см"1 были выделены три характерных признака для ИК-спектров анализируемых соединений.

Таблица 7 - Характерные признаки ИК-спектров производных бензамида

Лекарственное средство Признак №1, см"1 Признак №2, см"1 Признак №3, см"1

Амисульприд 6700 6480 6250-6050*

Тиаприд 6650 6450 6350-6050*

Сульпирид 6900-6800* 6480 6350

* - диапазон расположения «плеча» спектра

Исследование ИК-спектрофотометрии в средней области проводилось на инфракрасном спектрометре марки Nicolet Avatar 330FT-IR (США) с типом детектора DTGS, при условиях: температура воздуха - 21,5°С, влажность воздуха - 16,6% (термогидрометр ИВА-6, Россия). Данные получали и обрабатывали с помощью программного обеспечения OMNIC 6.0., устанавливаемого в стандартной комплектации к прибору.

Производные бензамида - амисульприд, сульпирид и тиаприд имеют характерные полосы поглощения в интервале 1650-600 см"', что представлено

Рисунок 14 - Дифференциация амисульприда, сульпирида и тиаприда методом ИК-спектроскопии

По данным рисунка 14, для амисульприда, сульпирида и тиаприда характерна одна общая полоса поглощения при 1300±10 см"' (1). Наибольшее совпадение наблюдается у сульпирида и тиаприда с полосами поглощения при 1610 (За), 1510 (36), 1075 (Зв) и 1000 см"1 (Зг), а у амисульприда и сульпирида-совпадение только в области при 810 см"1 (2). Данные имеют допустимое отклонение ±10 см"1.

Использование хромато-масс-спектрометрии при судебно-химическом анализе нейролептиков производных бензамида не описано в доступной научной литературе. К сожалению, масс-спектры и индексы удерживания данных нейролептиков крайне редко встречаются в литературе и в электронных библиотеках, либо разноречивы. Хромато-масс-спектральный анализ выполняли на приборе «6890-5973N» фирмы «Agilent Technologies» (США), работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном универсальной капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м и

внутренним диаметром 0,25 мм. В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока газа-носителя 1,2 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса составляли 280°С. Температура колонки программировалась от 90°С до 310°С со скоростью 35°С/мин. Ввод образцов объемом 1 мкл осуществляли методом без деления потока газа-носителя. Масс-спектрометр работал в режиме сканирования спектров электронного удара при 70 эВ в диапазоне от 31 до 550 дальтон. Напряжение электронного умножителя устанавливали по результатам работы программы AUTOTUNE из стандартного пакета математического обеспечения фирмы-производителя.

Масс-спектры амисульприда и тиаприда не вызывают особых затруднений при идентификации на хроматограммах, однако спектр сульпирида не однороден и затруднен при идентификации. Поэтому при анализе на сульпирид представляется наиболее достоверным первичное определение по пику со временем удерживания 8,86 минут, а амисульприда и тиаприда со временем удерживания 11,89 и 8,71 минут, соответственно.

Время удерживания тиаприда и сульпирида не достоверно в отличии друг от друга, поэтому необходимо производить их дифференциацию и последующую идентификацию по масс-спектрам с данными атомных единиц массы молекул исследуемых веществ: тиаприд - 86, сульпирид - 98.

При использовании метода хромато-масс спектрометрии общепринято проводить идентификацию по восьмипиковой системе Поскольку довольно часто в практике анализа лекарственных веществ в условиях проведения судебно-химического или химико-токсикологического анализа отсутствует стандарт исследуемого вещества, то нами установлены и приведены в таблице 8 данные по пикам (m/z) амисульприда, сульпирида и тиаприда.

Таблица 8 - Данные пиков нейролептиков производных бензамида

Исследуемое вещество Пики, (m/z)

Амисульприд 43, 70, 98, 121, 149, 171, 196, 218, 242, 271, 311, 346, 369, 401,433,455,481, 504, 537

Сульпирид 43, 70, 98, 120, 155, 179, 200, 230, 267, 295, 325, 355, 379, 401, 429, 462, 504, 535

Тиаприд 58, 86, 109, 134, 177, 213, 256, 281, 303, 328, 355, 377,405,429,461,493,537

* жирным выделены основные пики

Как видно из таблицы 8, производные бензамида имеют от 16 до 18 характерных пиков (m/z), по которым можно вести качественное обнаружение исследуемых веществ.

Исследования нейролептиков производных бензамида методом газо-жидкостной хроматографии проводились на газожидкостном хроматографе «Кристалл 2000 М» с пламенно-ионизационным детектором (ПИД) производства СКВ «Хроматэк» (Россия). ПИД - наиболее широко используемый детектор в газовой хроматографии. Он реагирует почти на все соединения, содержащие СН-группы, но не реагирует на благородные газы, азот, аммиак, а также воду. Хроматографирование проводилось с

использованием программы «Хроматек Аналитик» в версии 1.21, которая позволяла в соответствии с заданной программой обеспечивать выполнение всех циклов хроматографирования. Исследование осуществляли на хроматографической колонке капиллярной с неподвижной фазой HP-FAPP (Poliethylene glycol - ТРА modified / Полиэтиленгликоль - 20000, терминированный 2-нитротерефталевой кислотой) с внутренним диаметром 0,25мм, длиной 30 м. В качестве газа-носителя использовался азот. Скорость подачи подвижной фазы составляла 30 мл/мин, расход водорода 40 мл/мин, расход воздуха 300 мл/мин. При варьировании рабочих температур и температуры колонки от 160 до 240°С. Оптимальные температуры были выбраны следующими: детектора - 300°С, испарителя - 250°С, колонки - 200°С. Ввод пробы производился вручную, объемом 2 мкл в виде 0,01% спиртового раствора производных бензамида при использовании микрошприца на 5 мкл. Идентификация производных бензамида осуществлялась по времени удерживания. Для определения параметров удерживания была произведена запись хроматограммы амисульприда, сульпирида и тиаприда (рисунок 15).

ХРОМАТОГРАММА

мВо.оооо

Рисунок 15 - Хроматограмма лекарственных веществ группы нейролептиков производных бензамида при совместном присутствии методом ГЖХ

Разработка способов количественного определения нейролептиков производных бензамида в извлечениях из биологических объектов и в лекарственных формах Метод тонкослойной хроматографии (полуколичественное определение)

производных бензамида Предварительное количественное определение позволяет более целесообразно проводить дальнейшее исследование количественного содержания производных бензамида арбитражными и точными методами. Исследование проводили в ранее разработанных системах растворителей: толуол-ацетон-диэтиламин (50:10:10); изопропанол-диэтиламин (90:10); толуол-диэтиловый эфир-диэтиламин (30:20:10). В качестве исследуемого объекта была принята окружность, то есть пятно исследуемого вещества после хроматографирования и проявления соответствующим реактивом. В качестве максимально допустимого количества исследуемого вещества было принято пятно в виде овала не превышающее соотношение ширина к высоте - 1 к 3, а

незначительно удлиненная окружность грубо измерялась в виде круга, так как основная концентрация (>80%) исследуемого вещества находится в этом месте. Поэтому в качестве оценочной системы нами было принято измерять диаметр круга с помощью металлической линейки Stayer с делением 0,5 мм.

Результаты полуколичественного определения (калибровочные графики) представлены на примере амисульприда, представлены на рисунках 16-17 как при использовании в качестве проявителя УФ-света при длине волны 254 нм, так и реактива Драгендорфа в модификации по Мунье.

Рисунок 16 - Калибровочный график и уравнение полуколичественного определения амисульприда при проявлении ТСХ в УФ-свете

Рисунок 17 — Калибровочный график и уравнение полуколичественного определения амисульприда при проявлении ТСХ реактивом Драгендорфа в модификации по Мунье

Полуколичественное определение сульпирида методом ТСХ при проявлении УФ-светом равняется уравнению калибровочного графика у=0,4035х+0,3646, а коэффициент корреляции составляет 0,9916. При использовании в качестве проявителя реактива Драгендорфа в модификации по Мунье уравнение калибровочного графика у=0,4299х+0,5381, а коэффициент

корреляции составляет 0,9902. Полуколичественное определение тиаприда методом ТСХ при проявлении УФ-светом равняется уравнению калибровочного графика у=0,4219х+0,5384, а коэффициент корреляции составляет 0,9917. При использовании в качестве проявителя реактива Драгендорфа в модификации по Мунье уравнение калибровочного графика у=0,4320х+0,7171, а коэффициент корреляции составляет 0,9910.

Метод УФ-спектрофотометрии

Калибровочные графики строили в зависимости оптической плотности анализируемого раствора от его концентрации. Для этого готовили водные растворы нейролептиков производных бензамида в пределах соответствующих концентраций. Абсорбцию стандартных растворов исследуемых веществ измеряли на спектрофотометре марки СФ-103 в 1 см кюветах относительно воды очищенной.

Подчинение основному закону светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера наблюдается в интервалах концентраций амисульприда от 5 до 120 мкг/мл. Калибровочный график УФ-спектрофотометрического количественного определения (КО) амисульприда представлен на рисунке 18.

спектрофотометрическом определении

Рисунок 19 — Калибровочный график и уравнение КО сульпирида при УФ-спектрофотометрическом определении

Подчинение основному закону светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера наблюдается в интервалах концентраций тиаприда от 20 до 200 мкг/мл. Калибровочный график КО тиаприда представлен на рисунке 20.

спектрофотометрическом определении

Поскольку при количественном определении лекарственных веществ (амисульприд, сульпирид и тиаприд) возможно использовать вместо калибровочного графика удельный показатель поглощения, то мы приводим данные по всей группе производных бензамида в различных растворителях. Данные удельного показателя поглощения по нейролептикам производным бензамида в различных растворителях представлены в таблице 9.

Таблица 9 - Результаты определения удельного показателя поглощения амисульприда, сульпирида и тиаприда в различных растворителях_

Исследуемое вещество Растворитель Удельный показатель, г-1% 1см Абсолютное отклонение, Д Е]% см Относительное отклонение, Д%

1 2 3 4 5

Амисульприд Вода очищенная 198,0 ±2,9 ±1,5%

0,1М раствор кислоты хлористоводородной 193,6 ±3,8 ±2,0%

0,1М раствор натрия гидроксида 194,4 ±3,7 ±1,9%

Этиловый спирт 195,7 ±3,3 ±1,7%

Сульпирид Вода очищенная 30,0 ±2,2 ±8,0%

0,1М раствор кислоты хлористоводородной 25,2 ±1,8 ±7,8%

0,1М раствор натрия гидроксида 26,7 ±2,7 ±11,1%

Этиловый спирт 30,4 ±3,3 ±12,1%

1 2 3 4 5

Тиаприд Вода очищенная 60,0 ±2,7 ±4,7%

0,1М раствор кислоты хлористоводородной 63,3 ±1,2 ±1,8%

0,1М раствор натрия гидроксида 66,4 ±1,8 ±2,7%

Этиловый спирт 71,6 ±1,2 ±1,6%

Предел обнаружения при определении методом УФ-спектрофотометрии для амисульприда составляет 0,3 мкг/мл, а у сульприда предел обнаружения -1,6 мкг/мл и тиаприда — 0,7 мкг/мл.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

При оценке методики проводили проверку линейной зависимости величины отклика детектора от количества определяемого вещества. Сначала выполняли проверку линейности путем визуальной оценки — зависимость величины сигнала от концентрации определяемого вещества аппроксимируется прямой линией, затем проводили регрессионный анализ данной зависимости в соответствии с соответствующим линейным уравнением. Количественное определение по данным ряда авторов, возможно, проводить по площади или высоте пика исследуемого вещества. Прежде, чем предлагать при расчете количественного содержания производных бензамида либо высоту пика, либо площадь пика, нами были исследованы графики зависимости - "площадь пика - концентрация" и "высота пика - концентрация". Для этого строили графики зависимости площади и высоты пика от концентрации исследуемого вещества. Определение площади и высот пиков проводили в шести повторностях водных растворов производных бензамида.

Калибровочный график амисульприда строили в интервале концентраций исследуемого вещества 0,02-5мкг/пробе вводимой в колонку, измерение проводили при длине волны 280 нм. Для установления линейной зависимости концентрации амисульприда к высоте и площади пика строили графики (рисунки 21,22).

амисульприда при ВЭЖХ определении

-__._мкг/пробе

Рисунок 22 - Калибровочный график и уравнение КО по высоте пика амисульприда при ВЭЖХ определении

Из рисунков 21, 22 видно, что линейная зависимость КО наблюдается в данном интервале 0,02-10 мкг/пробе (5-2500 мкг/мл).

Исследования сульпирида проводили в интервале концентраций от 25 мкг/мл, что соответствует 0,1 мкг/пробе до 10000 мкг/мл, что соответствует 40 мкг/пробе при объеме анализируемой пробы в 4 мкл.

Калибровочный график КО сульпирида строили в интервале концентраций исследуемого вещества от 0,02 мкг/пробе до 40 мкг/пробе вводимой в колонку, измерение проводили при длине волны 290 нм.

Для установления линейной зависимости концентрации сульпирида к высоте и площади пика строили графики, изображенные на рисунках 23, 24.

Рисунок 23 - Калибровочный график и уравнение КО по площади пика сульпирида при ВЭЖХ определении

Рисунок 24 - Калибровочный график и уравнение КО по высоте пика сульпирида при ВЭЖХ определении

Исследования тиаприда проводили в интервале концентраций от 12,5 мкг/мл, что соответствует 0,05 мкг/пробе, до 2000 мкг/мл, что соответствует 8 мкг/пробе при объеме анализируемой пробы в 4 мкл. Калибровочный график КО тиаприда строили в интервале концентраций исследуемого вещества от 0,05 мкг/пробе до 8 мкг/пробе вводимой в колонку, измерение проводили при длине волны 288 нм.

Для установления линейной зависимости концентрации амисульприда к высоте и площади пика строили графики, изображенные на рисунках 25, 26.

о >=---1-1-1-

0 2 4 6 8

_мкг/пробе

Рисунок 25 - Калибровочный график и уравнение КО по площади пика тиаприда при ВЭЖХ определении

h, AU

2,5 у = 0.3493Х + 0,0064

R2 = 0,9998^^

1,5 1 0,5

С 2 4 6 8 мкг/гтообе

Рисунок 26 - Калибровочный график и уравнение КО по высоте пика сульпирида при ВЭЖХ определении

Предел обнаружения определяли как наименьшую концентрацию изучаемых нейролептиков производных бензамида в образце, которую можно обнаружить при заданных условиях хроматографирования. Оценку предела обнаружения проводили по соотношению «Сигнал/Шум» Б/Ы'^З. Предел количественного определения оценивали по соотношению «Сигнал/Шум» Б/к'=10.

Таблица 10 - Пределы обнаружения амисульприда, сульпирида и тиаприда методом ВЭЖХ

Исследуемое вещество Пределы обнаружения, мкг во вводимой пробе Концентрация*, С (мкг/мл)

Амисульприд 0,005 1,25

Сульпирид 0,03 7,5

Тиаприд 0,01 2,5

* - при данной концентрации необходимо вводить в колонку не менее 4 мкл

Таблица 11 - Пределы количественного определения амисульприда, сульпирида и тиаприда методом ВЭЖХ_

Исследуемое вещество Пределы количественного определения мкг во вводимой пробе Концентрация*, С (мкг/мл)

Амисульприд 0,02 5,0

Сульпирид 0,11 27,5

Тиаприд 0,05 12,5

* - при данной концентрации необходимо вводить в колонку не менее 4 мкл

Разработка методик изолирования нейролептиков производных бензамида из биологического материала

Исследование биологических объектов производится при химико-токсикологических и судебно-химических исследованиях согласно приказу МЗ РФ №346н от 12 мая 2010 года «Об утверждении порядка организации и

производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации» пункт 73 «Особенности взятия объектов для производства судебно-химической экспертизы». При подозрении на отравление наркотическими средствами и психотропными веществами согласно приказу №346н для проведения экспертных исследований в качестве биологической жидкости в обязательном порядке берется кровь, моча и желчь.

Изолирование нейролептиков производных бензамида из мочи

Моча является наиболее предпочтительной жидкостью для анализов у живых людей. При ненаправленном анализе необходимо проводить изолирование веществ как кислотного, так и основного характера. Исходя из вышеизложенного, изолирование производных бензамида из мочи трупа и живых лиц проводили по следующей методике: к пробе мочи объемом 25 мл добавляли 1 мл 1% раствора (по 10 мг) амисульприда или сульпирида, или тиаприда и оставляли на 3 часа. Затем добавляли 50% раствор кислоты серной до значения рН среды 1-2 и 25 мл диэтилового эфира (для очистки), после чего экстрагировали в течение 5 минут, отстаивали в течение 15 минут для расслоения образовавшейся эмульсии. Тщательно отделяли слой органического растворителя от водной фазы и удаляли его. К водной фазе добавляли 2 М раствор натрия гидроксида до значения рН среды 12 (по универсальному индикатору) и аммония сульфат до насыщения. Экстракцию проводили в течение 5 минут в двух вариантах: а) однократно 25 мл хлороформа; б) трёхкратно по 10 мл хлороформа. После отстаивания органическую фазу отделяли и переносили в фарфоровую чашку и удаляли растворитель. Полученный сухой остаток растворяли в воде, количественно переносили в мерную колбу на 100 мл и доводили водой очищенной до метки. Оптическую плотность полученных растворов измеряли с помощью спектрофотометра марки СФ-56 в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения для амисульприда при длине волны 280 нм, для сульпирида при 290 нм, а для тиаприда при длине волны 288 нм. Раствором сравнения служило извлечение из контрольного опыта без добавления раствора исследуемого лекарственного вещества. Параллельно проводили измерение оптической плотности раствора рабочего стандартного образца производного бензамида с концентрациями 0,1 мг/мл.

Результаты выхода производных бензамида при однократной экстракции представлены в таблицах 12-14.

Таблица 12 - Выход амисульприда при использовании однократной экстракции при ненаправленном анализе___

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

3,2 80,94; 81,25; 79,34; 80,44; 84,33; 82,16 А!" =81,41; Б* =0,70; Д ^=1,79; 8=2,20%

6,5 78,26; 79,54; 79,58; 80,12; 81,47; 79,52 X =79,75; 8 л: =0,43; АХ=1,09; 8=1,37%

10,0 77,45; 76,58; 79,51; 80,11; 78,47; 79,23 X =78,56; Б* =0,54; ДХ=1,40; е=1,78%

Таблица 13 - Выход сульпирида при использовании однократной экстракции при ненаправленном анализе _

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

3,0 85,12; 83,45; 84,56; 85,11; 82,87; 84,34 X =84,24; Бл=0,37; АХ =0,96; 8=1,13%

6,0 84,12; 82,78; 86,34; 86,39; 83,51; 81,78 А' =84,15; Бл=0,77; АХ =1,98; £=2,35%

10,0 84,18; 87,45; 83,23; 82,12; 83,65; 85,13 X =84,29; 81=0,87; АХ=1,93; £=2,29%

Таблица 14 - Выход тиаприда при использовании однократной экстракции при ненаправленном анализе_

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

2,3 82,93; 85,41; 82,64; 84,98; 79,25; 81,89 X =82,80; 8*=0,91; АХ =2,4; £=2,8%

6,0 78,22; 80,54; 82,25; 78,56; 83,47; 81,95 X =80,83; 8*=0,86; АХ =2,22; г=2,74%

10,0 81,44; 82,63; 85,61; 82,54; 85,87; 80,96 Х=83,18; 8.x =0,85; АХ=2,19; £=2,63%

Для изолирования производных бензамида из мочи при направленном анализе предложена следующая методика: к пробе мочи объёмом 25 мл прибавляли 1 мл 1% раствора тиаприда, доводили 2 М раствором натрия гидроксида до значения рН среды 12 и добавляли аммония сульфат до насыщения. Экстрагировали 25 мл хлороформа в течение 5 минут. Определяли содержание изолированных исследуемых лекарственных веществ (амисульприда, сульпирида и тиаприда) из мочи аналогично вышеописанной методики. Средние результаты определений представлены в таблице 15-17.

Таблица 15 — Выход амисульприда при использовании однократной экстракции при направленном анализе___

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

3,2 78,54; 76,23; 78,76; 81,41; 79,54; 78,22 X =78,78; 8* =0,69; Ах=1,78; £=2,26%

6,5 77,56; 78,43; 83,12; 80,65; 81,23; 79,67 Х=80,11; 81=0,82; АХ =2,11; £=2,63%

10,0 82,45; 81,49; 78,87; 80,19; 77,98; 82,14 X =80,52; 8л =0,74; ДХ=1,91; с=2,37%

Таблица 16 - Выход сульпирида при использовании однократной экстракции при направленном анализе____

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

3,0 71,15; 74,24; 72,84; 70,74; 73,41; 72,83 X =72,54; Б* =0,55; АХ =1,41; £=1,94%

6,0 73,84; 74,78; 76,67; 71,14; 73,54; 72,45 Х=73,74;8*=0,78; АХ =2,00; 8=2,71%

10,0 77,41; 72,25; 74,54; 74,24; 73,67; 76,81 X =74,82; 8*=0,80; ДХ=2,05; 8=2,73%

Таблица 17 - Выход тиаприда при использовании однократной экстракции при направленном анализе_____

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

2,3 86,05; 81,56; 86,19; 87,07; 81,64; 84,49 X =84,50; Б* =0,98; АХ =2,51; г=2,98%

6,0 81,78; 86,25; 85,98; 88,64; 86,47; 82,97 X =85,35; Б* =1,03; ДХ=2,64; 8=3,10%

10,0 82,66; 86,25; 87,95; 89,21; 86,47; 84,79 X =86,22; Б л =0,94; ДХ=2,43; 8=2,81%

Изолирование нейролептиков производных бензамида из крови

Изолирование из крови трупа и живых лиц сводилось к следующему: в пробу объёмом 5 мл вводили водный раствор производного бензамида (не более 1 мл) и оставляли для связывания исследуемого вещества с белками цельной крови на сутки при температуре не более 10°С. К модельной смеси крови прибавляли 8 мл 40% раствора натрия бисульфита и 24 мл 15% раствор кислоты хлористоводородной. Солянокислый гидролиз проводили на кипящей водяной бане в течение 30 минут с воздушным холодильником. Раствор после гидролиза оставляли для охлаждения до комнатной температуры, затем прибавляли 8 мл 50% раствора кислоты трихлоруксусной до 7% концентрации для осаждения белковых веществ. Центрифугирование проводили в течение 5 минут при 5000 оборотов в минуту, так как фильтрование может привести к ненужным потерям исследуемого вещества. Экстрагирование амисульприда, сульпирида и тиаприда из полученной водной фазы проводили при значении рН среды 12 путём доведения аммиаком водным и добавляли в качестве электролита аммония сульфат до насыщения. Значение рН среды контролировали с помощью универсальной индикаторной бумаги. Экстрагирование проводили трёхкратно по 20 мл хлороформа в течение 5 минут. Полученные хлороформные извлечения объединяли в фарфоровой чашке и выпаривали в токе теплого воздуха. Полученный сухой остаток растворяли в воде и переносили в мерную колбу на 10 мл либо 25 мл и доводили объём водой до метки.

Измерение проводили относительно раствора сравнения, полученного по указанной методике без исследуемого вещества при длинах волн: для

амисульприда при 280 нм, для сульпирида - 290 нм, для тиаприда 288 нм. Результаты приведены в таблицах 18-20.

Таблица 18 — Выход амисульприда при изолировании из крови

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,2 21,23; 24,87; 23,45; 21,56; 22,43; 21,78 X =22,55; Sx =0,56; Ах=1,45; е=6,42%

1,0 25,12; 27,31; 24,65; 23,67; 26,32; 25,11 X =25,36; Sx=0,52; AX=1,34; s=5,30%

5,0 28,45; 27,64; 26,32; 29,65; 27,24; 28,56 X =27,98; Sx=0,48; Дх=1,22; 8=4,36%

Таблица 19 - Выход сульпирида при изолировании из крови

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,2 20,13; 23,34; 23,67; 21,18; 22,25; 20,87 X =21,91; Sx=0,58; АХ=1,49; е=6,79%

1,0 24,23; 21,56; 23,45; 24,54; 23,67; 22,05 X =23,25; SÏ =0,49; ДХ=1,25; 8=5,39%

5,0 23,64; 22,84; 25,12; 23,45; 24,61; 25,31 X=24,16;Sx=0,41; АХ=1,05; е=4,33%

Таблица 20 — Выход тиаприда при изолировании из крови

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,2 27,15; 29,34; 27,29; 29,58; 31,73; 28,25 7=28,89; S* =0,70; АХ =1,80; 8=6,24%

1,0 27,15; 24,36; 28,04; 24,47; 28,08; 26,01 X =26,35; Sx =0,69; АХ =1,76; 8=6,69%

5,0 30,13; 29,23; 28,07; 31,58; 32,58; 30,15 X =30,29; Sx =0,66; АХ=1,69; 8=5,59%

Изолирование нейролептиков производных бензамида из слюны Нами была разработана методика изолирования производных бензамида из слюны: к пробе слюны объемом 5 мл добавляли производные бензамида в 3-х различных концентрациях и оставляли на 3 часа, затем прибавляли 1 мл 50% раствора кислоты трихлоруксусной. После осаждения эндогенных веществ пробу центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Водную фазу отделяли, доводили значение рН среды до 12 аммиаком водным и добавляли аммония сульфат до насыщения. Экстрагирование проводили хлороформом объемом 10 мл в течение 5 минут. Органическую фазу переносили в выпарительную чашку и осуществляли удаление растворителя в потоке теплого воздуха при температуре 30-40°С. Полученный сухой остаток после выпаривания растворяли в воде, переносили в мерную колбу на 25 мл или 10 мл и доводили объем до метки.

Количественное содержание производных бензамида определяли спектрофотометрическим методом с помощью прибора СФ-56 при длине волны

для амисульприда - 280 нм, для сульпирида - 290 нм, для тиаприда 288 нм с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения (контрольный опыт).

В таблицах 21-23 представлены результаты изолирования амисульприда, сульпирида и тиаприда из слюны.

Таблица 21 - Выход амисульприда при изолировании из слюны

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,5 70,10; 68,65; 73,16; 72,23; 73,48; 69,62 А-=71,21; Б л: =0,82; Ьх =2,11; 8=2,97%

1,0 72,56; 74,34; 72,56; 75,98; 71,52; 70,68 X =72,94; 8л: =0,79; АХ =2,02; е=2,78%

5,0 73,05; 74,62; 75,55; 78,13; 76,69; 74,54 X =75,43; Б* =0,73; ДХ =1,88; £=2,49%

Таблица 22 - Выход сульпирида при изолировании из слюны

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,5 67,45; 68,61; 65,78; 69,56; 69,44; 66,43 X =67,88; Б* =0,65; ДХ=1,66; е=2,44%

1,0 68,56; 66,48; 70,13; 69,43; 67,62; 69,72 X =68,66; Б л =0,57; ДХ=1,46; £=2,13%

5,0 71,61; 67,74; 69,65; 68,34; 70,32; 71,38 X =69,84; 8*=0,64; ДХ=1,65; £=2,37%

Таблица 23 - Выход тиаприда при изолировании из слюны

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,5 74,08; 77,35; 78,25; 76,51; 75,14; 80,85 Х=77,0; Б* =0,98; Дх=2,5; £=3,3%

1,0 82,68; 78,97; 81,96; 77,42; 80,03; 83,79 ^=80,8; 8*=0,99; АХ =2,5; £=2,1%

5,0 79,95; 74,58; 76,87; 74,08; 78,96; 75,17 Х=76,6; Б* =0,99; ДХ=2,5; £=3,3%

Изолирование нейролептиков производных бензамида из желчи Методика изолирования из желчи трупа сводилась к следующему: к пробе объемом 5 мл желчи, добавляли 8 мл 40% раствора натрия бисульфита и 24 мл 15% раствора кислоты хлористоводородной до содержания её в растворе 10%. Смесь нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут с воздушным холодильником. Раствор после гидролиза охлаждали до комнатной температуры. К жидкости добавляли 8 мл 50% раствора кислоты трихлоруксусной до 7% концентрации. После осаждения эндогенных веществ через 5-10 минут центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Водную фазу сливали и доводили значение рН среды до 12 с помощью аммиака водного и добавляли в качестве электролита аммония сульфат до насыщения. Экстрагирование проводили хлороформом трехкратно по 20 мл в течение 5 минут при 120 об/мин на перемешивающем устройстве (марки ЛАБ-ПУ-01,

Россия). Для разделения фаз использовали центрифугирование. Органическую фазу сливали в выпарительную чашку и удаляли растворитель в потоке теплого воздуха при температуре 30-40°С. Полученный сухой остаток после выпаривания растворяли в воде, переносили в мерную колбу на 10 мл и доводили до метки.

Выход производных бензамида из желчи при изолировании определяли спектрофотометрически с помощью прибора СФ-56 при длине волны для амисульприда - 280 нм, для сульпирида - 290 нм, для тиаприда 288 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения (контрольный опыт). Полученные данные приведены в таблицах 24-26.

Таблица 24 - Выход амисульприда при изолировании из желчи

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,5 64,58; 66,27; 68,61; 63,24; 65,89; 67,23 X =65,91', 81=0,78; ДХ=1,99; £=3,02%

0,7 65,47; 68,56; 66,12; 67,41; 64,29; 66,15 X =66,33; 8х=0,61; Ах=1,56; е=2,36%

1,0 69,45; 67,84; 66,72; 65,57; 66,58; 70,32 X =67,75; 8х=0,75; ДХ=1,92; £=2,83%

Таблица 25 — Выход сульпирида при изолировании из желчи

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,5 60,67; 62,65; 61,89; 59,45; 63,56; 62,56 X =61,80; 8х=0,61; АХ=\,51\ е=2,54%

0,7 58,67; 60,54; 59,44; 62,47; 62,89; 61,74 Х=60,96; 8-с =0,69; Дх=1,78; £=2,92%

1,0 66,45; 61,38; 63,67; 65,83; 64,83; 66,09 X =64,71; 8* =0,78; АХ =2,01; е=3,11%

Таблица 26 - Выход тиаприда при изолировании из желчи

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

0,5 68,15; 72,65; 73,42; 67,54; 67,15; 70,09 X =69,83; 8л=1,10; АХ =2,82; £=4,04%

0,7 69,44; 71,54; 74,25; 68,54; 67,89; 69,07 X =70,12; 8 л =0,97; ДХ =2,49; 8=3,6%

1,0 74,52; 68,87; 74,95; 69,93; 75,08; 73,69 X =72,84; 81=1,11 АХ =2,86; £=3,93%

Изолирование нейролептиков производных бензамида из биологического материала

Нами были апробированы классические методы изолирования токсикологически важных веществ при изучении изолирования производных бензамида из печени - А.А. Васильевой, проф. В.Ф. Крамаренко и Стаса-Отто.

Метод A.A. Васильевой Изолирование проводили методом A.A. Васильевой, основанное на извлечении токсикологически важных веществ водой, подкисленной щавелевой кислотой до значения pH среды 2-3, соблюдая условия изолировани, с последующей экстракцией производных бензамида эфиром из кислой среды и из щелочного раствора хлороформом при значении pH среды 10.

Данные и статистическая обработка результатов определения представлены в таблицах 27-29.

Таблица 27 - Выход амисульприда при изолировании из печени по методу А.А.Васильевой _

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 48,56; 46,11; 47,27; 49,34; 51,23; 49,45 X =48,66; S*=0,82; ДХ=1,88; 8=3,87%

10,0 47,48; 46,13; 50,61; 48,23; 50,98; 46,85 X =48,38; Sл: =0,82; АХ =2,10; 8=4,33%

15,0 46,27; 48,65; 51,34; 50,38; 47,89; 47,68 X =48,70; S 1=0,76; ДХ=1,96; 8=4,02%

Таблица 28 - Выход сульпирида при изолировании из печени по методу А.А.Васильевой _

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 41,34; 40,76; 45,56; 42,47; 43,52;41,87 X=42,59; S 1=0,71; ДХ=1,83; s=4,23%

10,0 42,78; 43,56; 45,35; 44,31; 40,79; 41,77 X =43,09; S*=0,68; АХ =1,75; 8=4,07%

15,0 41,90; 44,56; 43,84; 46,47; 42,36; 43,84 X =43,83; Sл =0,67; Дх=1,72; е=3,92%

Таблица 29 — Выход тиаприда при изолировании из печени по методу А.А.Васильевой

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 52,83; 51,47; 50,04; 55,87; 52,58; 53,85 X =52,77; SJC=0,82; Дх=2,10; 8=3,97%

10,0 50,47; 48,26; 49.12; 48,15; 51,89; 53,47 X =50,23; Sjc=0,87; АХ =2,24; е=4,46%

15,0 50,47; 49,86; 48,73; 51,48; 52,16; 46,58 X =49,88; Sl=0,82; ДХ=2,12; 8=4,24%

Метод проф. В.Ф. Крамаренко Изолирование проводили методом проф. В.Ф. Крамаренко, основанное на извлечении токсикологически важных веществ водой, подкисленной кислотой серной, с очисткой эфиром из кислой среды и экстракцией производных бензамида из щелочного раствора хлороформом при значении рН среды 8-9.

Данные изолирования амисульприда, сульпирида и тиаприда из трупной печени представлены в нижеприведенных таблицах 30-32.

Таблица 30 - Выход амисульприда при изолировании из печени по методу В.Ф. Крамаренко___

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 32,12; 30,88; 33,24; 32,26; 29,67; 31,45 7 =31,60; 81=0,51; Д7=1,30;е=4,11%

10,0 32,24; 31,56; 28,81; 29,95; 32,45; 31,18 7=31,03; 8*=0,57; АХ =1,48; £=4,75%

15,0 28,56; 30,43; 28,66; 32,34; 31,23; 29,52 7=30,12; ЭЗс =0,61; АХ =1,57; е=5,21%

Таблица 31 - Выход сульпирида при изолировании из печени по методу В.Ф. Крамаренко___

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 26,56; 25,78; 29,43; 30,41; 28,45; 27,58 7=28,04; 8*=0,71; АХ=1,83;е=6,53%

10,0 29,56; 28,72; 30,22; 27,56; 25,93; 28,47 7=28,41; 8-с=0,62; АХ =1,60; е=5,62%

15,0 25,44; 26,78; 28,32; 27,12; 29,59; 28,38 7=27,61; 81=0,60; АХ =1,53; £=5,55%

Таблица 32 - Выход тиаприда при изолировании из печени по методу В.Ф. Крамаренко_

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 33,95; 37,24; 35,47; 36,45; 33,27; 36,85 7=35,54; 81=0,66; ДХ=1,70; е=4,78%

10,0 35,83; 33,87; 31,58; 34,12; 35,41; 32,11 X =33,82; Б* =0,70; Д7=1,79; £=5,30%

15,0 32,45; 37,12; 34,85; 32,54; 34,84; 32,87 7=34,11; 81=0,75; Д7=1,93; 8=5,65%

Метод Стаса-Отто Изолирование проводили методом Стаса-Отто в современной модификации, основанное на извлечении токсикологически важных веществ спиртом, подкисленным щавелевой кислотой, с последующей экстракцией производных бензамида (амисульприда, сульпирида, тиаприда) эфиром из кислой среды и из щелочного раствора хлороформом при значении рН среды 910.

В таблицах 45-47 представлены данные о степени изолирования производных бензамида из биологического материала (печени) методом Стаса-Отто.

Таблица 33 - Выход амисульприда при изолировании из печени методом Стаса-Отто

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 35,34; 36,45; 38,17; 37,23; 34,89; 33,73 X =35,97; 8*=0,66; АХ=1,71; 8=4,75%

10,0 34,68; 37,07; 36,45; 35,21; 36,56; 32,49 X =35,41; Б л =0,69; АХ=1,77; 8=5,00%

15,0 35,77; 33,68; 34,89; 36,54; 37,12; 32,92 Х=35,15; 8*=0,67; АХ=1,72; 8=4,89%

Таблица 34 — Выход сульпирида при изолировании из печени методом Стаса-Отто

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 31,22; 33,42; 34,76; 32,66; 34,09; 32,31 X =33,08; 81=0,52; АХ=1,34; 8=4,06%

10,0 33,54; 32,25; 33,15; 31,78; 35,12; 30,25 X =32,68; 8* =0,68; А X=1,74; 8=5,34%

15,0 34,56; 30,28; 32,78; 31,29; 31,02; 33,74 X =32,28; 8* =0,69; АХ=1,77; 8=5,47%

Таблица 35 - Выход тиаприда при изолировании из печени по методу Стаса-Отто

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 42,14; 37,13; 39,24; 41,64; 40,56; 38,16 X =39,81; 8л=0,81; АХ =2,08; 8=5,21%

10,0 35,57; 38,77; 40,99; 36,12; 37,68; 36,11 X =37,54; 8*=0,84; АХ=2,17; 8=5,78%

15,0 40,23; 36,85; 37,27; 41,25; 38,24; 35,04 X =38,15; Бх=0,93; АХ =2,40; 8=6,28%

Разработка способа изолирования нейролептиков производных бензамида из биологического материала Методика изолирования сводилась к следующему: к модельной смеси печени трупа, содержащей 5-15 мг производных бензамида, прибавляли 100 мл воды, подкисленной кислотой щавелевой до значения рН среды 2-2,5, оставляли на 2 часа и сливали извлечение, процеживая через двойной слой марли. Затем снова заливали 100 мл воды и настаивали 1 час. Настаивание смеси проводили при постоянном перемешивании. Затем извлечение сливали и процеживали через двойной слой марли. После этого полученную жидкость центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливали и доводили значение рН среды водного раствора до 12 аммиаком водным. Экстрагирование проводили трехкратно хлороформом по 20 мл в течение 5 минут. Хлороформное извлечение центрифугировали для

расслоения образовавшейся эмульсии. Органическую фазу сливали в фарфоровую чашку и высушивали до сухого остатка в потоке теплого воздуха. Полученный сухой остаток растворяли в воде, количественно переносили в мерную колбу на 100 мл и доводили водой до метки. Выход производных бензамида определяли спектрофотометрически с помощью прибора марки СФ-56 при длине волны для амисульприда - 280 нм, для сульпирида - 290 нм, для тиаприда 288 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения (контрольный опыт). В таблицах 36-38 представлены результаты изолирования амисульприда, сульпирида и тиаприда по модифицированной методике.

Таблица 36 - Выход амисульприда при изолировании из печени по разработанной методике__

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 51,04; 50,36; 55,53; 56,27; 54,60; 52,89 X =53,45; Sx =0,99; АХ =2,54; е=4,75%

10,0 52,78; 55,67; 56,71; 54,56; 55,94; 51,65 X =54,55; S*=0,80; ДХ=2,07; £=3,79%

15,0 58,73; 55,69; 54,72; 55,83; 56,35; 59,53 X =56,81; S*=0,77; ДХ=1,98; £=3,49%

Таблица 37 - Выход сульпирида при изолировании из печени по разработанной методике

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 47,92; 49,43; 50,36; 48,11; 46,78; 51,77 X =49,06; S-с =0,74; ДХ=1,91; £=3,89%

10,0 48,67; 49,34; 52,39; 53,19; 47,31; 48,65 X =49,93; S л =0,95; АХ =2,44; £=4,89%

15,0 53,84; 52,14; 48,36; 50,21; 52,69; 52,83 Х=51,68; S*=0,82; АХ =2,12; £=4,10%

Таблица 38 - Выход тиаприда при изолировании из печени по разработанной методике_

Добавлено, мг Выход, % Метрологические характеристики

5,0 58,14; 60,14; 61,67; 59,48; 57,45; 56,23 X =58,85; Sx =0,80; ДХ=2,06; £=3,51%

10,0 61,15; 59,09; 58,15; 57,83; 61,25; 62,83 X =60,05; S-t=0,81; АХ =2,09; £=3,48%

15,0 62,83; 60,88; 63,65; 64,27; 59,47; 62,08 X =62,20; Si =0,73; АХ =1,88; £=3,02%

Сохраняемость нейролептиков производных бензамида в трупном материале Изучена сохраняемость нейролептиков производных бензамида (амисульприда, сульпирида и тиаприда) в трупном материале (печени трупа). В

печени при добавлении производных бензамида в количестве 10 мг установлено, что данные соединения обнаруживаются в течение 6 месяцев и возможно провести количественное определение. Сохраняемость амисульприда при изолировании по разработанной методике составляет до 22%, сульпирида -20%, а тиаприда - 25%. Степень изолирования в загнившем трупном материале при хранении 60, 90 или 180 дней практически одинакова. Поэтому можно предположить, что в первые недели хранения происходит связывание и разрушение производных бензамида, а затем процессы приостанавливаются.

Предложенная методология изолирования, обнаружения и количественного определения производных бензамида в биологическом и трупном материале заключается в следующем: выборки органов и биологических объектов для исследования, разработанных методиках изолирования, качественные и количественные методы анализа в сочетании с условиями оснащений лабораторий. Методология включает в себя возможность использования следующих методов, таких как тонкослойная хроматография, хромогенные реакции, микрокристаллоскопические реакции,

высокоэффективная жидкостная хроматография, УФ-спектрофотометрия, газожидкостная хроматография, ИК-спектрофотометрия в ближней и средней области и хромато-масс-спектрометрии, а также применима к исследованию и разработке методик анализа вновь синтезируемых производных бензамида.

Общие выводы

1. По результатам проведенных социологических и медицинских исследований установлено, что нейролептики производные бензамида широко используются в современной медицинской практике, довольно часто встречаются побочные эффекты на фоне приема с необходимостью отмены в связи с угрозой для жизни пациента. Описана симптоматика побочных эффектов при употреблении нейролептиков данной группы.

2. Предложены на основе практических результатов и теоретического обоснования рекомендации к выбору биологических объектов исследования. Установлено, что оптимальными в качестве объектов исследования являются внутренние органы трупа: печень, почки, желудок с содержимым, тонкий кишечник, селезёнка, лёгкие и сердце. Изучены некоторые фармакокинетические параметры данных соединений, необходимые для целей и задач при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований.

3. Разработан методологический подход к стадии пробоподготовки и изолированию производных бензамида, основываясь на результатах практических исследований и теоретических обоснований. Разработаны по результатам теоретических и экспериментальных исследований методики изолирования производных бензамида из биологических жидкостей (крови, мочи, желчи, слюны) и трупного материала с оптимальным выходом. Проведена сравнительная оценка изолирования амисульприда, сульпирида и тиаприда классическими методами: Стаса-Отто, A.A. Васильевой и проф В.Ф. Крамаренко.

4. Разработан методологический подход к систематическому анализу амисульприда, сульпирида и тиаприда на стадии качественного определения в извлечениях из биологических жидкостей и объектов. На основании теоретических и экспериментальных исследований разработаны методики качественного исследования с возможностью их дифференциации между собой амисульприда, сульпирида и тиаприда современными химическими и физико-химическими методами, как хромогенные реакции, микрокристаллоскопические реакции, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, УФ-спектрофотометрия, ИК-спектроскопия в ближней и средней области, хромато-масс-спектрометрия и газожидкостная хроматография. Установлены пределы обнаружения нейролептиков производных бензамида при использовании данных методов.

5. Разработан методологический подход и методология к систематическому анализу амисульприда, сульпирида и тиаприда на стадии количественного определения в извлечениях из биологических жидкостей и внутренних органах живых лиц и трупа. Разработаны методики количественного определения амисульприда, сульпирида и тиаприда в извлечениях из биологических объектов с помощью методов тонкослойной хроматографии (полуколичественное определение), УФ-спектрофотометрией и высокоэффективной жидкостной хроматографией. Валидационная оценка разработанных методик количественного определения нейролептиков производных бензамида в биологических объектах показала, что они дают воспроизводимые и достоверные результаты.

6. Предложен методологический системный подход и методология анализа к проведению судебно-химического и химико-токсикологического исследования на нейролептики производные бензамида, рекомендации к проведению экспертного исследования и судебно-медицинская оценка результатов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Калёкин P.A., Кулешова С.А. Новые сведения о токсичности и опасности химических и биологических веществ. Тиаприд. // Токсикологический вестник. - 2006. - №2. - С. 42-43.

2. Калёкин P.A., Лазарян Д.С. Газохроматографический анализ тиаприда // Вестник ВГУ. Серия: химия, биология, фармация. - 2006. - №2. - С. 5153.

3. Калёкин P.A., Лазарян Д.С., Цыбулина М.Г. Судебно-химический анализ тиаприда в биологических жидкостях трупа // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном этапе: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. С международным участием, посвященной 75-летию Российского центра судебно-медицинской экспертизы 18-20 октября 2006 г. - М., РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2006. - С. 171-173.

4. Калёкин P.A., Теплова A.A. Микрокристаллоскопический анализ анальгина и хинина // Научное обозрение. - 2006. - №2. — С. 44-45.

5. Калёкин P.A., Лазарян Д.С., Цыбулина М.Г. Анализ тиаприда в трупном материале // Судебно-медицинская экспертиза. - 2007. - №1. - С. 24-27.

6. Калёкин Р.А, Саломатин Е.М., Калёкина В.А. Перспективы разработки судебио-химического и химико-токсикологического анализа нейролептиков, замещенных бензамидов // Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф., посвященной памяти проф. Ю.М. Кубицкого 31 октября - 01 ноября 2007 г. -М., РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2007. - С. 212-218.

7. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А. Токсикологическая характеристика нейролептиков - замещенных бензамидов // Судебно-медицинская экспертиза. — 2007. - №6. — С. 31-34.

8. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова A.A. Использование УФ-спектрофотометрии в судебно-химическом анализе нейролептиков, производных бензамидов // Человек и лекарство: тез. докл. 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апр. 2008 г. - М., 2008. - С. 540-541.

9. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова A.A. Дифференциация нейролептиков группы производных бензамидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) // Материалы Всероссийского совещания судебно-медицинских экспертов по применению правил и медицинских критериев определения степени тяжести вреда, причененного здоровью человека, и итоговой научно-практической конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы, Москва, 30-31 октября 2008 г./ под ред. проф. В.А. Клевно - М.: РИО ФГУ РЦСМЭ Минздравсоцразвития России, 2008. - С. 226-228.

10. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова A.A. Лабораторная диагностика отравлений нейролептиками производными бензамида в наркологии: возможности и проблемы // Наркология. — 2008. -№4. - С. 33-37.

11. Калёкин P.A., Лазарян Д.С., Цыбулина М.Г. Определение тиаприда в биологических объектах при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа. Новая медицинская технология. - Разрешение на применение ФС №2009/057 от 31.03.2009.

12. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова A.A. Возможность использования различных растворителей при определении нейролептиков, производных бензамидов методом УФ-спектрофотометрии в целях судебно-химического анализа // Человек и лекарство: тез. докл. 16 Рос. нац. конгр. 6-10 апр. 2009 г. - М., 2009. - С. 531.

13. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А. Дифференциации производных бензамидов с использованием метода ИК-спектроскопии // Судебная экспертиза. - 2009. - № 4. - С.33-38.

14. Калёкин P.A., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова A.A. Проблемы и ошибки в судебно-химических исследованиях на наркотические и психотропные вещества // О проблемных вопросах в организации производства судебно-медицинских экспертиз: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. 5-6 ноября 2009 г. - М., РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2009. -С. 313-317.

15. Калёкин Р.А., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова А.А. Спектрофотометрический анализ в условиях дифференциации нейролептиков группы производных бензамида // О проблемных вопросах в организации производства судебно-медицинских экспертиз: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. 5-6 ноября 2009 г. - М., РИО ФГУ «РЦСМЭ Росздрава», 2009. - С. 317-320.

16. Калёкин Р.А., Саломатин Е.М., Калёкина В.А., Волкова А.А. Ошибки в производстве судебно-химических экспертиз // Альманах судеб, медицины. -2009. - №5.-С. 11-13.

17. Калёкин Р.А., Саломатин Е.М., Калёкина В.А. Применение ИК-спектроскопии в ближней области при дифференциации нейролептиков, производных бензамидов // Судебно-медицинская экспертиза. - 2010. - №3. -С. 33-35.

18. Kalekin R.A., Salomatin Е.М., Kalekina V.A., Volkova А.А. Judicial-chemical research of some neuroleptics // 48th Annual Meeting of the International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT) 29 aug. - 2 sep. 2010. -Bonn, 2010.-P. 179.

19. Калёкин P.A. Предел обнаружения нейролептиков, производных бензамидов, методом УФ-спектрофотометрии // Человек и лекарство: тез. докл. 18 Рос. нац. конгр. 11-15 апр. 2011 г. - М., 2011. - С. 530.

20. Калёкин Р.А. Дифференциация амисульприда, сульпирида и тиаприда в анализе слюны при химико-токсикологическом исследовании // Человек и лекарство: тез. докл. 18 Рос. нац. конгр. 11-15 апр. 2011 г. — М., 2011. - С. 530-531.

21. Калёкин Р.А., Саломатин Е.М. Определение нейролептиков производных бензамида (амисульприда, сульпирида и тиаприда) при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследований. Методические рекомендации. - М.: ФГБУ «РЦСМЭ» Минздравсоцразвития России, 2012. — 28 с.

22. Калёкин Р.А. Изучение особенностей использования в практической медицине нейролептиков производных бензамида для целей судебной медицины // Эксперта. -2012. - №2. - С. 49-51.

23. Калёкин Р.А., Саломатин Е.М., Калёкина В. А., Волкова А.А. Использование УФ-спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии для выявления фальсифицированных лекарственных средств // Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы: сб. тез. науч.-практ. конф. с международным участием 17-18 мая 2012 г. - М.: Изд-во Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, 2012. - С. 237-240.

24. Калёкин Р.А. Судебно-медицинская (химическая) оценка нейролептиков. - Из-во: LAP, 2012. — 110 с.

25. Калёкин Р.А. Использование метода хроматографии в тонком слое сорбента для идентификации и дифференциации между собой нейролептиков производных бензамида // Наука в современном обществе: материалы II Международной научной конференции. - Ставрополь: Центр научного знания «Логос», 2012. — С. 24-26.

26. Калёкин P.A. Возможность первичной диагностики острых отравлений нейролептиками амисульпридом, сульпиридом и тиапридом по клиническим признакам // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - № 2. — С.104-106.

27. Калёкин P.A., Лазарян Д.С., Цыбулина М.Г. Определение тиаприда в биологических объектах при проведении химико-токсикологического и судебно-химического анализа (новая медицинская технология) // Медицинские технологии, используемые при производстве судебно-медицинских экспертиз: Сборник 2005-2011. Сост. В.А. Клевно. — М.: «Компания Планета Земля», 2012. - С.137-142.

28. Калёкин P.A. Идентификация и установление подлинности лекарственных средств группы нейролептиков производных бензамида при использовании хромогенных реакций // Вестник московского университета. Серия 2. Химия. - 2012. - № 5. С.350-352.

КАЛЕКИН РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ (РОССИЯ)

Разработка методологии химико-токсикологического и судебно-химического определения нейролептиков производных бензамида

На основании теоретических и экспериментальных исследований, их систематизации и анализа производных бензамида: предложен методологический подход к систематическому анализу амисульприда, сульпирида и тиаприда для судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Предложенная методология изолирования, обнаружения и количественного определения указанных производных бензамида в биологическом и трупном материале заключается в следующем: выборки органов и биологических объектов для исследования, использование разработанных методик изолирования, качественных и количественных методов анализа, с учетом современной оснащенности лабораторий. Методология включает в себя возможность использования следующих методов анализа: таких как тонкослойная хроматография, хромогенных и микрокристаллоскопических реакций, высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ-спектрофотометрии, газо-жидкостной хроматографии, ИК-спектрофотометрии в ближней и средней области и хромато-масс-спектрометрии. Указанная методология применима к исследованию и разработке методик анализа вновь синтезируемых производных бензамида.

KALEKIN ROMAN ANATOLYEVICH (RUSSIA)

Development of methodology chemico-toxicological and forensic determination of neuroleptics - benzamides

Basing on systematization of theoretical and experimental research in benzamides analysis, the methodological approach for systematic analysis of amisulpride, sulpiride and tiapride in chemico-toxicological and forensic determination was developed. This methodology is describing: insulation, determination and measuring of amisulpride, sulpiride and tiapride in biological and cadaveric substance, and consists of: biological substance and organs selection; qualitative and quantative methods, which are representing on present laboratory equipment. This methodology is including the possibility of use such methods of analysis as, thin layer chromatography, chromogenic and micro-crystallized reactions, high-performance liquid chromatography, ultraviolet spectrophotometry, gas-liquid chromatography, infrared spectrophotometry in nearby and middle spectral range, chromatography-mass spectrometry. The methodology could be used in research and development analysis procedures of newly synthesize benzamides.

КАЛЁКИН РОМАН АНАТОЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО И СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОЛЕПТИКОВ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗАМИДА

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора фармацевтических наук

Подписано в печать: 01.10.2012 Объем: 2,0 усл. п.л. Тираж: 150 экз. Заказ № 682 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru