Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование 2-метокси-4-аллилгидроксибензола

и""

На правах рукописи

1 3 А В Г 2009

СУХОМЛИНОВА Екатерина Алексеевна

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 2-МЕТОКСИ-4-АЛЛИЛГИДРОКСИБЕГООЛА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Курск - 2009

003475174

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Шорманов Владимир Камбулатович Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пятигорская государственная

фармацевтическая академия Росздрава»

на заседании диссертационного сове ,, 039.03 при ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава»

Автореферат разослан «..-¿У » ¿¿/¿¿¿Л 2009 г.

Яцюк Валентина Яковлевна кандидат фармацевтических наук, доцент Дурицын Евгений Петрович

Защита состоится « 2009 г. в

часов

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. 2-метокси-4-аллилгидроксибензол (синонимы: эвгенол, З-этокси-4-оксиаллилбензол) - биологически активное вещество, входящее в состав гвоздичного, базиликового и ряда других эфирных масел и обладающее антисептическими свойствами. 2-метокси-4-аллилгидроксибензол применяется в стоматологии, парфюмерной и табачной промышленности, является полупродуктом синтеза изоэвгенола.

Данное соединение обладает значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. ЬВ50 2-метокси-4-аллилгидроксибензола для крыс при внутрижелудочном введении составляет 1930 мг/кг, при интраперитонеальном - 800 мг/кг, при интратрахеальном - 11 мг/кг. Для мышей ЬВ50 при интраперитонеальном введении составляет 500 мг/кг.

Описаны случаи отравления данным веществом, в том числе с летальным исходом.

Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе его производства, хранения и применения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.

Широкое применение 2-метокси-4-аллигидроксибензола, его токсические свойства, наличие случаев летального отравления обусловливают необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования 2-метокси-4-аллигидроксибензола из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического исследования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

изучить особенности поглощения 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом электромагнитного излучения в УФ- и ИК- областях спектра;

- определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз;

исследовать хроматографическое поведение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола и компонентов ряда содержащих его природных смесей веществ в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектированием;

- изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях 2-метокси-4-аллилгидроксибензола с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала;

- исследовать особенности изолирования объекта исследования из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы, разработать схему очистки извлечений;

- исследовать особенности изолирования из биологического материала и очистки объекта исследования путём переведения его в парогазовую фазу;

- изучить распределение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в органах и биожидкостях теплокровных животных;

- определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Исследованы закономерности хроматографической активности 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в условиях применения различных элюентов; определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемого вещества методами ТСХ и колоночной хроматографии низкого давления.

На основе предварительных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методами ТСХ и ВЭЖХ.

Изучены особенности поглощения 2-метокси-4-

аллилгидроксибензолом электромагнитного излучения в УФ- и ИК- областях спектра. Для повышения селективности определения рассматриваемого вещества методом электронной спектрофотометрии рассчитан ряд основных характеристик и производные спектров. Для идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола предложены хромогенные реакции с окислителями (бихроматом калия, нитритом натрия, 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом, концентрированной серной кислотой), а также реакции электрофильного замещения (с 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте и с бромной водой).

Изучены особенности масс-спектра 2-метокси-4-

аллилгидроксибензола, получаемого методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения рассматриваемого соединения по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.

Впервые для изолирования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен этилацетат. На основе использования этилацетата как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого вещества в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.

Показана возможность и определены оптимальные условия идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом хромато-масс-спектрометрии в объектах биологического происхождения после предварительного переведения анализируемого вещества в парогазовую фазу.

В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в организме теплокровных.

Изучена сохраняемость рассматриваемого отравляющего вещества в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения в гнилостно-разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований предложено 3 варианта общей схемы исследования биоматериала при отравлении 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом.

Внедрение результатов работы:

- методика количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 1 июня 2006 года, на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 20 сентября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 10 октября 2006 года;

- методика идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в моче (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета со 2 июня 2006 года, на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 3 октября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 12 сентября 2006 года;

- методика количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани трупного органа (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 1 июня 2006 года, на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии

Курского государственного медицинского университета с 3 октября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 12 сентября 2006 года;

- методика определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола и близких по структуре гидроксиаренов методом ТСХ (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре биоороганической химии Курского государственного медицинского университета с 25 октября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 24 октября 2006 года;

методика фотометрического определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в извлечениях из биологических объектов на основе реакции азосочетания (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 10 октября 2006 года;

- методика идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в эфирном масле гвоздики (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 16 ноября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 21 ноября 2006 года;

методика спектрофотометрического определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 25 октября 2006 года;

- методика определения гидроксибензола и его монометильных производных при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в ГУЗ Курское областное бюро суд.-мед. экспертизы, акт апробации от 4 декабря 2007 года и в экспертно-криминалистическом центре УВД по Курской области, акт апробации от 25 декабря 2007 года).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографического поведения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;

- особенности поглощения анализируемым веществом электромагнитного излучения в УФ- и ИК- областях спектра;

- методики идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;

условия взаимодействия анализируемого соединения с рядом цветореагентов;

результаты исследования особенностей очистки 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;

- методика изолирования объекта исследования на основе настаивания с этилацетатом и очистки от соэкстрактивных веществ;

- методика изолирования рассматриваемого соединения из биологического материала путем переведения его в парогазовую фазу;

- особенности распределения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в организме теплокровных животных;

- сохраняемость 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на 72-ой итоговой межвузовской научной конференции «Молодежная наука и современность» (Курск, 2007 г.), на региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики» (Курск, 2006 г.), на 73-ей научной конференции КГМУ и сессии Центально-Чернозёмного научного центра РАМН (Курск, 2008 г.), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 2008 г.), на II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008 г.).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.00610402.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 9 публикациях, 3 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования материалов диссертационных исследований.

Объём и структура диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, пять глав, содержащих результаты эксперементальных исследований, общие выводы, общую схему исследования, список цитируемых литературных источников. Работа изложена на 249 страницах, иллюстрирована 19 рисунками, содержит 46 таблиц. Список литературы составляют 241 источник, 103 из которых на русском и 138 - на иностранных языках.

В первой главе (обзор литературы) излагается известная информация о 2-метокси-4-аллилгидроксибензоле как объекте химического и химико-токсикологического исследования.

В главах со второй по шестую (включительно) приводятся результаты собственных экспериментальных исследований.

Во второй главе рассмотрены особенности идентификации рассматриваемого соединения хромогенными реакциями, методами хроматографии, хромато-масс-спектрометрии, фотометрии.

Третья глава включает результаты исследований по количественному определению 2-метокси-4-аллилгидроксибензола.

В четвертой главе рассматриваются вопросы выделения и очистки анализируемого вещества с применением жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

Пятая глава посвящена изучению особенностей изолирования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала и определения рассматриваемого вещества в получаемых извлечениях.

В шестой главе приводятся результаты изучения распределения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в организме теплокровных и сохраняемости данного вещества в трупном материале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования явился 2-метокси-4-аллилгидрокси-бензол (2-МО-4-АГОБ) (эвгенол) с содержанием основного вещества не менее 99,9 % (фирма «Мерк» (ФРГ)).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследована хроматографическая подвижность данного вещества в тонких слоях и колонках нормальнофазовых и обращённофазовых сорбентов в присутствии ряда близких по структуре гидроксиаренов (гиюроксибензола (ГОБ), 2-метилгидроксибензола (2-МГОБ), 2-метилэтил-5-метилгидрокси-бензола (2-МЭ-5-МГОБ).

Для характеристики подвижности анализируемых соединений рассчитаны значения ЯГ и Пб (относительно гидроксибензола), условного удерживания (В), изменения свободной энергии при адсорбции (Д(ДО) для метода ТСХ, а также значения времени (1:к) и объёма удерживания относительного (по отношению к гидроксибензолу) удерживания, коэффициента ёмкости (к), числа теоретических тарелок (>{), относительной ёмкости (['V) и изменения свободной энергии при адсорбции (Д(ДО)) для ВЭЖХ.

Как свидетельствуют данные таблицы 1, наиболее оптимальные условия хроматографирования 2-МО-4-АГОБ в тонких слоях сорбента с гидроксилированной поверхностью (широкопористый силикагель на пластинах «Силуфол» ЦУ-254) достигаются при использовании отдельных подвижных фаз малой и средней полярности гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (20:5:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) и гексан-хлороформ-пропанол-2 (20:5:1).

Системы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) явились оптимальными для определения объекта исследования методом ВЭЖХ в колонках нормальнофазового сорбента «Силасорб-бОО» (см. таблицу 2).

При использовании данных элюентов хроматографическая подвижность при определении в тонких слоях и колонках рассмотренных гидроксилированных сорбентов изменяется в ряду: ГОБ < 2-МГОБ < 2-МЭ-5-МГОБ < 2-МО-4-АГОБ.

Таблица 1

Параметры хроматографирования 2-МО -4-АГОБ и близких по струетуре веществ в тонком слое гидроксилированного сорбента с использованием оптимальных

Подвижные фазы Анализируемые вещества ИГ № В А(ДС)

Гексан- диоксап- пропанол-2 (40:5:1) 2-МГОБ 0,24 1,00 4,16 1,00 0

2-МО-4-АГОБ 0,30 1,25 3,33 0,80 539,58

2-( 1 -МЭ)-5-МГОБ 0,30 1,25 3,33 0,80 539,58

ГОБ 0,24 1,00 4,16 1,00 0

Гексан-дноксан-пропанол-2 (20:5:1) 2-МГОБ 0,52 1,13 1,92 0,88 318,84

2-МО-4-АГОБ 0,56 1,22 1,79 0,83 465,00

2-(1-МЭ)-5-МГОБ 0,62 1,35 1,61 0,74 735,79

ГОБ 0,46 1,00 2,17 1,00 0

Гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) 2-МГОБ 0,56 1,10 1,79 0,91 515,05

2-МО-4-АГОБ 0,59 1,16 1,69 0,86 367,89

2-( 1 -МЭ)-5 -МГОБ 0,64 1,25 1,59 0,80 539,58

ГОБ 0,51 1,00 1,96 1,00 0

Гексан-хлороформ-пропаиол-2 (20:5:1) 2-МГОБ 0,30 1,25 3,33 0,80 367,89

2-МО-4-АГОБ 0,45 1,88 2,22 0,53 1545,16

2-(1-МЭ)-5-МГОБ 0,43 1,79 2,33 0,56 1422,53

ГОБ 0,24 1,00 4,17 1,00 0

Таблица 2

Параметры хроматографирования 2-МО -4-АГОБ и близких по струетуре соединений методом нормалыюфазовон ВЭЖХ ____

Анализируемые соединения 11! Относительное удерживание к' N Д(ДС)

Система растворителей гексан-диоксан-пропаиод-2 (40:5:1)

ГОБ 3,78 378 1,00 1,15 2025 1,00 0

2-МГОБ 3,30 330 0,87 0,84 2739 0,73 766,265

2-МО^-АГОБ 3,02 302 0,80 0,72 1622 0,624 1530,441

2-( 1 -МЭ)-5 -МГОБ 2,88 288 0,76 0,59 2086 0,51 1639,478

Система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1)

ГОБ 2,23 223 1,00 0,27 1076 1,0 0

2-МО -4-АГОБ 2,14 214 0,96 0,22 1373 0,809 519,958

Как свидетельствуют данные таблицы 2, подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) позволяет идентифицировать 2-МО-4-АГОБ методом ВЭЖХ в присутствии ряда близких по структуре и свойствам гидроксиаренов.

Для варианта обращённофазовой ТСХ (модель привитой фазы Сн - С15 на основе пластин «Силу фол» ЦУ-254) (см. таблицу 3) наиболее оптамальными подвижными фазами явились этанол-буферный раствор с рН 9,9 (5:5) и ацетон-буферный раствор с рН 3,29 (5:5).

Таблица 3

Параметры хроматографирования 2-МО -4-АГОБ и близких по структуре веществ в тонком слое обращённофазового сорбента (модель привитой фазы См-С15) с использованием оптимальных подвижных фаз_____

Подвижные фазы Анализируемые вещества Rf Rs В Ft- A(AG)

Этанол-буферный раствор с рН 9,9 2-МГОБ 0,65 0,89 1,54 1,12 -227,95

2-МО -4-АГОБ 0,52 0,71 1,92 1,40 -825,24

2-( 1 -МЭ)-5 -МГОБ 0,34 0,47 2,94 2,15 -1877,41

ГОБ 0,73 1,00 1,37 1,00 0

Ацетон-буферный раствор с рН 3,29 (5:5) 2-МГОБ 0,52 0,85 1,92 1,17 -385,07

2-МО -4-АГОБ 0,42 0,69 2,38 1,45 -911,31

2-( I -МЭ)-5-МГОБ 0,26 0,43 3,85 2,35 -2095,57

ГОБ 0,61 1,00 1,64 1,00 0

Система ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (6:4) явилась оптимальной для определения объекта исследования методом ВЭЖХ в колонках обращённофазового сорбента «Nova Pack С-18» размерами 150x3,9 мм с использованием хроматографа «Alliance» фирмы «Waters» (США), снабженного диодно-матричным детектором (см. таблицу 4).

Таблица 4

Параметры хроматографирования 2-МО -4-ЛГОБ и близких по структуре

соединений методом обращённофазовон ВЭЖХ

Анализируемые соединения tR VR Относительное удерживание к' N F к' Д(ДО

Система растворителей ацетонитрил-буферный раствор с рН 2,5 (6:4)

2-МО-4-АГОБ 2,179 i 2179 | - | 0,45 | 1798 | - |

Система растворителей ацетонитрил-буферный раствор с рН 4 (3:7)

ГОБ 3,196 3196 1,00 1,13 4184 1,00 0

2-МО -4-АГОБ 13,281 1328 1 4,16 7,85 6241 6,95 -4754,914

Результаты изучения особенностей хроматографической подвижности 2-МО-4-АГОБ свидетельствуют о возможности его идентификации методами ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Открываемый минимум при идентификации методом ТСХ в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями составляет 0,1-0,2 мкг. Открываемый минимум рассматриваемого соединения методом ВЭЖХ составляет 0,02 мкг при использовании нормальнофазового варианта хроматографирования и 0,003 мкг при использовании обращённофазового варианта проведения процесса.

Разработаны методики количественного определения рассматриваемого соединения с применением метода ВЭЖХ в субстанции и некоторых эфирных маслах с большим его содержанием. Результаты представлены в таблице 5.

Как свидетельствуют полученные данные, методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата в случае использования нормальнофазового

варианта хроматографирования составляет не более 1,6 % при определении в субстанции, при использовании обращённофазового варианта не превышает 1,24 % при определении в субстанции, 1,5 % при определении в масле гвоздики и 2,2 % при определении в масле базилика.

Таблица 5

Результаты количественного определения 2-М-4-АГОБ методой ВЭЖХ (п=6; =0.95)

Объект исследо- Найдено, %

Сорбент Элюепт вания и содержание 2-М-4-АГОБ в хроматографи-руемой пробе,мкг X S S, Дх

Гексан-

Сшмсорб- диоксан-пропанол-2 (15:5:1) Субстанция, 0,64 99,93 1,52 0,62 1,60 1,60

600 Гексан-

диоксан-пропаиол-2 (40:5:1) Субстанция, 0,64 99,79 1,47 0,60 1,54 1,55

Nova Pack С-18 Ацетонитр ил- буферный раствор с рН 2,5 (6:4) Субстанция, 1,00 Масло гвоздики 1,20 Масло базилика 1,60 99,90 80,04 59,42 1,18 1,11 1,21 0,48 0,45 0,49 1,24 1,17 1,26 1,24 1,46 2,13

Изучены особенности светопоглощения 2-МО-4-АГОБ в УФ- и видимой областях спектра при использовании в качестве растворяющих сред органических соединений различной полярности, а также воды и разбавленных растворов кислой и щелочной реакции. Рассчитаны некоторые оптические характеристики электронных спектров исследуемого образца в данных растворителях.

В ИК-спектрах исследуемого вещества присутствуют характеристические полосы поглощения, соответствующие валентным (3483 см"1) и деформационным (1366 см"1) колебаниям гидроксильной группы, валентным колебаниям С-Н (интервал частот 3075-2840 см"1), валентным колебаниям С=С бензольного ядра, валентным колебаниям =С-0 (1232 см'1) и С-О-С (1033 см"1), плоскостным и внеплоскостным типам колебаний =С-Н.

Показана возможность идентификации 2-МО-4-АГОБ по характеру поглощения УФ- и ИК-излучения .

Изучены особенности взаимодействия анализируемого вещества с рядом окислителей неорганической (дихромат калия, концентрированная серная кислота, нитрит натрия) и органической (хлорид 2,3,5-трифенилтетра-золия) природы, а также с электрофильными агентами в реакциях азосочета-ния или нитрования с последующим получением аци-нитропроизводного.

На основе рассмотренных цветных реакций разработаны методики идентификации анализируемого вещества. Открываемый минимум - 0,05-2,5 мкг/мл.

Разработаны методики количественного спектрофотометрического и хроматоспектрофотометрического определения 2-МО-4-АГОБ на основе его поглощения в среде этанола, по реакции азосочетания с диазотированным 2-(4-аминобензолсульфамидо)тиазолом, а также методики определения 2-МО-4-АГОБ в субстанции и эфирных маслах на основе расчёта вторых производных электронных спектров. Результаты определения вещества предлагаемым рядом методик представлены в таблице 6.

Разработанные методики позволяют достичь достаточно высокой чувствительности, воспроизводимости и правильности определения. Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) при определении 2-МО-4-АГОБ в субстанции без математической обработки спектров составила 0,85-1,23%, с применением расчёта вторых производных - 2,09%. При определении в эфирных маслах гвоздики и базилика методом производной спектрофотометрии относительная ошибка составила соответственно 2,59% и 3,78%.

Изучена возможность применения метода газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием для идентификации 2-МО-4-АГОБ и эфирных масел с его высоким содержанием.

Таблица 6

Результаты количественного определения 2-МО-4-АГОБ методом

спектрофотометрии (п=6, Р=0.95)

Методика определения Объект исследования и содержание 2-М-4-АГОБ в фотометрируемом растворе, мкг/мл Найдено, %

X в в,- Дх £

По поглощению в среде этанола Субстанция, 40,0 99.93 0,75 0,31 0,85 0,85

На основе реакции азосочетания Субстанция, 1,6 100.01 0,85 0,35 0,89 0,89

На основе расчета второй производной электронного спектра в среде этанола Субстанция, 40,0 Масло гвоздики 48,0 Масло базилика 72,0 99.99 81,73 59,39 1,99 2,01 2,14 0,81 0,82 0,87 2,09 2,11 2,24 2,09 2,59 3,78

По поглощению в среде этанола после хроматографирования в тонком слое силикагеля Субстанция, 40,0 100,03 1,10 0,45 1,25 1,25

Для очистки исследуемого вещества рассмотрена возможность применения жидкость-жидкостной экстракции и хроматографических методов.

По результатам изучения хроматографической активности 2-МО-4-АГОБ предложены способы его очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонках с гидроксилированным (силикагель Ь 40/100р.) и привитым («Силасорб С-18») сорбентами, а также на пластинах «Силуфол» ЦУ-254 и «Силуфол» иУ-254, пропитанных вазелиновым маслом (модель привитой

фазы С14 - Си). Потери анализируемого вещества при хроматографировании во всех случаях не превысили 1%.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений методами ТСХ и колоночной жидкостной хроматографии низкого давления.

Проведено сравнительное изучение изолирования 2-МО-4-АГОБ из биоматериала изолирующими агентами различной природы. В качестве изолирующих жидкостей рассмотрены гидрофобные (гексан, толуол, хлороформ, этилацетат, диэтиловый эфир, уксусный ангидрид) и гидрофильные (диоксан-1,4, ацетон, ацетонитрил, этанол, ледяная уксусная кислота, ДМФА) органические растворители, а также вода, ОД н раствор гидроксида натрия и 8%-й водный раствор уксусной кислоты).

Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Результаты сравнительного изолирования 2-МО-4-АГОБ из биологического материала

Как свидетельствуют полученные данные, наиболее высокий процент извлечения 2-МО-4-АГОБ достигается этилацетатом.

Исследована зависимость степени извлечения 2-МО-4-АГОБ этилацетатом от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.

Исследования зависимости степени извлечения рассматриваемого вещества этилацетатом от объема изолирующего агента и кратности изолирования показали, что для достижения достаточно полного извлечения анализируемого соединения из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующего агента в каждом случае должно превышать количество биоматериала как минимум в два раза.

При изучении зависимости степени извлечения 2-МО-4-АГОБ от продолжительности контакта изолирующей жидкости и биоматериала установлено, что максимальные значения степени извлечения анализируемого вещества из ткани трупной печени достигаются при продолжительности настаивания не менее 30 минут.

Установлено, что при увеличении содержания 2-МО-4-АГОБ в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (0,01-0,2%) при постоянной массе навески ткани трупной печени наблюдается лишь незначительное изменение степени извлечения, не превышающее 1,5%.

На основе предварительных исследований разработаны методики определения 2-МО-4-АГОБ в ткани трупных органов, крови и моче на основе изолирования этилацетатом и последующей очистки извлечённого соединения методами ТСХ и колоночной хроматографии. Количественная оценка результатов определения представлены на рисунках 2 и 3.

Как свидетельствуют полученные данные, при внесении 2-МО-4-АГОБ в биологические объекты в виде субстанции в количестве 100 мг в 100 г биоматериала разработанные методики, предусматривающие хроматографи-ческую очистку извлечений, позволяют определять в ткани печени 84,1988,51%, в крови - 77,53-85,64%, в моче - 92,95-97,24%, в гнилостно изменённой печени - 86,34-88,30% анализируемого соединения, методики, основанные на очистке сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и

I*, %

И 3 м.

печень

Рис. 2. Результаты определения 2-МО-4-АГОБ в биологичсском материале после изолирования этилацетатом (содержание вещества - 100 мг в 100 г биологического объекта) и очистки с применением нормальнофазовой хроматографии:

1 - хроматография в колонке силикагеля Ь40/100ц;

2 - жидкость-жидкостная экстракция и хроматография в колонке силикагеля 1.40/100(1;

3 - хроматография в тонком слое силикагеля

И, %

50

25

О

печень

кровь

моча

Рис. 3. Результаты определения 2-МО-4-АГОБ в биологическом материале после изолирования этилацетатом (содержание вещества - 100 мг в 100 г биологического объекта) и очистки с применением обращеннофазовой хроматографии:

1 - хроматография в колонке с сорбентом «Силасорб С-18» ЗОц;

2 - жидкость-жидкостная экстракция и хроматография в колонке с сорбентом

«Силасорб С-18» 30(1

хроматографии позволяют определять в ткани печени - 79,69-84,45%. в крови - 74,12-81,91%, в моче - 89,81-94,24%, в гнилостно изменённой печени -82,84-84,19%.

Значения полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) при этом составили (без учёта методики, предусматривающей количественное определение методом производной спектрофотометрии) не более 3,60% (исследование ткани печени), 3,47% (исследование крови), 2,71% (исследование мочи), 3,66% (исследование гнилостно изменённой печени). Для методики, предусматривающей количественное определение на основе расчёта производных спектров, эти значения в случае исследования ткани печени, крови и мочи составили соответственно 4,03, 3,64 и 2,65%

Изучена возмохсность изолирования 2-МО-4-АГОБ из биологического материала путём переведения анализируемого вещества в парогазовую фазу и последующего определения хромато-масс-спектрометрическим методом (сочетание газо-жидкостной хроматографии и масс-селективного детектирования).

Установлено, что относительно полное извлечение 2-МО-4-АГОБ из биологического объекта в парогазовую фазу без нарушения структуры вещества может быть достигнуто уже в условиях нагревания образца при 60°С.

Продолжительность нагревания анализируемого образца должна составлять 10 минут.

Показано, что введение в исследуемый биологический материал электролита (хлорида натрия) приводит к повышению степени извлечения 2-МО-4-АГОБ без изменения его структуры. Оптимальной температурой нагревания шприца является температура 60°С.

Анализируемое вещество идентифицировали по сочетанию характерного времени удерживания со специфическим набором сигналов заряженных частиц в масс - спектре, снятом по полному ионному току.

Время удерживания 2-МО-4-АГОБ при данных условиях определения составляло 18,56 минут.

Дополнительно идентификацию осуществляли на основе совпадения времени удерживания анализируемого соединения на хроматограммах парогазовой фазы по отдельным характеристическим заряженным частицам с массовыми числами 103, 131 и 164 со временем удерживания стандарта 2-МО-4-АГОБ на хроматограммах его парогазовой фазы по этим же частицам.

Показано, что в основу идентификации может быть положено совпадение соотношений площадей пиков, соответствующих частицам с массовыми числами 164 и 131, и совпадение соотношений площадей пиков, соответствующих частицам с массовыми числами 164 и 103 на хроматограммах анализируемых проб и стандарта.

Количественное содержание 2-МО-4-АГОБ в искусственных смесях с тканью трупного органа и биожидкостями определяли по площади пика на хроматограмме парогазовой фазы над биологическим объектом, полученной на основе регистрации интенсивности по полному ионному току.

Результаты определения анализируемого вещества в ткани трупного органа, крови и моче после перевода в парогазовую фазу представлены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты определения 2-МО-4-АГОБ в биологических объектах (при содержании 2,0 мг вещества в 100 г биоматериала) после изолирования переводом в парогазовую фазу__

Объекты исследования Найдено, % (п =5; Р=0,95)

X 8 в; ДЗс

Ткань печени 45,69 4,25 1,90 5,28

Кровь 76,47 3,43 1,54 4,72

Моча 93,58 3,46 1,55 4,30

Гнилостно изменённая ткань печени 44,88 4,31 1,93 5,36

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании 2-МО-4-АГОБ в количестве 2 мг в 100 г биоматериала предлагаемые методики позволяют определять в ткани печени 45,69%, в крови - 76,47%, в моче -93,58%, в гнилостно изменённой печени - 44,88% анализируемого соединения.

Методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью. Значения полуширины доверительного интервала (п=5;

Р=0,95) составляют: 5,68% при исследовании ткани печени, 5,13% при исследовании крови, 4,30% при исследовании мочи, 5,73% при исследовании ткани печени, подвергшейся гнилостным изменениям.

Рис. 4. Распределение 2-МО-4-АГОБ в организме теплокровных животных

Изучены особенности распределения 2-МО-4-АГОБ в организме теплокровных животных (крысы). Экспериментальным животным с массой от 100 до 120 г вводили через зонд в желудок двойную LDS0 исследуемого соединения (4000 мг вещества на 1 кг массы животного). После гибели животных, которая наступала в течение 0,5-1,5 часа с момента введения вещества, трупы вскрывали и исследовали различные органы и кровь на наличие в них 2-МО-4-АГОБ.

Результаты изучения распределения представлены на рисунке 4.

Как свидетельствуют полученные данные, 2-МО-4-АГОБ присутствует в неизменном виде как в органах отравленных животных, так и в крови. Наибольшие количества отравляющего вещества обнаруживаются в желудке с содержимым и тонком кишечнике с содержимым. В меньших количествах 2-МО-4-АГОБ представлен в селезенке, сердце, легких, печени, почках и крови.

Исследованы особенности сохранения 2-МО-4-АГОБ в гнилостно разлагающемся трупном материале (искусственных смесях с тканью трупной печени) в четырёх температурных режимах: при 4°С, 10°С, 20°С и 36°С.

Результаты представлены на рисунке 5.

Как свидетельствуют полученные данные, при сохранении модельных смесей в выбранных температурных режимах, рассматриваемое вещество

□ Желудок с содержимым ■ Тонкий кишечник с содержи!

ЕКровь ЕЗ Сердце @ Печень El Почки □ Легкие

11 Селезенка

может быть определенно в трупном материале по крайней мере в течение 9 месяцев с момента начала эксперимента.

I, сутки

Рис. 5. Степень извлечения 2-МО-4-АГОБ из гнилостно разлагающегося трупного материала в зависимости от продолжительности и температурного режима сохранения: 1 - 4°С ; 2-10 °С ; 3 - 20 °С ; 4 - 36 "С

По результатам проведенных исследований предложено 3 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении рассматриваемым веществом, два из которых основаны на изолировании путём настаивания с этилацетатом, третий - на переводе анализируемого вещества в парогазовую фазу.

Предлагаемые схемы позволяют изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемое токсичное соединение с достаточно высокими селективностью, чувствительностью и воспроизводимостью.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучены особенности поглощения УФ- излучения 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом в различных растворяющих средах. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Для повышения селективности определения рассматриваемого соединения методом электронной спектрофотометрии по поглощению в

среде 95% этанола и 0,1 н. раствора гидроксида натрия применён расчёт производных первого и второго порядка.

Показана возможность идентификации 2-метокси-4-

аллилгидроксибензола в субстанции и некоторых эфирных маслах, содержащих не менее 60% этого вещества, по особенностям светопоглощения в области кварцевого ультрафиолета, а также на основе расчёта первых и вторых производных электронных спектров.

Установлена целесообразность использования для идентификации рассматриваемого соединения метода колебательной спектрофотометрии в диапазоне частот 4000-400 см"1.

На основе особенностей поглощения 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом УФ-излучения в среде этанола предложены методики его количественного спектрофотометрического и хроматоспектрофотометрического определения в субстанции. Относительная ошибка среднего результата при определении данными методиками (п = 6; Р = 0,95) не превышает соответственно 0,85% и 1,23%.

Используя принцип расчёта второй производной электронного спектра в этаноле разработаны методики количественного определения рассматриваемого вещества в субстанции и эфирных маслах гвоздики и базилика. Относительная ошибка среднего результата (п = 6; Р = 0,95) составляет при этом соответственно 2,09%, 2,59% и 3,78%.

2. Проведено изучение особенностей определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом газо-жидкостной капиллярной хроматографии в сочетании с масс-селективным детектированием

Показана возможность применения хромато-масс-спектрометрии для идентификации рассматриваемого соединения в субстанции и сложных смесях органических веществ - компонентов гвоздичного и базиликового эфирных масел.

3. Исследовано хроматографическое поведение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в присутствии ряда близких по структуре и свойствам веществ в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой поверхностями с применением элюентов различной полярности. Рассчитаны отдельные параметры, характеризующие особенности хроматографирования анализируемых соединений.

Установлено, что оптимальными для определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в тонких слоях широкопористого силикагеля (пластины «Силуфол» ЦУ-254) являются подвижные фазы малой и средней полярности гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (20:5:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) и гексан-хлороформ-пропанол-2 (20:5:1), а для определения в тонких слоях обращённофазового сорбента (модель привитой фазы С]4 - С15) - сильнополярные элюенты этанол-буферный раствор с рН 9,9 (5:5) и ацетон-буферный раствор с рН 3,29 (5:5).

Показано, что универсальными подвижными фазами для определения рассматриваемого соединения методами ТСХ и ВЭЖХ с использованием гидроксилированных сорбентов являются системы растворителей гексан-

диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1). При определении 2-метокси-4-аллилгидронсибензола методом ВЭЖХ в колонке с привитой неподвижной фазой («Nova Pack С-18») целесообразно использование в качестве элюентов систем растворителей ацетонитрил-буферньгй раствор с рН 2,5 (6:4) и ацетонитрил-буферный раствор с рН 2,5 (6:4).Разработаны методики количественного определения рассматриваемого вещества методами нормальнофазовой и обращённофазовой ВЭЖХ.

Относительная ошибка среднего результата при определении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в субстанции не превышает 1,6%, при определении в гвоздичном и базиликовом эфирных маслах (обращённофазовый вариант хроматографирования) не превышает 2,2 % .

4. Для идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола предложен ряд хромогенных реакций окисления и электрофильного замещения.

Открываемый минимум данных реакций составляет 0,05- 2,5 мкг/мл.

На основе реакции азосочетания с диазотированным 2-(4-аминобензолсульфамидо)тиазолом разработана методика количественного определения исследуемого соединения с относительной ошибкой среднего результата 0,89 % (п=6; Р=0,95).

5. Изучена экстракция 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из водных растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от рН водного слоя, природы органического экстрагента, насыщения органической фазы водой, а водной фазы электролитами, природы электролита.

Установлено, что наибольшие количества исследуемого вещества (99,5-99,9% при однократной экстракции и г = 1) удаётся извлечь диэтиловым эфиром из водных растворов с рН 1-10 в условиях насыщения водной фазы сульфатом натрия.

Исследованы особенности прапаративного хроматографирования рассматриваемого соединения в макроколонках различного диаметра, заполненных силикагелем L 40/100 ц или сорбентом «Силасорб С-18».

Определён уровень потерь анализируемого вещества при хроматографировании в тонких слоях и колонках различных сорбентов.

Показана достаточная эффективность разработанных способов очистки 2-метокси-4-аллилгидроксибензола от соэкстрактивных веществ методами хроматографии и сочетанием хроматографии с жидкость-жидкостной экстракцией.

6. Проведено сравнительное изолирование 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала 12 изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания.

Установлено, что извлечение рассматриваемого вещества из биологического материала наиболее целесообразно проводить этилацетатом, обеспечивающим наибольшую степень извлечения анализируемого соединения.Оптимальные условия изолирования этилацетатом можно достичь уже при . двукратном настаивании в случае, если масса изолирующего агента как минимум в два раза превышает массу

биоматериала, а продолжительность отдельного настаивания составляет не менее 30 минут.

7. При внесении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в количестве 100 мг в 100 г биоматериала методики, основанные на изолировании этилацетатом, позволяют определять в ткани печени 79,69-88,51%, в крови -74,12-85,64%, в моче - 89,81-97,24%, в гнилостно изменённой печени - 82,8488,30% анализируемого соединения.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при использовании предлагаемых методик составляет 0,08-0,20 мг в 100 г трупного органа, 0,06-0,14 мг в 100 мл крови, 0,015-0,025 мг в 100 мл мочи, 0,1-0,25 мг в ткани органа, подвергшегося гнилостным изменениям.

При внесении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологический материал в составе эфирных масел (30 мг гвоздичного или 40 мг базиликового масла на 100 г биологического объекта) удавалось определить в ткани печени соответственно 64,88-64,96% и 48,21-48,29%, в крови - 62,9663,20% и 46,79-46,83%, в моче - 72,72-72,81% и 53,95-54,04% анализируемого соединения по отношению к внесённой навеске.

8. Изучены особенности изолирования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала путём перевода анализируемого вещества в паро-газовую фазу.

На основе данного принципа изолирования разработаны методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупных органов и биожидкостях человека с применением сочетания газо-жидкостной хроматографии и масс-селективного детектирования.

При содержании 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в количестве 2,0 мг в 100 г биоматериала разработанные методики позволяют определить в ткани печени 45,69%, в крови - 76,47%, в моче - 93,58%, в гнилостно изменённой печени - 44,88% анализируемого соединения с достаточными воспроизводимостью и правильностью.

Значения полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) не превышают соответственно 5,68% (исследование ткани печени), 5,13% (исследование крови), 4,30% (исследование мочи), 5,73% (исследование ткани печени, подвергшейся гнилостным изменениям).

9. Изучен характер распределения рассматриваемого соединения в органах и биожидкостях теплокровных организмов (на примере крыс) при летальных отравлениях после внутрижелудочного введения отравляющего вещества.

Установлено, что 2-метокси-4-аллилгидроксибензол в наибольших количествах присутствует в желудке, тонком кишечнике, селезенке и сердечной мышце крыс, погибших от отравления.

10. В модельных опытах с тканью трупной печени человека изучена устойчивость рассматриваемого соединения в гнилостно разлагающемся биологическом материале в зависимости от продолжительности и температурного режима сохранения.

Выявлено, что в условиях сохранении модельных смесей в четырёх температурных режимах (0°С, 8-10°С, 20°С, 36°С) 2-метокси-4-аллилгидроксибензол определяется в биологических объектах в течение 9 месяцев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение особенностей распределения 2-метокси-4-аллилгидрокси-бензола в организме теплокровных животных при летальных отравлениях / Е.А.Сухомлинова, В.К.Шорманов, Л.Л.Квачахия, М.К.Елизарова // Суд.-мед. экспертиза. - 2009. - Т. 52, № 2. - С. 35-38.

2. Сухомлинова, Е.А. Количественное определение 2-метокси-4-аллил-гидроксибензола спектрофотометрическим методом / Е.А.Сухомлинова // Молодёжная наука и современность: 72-я итог, межвуз. конф. студентов и молодых учёных. - Курск, 2007. - Ч. 2. - С. 155.

3. Сухомлинова, Е.А. Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом УФ-спектрофотометрии / Е.А.Сухомлинова // Молодёжная наука и современность: 72-я итог, межвуз. конф. студентов и молодых учёных. -Курск, 2007. - Ч. 2.-С. 156.

4. Сухомлинова, ЕА. Определение эвгенола в биологических жидкостях / Е.А.Сухомлинова, В.К.Шорманов // Фармация. - 2008. - Т. 57, № 1. -С. 7-9.

5. Сухомлинова, Е.А. Определение эвгенола в эфирных маслах и биологическом материале с применением метода производной спектрофотометр™ / Е.А.Сухомлинова, В.К.Шорманов, А.И. Колесникова // II Между -нар. Форум «Аналитика и аналитики». - Воронеж, 2008. - Т. 2. - С. 718.

6. Сухомлинова, Е.А. Фотометрическое определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в извлечениях из биожидкостей / Е.А.Сухомлинова, В.К.Шорманов, М.К.Елизарова // Биомедицинская инженерия и биотехнология: сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 10-летию биотех. Фак. Курского гос. мед. ун-та. - Курск, 2008. - С. 200-202.

7. Сухомлинова, Е.А. Фотометрическое определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола на основе реакции образования диазопроизводного / Е.А.Сухомлинова, А.И.Колесникова, В.К.Шорманов // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центр-Чернозём, науч. центра РАМН. - Курск, 2008. - Т. 3. - С. 125-126.

8. Шорманов, В.К. Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом нормальнофазовой ТСХ / В.К.Шорманов, Е.А.Сухомлинова // Материалы регион, науч.-практ. конф. (с междунар. участием), посвящ. 40-летию фармац. фак. КГМУ «Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики». - Курск, 2006. - С. 254-256.

9. Шорманов, В.К.Особенности определения эвгенола в биологическом материале / В.К.Шорманов, Е.А.Сухомлинова И Суд.-мед. экспертиза. - 2008. -Т.51,№3.-С. 17-21.

Сдано в набор 10.07.2009 г. Подписано в печать 10.07.2009 г. Формат 60x84 '/¡б. Бумага «Снегурочка». Гарнитура Times New Roman Cyr. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 770.

Отпечатано: ПБОЮЛ Киселева О.В. ОГРН 304463202600213

Актуальность темы. 2-метокси-4-аллилгидроксибензол (синонимы: эвгенол, З-этокси-4-оксиаллилбензол) - биологически активное вещество, входящее в состав гвоздичного, базиликового и ряда других эфирных масел и обладающее антисептическими свойствами. 2-метокси-4-аллилгидроксибензол применяется в стоматологии, парфюмерной и табачной промышленности, является полупродуктом синтеза изоэвгенола.

Данное соединение обладает значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. LD50 2-метокси-4-аллилгидроксибензола для крыс при внутрижелудочном введении составляет 1930 мг/кг, при интраперитонеальном — 800 мг/кг, при интратрахеальном - 11 мг/кг. Для мышей LD50 при интраперитонеальном введении составляет 500 мг/кг.

Описаны случаи отравления данным веществом, в том числе с летальным исходом.

Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе его производства, хранения и применения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.

Широкое применение 2-метокси-4-аллигидроксибензола, его токсические свойства, наличие случаев летального отравления обусловливают необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования 2-метокси-4-аллигидроксибензола из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического исследования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: изучить особенности поглощения 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом электромагнитного излучения в УФ- и ИК-областях спектра; определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз; исследовать хроматографическое поведение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола и компонентов ряда содержащих его природных смесей веществ в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектированием;

- изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях 2-метокси-4-аллилгидроксибензола с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала;

- исследовать особенности изолирования объекта исследования из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы, разработать схему очистки извлечений;

- исследовать особенности изолирования из биологического материала и очистки объекта исследования путём переведения его в парогазовую фазу;

- изучить распределение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в органах и биожидкостях теплокровных животных;

- определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Исследованы закономерности хроматографической активности 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в условиях применения различных элюентов; определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемого вещества методами ТСХ и колоночной хроматографии низкого давления.

На основе предварительных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методами ТСХ и ВЭЖХ.

Изучены особенности поглощения 2-метокси-4аллилгидроксибензолом электромагнитного излучения в УФ- и ИК-областях спектра. Для повышения селективности определения рассматриваемого вещества методом электронной спектрофотометрии рассчитан ряд основных характеристик и производные спектров. Для идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола предложены хромогенные реакции с окислителями (бихроматом калия, нитритом натрия, 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом, концентрированной серной кислотой), а также реакции электрофильного замещения (с 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте и с бромной водой).

Изучены особенности масс-спектра 2-метокси-4аллилгидроксибензола, получаемого методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения рассматриваемого соединения по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.

Впервые для изолирования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен этилацетат. На основе использования этилацетата как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого вещества в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.

Показана возможность и определены оптимальные условия идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом хромато-масс-спектрометрии в объектах биологического происхождения после предварительного переведения анализируемого вещества в парогазовую фазу.

В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в организме теплокровных.

Изучена сохраняемость рассматриваемого отравляющего вещества в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения в гнилостно-разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований предложено 3 варианта общей схемы исследования биоматериала при отравлении 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом.

Внедрение результатов работы: методика количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 1 июня 2006 года, на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 20 сентября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 10 октября 2006 года;

- методика идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в моче (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета со 2 июня 2006 года, на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 3 октября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 12 сентября 2006 года; методика количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани трупного органа (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 1 июня 2006 года, на кафедре фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 3 октября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 12 сентября 2006 года;

- методика определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола и близких по структуре гидроксиаренов методом ТСХ (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре биоороганической химии Курского государственного медицинского университета с 25 октября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 24 октября 2006 года; методика фотометрического определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в извлечениях из биологических объектов на основе реакции азосочетания (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 10 октября 2006 года;

- методика идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в эфирном масле гвоздики (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 16 ноября 2006 года и на кафедре фармацевтической химии Воронежской государственной медицинской академии с 21 ноября 2006 года; методика спектрофотометрического определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу на кафедре биороганической химии Курского государственного медицинского университета с 25 октября 2006 года;

- методика определения гидроксибензола и его монометильных производных при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в ГУЗ Курское областное бюро суд.-мед. экспертизы, акт апробации от 4 декабря 2007 года и в экспертнокриминалистическом центре УВД по Курской области, акт апробации от 25 декабря 2007 года).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографического поведения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;

- особенности поглощения анализируемым веществом электромагнитного излучения в УФ- и ИК- областях спектра;

- методики идентификации и количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;

- условия взаимодействия анализируемого соединения с рядом цветореагентов; результаты исследования особенностей очистки 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;

- методика изолирования объекта исследования на основе настаивания с этилацетатом и очистки от соэкстрактивных веществ;

- методика изолирования рассматриваемого соединения из биологического материала путем переведения его в парогазовую фазу; особенности распределения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в организме теплокровных животных;

- сохраняемость 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на 72-ой итоговой межвузовской научной конференции «Молодежная наука и современность» (Курск, 2007 г), на региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40-летию фармацевтического факультета

Курского государственного медицинского университета «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики» (Курск, 2006 г), на 73-ей научной конференции КГМУ и сессии Центально-Чернозёмного научного центра РАМН (Курск, 2008 г),, на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 10-летию биотехнологического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 2008 г), на II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.00610402.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 9 публикациях, 3 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования материалов диссертационных исследований.

Объём и структура диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, пять глав, содержащих результаты эксперементальных исследований, общие выводы, общую схему исследования, список цитируемых литературных источников. Работа изложена на 249 страницах, иллюстрирована 19 рисунками, содержит 46 таблиц. Список литературы составляют 241 источник, 103 из которых на русском и 138 - на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучены особенности поглощения УФ- излучения 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом в различных растворяющих средах. Рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Для повышения селективности определения рассматриваемого соединения методом электронной спектрофотометрии по поглощению в среде 95 % этанола и 0,1 н. раствора гидроксида натрия применён расчёт производных первого и второго порядка.

Показана возможность идентификации- 2-метокси-4аллилгидроксибензола в субстанции и некоторых эфирных маслах, содержащих не менее 60% этого вещества, по особенностям светопоглощения в области кварцевого ультрафиолета, а также на основе расчёта первых и вторых производных электронных спектров.

Установлена целесообразность использования для идентификации рассматриваемого соединения метода колебательной спектрофотометрии в диапазоне частот 4000-400 см"1 .

На основе особенностей поглощения 2-метокси-4-аллилгидроксибензолом УФ-излучения в среде этанола предложены методики его количественного спектрофотометрического и хроматоспектрофотометрического определения в субстанции. Относительная ошибка среднего результата при определении данными методиками (п = 6; Р = 0,95) не превышает соответственно 0,85 % и 1,23 %.

Используя принцип расчёта второй производной электронного спектра в этаноле разработаны методики количественного определения рассматриваемого вещества в субстанции и эфирных маслах гвоздики и базилика. Относительная ошибка среднего результата (п = 6; Р = 0,95) составляет при этом соответственно 2,09 %, 2,59 % и 3,78 %.

2. Проведено изучение особенностей определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом газо-жидкостной капиллярной хроматографии в сочетании с масс-селективным детектированием

Показана возможность применения хромато-масс-спектрометрии для идентификации рассматриваемого соединения в субстанции и сложных смесях органических веществ - компонентов гвоздичного и базиликового эфирных масел.

3. Исследовано хроматографическое поведение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в присутствии ряда близких по структуре и свойствам веществ в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой поверхностями с применением элюентов различной полярности. Рассчитаны отдельные параметры, характеризующие особенности хроматографирования анализируемых соединений.

Установлено, что оптимальными для определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в тонких слоях широкопористого силикагеля (пластины «Силуфол» UV-254) являются подвижные фазы малой и средней полярности гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (20:5:1), гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) и гексан-хлороформ-пропанол-2 (20:5:1), а для определения в тонких слоях обращённофазового сорбента (модель привитой фазы Си - С15) — сильнополярные элюенты этанол-буферный раствор с рН 9,9 (5:5) и ацетон-буферный раствор с рН 3,29 (5:5).

Показано, что универсальными подвижными фазами для определения рассматриваемого соединения методами ТСХ и ВЭЖХ с использованием гидроксилированных сорбентов являются системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) и гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1). При определении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола методом ВЭЖХ в колонке с привитой неподвижной фазой («Nova Pack С-18») целесообразно использование в качестве элюентов систем растворителей ацетонитрил-буферный раствор с рН 2,5 (6:4) и ацетонитрил-буферный раствор с рН 2,5 (6:4).Разработаны методики количественного определения рассматриваемого вещества^ методами нормальнофазовой и обращённофазовой ВЭЖХ.

Относительная ошибка среднего результата при определении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в субстанции не превышает 1,6 %, при определении в гвоздичном и базиликовом эфирных маслах (обращённофазовый вариант хроматографирования) не превышает 2,2 % .

4. Для идентификации 2-метокси-4-аллилгидроксибензола предложен ряд хромогенных реакций окисления и электрофильного замещения.

Открываемый минимум данных реакций составляет 0,05- 2,5 мкг/мл.

На основе реакции азосочетания с диазотированным 2-(4-аминобензолсульфамидо)тиазолом разработана методика количественного определения исследуемого соединения с относительной ошибкой среднего результата 0,89 % (п=6; Р=0,95).

5. Изучена экстракция 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из водных растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от рН водного слоя, природы органического экстрагента, насыщения органической фазы водой, а водной фазы электролитами, природы электролита.

Установлено, что наибольшие количества исследуемого вещества (99,5-99,9 % при однократной экстракции и г = 1) удаётся извлечь диэтиловым эфиром из водных растворов с рН 1-10 в условиях насыщения - водной фазы сульфатом натрия.

Исследованы особенности прапаративного хроматографирования рассматриваемого соединения в макроколонках различного диаметра, заполненных силикагелем L 40/100 и или сорбентом «Силасорб С-18».

Определён уровень потерь анализируемого вещества при хроматографировании в тонких слоях и колонках различных сорбентов.

Показана достаточная эффективность разработанных способов очистки 2-метокси-4-аллилгидроксибензола от соэкстрактивных веществ методами хроматографии и сочетанием хроматографии с жидкость-жидкостной экстракцией.

6. Проведено сравнительное изолирование 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала 12 изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания.

Установлено, что извлечение рассматриваемого вещества из биологического материала наиболее целесообразно проводить этилацетатом, обеспечивающим наибольшую степень извлечения анализируемого соединения.Оптимальные условия изолирования этилацетатом можно достичь уже при двукратном настаивании в случае, если масса изолирующего агента как минимум в два раза превышает массу биоматериала, а продолжительность отдельного настаивания составляет не менее 30 минут.

7. При внесении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в количестве 100 мг в 100 г биоматериала методики, основанные на изолировании этилацетатом, позволяют определять в ткани печени 79,69-88,51 %, в крови -74,12-85,64 %, в моче - 89,81-97,24 %, в гнилостно изменённой печени - 82,84-88,30 % анализируемого соединения.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при использовании предлагаемых методик составляет 0,08-0,20 мг в 100 г трупного органа, 0,06-0,14 мг в 100 мл крови, 0,015-0,025 мг в 100 мл мочи, 0,1-0,25 мг в ткани органа, подвергшегося гнилостным изменениям.

При внесении 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологический материал в составе эфирных масел (30 мг гвоздичного или 40 мг базиликового масла на 100 г биологического объекта) удавалось определить в ткани печени соответственно 64,88-64,96 % и 48,21-48,29 %, в крови -62,96-63,20 % и 46,79-46,83 %, в моче -72,72-72,81% и 53,9554,04 % анализируемого соединения по отношению к внесённой навеске.

8. Изучены особенности изолирования 2-метокси-4-аллилгидроксибензола из биологического материала путём перевода анализируемого вещества в паро-газовую фазу.

На основе данного принципа изолирования разработаны методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупных органов и биожидкостях человека с применением сочетания газо-жидкостной хроматографии и масс-селективного детектирования.

При содержании 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в количестве 2,0 мг в 100 г биоматериала разработанные методики позволяют определить в ткани печени 45,69 %, в крови -76,47 %, в моче - 93,58 %, в гнилостно изменённой печени — 44, 88% анализируемого соединения с достаточными воспроизводимостью и правильностью.

Значения полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) не превышают соответственно 5,68 % (исследование ткани печени), 5,13 % (исследование крови), 4,30 % (исследование мочи), 5,73 % (исследование ткани печени, подвергшейся гнилостным изменениям).

9. Изучен характер распределения рассматриваемого соединения в органах и биожидкостях теплокровных организмов (на примере крыс) при летальных отравлениях после внутрижелудочного введения отравляющего вещества.

Установлено, что 2-метокси-4-аллилгидроксибензол в наибольших количествах присутствует в желудке, тонком кишечнике, селезенке и сердечной мышце крыс, погибших от отравления.

10. В модельных опытах с тканью трупной печени человека изучена устойчивость рассматриваемого соединения в гнилостно разлагающемся биологическом материале в зависимости от продолжительности и температурного режима сохранения.

Выявлено, что в условиях сохранении модельных смесей в четырёх температурных режимах (0°С, 8-10°С, 20°С, 36°С) 2-метокси-4-аллилгидроксибензол определяется в биологических объектах в течение 9 месяцев.