Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование 2,6'-БИС-[БИС-(β-оксиэтил)-амино]-4,8-ДИ-N-пиперидино-пиримидо (5,4-D) пиримидина (дипиридамола)

КВАЧАХИЯ ЛЕКСО ЛОРИКОВИЧ

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 2,6'-БИС-[БИС-(/?-ОКСИЭТИЛ)-АМИНО]-4,8-ДИ-1Ч-ПИПЕРИДИНО-ПИРИМИДО (5,4-Й) ПИРИМИДИНА (ДИПИРИДАМОЛА)

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

003454

Курск-2008

003454148

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители: доктор фармацевтических наук,

профессор Шорманов Владимир Камбулатович доктор биологических наук, профессор Сипливая Любовь Евгеньевна Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук

Саломатин Евгений Михайлович доктор фармацевтических наук Яцюк Валентина Яковлевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Зашита состоится « ^Г&^&^/РЯ 2008 г. в if 0О

часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

Автореферат разослан « // »г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуально сть темы. 2,6'-бис-[бис-(/?-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-N-пиперидино-пиримидо (5,4-d) пиримидин - лекарственное средство, широко применяющееся в медицинской практике в виде субстанции и таблеток под названием «Дипиридамол» (Верофарм, Россия), а также таблеток «Курантил» (Berlinchemie, Германия) и <(Персантин» (Испания). Данное вещество расширяет коронарные сосуды, увеличивает объёмную скорость коронарного кровотока, улучшает снабжение миокарда кислородом. Дипиридамол повышает толерантность миокарда к гипоксии. При нарушении кровообращения в основных коронарных сосудах он способствует улучшению кровообращения в коллатеральной сосудистой сети. Под его влиянием уменьшается также общее периферическое сопротивление, несколько понижается системное АД, улучшается мозговое кровообращение. Как производное пиримидина, дипиридамол является индуктором интерферона и оказывает модулирующее действие на функциональную активность системы интерферона, повышает сниженную продукцию интерферона альфа и гамма лейкоцитами крови in vitro.

Дипиридамол обладает определёнными токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам. Описана его способность к кумуляции в организме человека. Поэтому в случае длительного применения данного лекарственного средства его концентрация в организме может приближаться к токсической. Создание высоких концентраций дипиридамола в органах и тканях человека также может быть следствием ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта и мочевыделительной системы, приводящих к нарушениям процессов выведения экзогенных веществ.

LDso дипиридамола для крыс при внутривенном введении составляет 195 мг/кг, при внутрибрюшинном - 1260 мг/кг, при подкожном - 1650 мг/кг, при введении через рот - 8400 мг/кг.

В Российской Федерации за последние 10 лет отмечены случаи отравления людей дипиридамолом различной степени тяжести при ошибочном завышении доз, а также при суицидальных попытках, в том числе 6 случаев отравления с летальным исходом.

Широкое применение дипиридамола, его токсичность, наличие случаев легального отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в судебно-химическом отношении.

До настоящего времени в Российской Федерации отсутствует официальная методика химико-токсикологического исследования дипиридамола. Остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования дипиридамола из объектов биологического происхождения, его очистки, обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют систематические данные по распределению и сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики химико-токсикологического исследования дипиридамола является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического исследования дшшридамола.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности электронных и колебательных спектров дипиридамола.

2. Определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.

3. Изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях дипиридамола с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала.

4. Изучить особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

5. Исследовать распределение дипиридамола в органах и биологических жидкостях теплокровных животных.

6. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна исследований. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения дипиридамола в сорбентах с гидроксилированной и привитой поверхностями при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения дипиридамола методами ТСХ и хроматоспектрофотометрии.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения дипиридамола.

Показана возможность образования окрашенных продуктов при взаимодействии дипиридамола с 10 % нитратом калия в концентрированной серной кислоте. На основе предложенной хромогенной реакций разработана методика идентификации исследуемого вещества.

Впервые для изолирования из биологического материала дипиридамола обосновано использование в качестве изолирующего агента ацетона. На основе применения в качестве изолирующего агента ацетона и очистки в тонких слоях или колонках обращённофазовых сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (крысы) исследованы особенности распределения дипиридамола в организме теплокровных.

Определены сроки сохранения рассматриваемого отравляющего вещества в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения дипиридамола. Методика судебно-химического исследования представлена в виде проекта информационного письма, принятого к рассмотрению на предмет утверждения и опубликован™ Российским центром судебно-медицинской экспертизы Минздрава РФ.

Внедрение результатов работы:

— методика определения дипиридамола в крови (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 05.12.2005, кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.12.2006, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко с 22.02.2006, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 04.05.2006, кафедры фармацевтической химии СевероОсетинского государственного университета им. K.JI. Хетагурова с 19.04.2006);

— методика определения дипиридамола в моче (внедрена в учебный и научный процесс кафедры органической химии Курского государственного медицинского университета с 12.12.2005, кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко с 25.01.2006, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 22.03.2006, кафедры фармацевтической химии Северо-Осетинского государственного университета им. К.Л. Хетагурова с 19.04.2006);

— методика фотометрического определения дипиридамола в ткани печени (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 05.12.2005, кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.11.2006, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко с 08.02.2006, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 12.04.2006, кафедры фармацевтической химии Северо-Осетинского государственного университета им. K.JI. Хетагурова с 19.04.2006);

- методика определения дипиридамола в трупном материале (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 05.12.2005, кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.10.2006, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Воронежской государственной медицинской академии имени Н.Н.Бурденко с 25.01.2006, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 22.03.2006, кафедры фармацевтической химии Северо-Осетинского государственного университета им. K.JI. Хетагурова с 19.04.2006);

- методика определения дипиридамола методом обращеннофазовой ТСХ в биологических жидкостях (внедрена в учебный и научный процесс кафедры органической химии Курского государственного медицинского университета с 12.12.2005, кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.11.2006, кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Воронежской государственной медицинской академии имени H.H. Бурденко с 22.02.2006, кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного университета с 12.03.2006, кафедры фармацевтической химии Северо-Осетинского государственного университета им. К JI. Хетагурова с 19.04.2006);

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.006 10418.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографической активности дипиридамола в тонких слоях и колонках сорбентов;

- особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемого вещества в УФ- и ИК- областях спектра;

- условия взаимодействия дипиридамола с рядом цветореагентов;

- особенности идентификации и количественного определения объекта исследования методами хроматографии, хромато-масс-спектрометрии и фотометрии;

- результаты исследования экстракции анализируемого вещества из водных растворов;

- методика изолирования объекта исследования из биологического материала и очистки от соэкстрактивных веществ;

- особенности распределения дипиридамола в организме теплокровных животных;

- сохраняемость дипиридамола в трупном материале и в биологических жидкостях.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы медико-криминалистичских, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 31 октября - 1 ноября 2007 года), на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007 г.), 71 итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Чернозёмного научного центра РАМН (Курск, 2006 год), на 71 итоговой межвузовской научной конференции «Молодёжная наука и современность» (Курск, 18-19 апреля 2006 года), на Региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики» (Курск, 15 декабря 2006 года).

П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 169 страницах машинописного текста, содержат 8 рисунков, 22 таблицы. Список цитируемой литературы включает 189 источников, из которых 50 - на иностранных языках.

Первая глава (обзор литературы) включает в себя известные данные о дипиридамоле (как объекте химико-токсикологического исследования.

Вторая глава посвящена вопросам идентификации объекта исследования хроматографическими и спектральными методами.

В третьей главе приводятся экспериментальные данные по вопросам количественного определения анализируемого вещества.

Четвёртая глава включает в себя результаты изучения особенностей выделения и очистки объекта исследования хроматографическими методами.

В пятой главе рассмотрены вопросы определения дипиридамола после его изолирования из биологического материала оптимальным изолирующим агентом.

В шестой главе приведены данные, полученные в результате изучения особенностей распределения дипиридамола в организме теплокровных и сохраняемости в трупном материале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе был использован 2,6'-бис-[бис-(/?-оксиэтил)-амино]-4,8-ди-Ы-пиперидино-пиримидо (5,4-d) пиримидин - соответствующий НД 42-12061-01. Дипиридамол (субстанция) производства фирмы «Верофарм».

Применены методы хроматографии в тонких слоях сорбентов, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК- спектрофотометрии, хромато-масс-спектрометрии.

Методики количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследована хроматографическая подвижность дипиридамола в тонких слоях и колонках нсрмальнофазовых и обращёпнофазовых сорбентов. Дш1 характеристики подвижности анализируемого соединения в тонких слоях сорбентов рассчитывались значения коэффициента хроматографической активности и условного удерживания в тонком слое сорбента В.

Как свидетельствуют данные таблицы 1, наиболее оптимальные условия хроматографирования дипиридамола в тонких слоях сорбентов с гидроксилированной поверхностью достигаются при введении в среднеполярные и полярные элюенты ряда компонентов основного характера (концентрированный раствор аммиака, метиламин, диметиламин). Присутствие веществ основного характера позволяет повысит эффективность хроматографирования, а для привитой фазы оптимальные условия хроматографирования достигаются при использовании в качестве подвижных фаз систем растворителей, включающих в себя сильно-кислотный водный раствор с добавкой до 80 % гидрофильного органического растворителя (ацетонитрил, диоксан).

Таблица 1

Оптимальные подвижные фазы для хроматографирования анализируемого вещества в тонких слоях сорбентов

Подвижные фазы Ш" В

Номальнофазовый сорбент (широкопористый сшшкагель)

Этилацетат-метанол-25% раствор аммиака(8,5:1,0:0,5) Этилацетат-этанол-25% раствор аммиака (8,5:1:0,5) 0,53 0,66 1,89 1,52

Обращённофазовый сорбент (широкопористый сшшкагель, обработшшый вазелиновым маслом)

Ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2) Ацетопитрил- буферный раствор с рН 1,68 (2:8) Этанол- буферный раствор с рН 1,68 (5:5) 0,46 0,61 0,46 2,17 1,65 2,17

Для варианта нормапьнофазовой ТСХ такими подвижными фазами явились этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (8,5:1,0:0,5) и система растворителей этилацетат-этанол-25% раствор аммиака (8,5:1:0,5), для варианта обращённофазовой ТСХ - системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (8:2), ацетонитрил-буферный раствор с рН 1,68 (2:8) и этанол-буферный раствор с рН 1,68 (5:5).

Наиболее универсальной подвижной фазой для определения исследуемого вещества методом ТСХ (пластины «Силуфол» \TV-254, обработанные вазелиновым маслом) и методом колоночной хроматографии (колонки с сорбентом «Силасорб С-18»), обеспечивающей оптимальные

результаты хроматографирования, является система растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (8:2). Данная система растворителей позволяет идентифицировать 2,6'-Бис-[бис-( р -оксиэтил)-амино]-4,8-ди-К-пиперидино-пиримидо (5,4-<1) пиримидин в присутствии веществ нейтрального характера, а также многих соединений кислотной и основной природы.

Результаты изучения хроматографических свойств рассматриваемого соединения указывают на возможность его идентификации методами ТСХ и колоночной жидкостной хроматографии.

Открываемый минимум при идентификации дипиридамола методами ТСХ и колоночной хроматографии составляет 0,1-0,2 мкг.

Рассмотрена возможность идентификации дипиридамола хромато-масс-спектрометрическим методом с использованием капиллярной колонки и масс-селективного детектора, работающего в режиме электронного удара (70 эВ). Получаемая газо-жидкостная хроматограмма представлена на рисунке 1.

Как следует из рисунка, на хроматограмме обнаруживается пик вещества с временем удерживания 9,909 мин.

Как свидетельствуют полученные данные, масс-спектр включает сигналы ряда осколков с характерными массами (45, 58, 73, 89,105, 115, 128, 139,152, 165, 182, 227). Основным (с массой, принимаемой за 100%), является осколок с массой 58. Подобное сочетание характерных осколков вещества с временем удерживания пика позволяет с достаточной степенью селективности идентифицировать анализируемое вещество хромато-масс-спектрометрическим методом.

Изучены особенности светопоглощения рассматриваемого вещества в УФ- и видимой областях спектра при использовании в качестве растворяющих сред воды, водных растворов кислот, гидрофильных органических растворителей, а также смесей гидрофильных органических растворителей с водой или водными растворами кислот.

1эоооо) 120000] 1 ЛОООО Л ООООО, 90000' 80000| тоооо еоооо; вооао | 40000> эоооо 2; оооо юооо

Рис. 1. Газо-жидкостная хроматограмма испаряемого вещества

В ИК-спектрах исследуемого вещества (таблица 2) выявлены характеристические полосы поглощения, соответствующие колебаниям различных участков молекулы: валентным СН (в том числе в ядре пиридина), валентным симметричным СН2, валентным колебаниям пиридинового кольца, ножничным СН2 алифатического участка, плоскостным и внеплоскостным деформационным колебаниям СН.

Показана возможность идентификации дипиридамола по его УФ-, видимым и ИК-спектрам.

Таблица 2

Характеристика ИК-спектра дипиридамола

Максимумы характеристических полос, см"1 Отнесение колебаний

3550 Валентные ОН

3386 То же

2921 Асимметричные валентные СН2

2851 Симметричные валентные СН2

1531 Колебания кольца пиримидина

1469 Ножничные СН2 в линейных алифатических цепях

1375 Деформационные ОН

1216 Валентные - С - N7

1050 Валентные - С - ОН?

Изучены особенности взаимодействия анализируемого вещества с 2,4,6-тринитрофенолом и бромтимоловым синим с образованием окрашенных ионных ассоциатов, извлекающихся хлороформом, и с 10 % нитратом калия в концентрированной серной кислоте с образованием цветного продукта окисления.

На основе рассмотренных цветных реакций разработаны методики идентификации анализируемого вещества. Открываемый минимум 0,1-0,5 мкг/мл.

Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения исследуемого вещества на основе его поглощения в 1 н. растворе серной кислоты и в смеси ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (8:2). Предложена методика хроматоспектрофотометрического определения рассматриваемого соединения на основе поглощения в смеси ацетонитрил -1 н. раствор серной кислоты (8:2) после предварительного хроматографирования в тонком слое обращённофазового сорбента.

Установлена возможность количественного определения дипиридамола фотометрическим методом на основе реакции окисления 10% раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте.

Как следует из таблицы 3, относительная ошибка среднего результата во всех случаях не превышает ±1,15 %.

Таблица 3

Результаты количественного определения дипиридамола (п=6; Р=0,95)

X 8 в, Ах е

Спектрофотометрия по поглощению в среде ацетонитрил-1 н

раствор серной кислоты (8:2)

100,06 0,84 0,34 0,87 0,87

Хроматоспектрофотометрия

100,04 1,20 0,49 1,25 1,25

Фотометрия на основе реакции окисления

99,96 0,90 0,37 0,95 0,95

Для очистки исследуемого вещества рассмотрена возможность применения методов экстракции и хроматографии.

В частности, исследованы особенности экстрагирования анализируемого соединения из водных растворов гидрофобньми и гидрофильными органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения экстрагентов водой и электролитами.

Показано, что дипиридамол большинством рассмотренных растворителей наиболее полно извлекается из водных растворов с рН от 5-6 до 12 и из растворов, содержащих 5-10 % гидроксида натрия.

Оптимальные условия извлечения дипиридамола из водных растворов достигаются при использовании в качестве экстрагента этилацетата в условиях насыщения водной фазы хлоридом натрия при рН водного слоя 4-10 или при содержании в водной фазе 5 % гидроксида натрия.

По результатам изучения хроматографической активности дипиридамола предложены способы его очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонках с сорбентом «Силасорб С-18» и на пластинах «Силуфол» 1ГУ-254, предварительно обработанных вазелиновым маслом. Потери анализируемого вещества при хроматографировании не превысили 1 %.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений методами ТСХ и колоночной жидкостной хроматографии низкого давления.

Проведено сравнительное изучение изолирования дипиридамола из биологического материала изолирующими агентами различной химической природы: водой и водными растворами (0,1 н. раствор гидроксида натрия, 0,1 н раствор соляной кислоты, 8 % раствор уксусной кислоты, 8 % раствор хлорной кислоты), карбоновыми кислотами (ледяная уксусная кислота), сложных эфиров карбоновых кислот (уксусный ангидрид), алкилзамещенными амидами кислот (диметилформамид), кетонами (ацетон), спиртами (метанол, этанол, пропанол-2), гетероциклическими кислородсодержащими соединениями

(диоксан), алканами (гексан), галогенапканами (хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтан), аренами (бензол, толуол, о-ксилол), сложными и простыми эфирами (диэтиловый эфир, этилацетат, бутилацетат), нитрилами (ацетонитрил).

Полученные результаты представлены на рисунке 2 и 3.

Рис. 2. Результаты изучения сравнительного изолирования дипиридамола из биологического материала

Рис. 3. Результаты изучения сравнительного изолирования дипиридамола из биологического материала

Как свидетельствуют полученные данные, наиболее высокий процент извлечения анализируемого соединения достигается при изолировании ацетоном.

В дальнейшем в качестве изолирующего агента рассматривалось ацетон.

Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемого вещества ацетоном от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.

Исследования зависимости степени извлечения дипиридамола от объема изолирующего агента и кратности изолирования показали, что для достижения достаточно полного извлечения рассматриваемого соединения из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза.

При изучении зависимости степени извлечения от продолжительности контакта изолирующей жидкости и биоматериала установлено, что максимальные значения степени извлечения дипиридамола из ткани трупной печени достигаются при продолжительности настаивания 30 и более минут.

Установлено, что при увеличении содержания дипиридамола в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (2,5-50,0 мг) при постоянной массе навески ткани трупной печени (25 г) наблюдается лишь незначительное изменение степени извлечения, не превышающее 1,5 %.

На основе предварительных исследований разработаны методики определения рассматриваемого соединения в ткани трупных органов, крови и моче после изолирования ацетоном и очистки извлечённого вещества методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографическими методами.

Количественная оценка результатов определения представлена на рисунке 4.

Свежая печень

Гнилостно-взменеепая печень

Кровь

Моча

Рис. 4. Результаты определения дипиридамола в биологическом материале

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемого соединения в количестве 100 мг в 100 г биоматериала методики, основанные на изолировании ацетоном, позволяют определить методами спектрофотометрии и ВЭЖХ соответственно 93,58 и 95,15 % дипиридамола в ткани свежей трупной печени, 97,50 и 97,70 % в крови, 98,24 и 98,45 % в моче, 94,45 и 94,15 % в ткани трупной печени, подвергшейся гнилостным изменениям. Методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.

Показана возможность применения разработанных методик при исследовании гнилостно изменённого трупного материала.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при использовании предлагаемых методик составляет 0,028-0,030 мг в 100 г трупного органа, 0,032-0,035 в 100 г трупного органа, подвергшегося гнилостным изменениям, 0,02-0,022 мг в 100 г крови, 0,01-0,012 мг в 100 г мочи.

Изучены особенности распределения дипиридамола в организме теплокровных животных (крысы). В процессе исследования крысам, объединенным в 5 групп по 5 особей в каждой, с массой от 320 до 340 г ежедневно в течение 6 дней подряд вводили через зонд в желудок дипиридамол в виде водной суспензии вместе с крахмалом из расчета 8400 мг вещества на 1 кг массы животного. После гибели животных, которая наступала на 6 день со дня начала введения вещества, трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них дипиридамола.

Результаты изучения распределения представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты определения количественного содержания дипиридамола

Исследуемый биологический объект Определено анализируемого вещества

мг в 100 г биологического объекта в%к найденному количеству

Почки х= 15,92; 8 = 0,59; Бх = 0,27; Дх = 0,74 0,81

Печень х= 10,11; Б= 1,59; = 0,71; Дх= 1,97 0,51

Кровь х= 8,56; 8= 0,40; = 0,18; Дх = 0,50 0,43

Сердце х= 10,85; 0,61; Б, = 0,27; Дх = 0,76 0,55

Лёгкие х— 15,92; 8=0,96; 8Х =0,43 ; Дх = 1,19 0,81

Ткань желудка х= 160,27; Б= 3,91; 1,75; Дх = 4,86 8,11

Ткань тонкого кишечника х— 136,08; Б= 14,77; Б, = 6,60; Дх= 18,36 6,88

Селезёнка х= 15,98; 8= 1,49; 8Х= 0,67; Дх = 1,86 0,81

Кал х= 1603,24; 8= 96,60; вх= 43,20; Дх= 120,10 81,10

Как свидетельствуют полученные данные, наибольшие количества дипиридамола обнаруживается в кале. Анализируемое вещество в значительных количествах присутствует в тканях желудка и тонкого кишечника, а также в почках, лёгких, селезёнке и ряде других органов и тканей крыс. В большинстве исследованных органов и тканей отравленных животных дипиридамол распределён достаточно равномерно.

Исследованы особенности сохранения дипиридамола в трупном материале в различных температурных режимах (при 0°С, 8°С, 19-20°С, 36°С). Результаты представлены на рисунке 5.

Рис. 5. Результаты изучения сохраняемости дипиридамола в трупном материале

Как свидетельствуют данные, полученные при изучении сохраняемости рассматриваемого вещества в трупном материале, дипиридамол в предлагаемых условиях сохранения определяется в трупном материале в течение года.

По результатам проведённых исследований предложена общая схема химико-токсикологического анализа рассматриваемого соединения.

Предлагаемая схема позволяет изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемое отравляющее вещество.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследован характер поглощения электромагнитного излучения дипиридамолом в УФ-, видимой и ИК-областях спектра. Установлены специфические отличия в поглощении рассматриваемого соединения.

Показана возможность идентификации исследуемого вещества методами электронной и колебательной спектрофотометрии.

На основе способности к поглощению УФ- и видимого излучения в среде смеси растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2) разработана методика количественного определения рассматриваемого соединения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает ±0,9%.

2. Изучена хроматографическая активность исследуемого соединения в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями с использованием элюентов различной полярности. Рассчитан ряд параметров хроматографирования.

Для хроматографирования в тонких слоях сорбента с гидроксилированной поверхностью (широкопористый силикагель на пластинах «Силуфол» иУ-254) в качестве оптимальных подвижных фаз предложены системы растворителей этанол- буферный раствор с рН 1,68 (5:5), ацетонитрил-буферный раствор с рН 1,68 (2:8).

Установлено, что универсальной подвижной фазой для определения рассматриваемого вещества в тонких слоях и колонках обращённофазных сорбентов (Си- С)8) является система растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2).

Разработана методика количественного определения дипиридамола хроматоспектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает ±1,3 %.

Изучены особенности количественного определения рассматриваемого соединения методом ВЭЖХ с применением обращённофазового сорбента и сильнополярной подвижной фазы ацетонитрил-0,025М раствор дигидрофосфата калия (3:2). Полученные результаты свидетельствуют о возможности определения дипиридамола с достаточной воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (п=6; Р=0,95) составляет не более 1,2 %.

3. Показана возможность селективного качественного определения дипиридамола методом хромато-масс-спектрометрии после предварительного переведения анализируемого соединения в соответствующее ацетильное производное.

4. Изучены особенности определения исследуемого соединения на основе получения окрашенных продуктов в реакциях с 2,4,6-тришпрофенолом, бромтимоловым синим и 10 % раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте.

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации рассматриваемого соединения. Открываемый минимум 0,1-0,5 мкг/мл.

На основе хромогенной реакции с 10 % раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте разработана методика количественного определения дипиридамола, отличающиеся достаточно высокой воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата (п=6 ; Р=0,95) не превышает 1 %.

5. Исследованы особенности экстракции анализируемого соединения из водных растворов гидрофобными и гидрофильными органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения экстрагентов водой и электролитами.

Показано, что дипиридамол большинством рассмотренных растворителей наиболее полно извлекается из водных растворов с рН от 5-6 до 12 и из растворов, содержащих 5-10 % гидроксида натрия.

Оптимальные условия извлечения дипиридамола из водных растворов достигаются при использовании в качестве экстрагента этилацетата в условиях насыщения водной фазы хлоридом натрия при рН водного слоя 4-10 или при содержании в водной фазе 5 % гидроксида натрия.

6. Изучены особенности препаративного хроматографирования объекта исследования на колонке с сорбентом «Силасорб» С-18 (размер частиц 30 ц). Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (8:2). Дана оценка потерь анализируемого соединения в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем экстракционной и хроматографической очистки рассматриваемого вещества от соэкстрактивных веществ биологического материала.

7. Проведено изучение сравнительного изолирования исследуемого вещества из биологического материала различными изолирующими агентами.

Установлено, что наиболее высокую степень извлечения рассматриваемого соединения удается достичь при использовании в качестве изолирующего агента ацетона.

Определены оптимальные условия изолирования рассматриваемого соединения ацетоном.

Разработаны методики определения дипиридамола в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования ацетоном и очистки методом хроматографии или сочетания методов экстракции и хроматографии.

8. При содержании анализируемого соединения в количестве 100 мг в 100 г биоматериала разработанные методики позволяют определить методами спектрофотометрии и ВЭЖХ соответственно 93,58 и 95,15 % дипиридамола в ткани свежей трупной печени, 97,50 и 97,70 % в крови, 98,24 и 98,45 % в моче, 94,45 и 94,15 % в ткани трупной печени, подвергшейся гнилостным изменениям.

Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при использовании предлагаемых методик составляет 0,028-0,030 мг в 100 г трупного органа, 0,032-0,035 в 100 г трупного органа, подвергшегося гнилостным изменениям, 0,02-0,022 мг в 100 г крови, 0,01-0,012 мг в 100 г мочи.

9. Исследованы особенности распределения дипиридамола в организме теплокровных животных при введении яда через желудок.

Наибольшее содержание дипиридамола отмечается в кале, тканях желудка и тонкого кишечника, а также в лёгких, селезёнке и почках отравленных животных.

10. Изучена сохраняемость исследуемого вещества в трупном материале.

Показано, что при температурах от 0 до 36°С дипиридамол сохраняется в

модельных смесях с тканью трупной печени по крайней мере в течение года.

11. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении дипиридамолом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Квачахия, Л Л. определение дипиридамола в биологических объектах методом УФ-спектрофотометрии / Л.Л. Квачахия // Молодежная наука и современность: сб. - Курск, 2006. - С. 77-78.

2. Квачахия, Л.Л. Фотометрическое определение дипиридамола в биологическом материале / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики: сб. -Курск, 2006.-С. 213.

3. Квачахия, Л.Л. Применение метода ТСХ для определения дипиридамола в биологических жидкостях / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // Разработка, исследование новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Вып. 61. - Пятигорск, 2006. - С. 218-219.

4. Квачахия, Л.Л. Определение дипиридамола в крови человека / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // XIV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М., 2007. - С. 113.

5. Квачахия, Л.Л. Изучение сохраняемости дипиридамола в биологическом материале / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // Современные проблемы медико-криминалистичских, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований: сб. - М., 2007. - С. 221224.

6. Квачахия, ЛЛ. Распределение дипиридамола в организме теплокровных животных / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // Судебно-медицинская экспертиза. - 2008. - Т. 51, № 2. - С. 34-37.

7. Квачахия, Л.Л. Применение ИК-спектрофотометрии для идентификации дипиридамола в извлечениях из биологического материала / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сес. Центр,-Чернозём. Науч. центра РАМН. - Т 3 . - Курск, 2008. - С. 84-88.

8. Квачахия, Л.Л. Химико-токсикологическое исследование дипиридамола / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Л.Е. Сипливая // Проблемы судебно-медицинской экспертизы в условиях реформирования вооруженных сил и генеральной прокуратуры РФ: материалы науч.-практ. конф., посвященной 65-летию образования органов судебно-медицинской экспертизы Вооруженных Сил РФ. - М., 2008. - С. 261-264.

9. Пат. 2322674 Российская Федерация, МПК7 С1 в 01 N 33/49; й 01 N 33/48. Способ определения 2,6-бис-[бис-(/?-оксиэтал)-амино] -4,8-ди-Ы-пиперидино-пиримидо (5,4-с1 )-пиримидина в биологическом материале / Шорманов В.К., Квачахия Л.Л., Сипливая Л.Е.; заявители и патентообладатели: В.К. Шорманов, Л.Л. Квачахия, Л.Е. Сипливая. - №2006135873/15; Заяв. 10.10.2006; Опуб. 20.04.2008 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2008. - № 11. -6с.

10. Шорманов, В.К. Особенности изолирования дипиридамола из биологического материала / В.К. Шорманов, Л.Л. Квачахия // Судебно-медицинская экспертиза. - 2007. - Т. 50, № 5. - С. 39-42.

11. Шорманов, В.К. Определение дипиридамола в биологических жидкостях / В.К. Шорманов, Л.Л. Квачахия, Л.Е. Сипливая // Судебно-медицинская экспертиза. - 2007. - Т. 50, № 4. - С. 32-35.

Сдало в шбор 27.10 2008 г Подписано в печать 27 10 2008 г. Формат 60x84 7[й Бумага «Снегурочка» Гарнитура Times New Roman Суг Объем 1,0 уел иеч л Тираж 100 экз Заказ № 625

Издательство МУ «Издательский центр «ЮМЭКС», 305000, г Курск, ул. Володарского, 44а ИД №04804 от 21 05 2001 г

Отпечатано ПБОЮЛ Киселева О В (ОГРИ 304463202600213)