Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование 2,4-динитрофенола

На правах рукописи

Дмитриева Ирина Александровна

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 2,4-ДИНИТРОФЕНОЛА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогонозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

КУРСК-2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Шорманов Владимир Камбулатович,

доктор биологических наук, профессор Сипливая Любовь Евгеньевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Квач Александр Сергеевич

кандидат фармацевтических наук Дурицын Евгений Петрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения РФ»

Защита состоится <( 9 »„^ассгг^^ 2004 г. в /У— часов на заседании диссертационного совета К208.039.01 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет МЗ РФ» по адресу: 305041, г. Курск, ул. К.Маркса. д.З.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет МЗ РФ» (305041, г, Курск, ул. К.Маркса, д. 3.)

Автореферат раз » о/ерпяео^&ве. 4 г.

Ученый секретарь /

диссертационного совета Г/" Н.Н. Пашин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительные успехи органического синтеза в последние два столетия привели к ситуации, когда человек в различных сферах своей деятельности постоянно сталкивается с химическими веществами, не встречающимися в естественных условиях. Многие из этих веществ оказывают неблагоприятные воздействия на процессы функционирования организма, приводя к патологическим изменениям. К таким веществам относятся, например, нитропроизводные фенола, в частности, 2,4-динитрофенол.

2,4-динитрофенол является полупродуктом ряда важнейших органических синтезов, применяется как пестицид и антисептирующее средство в лесной и деревообрабатывающей промышленности. В последнем случае он может использоваться как индивидуально, так и в составе комплексных препаратов вместе с 4-оксидифенилом. Известно применение 2,4-динитрофенола как реактива и боевого отравляющего вещества.

Рассматриваемое соединение обладает высокой токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. При попадании в организм оно может вызывать отравления различной степени тяжести. Описаны многочисленные случаи отравления 2,4-динитрофенолом с летальным исходом при различных путях проникновения отравляющего вещества в организм человека.

Летальная доза 2,4-динитрофенола для человека составляет при однократном приеме около 1 г.

Широкое применение 2,4-динитрофенола, его высокая токсичность, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно изученными вопросы изолирования 2,4-динитрофенола из объектов биологического происхождения, его очистки, идентификации и количественного определения. В доступной литературе практически отсутствуют данные по сохраняемости 2,4-динитрофенола и его основного метаболита (2-амино-4-нитрофенола) в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного, исследования в области химико-токсикологического анализа 2,4-динитрофенола являются актуальными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертации явилась разработка методики химико-токсикологического исследования 2,4-ди-нитрофенола.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- определить особенности светопоглощ|нввобНАкимв1мды1юе^ния в УФ-, видимой и Ж- областях спектра; I БИБЛИОТЕКА ]

! „тя&М

- исследовать особенности хроматографического поведения 2,4-ди-нитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов;

- изучить особенности взаимодействия рассматриваемых соединений с рядом цветореагентов, показать возможность применения хромогенных реакций в условиях анализа биологического материала;

- провести изучение процессов распределения анализируемых веществ в системах из взаимонесмешивающихся жидкостей;

- исследовать особенности изолирования 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений;

- изучить особенности распределения 2,4-динитрофенола в органах и биожидкостях теплокровных животных;

- определить сроки сохраняемости объектов исследования в трупном материале.

Научная новизна. Изучены отдельные закономерности хромато-графического поведения 2,4-динитрофенола, ряда его метаболитов и 4-окси-дифенила в сорбентах с гидроксилированной поверхностью при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенола, его метаболитов и 4-оксидифенила методами ТСХ и ВЭЖХ.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Впервые для идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенола предложены хромогенные реакции с 6'-метокси-(4')-[винилхинуклидил-(2)]-карбинолом (положительное решение на выдачу патента по заявке №93035497/04 РФ от 07.07.93), 1,2,3-бензотриазолом, полиэтиленгликолем ПЭГ-115; для идентификации и количественного определения 2-амино-4-нитрофенола предложена реакция с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия. Разработаны методики идентификации и количественного определения 4-оксидифенила на основе реакций с гидроксидом натрия и хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия после предварительного нитрования анализируемого вещества.

Определены сптимзлькыс условия экстрагирования ксслсдусмых веществ из водных растворов с учетом рН среды, природы органического растворителя, насыщения экстрагентов водой.

Впервые для изолирования 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен ацетон. На основе использования в качестве изолирующего агента ацетона и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

В опытах на животных (кролики) .исследованы особенности распределения 2,4-динитрофенола в организме теплокровных.

Изучена трансформация 2,4-динитрофенола и сроки сохранения данного вещества, его основного метаболита и 4-оксидифенила в трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

- методики изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенолов (информационное письмо «Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры при судебно-химическом исследовании биологического материала» (№1174/11-07 от 30.12.96; утверждено Республиканским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ и МП РФ). -М., 1996. -49 с.)

- методики идентификации 2,4-динитрофенола на основе хромогенных реакций с 1,2,3-бензотриазолом, 6'-метоксихинолил-(4')-[винилхинуклидил-(2)]-карбинолом, полиэтиленгликолем ПЭГ-115 (внедрены на кафедре органической химии Курского государственного медицинского университета; акт внедрения № 46 от 17 июня 2002 г);

- общая схема исследования биологического материала при отравлении соединениями динитрофенольной структуры (информационное письмо «Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры при судебно-химическом исследовании биологического материала» (1174/11-07 от 30,12,96; утверждено Республиканским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ и МП РФ). -М., 1996. -49 с);

- методика идентификации 2,4-динитрофенола, его метаболита и 4-оксидифенила в извлечениях из биологического материала (внедрена в научный процесс кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета; акт внедрения № 48 от 20 июня 2002 г);

- методика определения гетероциклических и ароматических 27.12.87) (внедрена в научный процесс кафедры фармацевтической химии

Курского государственного медицинского университета; акт внедрения № 47 от 19 июня 2002 г).

На защиту выносятся:

- результаты изучения хроматографической активности 2,4-ди-нитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной поверхностью;

- особенности поглощения электромагнитного излучения исследуемыми веществами в УФ-, видимой и ИК- областях спектра;

- оптимальные условия взаимодействия анализируемых веществ с рядом цветореагентов;

- методики идентификации и количественного определения 2,4-ди-нитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила хроматографическим и фотометрическим методами;

- результаты исследования экстракции анализируемых веществ из водных растворов;

- методики изолирования из биологического материала 2,4-ди-нитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила и очистки рассматриваемых соединений от соэкстрактивных веществ;

- особенности распределения 2,4-динитрофенола в организме теплокровных;

- сохраняемость 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-ок-сцдифенила в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы апробированы на II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995 г); на Международном экологическом форуме «Современные экологические проблемы провинции» (Курск, 1995 г); на Международной научной конференции «Спектрохимические методы анализа окружающей среды» (Курск, 1995 г); на III Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1996 г); на IV Всероссийском съезде судебных медиков (Москва - Владимир, 1996 г); на IV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997 г); на Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 96» с международным участием (Краснодар, 1996 г); на V Всероссийском съезде судебных медиков (Астрахань, 2000 г).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевта -ческих наук. Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.9.60012566), отраслевой научно-исследовательской программой № 35 МЗ РФ, тематикой проблемной комиссии по фармации № 36.08 РАМН.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 39 публикациях, 3 из которых - патенты на изобретения, 1 - заявка на изобретение.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, общей схемы исследования, общих выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 180 страницах. Список цитируемой литературы включает 192 источника, среди которых 114 на русском и 78 на иностранных языках.

В первой главе (обзор литературы) приводятся известные данные о 2,4-нитрофеноле, его основном метаболите, близких по структуре и свойствам нитроароматических соединениях и 4-оксидифениле как объектах химического и химико-токсикологического исследования.

Вторая глава диссертации посвящена вопросам идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила.

Третья глава включает экспериментальные данные по вопросам количественного определения рассматриваемых веществ.

В четвертой главе представлены результаты изучения особенностей выделения и очистки анализируемых соединений экстракционными и хроматографическими методами.

Пятая глава посвящена вопросам изолирования 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила из объектов биологического происхождения и особенностям определения рассматриваемых соединений в извлечениях из биологического материала.

В шестой главе приводятся данные, характеризующие распределение 2,4-динитрофенола в организме теплокровных и сохраняемость анализируемых веществ в трупном материале.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования явились 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ), его основной метаболит - 2-амино-4-нитрофенол (2-А-4-НФ) и 4-оксидифенил (4-ОДФ).

Исследована хроматографическая подвижность данных веществ в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов.

Для характеристики подвижности анализируемых соединений рассчитаны, в частности, значения № и ^ (относительно «базовой» структу-ры - фенола) для метода ТСХ, а также значения времени удерживания (^Х объёма удерживания (Уа) и относительного удерживания (по отношению к фенолу) для метода ВЭЖХ.

Как свидетельствуют данные таблиц 1 и 2, наиболее оптимальные условия хроматографирования 2,4-ДНФ, его основного метаболита и 4-ОДФ методом ТСХ на пластинах «Силуфол» ЦУ-254 и «Сорбфил» достигаются при использовании ряда подвижных фаз малой и средней

полярности: гексан-диоксан-пропанол-2 (40:10:2), гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), гексан-пропанол-2 (20:1), бензол-этилацетат (8:2).

Системы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:10:2), гексан-диоксан-пропа-нол-2 (40:5:1) и гексан-пропанол-2 (20:1) применимы также для определения объектов исследования методом ВЭЖХ в колонках нормальнофазного сорбента «Силасорб-600» (см таблицу 3).

При применении данных элюентов хроматографическая подвижность при определении методами ТСХ и ВЭЖХ возрастает в ряду 2-А-4-НФ<2,4-ДНФ <4-ОДФ.

Как свидетельствуют данные таблицы 4, система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) позволяет идентифицировать 2,4-ДНФ и 4-0ДФ в присутствии ряда близких по структуре к 2,4-ДНФ соединений.

Наиболее универсальной подвижной фазой для определения исследуемых веществ как методом ТСХ (пластины «Силуфол» ЦУ-254, так и методом ВЭЖХ (колонки с сорбентом «Силасорб-600»), позволяющей достичь хороших результатов хроматографирования, является система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:10:2).

Хроматограмма смеси веществ при определении методом ВЭЖХ и использовании этой системы представлена на рис. 1.

Хроматограмма смеси анализируемых веществ при определении методом ВЭЖХ в сорбенте «Силасорб-600» (колонка размером 64x2 мм; подвижная фаза - гексан-диоксан-пропанол-2 (40:10:2)

1 - 4-оксидифенил;

2 - 2,4-динитрофенол;

3 - 2-амиво-4-нитрофенол

г

Ввод пробы

15

Ш

г

о

{^ин

Рис. 1

Как свидетельствуют полученные данные, в предлагаемых условиях удаётся достичь полного разделения 2,4-ДНФ, его основного метаболита и 4-ОДФ.

Результаты изучения хроматографических свойств рассматриваемых соединений указывают на возможность их идентификации методами ТСХ и ВЭЖХ.

Открываемый минимум при идентификации методом ТСХ составляет 0,1-0,8 мкг, методом ВЭЖХ - 0,01-0,25 мкг.

Разработаны методики количественного определения исследуемых фенолов методом ВЭЖХ.

Как свидетельствуют полученные данные, методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата не превышает ±2 %.

Изучены особенности светопоглощения рассматриваемых веществ в УФ- и видимой областях спектра.

В ИК- спектрах исследуемых веществ (таблица 5) выявлены характе-

Таблица 5

Положение отдельных характеристических полос в ИК- спектрах анализируемых соединений_____

-ОН Вал. С=С Деф. =С-Н -N02 -МЬ (у 2-А-4-НФ)

Вал. Деф. Плоек. Вне- плоск. Симм. Асимм. Симм, Асимм.

32663592 13341376 14341626 10041200 684-882 13421348 15221536 3332 3402

ристические полосы поглощения, соответствующие колебаниям различных участков молекул: гидроксильной группы (-ОН), первичной аминогруппы

(-МН), нитрогруппы (-N0.), углерод-водородных связей ароматического ядра (==СН), углерод-углеродных связей ароматического ядра (С—С).

Показана возможность идентификации 2,4-ДНФ, 2-А-4-НФ и 4-ОДФ по их УФ-, видимым и ИК-спектрам.

Изучены особенности взаимодействия анализируемых фенолов с рядом цветореагентов.

В реакциях 2,4-ДНФ с полиэтиленгликолем ПЭГ-115, 1,2,3-бензотриазолом, основанием хинина и хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия (2,3,5-ТФТХ) в среде хлороформа очевидно происходит образование молекулярных продуктов.

Окрашенный продукт взаимодействия 2,4-ДНФ с 2,3,5-ТФТХ

одновременно проявляет и свойства ионного ассоциата, на что, в частности, указывает достаточно высокая константа устойчивости продукта.

Вероятно, что по такому же механизму взаимодействуют с 2,3,5-ТФТХ 2-А-4-НФ и 4-ОДФ (после его предварительного нитрования).

На основе рассмотренных цветных реакций разработаны методики идентификации рассматриваемых веществ. Открываемый минимум - 0,12,5 мкг/мл.

Разработаны методики количественного фотометрического определения исследуемых веществ. Относительная ошибка среднего результата во всех случаях не превышает ±1,9 %.

Для очистки исследуемых веществ рассмотрена возможность применения методов экстракции и хроматографии.

В частности, исследованы особенности экстрагирования анализируемых фенолов из водных растворов органическими растворителями.

Показано, что наиболее полно 2,4-ДНФ извлекается диэтиловым эфиром из кислых растворов (рН от 0,3 до 3-6), 4-ОДФ -хлороформом и этилацетатом из растворов с кислой, нейтральной и щелочной реакцией (рН от 0,3-2 до 9,5-12,5), 2-А-4-НФ -дизтиловым эфиром из слабокислых и нейтральных водных сред (рН от 2-4 до 6-7).

Определена необходимая кратность экстрагирования для извлечения заданных количеств рассматриваемых веществ из водных растворов в оптимальных условиях.

По результатам изучения хроматографической активности анализируемых веществ предложены способы их очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонках с силикагелем и на пластинах «Силуфол» иУ-254. Потери анализируемых веществ при хроматографировании не превысили 1 %.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений методом хроматографии и сочетанием экстракции и хроматографии.

Проведено сравнительное изучение изолирования рассматриваемых веществ из биоматериала 13 изолирующими агентами различной природы. Полученные результаты представлены на рис 2.

Как свидетельствуют полученные данные, наиболее высокий процент извлечения анализируемых соединений достигается при изолировании ацетоном и ДМФА.

В дальнейшем в качестве изолирующего агента выбран ацетон.

Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемых веществ ацетоном от количественного соотношения изолирующею агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.

Таблица 1

Результаты хроматографирования объектов исследования в тонком слое силикагели (пласшны «Силуфо.1>> 1!У - 254) с использованием многокомпонентных подвижных фаз

Анализируемые Гексан - Цензол - 1ексан - Гскын -

вещества пронанол-2 эгилацета г диоксан - диоксан -

(20:1) (8:2) пропаиол-2 пропанол-2

(40:5:1) (40:10:2)

КГ К5* ИГ Яч КГ ЯГ 'Я*

2,4-ДНФ 0,19 1,12 0,78 1,24 0,12 0,67 0,41 0,74

2-А-4-НФ 0,02 0,12 0,24 0,38 0 0 0,12 0,21

4-ОДФ 0,16 0,94 0,66 1,01 0,11 0,61 0,48 0,88

2-М-4,6-ДНФ 0,29 1,71 0,25 1,39 - -

2-(1-МП)-4,6- 0,38 2,24 0,39 2,17 - -

ДНФ

2-(1-МГ)-4,6-ДНФ 0,46 2,71 0,54 3,00 - ' -

4-(1-МГ)-2,6-ДНФ 0,34 2,00 0,33 1,83 - -

Фенол 0,17 1,00 0,47 1,00 0,18 1,00 0,55 1,00

Значения рассчитаны относительно КГ фенола

Таблица 2

Результаты хроматографирования объектов исследования в тонком слое силикагеля СТХ1-А (пластины «Сорбфил»)

Анализируемы« Гексан - дноксан- Гсксаи -диоксан- Днхлорэтан-

вещества пропанол-2 (40:5:1) - пропанол-2 (40:10:2) аиетоп (8:2)

КГ 1*8* ЛГ & КГ К$

2,4-ДНФ 0,02 0,06 0,02 0,02 0,18 0,18

2-А-4-НФ 0,06 0,17 0,37 0,46 0,60 0,62

4-ОДФ 0,30 0,83 0,61 0,75 0,84 0,81

2-М-4,б-ДНФ 0,07 0,19 . ; - - -

2-{1-МП) 4,6- 0,16 0,44 - - - -

ДНФ

2-(1-МГ)-4,6- 0,12 0,53 - - - -

ДНФ

4-(1-МГ)-2,6- 0,02 0,06 - - - -

ДНФ

Фенол . 0,36 1,00 0,81 1,00 0,97 1,00

* Значения Ив рассчитаны относительно КГ фенола

Таблица 3

Отдельные параметры хроматографирования объектов исследования методом ВЭЖХ с использованием нормальнофазного сорбента «Силасорб-600» (колонка размером 64x2 мм)

Анализируемые вещества и Относительное удерживание по отношению к фенолу в элюеите Предел обнаружения, мкг к' N Д(ДО

Подвижная фаза гексаи-диоксан-ацетои (20:16:1) (у=100 мкл/мин)

2-А-4-НФ 2,10 1,20 246 0,40 047 242 -3664,12

Фенол 1,75 1,00 27 0,04 0,06 340 0

Подвижная фаза гексан-пропаиол-2 (20:1) (у=50 мкл/мин)

2,4-ДНФ 6,81 1,07 260 0,04 1,07 793 -319,03

4-ОДФ 6,22 0,97 262 0,01 0,88 1911 150,66

Фенол 6,40 1,00 268 0,02 0,94 2500 0

Подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1) (»»=50 мкл/мин)

2,4-ДНФ 15,68 2,074 260 0,02 3,02 818 -2839,67

4-ОДФ 9,34 1,24 262 0,01 1,39 2,630 -954,56

Фенол 7,56 1,00 272 0,04 0,94 2025 0

Подвижная фаза гексан-диоксан-пропан<Ы1-2 (40:10:2) (и-100 мкл/мин)

2,4-ДНФ 3,71 1,40 260 0,05 0,68 738 •1887,33

2-А-4-НФ 8,74 3,20 260 0,40 3,62 770 -5111,03

4-ОДФ 3,12 1,14 260 0,04 0,65 1090 -921,93

Фенол 2,73 1,00 272 0,04 0,44 835 0

Таблица 4

Параметры хроматографирования искусственной смеси веществ методом ВЭЖХ (сорбент «Силасорб-600», подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1))

Вещество 1« N к' а К, 1

2-(1М1>4,6-ДНФ 4,48 825

2-{1-МП)-416-ДНФ 5,14 1447

4-(1-МГ)-2,6-ДНФ 6,30 695

2-М-4.6-ДНФ 7,40 1149

4-ОДФ 9,34 3154

2,4-ДНФ 15,68 611

0,15

0,32 2,14 1,13 1,14

0,62 1,94 1,55 1.11

0,90 1,46 1,20 1,50

1,39 1,55 2,52 2,75

3,02 2,П 1,98 2,95

Установлено, что оптимальные условия изолирования анализируемых веществ ацетоном могут быть достигнуты уже при 2-3-ёх-кратном настаивании при условии, что соотношение изолирующей жидкости и биоматериала составляет как минимум 2:1, а продолжительность каждого отдельного настаивания по крайней мере полчаса.

На основе предварительных исследований разработаны методики определения 2,4-ДНФ, его основного метаболита и 4-ОДФ в ткани трупных органов, крови и моче после изолирования ацетоном и очистки извлечённых веществ методами экстракции и хроматографии. Количественная оценка результатов определения представлена на рис. 3.

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемых соединений в количестве 50 мг в 100 г (100 мл) биоматериала разработанные методики позволяют определять в ткани печени 45-71 %, в крови - 47-77 %, в моче - 54-88 % исследуемых веществ.

Методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью. Определяемый минимум рассматриваемых веществ при изолировании ацетоном составляет 0,14-0,28 мг в 100 г трупного органа, 0,1-0,2 мг в 100 мл крови, 0,03-0,06 мг в 100 мл мочи.

Показана возможность применения разработанных методик при исследовании гнилостно изменённого трупного материала.

Изучены особенности распределения 2,4-ДНФ в организме теплокровных животных (кролики). Экспериментальным животным в состоянии общего наркоза вводили внутрижелудочно трёхкратную отравляющего вещества. Животные погибали через2-3 часа после введения дозы.

Результаты изучения распределения представлены на рис. 4. Как свидетельствуют полученные данные, в органах и биожидкостях отравленных животных обнаруживался как 2,4-ДНФ, так и его основной метаболит. Наибольшие количества исходного отравляющего агента присутствуют в крови, желудке и лёгких, его метаболита - в моче и крови отравленных животных.

Исследованы особенности сохранения 2,4-ДНФ, 2-А-4-НФ и 4-ОДФ в трупном материале при температуре 16-18°С. Результаты представлены на рис. 5.

Как свидетельствуют полученные данные, 2,4-ДНФ в предлагаемых условиях сохраняется в трупном материале в течение 13 дней. Через 16 дней обнаруживались его следы.

Через сутки сохранения искусственных смесей с 2,4-ДНФ появляется его метаболит - 2-А-4-НФ, который в дальнейшем определяется ещё в течение 19 дней.

Результаты изучения сравнительного изолирования 2,4-динитрофенпла и его основного метаболита

Изолирующие агенты: 1 - вода; 2 - ОД н. р-р гидроксида натрия; 3-8 % р-р уксусной кислоты; 4 - гексан; 5 - толуол; 6 - этанол; 7 - ацетон; 8 - этилацетат; 9 - ацетонитрил; 10 - лед. уксусная кислота; 11 -формамид; 12-ДМФА; 13-хлороформ

Рис.2

Результаты определения исследуемых соединении после изолирования ацетоном

Я//о

75 50 25

а). Очистка методом хроматографии

ПЕЧЕНЬ

КРОВЬ

МОЧА

б). Очистка методами экстракции и хроматографии

75 ■

50

25

ПЕЧЕНЬ КРОВЬ

иочд

□ 2,4-ДИНИТРОФЕШ

| 2-ДМИН0-4-НИТР0ФЕЯ0А Ш 4-ОКСШИФША

Распределение 2,4-динитрофенола и его основного метаболита в организме теплокровных животных

2-А-4-БФ (в % к найденному)

2,4-ДЙФ (в % к найденному)

ЛЁГКИЕ ПОЧКИ 1Ч1НЬ

£-л1гкие мочи

\ "ГОНК.ИШЕЧНИК ПЕЧЕНЬ И ПОЧКИ

Рис.4

Результаты изучения сохраняемости рассматриваемых соединений в трупном материале

1 - 2,4-динитрофенол; 2 - метаболит 2,4-динитрофенола (2-амино-4-ннтрофенол); 3 - 2-амино-4-нитрофеиол; 4 - метаболит 2-амино-4-нитрофенола (2,4-динифифенил);5- 4-икСндифенил

Общая схема исследования (при отравлении 2,4-ДНФ и 4-ОДФ)

(15:15:1); фракции по 1 мл

2-А-4-НФ в искусственных смесях с тканью трупной печени определяется в течение 10 дней, на 13 день обнаруживаются его следы. На третьи сутки в биоматериале появляется помимо 2-А-4-НФ продукт его окисления - 2,4-ДНФ, который можно определять в течение 10 суток. На 14-е сутки обнаруживаются следы 2,4-ДНФ.

4-ОДФ может быть определён в сохраняемом трупном материале по крайней мере в течение 3 месяцев с момента приготовления искусственных смесей.

По результатам проведённых исследований предложена обшая схема химико-токсикологического анализа рассматриваемых соединений.

Предлагаемая схема, представленная на рис. 6, позволяет изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить каждое из исследуемых веществ.

ВЫВОДЫ

1. Исследован характер поглощения электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК-областях спектра 2,4-динитрофенолом, 2-амино-4-нитрофенолом и 4-оксидифенилом.

Установлены специфические отличия в поглощении рассматриваемых соединений.

Показана возможность идентификации исследуемых веществ методами электронной и колебательной спектрофотометрии.

На основе способности к поглощению УФ- и видимого излучения в среде хлороформа разработаны методики количественного определения рассматриваемых соединений спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата в различных случаях не превышает ±1%

2. Изучена хроматографическая активность исследуемых фенольных структур в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов с использованием элюентов различной полярности. Рассчитан ряд параметров хроматографирования.

Установлено, что универсальной подвижной фазой для селективного определения рассматриваемых веществ в сорбентах с гидроксилированной поверхностью методами ТСХ (силикагель) и ВЭЖХ ("Силасорб-600") является система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:10:2).

Разработаны методики количественного определения 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила методом ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата не превышает ± 2%.

3. Показана возможность применение в качестве цветореагентов для определения исследуемых соединений ряда восстанавливающих веществ, гидроксида натрия в водной среде, органических веществ из группы производных амидов(ДМФА), этиленгликоля (ПЭГ-115),

гетероциклических аминов (хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия, 1,2,3-бензотриазола и 6,-мегоксихинолил-(4,)-[5-винилхинуклидил-(2)]-карбинола).

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений. Относительная ошибка среднего результата при количественном фотометрическом определении определении не превышает ±1,9 %.

4. Исследована экстрагируемость соединений анализируемой группы из водных растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения экстрагентов водой.

Показано, что 2,4-динитрофенол большинством рассмотренных растворителей наиболее полно извлекается из водных растворов с рН от 0,3 до 3,5-6, 4-оксидифенил - из растворов с рН от 0,3-2 до 9,5-12,5 , 2-амино-4-нитрофенол - из водных сред с рН от 2-4 до 6-7.

5. Изучены особенности препаративного хроматографирования объектов исследования на колонке с силикагелем Ь 40/100ц. Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1). Дана оценка потерь анализируемых соединений в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем экстракционной и хроматографической очистки рассматриваемых фенольных структур от соэкстрактивных веществ биологического материала.

6. Проведено сравнительное изолирования исследуемых веществ из биологического материала различными изолирующими агентами.

Установлено, что наиболее высокую степень извлечения рассматриваемых соединений удается достичь при использовании в

качестве изолирующих агентов ацетона и ДМФА

Определены оптимальные условия изолирования рассматриваемых соединений ацетоном.

Разработаны методики определения 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования ацетоном и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии.

7. При содержании анализируемых соединений в количестве 50 мг в 100 г (100 мл) биоматериала методики, основанные на изолировании

ЯТТРТЛНЛМ ТТП1ПЛТИПЛТ ПТТ™»Т№ТТ«ПТ. В ткьии пйирии 1А _ --- - ------- ------------ ---г---------- -- -------- . --- ^^ ' " ~) '

динитрофенола, 47-50% 2-амино-4-нитрофенола, 66-71% 4-оксидифенила, в крови - соотвегсгвенно 73-76%, 49-51% и 72-77% этих же соединений, в

моче - соответственно 84-88%, 52-55% и 71-75% данных веществ.

Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемых веществ при изолировании ацетоном составляет 0,14-0,28 мг в 100 г трупного органа,

0.10.0,20 мг в 100 мл крови, 0,03-0,06 мг в 100 мл мочи.

8. Исследованы особенности распределения 2,4-динитрофенола в организме теплокровных животных при введении яда через желудок.

Установлено присутствие в трупах отравленных животных как исходного отравляющего агента, так и его основного метаболита - 2-амино-4-нитрофенола.

2,4-Динитрофенол в наибольших количествах обнаруживается в крови, ткани желудка и моче, а2-амино-4-нитрофенол - в моче, крови и легких животных, погибших от отравления.

9. Изучена сохраняемость исследуемых веществ в трупном материале.

Показано, что при температуре 16-18°С продолжительность сохранения 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила в модельных смесях с тканью трупной печени составляет соответственно 16,13 и 90 суток.

При выбранном режиме сохранения 2,4-динитрофенол способен восстанавливаться в трупном материале до 2-амино-4-нитрофенола, а 2-амино-4-нитрофенол-трансформироваться в 2,4-динитрофенол.

10. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении 2,4-ди-нитрофенолом.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заявка №930354497/04 Ш6 в01№1/78. Способ определения 4-нитрофенолов [Текст] / В.К.Шорманов, ИАФурсова, М.Н.Якубовская (Курский гос. мед. ун-т);- Заявлено 07.07.93 // Изобретения (Заявки и патенты)-1996.- № 6.-С. 252.

2. Определение нитазола методом ВЭЖХ [Текст] / В.К.Шорманов, ИАФурсова, МДВанина и др. // Науч. тр. НИИФ МЗ РФ. Т. 32, Ч. 2.-М., 1997.-С. 112-115.

3. Определение 4-нитрофенола методом ВЭЖХ [ТеКс1] / В.КШорманов, ИАФурсова, ААЛрокошев и др. // IV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (1997 г., г. Москва).- М., 1997.- С. 348.

4. . Определение остаточных количеств нитропроизводных фенола в лекарственных растениях и фитопрепаратах [Текст] / В.К.Шорманов, ИАФурсова, ААПрокошев и др. // Материалы междунар.

экологического форума «Современные экологические проблемы провинции» (1995 г., г. Курск).- Курск, 1995,- С. 281- 282.

5. Определение остаточных количеств нитрофенолов в жидких лекарственных формах [Текст] / ИА1Фурсова, М.Н.Якубовская, В.КШорманов и др. // Сб. науч. тр., посвящ. 60- летаю Курского гос. мед. ун-та.- Курск, 1996.- С. 668-669.

6. Определение остаточных количеств пестицидов в лекарственных растениях, растительном сырье и фитопрепаратах [Текст] / В.КШорманов, ИА1Фурсова, ААПрокошев, Л.ИЛрокошева // Всерос. науч. конф. «Экоаналитика- 96» (2-8 октября 1996 г., г. Краснодар).- Краснодар, 1996.- С. 271.

7. Определение фенола и о-крезола в сточных водах методом ВЭЖХ [Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова, М.Ю.Маркелов и др. // Междунар. экологический форум «Современные экологические проблемы провинции» (1995 г., г. Курск) - Курск, 1995.-С. 280.

8. Определение 2-хлор-4-нитрофенола методом ВЭЖХ [Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова, ААПрокошев и др. // II Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (1995 г., г. Москва).- М., 1995.- С. 323.

9. Разработка методики количественного определения пестицидов в жидких лекарственных формах [Текст] / ЮАСухомлинов, ВХШорманов, ИАФурсова и др. // Междунар. экологический форум «Современные экологические проблемы провинции» (1995 г., г.Курск).- Курск, 1995.-С. 237- 238.

10. С 1 2100808 Ш6 ШШ33/48. Способ определения гетероциклических нитросоединений в биологическом материале [Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова (Курский гос. мед. ун-т)- № 96103668, Заявлено 01.03.96 // Изобретения (Заявки и патенты).- 1997.-№36.-С. 192.

11. С 1 2121681 Ш6 в0Ш33/50. Способ определения 4-нитро-фенолов в биологическом материале [Текст] / В.К.Шорманов, ИАФурсова (Курский гос. мед. ун-т).- № 94021200/14, Заявлено 07.06.94//Изобретения (Заявки и патенты).-1998.-№31.-С. 181.

12. С 1 2142125 ЯШ С01 N21/78. Способ определения сложных эфиров ароматических оксипроизводных [Текст] / В.К.Шорманов, ИАФурсова, ЬШАкилонова, М.Ю.Маркелов (Курский гос. мед. унт).- № 97117482/28, Заявлено 21.10.97 // Изобретения (Заявки и патенты).-1999.-№33.-С 206.

13. Фотометрическое определение оксипроизводных бензола[Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова, АЛ.Бедная и др. // Науч. тр. НИИФ МЗ РФ. Т. 32.-М.., 1996.-С. 47-52.

14. Фотометрическое определение пиридоксина гидрохлорида[Текст]/ В.КШорманов, ИА1Фурсова, ААПрокошев и др. // II Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (1995 г., г. Москва).- М,

1995.-С. 323.

15. Фотометрическое определение хинозола [Текст] / В.КШорманов, Л.Е.Сипливая, ИА1Фурсова и др. // III Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (1996 г., г. Москва).- М.; 1996.- С. 327.

16. Фотометрическое определение 2-хлор-4,6-динитрофенола[Текст] /

B.К.Шорманов, ИАФурсова, ААПрокошев и др. // IV Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство» (1997 г., г. Москва).- М., 1997.- С. 348.

17. Фурсова, ИА Особенности идентификации 2,4-нитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила в тонком слое сорбента с привитой фазой. С-3 [Текст] / ИАФурсова // Материалы 67-й междунар. конф. студентов и молодых ученых.-Ч. 2.- Курск, 2002 .С. 156-157.

18. Фурсова, И. А. Идентификация 2,4-динитрофенола и его основного метаболита в тонком слое обращеннофазного сорбента [Текст] / И А1Фурсова, Л.Е.Сипливая, ВКЛЫорманов // Сб. науч. тр., посвящ. 90- летию фармац. ф-та Курского гос. мед. ун-та.- Курск, 1997.-С. 109-110.

19. Фурсова, И. А. Идентификация нитрофенолов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [Текст] / ИАФурсова, В.КШорманов // Межвуз. науч. конф. «Актуальные проблемы медицины и фармации» (1995 г., г. Курск).- Курск, 1995.-

C. 85-86.

20. Фурсова, И.А. Идентификация 2,4-динитрофенола и его метаболита в тонком слое силикагеля [Текст] / ИА1Фурсова, В.К.Шорманов // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины и фармациии,- Курск, 1995,- С. 119.

21. Фурсова, И.А. Идентификация 2,4-динитрофенола и 4-ок-сидифенила методом ТСХ [Текст] / ИА1Фурсова, В.КШорманов // Межвуз. науч. конф. «Актуальные проблемы медицины и фармации» (1995 г., г. Курск). - Курск, 1995.- С. 118.

22. Фурсова, И.А. Идентификация 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4- оксидифенила в тонком слое обращеннофазного сорбента [Текст] / И.А.Фурсова, В.К.Шорманов // Материалы науч.-практ. конф., посвящ. 35- летию фармац. ф-та.- Курск, 2001.- С. 187188.

23. Фурсова, И А Изучение продукта реакции 2,4-динитрофенола с 1,2,3-бензотриазолом спектральными методами [Текст] / И.А.Фурсова, В.КШорманов // Тр. 67-ой науч. сессии КГМУ и отд. мед. - биол. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН.- Ч. 2.- Курск, 2002.- С. 129-130.

24. Фурсова, И.А. Особенности экстракции 2-амино-4-нитрофенола и 4-фенилфенола ns иидных растворов [Текст] / ИАФурсова, В.КШорманов // Суд.- мед. экспертиза. 2002.- Т. 45, № 6,- С.38- 41.

25. Фурсова, И А Определение 2,4-динитрофенола, его основного

метаболита и 4-оксидифенила в биологическом материале [Текст] / ИАФурсова, В.КШорманов, КВ.Гусев // Суд. - мед. экспертиза. -2003.-Т.46,№3.-С.29-33.

26. Фурсова, И.А. Определение 2,4-динитрофенола и 4-фенилфенола в воздухе методом ВЭЖХ [Текст] / ИАФурсови, В.КШорманов,

A.А.Прокошев // Тр. 67-ой науч. сес. КГМУ и отд. мед.-биол. наук Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН.-Ч. 2.- К>рск, 2002.- С. 130.

27. Фурсова, И.А. Хроматографическое определение 4-нитрофенола в извлечениях из растительного материала [Текст] / ИАФурсова, М.Н.Якубовская, ЮАСухомлинов, В.КШорманов // Межвуз. науч. конф. «Актуальные проблемы медицины и фармацик (1995 г., г. Курск).- Курск, 1995.- С. 94- 95.

28. Шорманов, В.К. Реакции идентификации 2,4-динитрофенола [Текст] / ВХШорманов, ИАФурсова // Актуальные вопросы экспериментальной клинической медицины и фармации.- Курск, 1993.-С. 195.

29. Шорманов, В.К Определение 2-(втор-октил)-4,6-динитрофенола и 4-(втор-октил)-2,6-динитрофенола в воде методом производной спектрофотометрии [Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова // Междунар. науч. конф. «Спектрофотометрические методы анализа окружающей среды» (1995г., г. Курск).- Курск, 1995.- С. 104-105.

30. Шорманов, В.К. Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры в биологических жидкостях [Текст] /

B.КШорманов, ИАФурсова // Суд. - мед. экспертиза.- 1995.- Т. 38, №3,-С. 33-36.

31. Шорманов, В.К. Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры при судебно- химическом исследовании биологического материала [Текст] / В.К.Шорманов, И.А.Фурсова // Суд. - мед. экспертиза,-1996.- Т. 39, № 3.- С. 40- 44.

32. Шорманов, В.К. Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры при судебно- химическом исследовании биологического материала [Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова // Материалы IV Всерос. съезда судебных медиков.- Ч. 2.- Москва-Владимир.- 1996.-С. 140-141.

33. Шорманов, В.К. Фотометрическое определение полинитрофено-лов [Текст] / В.КШорманов, ИА1Фурсова // Журн. аналит. химии. -1997.- Т. 2, № З.-С. 319- 323.

34. Шорманов, В.К. Определение 2,4-динитрофенола и 4-фенилфенола в крови и в моче методом ВЭЖХ[Текст]/ В.КШорманов, ИАФурсова // Материалы итоговой науч. сес. КГМУ.- Курск, 1997.- С. 183.

35. Шорманов, В.К.Определение 4-нитрофенолов в объектах биологического происхождения [Текст] / В КШорманов, И.Л. Фурсова

// Суд. - мед. экспертиза. -1998.- Т. 41, № 6.- С. 28- 33.

36. Шорманов, В.К Распределение 2,4 динитрофенола в организме теплокровных животных [Текст] / В.КШорманов, ИАФурсова // Материалы V съезда судебных медиков РФ.- Астрахань, 2002.- С. 337338.

37. Шорманов, В.К. Особенности экстракции 2,4-динитрофенола и 2,4,6-тринитрофенола из водных растворов [Текст] / В.К.Шорманов, ИАФурсова, М.НЛкубовская // Суд. - мед. экспертиза.- 1994.- Т. 37, № 2.- С. 22- 23.

38. Шорманов, В.К. Определение 2-хлор-4-нитрофенола в биологических жидкостях [Текст] / В.КШорманов, ИА1Фурсова, М.Н.Якубовская // Науч. конф. «Современные вопросы дерматовенерологии» (1995г., г. Курск).- Курск., 1995.- С. 152-153.

39. Шорманов, В.К. Экстрагирование 4-нитрофенола и 2-хлор-4-нитрофенола из водных растворов [Текст] / В К.Шорманов, ИАФурсова, М. НЛкубовская // Фармация.- 1996.- Т. 45, № 4.- С. 4041.

Сдано в набор 14.10.2004 г. Подписано в печать 14.10.2004 г. Формат 60x84 А«. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 82.

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К Маркса, 3.

Отпечатано в множительном центре ВНИИЗиЗПЭ 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70-6

»20 5 97

РНБ Русский фонд

2005^4 22782

Актуальность темы. Значительные успехи органического синтеза в последние два столетия привели к ситуации, когда человек в различных сферах своей деятельности постоянно сталкивается с химическими веществами, не встречающимися в естественных условиях. Многие из этих веществ оказывают неблагоприятные воздействия на процессы функционирования организма, приводя к патологическим изменениям. К таким веществам относятся, например, нитропроизводные фенола, в частности, 2,4-динитрофенол.

2,4-динитрофенол является полупродуктом ряда важнейших органических синтезов, применяется как пестицид и антисептирующее средство в лесной и деревообрабатывающей промышленности. В последнем случае он может использоваться как индивидуально, так и в составе комплексных препаратов вместе с 4-оксидифенилом. Известно применение 2,4-динитрофенола как реактива и боевого отравляющего вещества.

Рассматриваемое соединение обладает высокой токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. При попадании в организм оно может вызывать отравления различной степени тяжести. Описаны многочисленные случаи отравления 2,4-динитрофенолом с летальным исходом при различных путях проникновения отравляющего вещества в организм человека.

Летальная доза 2,4-динитрофенола для человека составляет при однократном приеме около 1 г.

Широкое применение 2,4-динитрофенола, его высокая токсичность, наличие случаев смертельного отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно изученными вопросы изолирования 2,4-динитрофенола из объектов биологического происхождения, его очистки, идентификации и количественного определения. В доступной литературе практически отсутствуют данные по сохраняемости 2,4-динитрофенола и его основного метаболита (2-амино-4-нитрофенола) в трупном материале.

Исходя из вышеизложенного, исследования в области химико-токсикологического анализа 2,4-динитрофенола являются актуальными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертации явилась разработка методики химико-токсикологического исследования 2,4-динитрофенола.

Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

- определить особенности светопоглощения объектов исследования в УФ-, видимой и ИК- областях спектра;

- исследовать особенности хроматографического поведения 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов;

- изучить особенности взаимодействия рассматриваемых соединений с рядом цветореагентов, показать возможность применения хромогенных реакций в условиях анализа биологического материала;

- провести изучение процессов распределения анализируемых веществ в системах из взаимонесмешивающихся жидкостей;

- исследовать особенности изолирования 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений;

- изучить особенности распределения 2,4-динитрофенола в органах и биожидкостях теплокровных животных;

- определить сроки сохраняемости объектов исследования в трупном материале.

Научная новизна. Изучены отдельные закономерности хроматографического поведения 2,4-динитрофенола, ряда его метаболитов и 4-оксидифенила в сорбентах с гидроксилированной поверхностью при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенола, его метаболитов и 4-оксидифенила методами ТСХ и ВЭЖХ.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров.

Впервые для идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенола предложены хромогенные реакции с 6'-метокси-(4')-[винилхинуклидил-(2)]-карбинолом (положительное решение на выдачу патента по заявке №93035497/04 РФ от 07.07.93), 1,2,3-бензотриазолом, полиэтиленгликолем ПЭГ-115; для идентификации и количественного определения 2-амино-4-нитрофенола предложена реакция с хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия. Разработаны методики идентификации и количественного определения 4-оксидифенила на основе реакций с гидроксидом натрия и хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия после предварительного нитрования анализируемого вещества.

Определены оптимальные условия экстрагирования исследуемых веществ из водных растворов с учетом рН среды, природы органического растворителя, насыщения экстрагентов водой.

Впервые для изолирования 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен ацетон. На основе использования в качестве изолирующего агента ацетона и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

В опытах на животных (кролики) исследованы особенности распределения 2,4-динитрофенола в организме теплокровных.

Изучена трансформация 2,4-динитрофенола и сроки сохранения данного вещества, его основного метаболита и 4-оксидифенила в трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены: методики изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенолов (информационное письмо «Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры при судебно-химическом исследовании биологического материала» (№1174/11-07 от 30.12.96; утверждено Республиканским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ и МП РФ). - М., 1996. -49с.) методики идентификации 2,4-динитрофенола на основе хромогенных реакций с 1,2,3-бензотриазолом, 6'-метоксихиноли л-(4')-[винилхинуклидил-(2)]-карбинолом, полиэтиленгликолем ПЭГ-115 (внедрены на кафедре органической химии Курского государственного медицинского университета; акт внедрения № 46 от

17 июня 2002 г); общая схема исследования биологического материала при отравлении соединениями динитрофенольной структуры (информационное письмо «Определение токсичных соединений динитрофенольной структуры при судебно-химическом исследовании биологического материала» (1174/11-07 от 30,12,96; утверждено Республиканским центром судебно-медицинской экспертизы МЗ и МП РФ). - М., 1996. - 49с.); методика идентификации 2,4-динитрофенола, его метаболита и 4-оксидифенила в извлечениях из биологического материала (внедрена в научный процесс кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета; акт внедрения № 48 от 20 июня 2002 г); методика определения гетероциклических и ароматических нитропроизводных в биологическом материале (Пат. №2100808 РФ от 27.12.87) (внедрена в научный процесс кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета; акт внедрения № 47 от 19 июня 2002 г). а защиту выносятся: результаты изучения хроматографической активности 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной поверхностью;

- особенности поглощения электромагнитного излучения исследуемыми веществами в УФ-, видимой и ИК- областях спектра;

- оптимальные условия взаимодействия анализируемых веществ с рядом цветореагентов;

- методики идентификации и количественного определения 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила хроматографическим и фотометрическим методами;

- результаты исследования экстракции анализируемых веществ из водных растворов;

- методики изолирования из биологического материала 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила и очистки рассматриваемых соединений от соэкстрактивных веществ;

- особенности распределения 2,4-динитрофенола в организме теплокровных;

- сохраняемость 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы апробированы на II Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1995 г); на Международном экологическом форуме «Современные экологические проблемы провинции» (Курск, 1995 г); на Международной научной конференции «Спектрохимические методы анализа окружающей среды» (Курск, 1995 г); на III Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1996 г); на IV Всероссийском съезде судебных медиков (Москва - Владимир, 1996 г); на IV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1997 г); на Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 96» с международным участием (Краснодар, 1996 г); на V Всероссийском съезде судебных медиков (Астрахань, 2000 г).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнялась в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.9.60012566), отраслевой научно-исследовательской программой № 35 МЗ РФ, тематикой проблемной комиссии по фармации № 36.08 РАМН.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 39 публикациях, 3 из которых - патенты на изобретения, 1 - заявка на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, общей схемы исследования, общих выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 180 страницах. Список цитируемой литературы включает 192 источника, среди которых 114 на русском и 78 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Исследован характер поглощения электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК-областях спектра 2,4-динитрофенолом, 2-амино-4-нитрофенолом и 4-оксидифенилом.

Установлены специфические отличия в поглощении рассматриваемых соединений.

Показана возможность идентификации исследуемых веществ методами электронной и колебательной спектрофотометрии.

На основе способности к поглощению УФ- и видимого излучения в среде хлороформа разработаны методики количественного определения рассматриваемых соединений спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата в различных случаях не превышает ±1%

2. Изучена хроматографическая активность исследуемых фенольных структур в тонких слоях и колонках нормальнофазных сорбентов с использованием элюентов различной полярности. Рассчитан ряд параметров хроматографирования.

Установлено, что универсальной подвижной фазой для селективного определения рассматриваемых веществ в сорбентах с гидроксилированной поверхностью методами ТСХ (силикагель) и ВЭЖХ ("Силасорб-600") является система растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:10:2).

Разработаны методики количественного определения 2,4-динитрофенола, его основного метаболита и 4-оксидифенила методом ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата не превышает ± 2%.

3. Показана возможность применение в качестве цветореагентов для определения исследуемых соединений ряда восстанавливающих веществ, гидроксида натрия в водной среде, органических веществ из группы производных амидов (ДМФА), этиленгликоля (ПЭГ-115), гетероциклических аминов ( хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия, 1,2,3-бензотриазола и 6'-метоксихинолил-(4')-[5-винилхинуклидил-(2)]-карбинола ).

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений. Относительная ошибка среднего результата при количественном фотометрическом определении не превышает ±1,9%.

4. Исследована экстрагируемость соединений анализируемой группы из водных растворов гидрофобными органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, рН среды, насыщения экстрагентов водой.

Показано, что 2,4-динитрофенол большинством рассмотренных растворителей наиболее полно извлекается из водных растворов с рН от 0,3 до 3,5-6, 4-оксидифенил - из растворов с рН от 0,3-2 до 9,5-12,5 , 2-амино-4-нитрофенол - из водных сред с рН от 2-4 до 6-7.

5. Изучены особенности препаративного хроматографирования объектов исследования на колонке с силикагелем L 40/100р. Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1). Дана оценка потерь анализируемых соединений в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем экстракционной и хроматографической очистки рассматриваемых фенольных структур от соэкстрактивных веществ биологического материала.

6. Проведено сравнительное изолирования исследуемых веществ из биологического материала различными изолирующими агентами.

Установлено, что наиболее высокую степень извлечения рассматриваемых соединений удается достичь при использовании в качестве изолирующих агентов ацетона и ДМФА.

Определены оптимальные условия изолирования рассматриваемых соединений и ацетоном.

Разработаны методики определения 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования ацетоном и очистки методом хроматографии или сочетанием методов экстракции и хроматографии.

7. При содержании анализируемых соединений в количестве 50 мг в 100 г (100 мл) биоматериала методики, основанные на изолировании ацетоном, позволяют определять в ткани печени 59-65% 2,4-динитрофенола, 47-50% 2-амино-4-нитрофенола, 66-71% 4-оксидифенила, в крови - соответственно 73-76%, 49-51% и 72-77% этих же соединений, в моче - соответственно 84-88%, 52-55% и 71-75% данных веществ.

Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемых веществ при изолировании ацетоном составляет 0,14-0,28 мг в 100 г трупного органа, 0,10-0,20 мг в 100 мл крови, 0,03-0,06 мг в 100 мл мочи.

8. Исследованы особенности распределения 2,4-динитрофенола в организме теплокровных животных при введении яда через желудок.

Установлено присутствие в трупах отравленных животных как исходного отравляющего агента, так и его основного метаболита - 2-амино-4-нитрофенола.

2,4-Динитрофенол в наибольших количествах обнаруживается в крови, ткани желудка и моче, а 2-амино-4-нитрофенол - в моче, крови и легких животных, погибших от отравления.

9. Изучена сохраняемость исследуемых веществ в трупном материале.

Показано, что при температуре 16-18°С продолжительность сохранения 2,4-динитрофенола, 2-амино-4-нитрофенола и 4-оксидифенила в модельных смесях с тканью трупной печени составляет соответственно 16, 13 и 90 суток.

При выбранном режиме сохранения 2,4-динитрофенол способен восстанавливаться в трупном материале до 2-амино-4-нитрофенола, а 2-амино-4-нитрофенол-трансформироваться в 2,4-динитрофенол.

10. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении 2,4-динитрофенолом.