Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-технологическое обоснование использования вики изменчивой, вики Гроссгейма и вики обрубленной как источников получения гепатозащитных и венотонизирующих средств

Актуальность темы. В настоящее время сохраняется потребность в лекарственных средствах природного происхождения, обладающих высокой терапевтической активностью и минимальным побочным действием. Этим требованиям отвечают препараты на основе флавоноидов. Характеризуясь в целом высокой антирадикальной активностью, они проявляют определенную избирательность при различных патологиях. Так, например, дигидрокверцетин, относящийся к флаванонолам и выпускаемый под названием «Капилар», повышает эластичность эритроцитов и улучшает кровоток в периферических сосудах. Кверцетин (флавонол) и рутин (кверцетин-3-рутинозид) используются как ка-пилляроукрепляющие средства; силибин, силикристин (конденсированные флаванонолы), входящие в состав «Легалона» - для лечения заболеваний гепа-тобилярной системы; гесперидин (флаванон) и диосмин (флавон) входят в состав венотонизирующих препаратов. Следует отметить, что основная часть ве-нотонизирующих и гепатозащитных средств таких как «Детралекс», «Дафлон», «Фламин», «Флакумин» и другие являются импортными препаратами. Поэтому вполне очевидно, что научные исследования, направленные на восполнение дефицита этих препаратов на основе отечественных сырьевых источников вполне актуальны.

С этой точки зрения использование растений рода Вика, относящихся к широко распространенным на Северном Кавказе кормовым растениям и характеризующихся высоким содержанием флавоноидов, целесообразно как с точки зрения их доступности, так и возможности введения в культуру.

Цель и задачи исследовании. Целыо настоящей работы является поиск рациональных путей выделения диосмина и его структурных аналогов (араби-но- и ксилоглюкозидов диосметина) из растений рода Вика и изучение их биологических свойств.

Для реализации поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

- выявить сырьевые источники биозидов диосметина среди представителей рода Вика и предложить оптимальные пути их выделения;

- получить индивидуальные соединения (диосмин, арабиноглюкозид и ксилоглюкозид диосметина);

- определить аминокислотный состав травы вики изменчивой, вики Гроссгейма и вики обрубленной, а также их этанольных извлечений;

- установить элементный состав травы исследуемых видов вик;

- изучить качественный состав 40 % этанольного извлечения вики обрубленной, содержащего сумму арабиноглюкозида и ксилоглюкозида диосметина;

- разработать методики количественного определения диосмина и его структурных аналогов;

- провести биологические и фармакологические испытания выделенных веществ;

- разработать нормативные показатели на сырье вики изменчивой как источника диосмина.

Научная новизна. Предложен модифицированный метод выделения диосмина из сырья вики изменчивой и вики Гроссгейма; впервые разработан способ выделения данного флавоноида, основанный на предварительной обработке сырья оксидом кальция и последующей экстракции водой. Определен элементный и аминокислотный состав травы вики изменчивой, вики Гроссгейма и вики обрубленной. Аминокислотный анализ проведен и для этанольных извлечений. Установлен качественный состав 40 % этанольного извлечения вики обрубленной. Разработаны методики количественного определения диосмина и структурных аналогов диосмина в сырье и в сухом извлечении. Теоретически обосновано и экспериментально подтверждено гепатозащитное действие диосмина, суммарной фракции, содержащей диосмин; структурных аналогов диосмина и сухого извлечения, содержащего арабиноглюкозид и ксилоглюкозид диосметина.

Практическая значимость работы. Предложены модифицированные методы получения дносмина, основанные на экстракции сырья либо органическим растворителем, либо обработкой оксидом кальция.

Изучение биологической и фармакологической активности индивидуальных соединений и суммарных фракций, содержащих биозиды диосметина, позволило рекомендовать наиболее активные соединения для углубленных исследований.

Гепатозащитное действие структурных аналогов дносмина, а также сухого извлечения, с содержанием этих соединений более 4 %, по биохимическим показателям превосходит известный гепатопротектор «Карсил».

Совместно с кафедрой биохимии и микробиологии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава установлено, что гепатозащитная активность дносмина и его структурных аналогов, а также сухого извлечения из вики обрубленной, реализуется путем поддержания эффективности собственной антиоксидантной системы организма. Это осуществляется за счет восстановления активности таких ан-тиоксидантных ферментов как СОД и каталазы, а также НАДФН -СБН - зависимого звена, обеспечивающего работу глутатионпероксидазы.

Разработаны нормативные показатели на сырье вики изменчивой в качестве источника получения дносмина.

Внедрение результатов исследования в практику. Диосмин, его структурные аналоги и содержащие их сухое извлечение переданы на кафедры фармакологии и биохимии с курсом микробиологии ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава для углубленного изучения на системный кровоток, мозговое кровообращение и выяснения механизма их действия (акты внедрения от 05.05.05).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование предложенных модифицированных способов получения дносмина;

- результаты исследования свойств арабино- и ксилоглюкозидов диосметина;

- данные элементного и аминокислотного анализа;

- результаты исследования 40 % этанольного извлечения вики обрубленной;

- данные количественного определения диосмина и его структурных аналогов по разработанньш методикам;

- результаты исследования гепатозащитной активности полученных индивидуальных соединений и суммарных фракций;

- обоснование нормативных показателей на траву вики изменчивой.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ПятГФА, № гос. регистрации 01.960.009193 и соответствует проблеме «Фармация».

Апробация работы и публикации. Основные фрагменты диссертационной работы доложены на 56-й, 57-й, 58-й, 59-й и 60-й региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск 2001, 2002, 2003, 2004, 2005), а также изложены в материалх VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 2001).

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ (из них 5 статей в центральной печати).

Объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста. Состоит из четырех глав, иллюстрирована 21 таблицей, 25 рисунками. Список литературы включает 162 библиографических источников, из них 107 на русском языке, 55 на иностранных языках.

В первой главе (обзор литературы) приведены сведения, отражающие современное состояние исследований растений рода Вика и их применение в народной и традиционной медицине. Здесь же освещены современные направле пия по созданию лекарственных препаратов на основе флавоноидов.

Во второй главе излагаются результаты исследований по разработке модифицированного способа получения диосмина из сырья путем экстракции органическим растворителем, а также обработкой известковой водой. Приведены результаты собственных исследований по установлению качественного состава суммарных фракций, полученных из сырья вики изменчивой, вики Гроссгейма и вики обрубленной, а также представлены данные количественного определения структурных аналогов и суммы флавоноидов в сырье и в сухом извлечении вики обрубленной.

В третьей главе представлены результаты исследований гепатозащитного действия индивидуальных флавоноидов и их суммарных фракций из вики изменчивой, вики Гроссгейма и вики обрубленной. I

Материал четвертой главы отражает результаты исследования товароведческих показателей травы вики изменчивой как источника диосмина. Определены сроки годности сырья, а также представлены анатомические характеристики листа и стебля вики изменчивой.

В приложениях представлены результаты качественного хроматографиче-ского анализа фракций, полученных из сырья вики изменчивой, вики Гроссгейма и вики обрубленной; а также материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

Изучение анатомической характеристики стебля и листа вики изменчивой проведены совместно с доцентом Л.Е. Назаровой (кафедра физиологии, биологии и патологии ПятГФА), а гепатозащитного действия - с доцентом Е.Г. Дор-киной (кафедра биохимии и микробиологии ПятГФА), за что мы приносим глубокую благодарность.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Впервые в качестве источника получения диосмина - основного компонента многих венотонизирующих препаратов, предложено кормовое растение - вика изменчивая (Vicia variabilis), в котором содержание данного соединения составляет около 2 %, в траве вики Гроссгейма содержание данного биозида - около 1 %.

2. Из травы вики обрубленной (V. truncatula) выделены и идентифицированы два структурных аналога диосмина - арабиноглюкозид и ксилог-люкозид диосметина, содержание которых в сырье составляет более 1 %, а в сухом извлечении - более 4 %.

3. Предложены два метода выделения диосмина: с помощью диметил-сульфоксида и оксида кальция.

4. Изучен качественный и количественный аминокислотный состав исследуемых видов рода Vicia (Вика) и их этанольных извлечений, а также элементный состав травы вики изменчивой, вики обрубленной и вики Гроссгейма.

5. В 40 % этанольном извлечении вики обрубленной, помимо арабиног-люкозида и ксилоглюкозида диосметина и аминокислот, обнаружены аскорбиновая кислота, углеводы, которые до гидролиза представлены глюкозой и мальтозой, а после гидролиза - глюкозой, рамнозой, ксилозой, арабинозой, раффинозой и сорбозой; полиолы - инозитом, дульцитом и маннитом, которые присутствуют как в свободном, так и в связанном состоянии.

6. Осуществлен теоретический прогноз и экспериментально подтверждена гепатозащитная активность флавоноидов: диосмина и суммы - ара-биноглюкозида и ксилоглюкозида диосметина (условно названной флавицином).

7. Флавицин в дозе 100 мг/кг в условиях острого СС14-гепатоза оказывает значительно более выраженное гепатозащитное действие, чем диосмин и суммарная фракция, содержащая его, в той же дозе.

8. Флавицин и сухое извлечение, содержащее флавицин (более 4 %) в дозах 100 и 300 мг/кг проявляют более выраженное по-сравнению с препаратом сравнения «Карсилом» гепатозащитное действие в условиях СС14-гепатоза.

9. Установлены основные морфолого-анатомические диагностические признаки травы вики изменчивой, подтверждающие подлинность сырья и основные товароведческие показатели (влажность, зольность, содержание диосмина).

Заключение.

Из обзора литературы следует, что растения рода Вика могут быть использованы в качестве источников получения флавоноидов с целыо создания на их основе лекарственных препаратов. Многие виды этого рода широко распространены на территории России в частности на Северном Кавказе.

Растения образуют широкие заросли и характеризуются значительной биомассой надземных органов. Так, вика мышиная - высокоценное кормовое растение, введенное в ряде областей России в культуру и дающее, по данным Алтайской опытной станции, в год посева урожай до 60 ц/га. В травостое держится до 10 лет [22]. Если учесть высокое содержание флавоноидных соединений, то очевидна экономическая целесообразность использования растений данного рода.

В качестве объектов исследования нами выбраны вика изменчивая (V. variabilis Freyn et Sint.), вика Гроссгейма (V. Grossheimii Ervtim) и вика обрубленная (V. truncatula Fich. ex Bibl.). Вика изменчивая и вика Гроссгейма долгое время считались одним видом [95], затем - разновидностью полиморфной V. cracca L. [99,101], по последним данным - это два самостоятельных вида [102].

Вика изменчивая и вика Гроссгейма распространены повсеместно, а вика обрубленная - в горных и предгорных районах Северного Кавказа, но как кормовые растения в настоящее время они не используется.

Химический состав стих видов изучен недостаточно, но известно, что V. truncatula и V. variabilis содержат гликозиды диосметина, которые обладают ве-нотонизирующим действием [15]. Следует отметить, что в вике изменчивой присутствует рамноглюкозид диосметина, а в вике обрубленной арабиноглюко-зид и ксилоглюкозид того же флавона. В связи с этим были поставлены задачи:

1. Сравнить биологическую активность дигликозидов и выявить, таким образом, роль углеводного компонента;

2. Разработать рациональные методы выделения этих веществ;

3. С целью более полного использования сырья, исследовать данные виды на наличие других биологически активных соединений.

ГЛАВА 2. РАЗРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ И СУММАРНЫХ СУБСТАНЦИЙ ФЛАВОНОИДНОЙ ПРИРОДЫ ИЗ РАСТЕНИЙ РОДА ВИКА.

2.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1.1. Выделение диосмипа из травы вики изменчивой

Основным флавоноидом надземной части вики изменчивой является ди-осмин (С28Н32О15, Тпл 290-293 °С), представляющий собой 7-рутинозид диосме-тина. Характерной особенностью данного биозида является высокая прочность гликозидной связи. о-ск

ОН ОН ОН

Диосмин

Впервые диосмин из цветков вики изменчивой был получен экстракцией метанолом [91]. Позднее, с целью замены токсического растворителя для его получения была разработана методика, согласно которой измельченную траву обезжиривают хлороформом, затем обрабатывают водой. Высушенное обезжиренное сырье далее последовательно экстрагируют 96% этанолом и диметил-сульфоксидом (ДМСО). ДМСО-извлечение выливают в 10-кратный объем воды [29, 73] и выделяющийся кристаллический осадок отделяют спустя 24-48 ч.

Предложенные методы выделения диосмина имеют ряд существенных недостатков:

- первый способ предполагает использование токсического растворителя и не обеспечивает полноты выхода целевого продукта, поскольку основная биомасса растения остается не использованной;

- второй способ продолжителен во времени.

Наши аналитические исследования позволяют утверждать, что предварительная обработка сырья хлороформом и водой нецелесообразна, так как эти

25 операции практически не влияют на выход конечного продукта. В то же время обработка этанолом обязательна, поскольку она способствует избирательной экстракции ряда сопутствующих веществ, которые в отличие от диосмина, хорошо растворимы в данном растворителе. Данный подход позволил нам модифицировать методику выделения диосмина, что показано ниже (рис.1).

Рисунок 1 - Схема выделения диосмина

Предложенная схема выделения целевого продукта позволяет сократить число операций и, следовательно, продолжительность процесса, а также исключить применение токсического хлороформа.

В качестве сырья использовали траву вики изменчивой, собранную в фазу цветения и плодоношения на юго-западном склоне горы Машук (г. Пятигорск).

С целью снижения экономических затрат был разработан также метод получения диосмина путем обработки сырья оксидом кальция.

Известен способ получения флаванона — 7-рутинозида гесперитина из кожуры цитрусовых, основанный на обработке отжимов мандаринов уншиу сухим оксидом кальция с последующим разбавлением водой и осаждением целевого продукта из подкисленного раствора (рН=2,5) [68]. В данном случае имеет место переход флаванона в халкон, последний в виде комплекса с Са2+ растворим. При подкислении этого раствора халкон вновь переходит во флаванон (рис. 2):

ОН О

О О

Рисунок: 2- Равновесная система флаванон-ионизированный халкон

Диосмин отличается от гесперидина природой агликона, а именно, является флавоном. В этой связи представлялось целесообразным апробировать данную методику в отношении флавона, коим является диосметин - агликон диосмина.

Предварительно 10,0 г сырья смешивали (в соответствии с методикой [68]) с 1,0 г сухого оксида кальция, тщательно перемешивали и добавляли небольшими порциями 50 мл воды в течение 2 часов, и оставляли на 40 мин. После этого жидкую фазу отделяли прессованием, фильтровали и подкисляли

10%-ной хлороводородной кислотой до рН=4. Выделившийся осадок отделяли, 1 промывали водой до рН=7, сушили и переосаждали из смеси ДМСО - вода (выход 0,015 г). Вещество очищали кристаллизацией из водного ДМСО и идентифицировали на основании данных физико-химических методов анализа: температуры плавления, УФ-, ИК- и ПМР- спектроскопии, тонкослойной (ТСХ) и бумажной (БХ) хроматографии, пробы смешения.

Вещество представляет собой белые кристаллы, нерастворимые в воде, этаноле и хлороформе.

Агликон - бледно-желтые кристаллы, хорошо растворимые в спирте, не дающие депрессии температуры плавления с диосметином (температура плавления 259-261 °С).

Углеводный остаток представлен О-глюкозой и Ь-рамнозой.

Хроматографический анализ диосмина и его агликона - диосметина представлены в таблице 2, а их спектральные характеристики - в разделе 2.1.3.

С целью повышения выхода целевого продукта и создания оптимальных условий процесса нами использован метод математического планирования эксперимента.

Для получения объективных результатов и сокращения количества опытов наиболее подходящим является метод дисперсионного анализа рандомизированных экспериментов, позволяющий проводить сравнительную оценку степени одновременного влияния двух факторов на процесс экстрагирования диосмина: 1) количество оксида кальция; 2) время экстракции сырья с известковой водой [17]. Результаты эксперимента и дисперсионного анализа приведены в разд. 2.2.2.2.

Установлено, что при увеличении количества оксида кальция от 2,5 до 15 г повышается выход диосмина. При больших количествах СаО (>15 г) и (или) длительном настаивании (> 48 ч) наблюдается снижение выхода продукта, что может быть объяснено разрушением флавона в сильно щелочной среде. Оптимальным является соотношение сырья и оксида кальция 10 : 15, а время настаивания - 48 часов, о чем свидетельствуют представленные ниже графики (рис. 3 и 4):

-♦—2,5 г СаО -■—5 г СаО -а— 10 г СаО -е-15 г СаО

20

40 60

Время, часы

80

100

Рисунок 3 - Зависимость выхода диосмина от времени настаивания

Зависимость выхода диосмина от массы оксида кальция

0,09

0,08 я' О.О7 0,06 —■— 1 час

8 0,05 —•— 24 часа

5 0,04 / т -^—48 часов

5 0,03 - —♦— 96 часов

3 0,02 0,01 ——.

0 I - Г - I - I

0 5 10 15 20

Масса оксида кальция, грамм

Рисунок 4 - Зависимость выхода диосмина от массы оксида кальция

В дальнейшем выделение диосмина осуществляли по следующей схеме:

Рисунок 5 - Схема выделения диосмина с помощью оксида кальция

Для получения диосмина в качестве сырья была использована также трава вики Гроссгейма, широко распространенная на Северном Кавказе. Наличие в ней 7-рутинозида диосметина нами доказано впервые. Данный вид рекомендуется использовать как дополнительный источник выделения диосмина, так как его содержание ниже, чем в траве вики изменчивой.

2.1.2. Выделение арабино- и ксилоглюкозидов диосметина из травы внки обрубленной

Вика обрубленная содержит структурные аналоги диосмина, отличающиеся от последнего только природой углеводных компонентов: у одного из них биоза представлена глюкозой и арабинозой, а у другого - глюкозой и ксилозой. Следует отметить, что с агликоном в обоих случаях биоза связана через глюкозный остаток [3]. В отличие от диосмина оба биозида значительно лучше растворяются в водном этаноле.

Сырье собрано в период цветения — плодоношения на юго-западном склоне горы Машук и северо-восточном - горы Бештау (Пятигорск). Выделение суммы гликозидов проводили по раннее разработанной методике [90] с использованием силикагеля марки Ь 5/40 и 40/100 мкм.

Оба биозида имеют одинаковые или очень близкие значения на тонкослойных и бумажных хроматограммах, что создает значительные трудности в их разделении.

Используя препаративную тонкослойную хроматографию на силикагеле, удается получить лишь небольшие количества каждого из этих веществ, достаточные для идентификации.

Ксилоглюкозид диосметина (С27Н30О15) - игольчатые кристаллы с температурой плавления 242-244 °С (из водного этанола), растворимы при нагревании в водном ацетоне, 50 % этаноле, почти не растворимы в воде и 96 % этаноле.

О-СН,

7-[ - О -р - О - ксилопиранозил - (1 —»6) - О - р -Р - глюкопиранозид] диосметина

В результате кислотного гидролиза получен диосметин (С^Н^Об, Тпл 259 — 261 °С) с выходом 64 %, а также Б-ксилоза и О-глюкоза,

Арабиноглюкозид (С27Нзо015) - игольчатые кристаллы белого цвета, плохо растворимые в воде, 70 и 96 % этаноле, растворимые при нагревании в водном ацетоне. Температура плавления 268-273 °С (из водного этанола).

7-[-0-а -1- арабинопиранозил (1—^6) - О - р - О - глюкопиранозид] - диосметина

При кислотном гидролизе образуется агликон диосметин, с выходом 64 % и моносахариды: Ь-арабиноза и Э-глюкоза.

Хроматографический анализ арабино- и ксилоглюкозидов диосметина представлен в таблице 2, спектральные характеристики - в разделе 2.1.3.