Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химическое исследование цветков хризантемы корейской (Chrysanthemum x koreanum Makai) с целью получения фармологически активных суммарных фитокомплексов

На правах рукописи

КОДОНИДИ МАКСИМ ИВАНОВИЧ

Химическое исследование цветков хризантемы корейской (Chrysanthemum х koreanum Makai) с целью получения фармакологически активных суммарных фитокомплексов

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени 2 2 О KT 2069

ПЯТИГОРСК 2009

003480987

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Челомбитъко Вячеслав Александрович доктор фармацевтических наук, профессор Сампиев Абдулмуталип Магометович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова»

Защита состоится «18» ноября 2009 года в 9 часов

на заседании диссертационного совета Д.208.069.01. по защитам диссертаций при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава».

Автореферат разослан октября 2009 г

Ученый секретарь диссертационного совета

д.ф.н., профессор Е.В. Ком.тнцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из проблем медицинской науки является исследование влияния активных форм кислорода (АФК) на физиологические функции организма человека. Известно, что гиперпродукция АФК приводит к нарушению перекисного окисления липидов и, как следствие, к повреждению клеточных мембран. Это является причиной тяжелых функциональных расстройств, в частности: сердечнососудистые заболевания, атеросклероз; ишемия мозга, рассеянный склероз; токсический гепатит; острые и хронические воспалительные процессы; мутагенез, злокачественные опухоли и многие другие.

Такие явления могут быть устранены не только путем применения лекарственных веществ, но и добавлением к рациону биологически активных соединений. В 2004 году НИИ питания РАМН были проведены исследования ежедневного рациона питания и опубликованы рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ, утвержденные главным государственным санитарным врачом РФ - Г. Г. Онищенко. К числу таких веществ следует отнести флавоноиды. В качестве одного из альтернативных источников полифенольных соединений, в том числе флавонов (лютсолина, апигенина, акацетина, диосметина) или С-гликозидов (витексина, изовитексина, ориентина, изоориентина) предложено использовать цветки хризантемы садовой (Chrysanthemum morifolium).

Известно, что широкий спектр действия флавоноидов объясняется их избирательностью по отношению к активным формам кислорода (АФК): при гиперпродукции АФК они проявляют антиоксидантные свойства, а при низком уровне генерации АФК - прооксидантные. Удачное сочетание низкой токсичности с высокой фармакологической активностью делает их чрезвычайно перспективными для профилактики и лечения многих заболеваний.

Однако сырьевые источники флавоноидов, которые могут быть использованы как лекарственные вещества, ограничены. В то же время

известны растения, которые широко применяются в народной медицине. Например, в странах юго-восточной Азии растения рода Chrysanthemum используются в качестве средств, улучшающих коронарный кровоток; устраняющих симптомы вегетососудистой листании; снижающих артериальное давление; нормализующих обмен веществ; поддерживающих антитоксическую функцию печени; как успокаивающее и антиаллергическое средство.

Хризантема корейская широко культивируется в нашей стране как декоративное растение, но не используется в практических целях в качестве источника биологически активных соединений. Причиной этого является недостаточная изученность химического состава Chrysanthemum х koreanum Makai и отсутствие исследований фармакологического действия препаратов, выделенных из этого растения.

С этой точки зрения углубленное изучение химического состава, а также разработка доступных и легковоспроизводимых способов получения суммарных фракций из хризантемы в качестве перспективных источников для создания новых лечебно-профилактических средств является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы является исследование химического состава цветков хризантемы корейской и разработка рациональных путей получения из них суммарных фракций, обладающих биологической активностью.

Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

изучить качественный и количественный состав основных групп биологически активных соединений цветков Chrysanthemum х koreanum Makai.;

выявить наиболее активные в фармакологическом отношении фракции, изучить их химический состав и определить содержание в них антиоксидантов;

разработать препаративные способы выделения индивидуальных соединений из цветков хризантемы корейской;

осуществить фармакологический скрининг индивидуальных веществ и отдельных фракций, полученных из хризантемы.

Научная новизна. Методами химического и физико-химического анализа доказано наличие биологически активных веществ в цветках хризантемы корейской, которые представлены флавоноидами, каротиноидами, витаминами, кумаринами, производными коричной кислоты, аминокислотами и полисахаридами. С целью полной характеристики сырья -цветков хризантемы корейской - проведено количественное определение основных групп БАВ и установлено содержание флавоноидов, каротиноидов, свободных аминокислот, витаминов (Е, С и р-каротиноидов), а также макро-и микроэлементов.

Показано, что антпоксидантнос действие определяется комплексом БАВ и найдена суммарная антиоксиданткая активность б сухих экстрактах цветков хризантемы.

Изучен качественный и количественный состав фенольных соединений методом ВЭЖХ в экстракте цветков хризантемы корейской, полученном спиртом этиловым 40%.

Методом препаративной колоночной хроматографии из сухого экстракта цветков хризантемы корейской, получено 5 кристаллических веществ флавоноидной природы. Вещества, выделенные из фракций V и VI, на основании качественных реакций, хроматографического анализа, УФ-, ИК- и ПМР-спектроскопии идентифицированы как лютеолин и лютеолин-7-глюкозид.

Впервые изучены физико-химические свойства пектинового комплекса из цветков хризантемы.

Выявлены гипотензивная, антигипоксическая и актопротекторная активность лютеолин-7-глкжозида и суммарных фракций из хризантемы и впервые доказано их влияние на потенцирование желудочковой аритмии.

Практическая значимость работы. В результате химического и фармакологического исследования доказана возможность и перспективность использования цветков хризантемы корейской в качестве альтернативного сырья для получения БАВ и суммарных лекарственных средств.

Разработаны способы получения сухих экстрактов, полученных экстракцией сырья спиртом этиловым 70% и 40% концентрации, а также определена их фармакологическая активность.

Предложен препаративный способ выделения доминирующего флавоноида - лютеолин-7-глюкозида из цветков хризантемы, что может быть использовано для получения стандартного образца данного соединения.

Внедрение результатов в практику. По материалам диссертации составлено информационное письмо «Фармакотехнологическое исследование хризантемы корейской (Chrysanthemum * koreanum Makai)», которое передано в НИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований, а также на кафедры фармакогнозии I (ятигорской государственной фармацевтической академии и Курского государственного медицинского университета для включения полученных результатов в курс лекций. Наработанные сухие экстракты цветков хризантемы переданы ООО «МИП «Уником» для разработки экспериментальных серий фармакологических средств на их основе.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование использования цветков хризантемы корейской в качестве источника для получения биологически активных веществ;

- результаты качественного и количественного исследования химического состава цветков хризантемы корейской;

- препаративные методы получения отдельных фракций и результаты изучения их химического состава;

- способ выделения лютеолин-7-глюшзида;

- результаты предварительного фармакологического и биохимического исследования влияния лютеолин-7-глюкозида и полученных из хризантемы фракций.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических паук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской J ФА Росздрава (№06/1049).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы изложены на 62-й и 63-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009 гг.). По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 155 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы и 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 156 источников, в том числе 61 иностранный; содержит 38 таблиц, 47 рисунков и приложение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Для выбора объекта исследования нами проведено предварительное изучение цветков отдельных сортов хризантемы на содержание полифенольных соединений. С этой целью были отобраны цветки таких сортов, как «Янтарь», «Лебедушка», «Вечерние огни», «Первый снег», «Золотая осень», «Лето», «Юбилейная», «Светозар», «Лелия», «Мишель».

Установлено, что сорт «Золотая осень» отличается наибольшим количественным содержанием этих соединений, поэтому именно этот сорт мы сочли наиболее перспективным для проведения дальнейших химических исследований.

Определение основных групп биологически активных веществ в цветках хризантемы корейской

Отдельные порции (по 20,0 г каждая) воздушно-сухого сырья цветков хризантемы корейской сорта «Золотая осень» экстрагировали спиртом этиловым 96% и 40% концентрации, хлороформом, а также водой дистиллированной. Полученные извлечения упаривали до объема 20 мл и далее их анализировали на содержание БАВ.

Качественными реакциями установлено, что в хлороформной фракции присутствуют терпены, каротиноиды, токоферолы и стерины, а также в следовых количествах флавоноиды, кумарины и производные коричной кислоты. В извлечении, полученном спиртом этиловым 96%, обнаружены флавоноиды, кумарины, стерины, терпены, производные коричной кислоты. В водно-спиртовом извлечении помимо флавоноидов и производных коричной кислоты присутствуют кислота аскорбиновая, аминокислоты и углеводы.

Таблица 1 — Содержание биологически активных веществ в цветках хризантемы корейской

Элементный состав, % Аминокислотный состав, % Витаминный состав, мт/% Полисахаридный состав, %

преобладают в золе Калий-30 Магний - 10 Фосфор -10 Свободных аминокислот -2,52 Преобладающие: Аргинин - 0,9 Глутаминовая кислота -0,88 Фенилаланин - 0,51 р-каротин 19,77 витамин Е 0,10 витамин С 1,78 водорастворимые полисахариды 8,89 пектиновые вещества 17,79 гемицеллюлоза А 1,80 гемицеллюлоза Б 0,51

Количественное содержание суммы флавоноидов в сырье составляет (0,874±0,028)% в пересчете на рутин; а каротиноидов - (3,132 ± 0,0992) мг/% в пересчете на Р-каротин.

Нами также установлен элементный, аминокислотный, витаминный и полисахаридный состав цветков хризантемы корейской.

Количественное определение антиоксидаптоа

Исследование суммарного содержания антиоксидантов в различных экстрактах из цветков хризантемы проводили на анализаторе антиоксидантной активности «Цвет Яуза-01-АА», что представлено в таблице 2.

Таблица 2 - Концентрации суммы антиоксидантов в сухих экстрактах цветков хризантемы корейской

Сухой экстракт, полученный экстракцией Площадь пика (Бл нА/с) Суммарная концентрация антиоксидантов, в пересчете на квериетин мг/г Суммарная концетрация антиоксидантов, в пересчете на галловую кислоту мг/г

спиртом этиловым 96% 5045 88,1 ±1,0 57,3 ± 0,8

спиргом л иловым 70% 9588 172,4 ±2,2 113,6 ±1,2

спиртом этиловым 40% 9810 177,4 ±2,3 116,9 ± 1,3

водой 1678 27,7 ± 0,7 17,1 ±0,6

Максимальная концентрация антиоксидантов определена в экстракте хризантемы, полученном при применении в качестве экстрагента спирта этилового 40%.

Определение полифенольных соединений

В сухом экстракте, полученном 40% спиртом этиловым, выявлено наибольшее содержание антиоксидантов, поэтому методом ВЭЖХ мы исследовали полифенольный состав именно этого экстракта. Обнаружено 17 соединений, из которых идентифицированы 12 соединений, представленных флавоноидами (геснеридином, гиперозидом, рутином, виценином, кверцетином), фенолокислотами (хлорогеновой, неохлорогеновой, кофейной, цикоревой, феруловой и о-метоксикумаровой) и кумарином (о-метосикумарин).

Преобладающими компонентами являются хлорогеновая, феруловая и цикоревая кислоты, а также гесперидин.

Пять соединений данным методом не идентифицированы из-за отсутствия «стандартов», причем, судя по ВЭЖХ-хроматограммам, три вещества явно преобладают.

Количественное содержание гидроксикоричных кислот в экстракте в пересчете на хлорогеновую кислоту нами определено по методике, предложенной профессором Сампиевым A.M. с соавторами.

Количественное содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислот в извлечении из цветков хризантемы корейской, полученном спиртом этиловым 40%, нами установлено с учетом значений удельных показателей поглощения растворов СО рутина и хлорогеновой кислоты: флавоноидов -0,847±0,0187 % в пересчете на рутин; а гидроксикоричных кислот -9,547±0,2342 % в пересчете ка хлорогеновую кислоту.

Изолирование и идентификация полифенольных соединений

На предварительном этапе исследования было показано, что максимальной антиоксидантной активностью обладает экстракт, полученный при экстракции цветков хризантемы спиртом этиловым 40% концентрации. Это явилось обоснованием для более детального изучения химического состава данной фракции. С этой целью экстракт подвергнут дальнейшему фракционированию методом колоночной хроматографии. В качестве адсорбента применялся силикагель марки L 40/100. Элюентом служили различные растворители и их смеси, начиная с гексана и далее в порядке увеличения полярности. Контроль за процессом элюирования осуществляли методами тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" и восходящей бумажной хроматографии в различных системах растворителей. Подбор хроматографических систем проводили экспериментально. Основным критерием в выборе системы растворителей для ТСХ служили наибольшее число пятен веществ в элюатах и значения Rf каждого из них.

Всего нами было получено 730 фракций. Хроматографически идентичные фракции объединяли и упаривали в вакууме до небольшого объема, откуда при комнатной температуре и при стоянии выпадали осадки,

которые отделяли и очищали повторной перекристаллизацией. Индивидуальность полученных соединений проверяли как хроматографически в различных системах растворителей, так и определением температур плавления.

Представлялось целесообразным изучить наличие

негликозидированных производных флавона в цветках хризантемы корейской. В этой связи извлечения, полученные из отдельных порций сырья спиртом этиловым 70% и 40% концентрации, после упаривания и разбавления водой обрабатывали в делительной воронке диэтиловым эфиром. Хроматографический контроль показал, что состав эфирных фракций идентичен, поэтому их объединили и подвергли фракционированию методом препаративной колоночной хроматографии. Все технологические операции и методы контроля аналогичны таковым, использованным при колоночной хроматографии экстракта хризантемы, полученного 40% спиртом этиловым, с той лишь разницей, что на начальной стадии процесса элюирования использовали хлороформ, а не гексан.

Контроль процесса элюирования осуществляли методом ТСХ в экспериментально подобранных системах растворителей.

Хроматографически идентичные фракции объединяли и концентрировали упариванием в вакууме до небольшого объема. При комнатной температуре в некоторых концентрированных фракциях формировались осадки, которые мы отделяли и очищали методом перекристаллизации. Индивидуальность полученных соединений устанавливали хроматографически в различных системах растворителей и определением температур плавления.

Спиртовые растворы веществ, полученных из отдельных фракций (V, VI, I Эф, II Эф и III Эф), в условиях цианидиновой реакции приобретали оранжевую окраску, характерную для производных флавона.

Дальнейший анализ структуры индивидуальных флавоноидов проводили методом УФ-спектрофотометрии с ионизирующими и комплексообразующей добавками.

Данные УФ-спектрального анализа указывают, что все исследуемые соединения имеют свободную гидроксигруппу в положении С5 (батохромный сдвиг в присутствии спиртового раствора алюминия хлорида на 10 нм для коротковолновой полосы и на 50 нм для длинноволновой полосы). В спектрах веществ V, VI и Ш Эф не наблюдается батохромный сдвиг при добавлении свежесплавленного натрия ацетата, что указывает на отсутствие или замещение гидроксигруппы у атома С7. Однако при добавлении натрия ацетата к спиртовым растворам агликонов этих соединений, полученных в результате кислотного гидролиза, наблюдается батохромный сдвиг первой полосы на 7-12 нм, что свидетельствует о появилении свободной гидроксигруппы в положении С7.

У веществ II Эф, VI и аглнкона VI, в фенильном радикале присутствует орто-дигилроксигруппировка (батохромный сдвиг первой полосы на 20-30 нм при добавлении свежесплавленного ацетата, натрия и борной кислоты) и находится у атомов С3- и С4' (батохромный сдвиг первой полосы на 50-55 нм с уменьшением интенсивности при добавлении этилата натрия). В то же время соединения V, III Эф и их агликоны, а также вещество I Эф содержат свободную гидроксигруппу у атома С4 (отсутствие изменений спектра при добавлении натрия ацетата и кислоты борной; батохромный сдвиг первой полосы на 25-35 нм без снижения интенсивности при добавлении этилата натрия).

При щелочном сплавлении из вещества I Эф и агликонов веществ V и III Эф образуются флороглюцин и анисовая кислота, а из вещества II Эф и агликона VI - флороглюцин и протокатеховая кислота.

Результаты анализа соединений V, ШЭф и VI методом ЯМР-'Н-спектроскопии (таблица 3) доказывают их моногликозидное строение. Об этом свидетельствуют сигналы протонов углеводной части и сигнал одного ß-аномерного протона.

Вещества V и Ш Эф содержат метоксигруппу, что подтверждается наличием сигналов трех протонов метоксигруппы в положении С4 и

абсолютно симметричные сигналы протонов у атомов С2' и С6', а также С3- и С5.

Таблица 3 - ЯМР-Н -спектральные характеристики флавоноидов,

выделенных из хризантемы

Положение протонов в структуре молекулы Вещества, выделенные из фракций

V ОМБО-ск ЗООМНг ШЭф ОМЬО-сЦ ЗООМНг VI ОМвО-йб ЗООМНг [[ Эф ОМЯО-ёб ЗООМНг

Н-3 6,85 6,85 (ПЬ) 6,63 (1Н,5) 6,64(111,5)

И-6 6,47 (1Н, (3, 1=2) 6,47 (111, (1, 1-2) 6,52 (1Н,(Ц~2,2) 6.18(111,5)

Н-8 6,97 (1Н,а, Л=2) 6,97(1Н,си=2) 6,81 (1НД 1=2,2) 6,44 (1Н,5)

Н-2' 8,05 (2Н,ё>8,7) 8,05 (2Н,«и-"8,7) 7,40 (1НД .1=2,2) 7,40 (111,(1,1=2)

Н-3' 7,14 (2Н, А, .1=8,7) 7,14 (2НД .1=8,7)

Н-5' 7,14 (2Н, (1, Л=8,7) 7,14 (2НД 1=8,7) 6,90 (1Н,с!, ]=8,1) 6,90 (1Н, (1,-1=8,1)

Н-6' 8,05 (2Н, й, Л=8,7) 8,05 (2Н,(3,1-8,7) 7,42 (ШД]=8,1&2) 7,42 (1НМ^8,1 &2)

ОН-5 12.95 (111,5) 12,95 (Ш^) 12,97 (1Н,5) 12,95 (1Н,5)

ОСНз-4' 3.83 (ЗН, з) 3,83 (311, б)

Протоны СоХарНОИ части 1(1 1 тг 3,20-3,75 3,25-3,75

шюмесный 5,11 (1Н,<У=10) 5,10 (1НД1=10) 5,10 (1Н,сУ=10)

Таблица 4 - Физико-химические свойства флавоноидов, выделенных из

хризантемы

Вещество •С Яг на БХ ИК-спектр, ит„, см"'

БУВ 4:1:5 15% СНзСООН -ОН С=0 у- пирона ОС аром, ядра С-0 -ОСНз

V 182185 0,68 0,26 3294(ш) 1657(с) 1601(с) 1564(ср) 1495(с) 1445(с) 1246(с) 1176(с) 2928(сл)

III Эф 182185 0,69 0,39 3409(ш) 3082(сл) 1656(с) 1618(с) 1584(ср) 1499(ср) 1174(с) 2930(сл)

VI 253255 0,47 0,15 3209(ш) 1653(с) 1596(с) 1529(ср) 1494(с) 1441(ср) 1258(с) 1178(с)

И Эф 330331 0,78 3377(ш) 1651 (с) 1612(с) 1578(ср) 1511(с) 1440(ср) 1261(0 1167(с)

Таким образом, на основании данных определения температуры плавления, бумажной хроматографии, щелочного расщепления веществ, УФ-, ЯМР-'Н-, и ИК-спектроскопии следует сделать вывод, что вещества, выделенные из фракций V и III Эф, являются 7-О-моногликозидным производным акацетина (5,7-дигидрокси-4 -метоксифлавона); вещество, полученное из фракции I Эф, - акацетином (5,7-дигидрокси-4-метоксифлавоном); соединение, выделенное из фракции VI, - лютеолин-7-O-P-D-глюкопиранозидом (3',4',5 -тригидроксифлавон-7-0-Р-0-глюкозидом), а вещество из фракции II Эф - его агликоном - лютеолином (3',4',5,7-тетрагидроксифлавоном).

Исследование веществ не фенольной природы

Помимо флавоноидов, методом препаративной колоночной хроматографии из экстракта, полученного спиртом этиловым 40%, было выделено 3 индивидуальных соединения: I, IV и 1УФ.

Вещество I представляет собой белые игольчатые кристаллы с низкой температурой плавления (54-56°С). УФ-спектр данного вещества не отличается от спектра растворителя (хлороформа). Данные ЯМР-'Н-спектроскопии указывают на наличие десяти алифатических протонов (синглет в области 2,49 м.д., ЮН, СН (алифат.)) и отсутствие ароматических протонов. Методом ИК-спектроскопии доказано, что в структуре соединения I отсутствуют кратные связи и функциональные группы. Характеристические частоты 2956,1 см'1; 2916,1 см"1; 2847,9 см"1; 1462,3 см'1 свидетельствуют о наличии нескольких метальных групп (-СН?). Полоса при 1377,4 см"1 соответствует С - Н связи у третичного атома углерода, а наличие плеча при 719,4 см"1 указывает на множество групп -(СН2)„-.

Сопоставляя результаты физико-химического анализа, можно сделать вывод, что соединение 1 представляет собой алкан с разветвленной углеводородной цепью.

Вещества IV и 1УФ получены из фракции IV. Соединение IV выпадает в осадок при концентрировании соответствующей фракции, а соединение

1УФ - из фильтрата при стоянии при комнатной температуре после отделения вещества IV. Оба вещества очищали кристаллизацией из спирта этилового 96% при нагревании. Вещество IV представляет собой бледно-желто-зеленые кристаллы с температурой плавления 281-283°С; 1УФ - белый мелкокристаллический осадок, который плавится с разложением при ] 23-\25°С. В УФ-спектре обоих соединений присутствует один максимум поглощения при 212 нм. Отсутствие других полос поглощения позволяет предположить, что их молекулы не содержат ароматической системы.

В ЯМР-'Н спектре вещества IV наблюдаются мультиплетный сигнал в области 0,9 м.д., который относится к протонам метиленовых групп алилицикла; более слабопольный метальный сигнал (3,31 м.д.) можно отнести к метальной группе, связанной с карбонилом лактонного кольца; уширенный сигнал (3,87 м.д. синглет) соответствует протону ОН.

В ЯМР-'Н спектре соединения из фракции 1У-Ф также как и в ЯМР-'Н спектре вещества из фракции IV содержится мультиплетный сигнал в области 0,9 м.д. — протоны метиленовых групп алифатического цикла. Слабопольный сигнал (3,33 м.д.) относится к метильной группе, связанной с карбонилом лактонного кольца. Протону гидроксигруппы соответствует уширенный сигнал (3,9 м.д., синглет).

ИК-спектры кристаллических веществ IV и 1УФ имеет несколько характеристических полос поглощения и отличаются лишь их интенсивностью.

Широкая полоса поглощения при 3377,7 см"' указывает на присутствие в молекуле ассоциированных межмолекулярными водородными связями гидроксильных групп, а также на наличие поглощения деформационных колебаний О-Н связей. Полоса при 1380 см"1 также указывает на деформационные колебания связи О-Н, а высокоинтенсивная при 1042 см"' относится к валентным колебаниям С-О связей вторичных гидроксильных групп.

Высокоинтенсивная полоса поглощения при 2918 см"1 и менее интенсивная при 2851 см"' характеризуются симметрическими и ассимметрическими колебаниями С-Н связей метиленовых групп (-СН2-). Деформационные колебания метиленовых групп проявляются при 1460 см"1 и указывают на их алициклическую природу. Полоса при 1731 см"1 принадлежит валентным колебаниям С=0 связи, а полоса меньшей интенсивности при 1643см"1 соответствуют С=С связи, причем не сопряженной с карбонилом.

На основании данных спектрального анализа соединения, полученные из фракций IV и 1У-Ф, можно отнести к сесквитерпеновым лактонам, не содержащим сопряженных эндоциклических и экзоциклических связей.

Изучение пектинового комплекса

Пектин из цветков хризантемы корейской, полученный по общепринятой схеме Н.К. Кочеткова, представляет собой аморфный порошок светло-сиреневого цвета, медленно растворимый в холодной воде, легко растворимый в горячей воде и практически нерастворимый в органических растворителях.

После кислотного гидролиза хроматографическими методами установлено, что в состав пектинового комплекса входят галактоза и галактуроновая кислота.

Для изучения поверхностной активности пектина по отношению к воде использовались два мегода: сгапагмометрический и метод наибольшего давления, основанный на продавливании пузырька воздуха через калиброванный капилляр. Результаты эксперимента представлены на изотерме (рис. 1), откуда следует, что пектин не может быть отнесен к группе поверхностно-активных веществ, т.к. повышает поверхностное натяжение воды.

о-10',Н/м

¿0 !.................

20 : ....... ......................

10 -I.................................. ....................................-

0 0.125 0./5 0,5 О.В 1

С.'

— • — Стг/тгг-лс^огри*! -Метод'^^бс^'^^сге д^лемт;

Рисунок 1 - Изотерма поверхностного натяжения водных растворов пектина

Уровень поверхностного натяжения существенно зависит от температуры и времени приготовления растворов, т.к. при значениях концентраций 1% и более происходит желирование.

Определение молярной массы проводилось с помощью вискозиметра Оствальда. Рассчитывались относительная, удельная и приведенная вязкости. Характеристическая вязкость [т|] найдена исходя из графической зависимости приведенной вязкости от концентрации раствора (таблица 5).

Таблица 5 - Зависимость вязкости водных растворов пектина от

концентрации

Концентрация раствора С,% Время г, сех Лотн. %д. Лпр М Средняя молярная масса, г/моль

0 33,18 29093

0,0625 40,54 1,212 0,212 3,472 2,5

0,2 69 2,079 1,079 5,395

0,3 101 3,044 2,044 6,813

0,4 142 4,280 3,28 8,20

0,5 162 4,910 3,910 9,80

Средняя величина вычисленной молярной массы пектина составляет 29093 г/моль.

Изучалась кинетика и сорбционная емкость пектина in vitro. В качестве иона - комплексообразователя использован катион РЬ2\ чье токсическое действие на организм хорошо изучено. Имеет место линейная зависимость концентрации ионов свинца, сорбированных на поверхности пектина, от времени, что позволяет предположить I порядок реакции взаимодействия субстрата с ионами свинца.

Средняя величина константы скорости определена экспериментально и составляет 9,76 • 10° мин"1.

В течение 1 часа (продолжительность комплексообразования) максимальное извлечение ионии РЬ~ составиляет 30% от равновесной концентрации, что в пересчете на 1 г сорбента равно примерно 143 мг свинца.

Для изучения влияния температуры на сорбционные свойства пектина проводили замораживание модельных растворов (-18°С) и температурную обработку (100±1°С) в течение 60 минут. Проведенные исследования показали, что процент сорбционной способности пектина относительно его протекания при комнатной температуре уменьшился до 25,1% при термической обработке и практически сохранился при замораживании (28,9%).

Относительное сохранение сорбционных свойств пектина при консервировании холодом и термической обработке позволяет говорить о возможности его использования с лечебно-профилактической целью.

Фармакологические исследования лютеолин-7-глюкозида и фракций, полученных из цветков хризантемы корейской

Поскольку в извлечениях, полученных из цветков хризантемы, количественно преобладает лютеолин-7-глюкозид и его агликон - лютеолин, то для этих соединений осуществлен компьютерный прогноз (программа

DAQC'l nunnnrunwrnS

Это позволило получить информацию о высокой вероятности влияния лютеолин-7-глюкозида и лютеолина на сердечно-сосулистую систему (капилляроукрепляющее, кардиолротскторное, антиангинальное) и антирадикальных свойствах этих соединений (антиоксидантная, мембранозащитная, хемозащитная и противоопухолевая активность).

На основании данных прогноза мы сочли целесообразным провести скрининг-исследования кардиотропного действия лютеолин-7-глюкозида, а также фракций, полученных из хризантемы и проявивших максимальный антиоксидантный эффект в опытах in vitro.

При определении острой токсичности значение LD50 для экстракта, полученного 40% спиртом этиловым, составила 4850 мг/кг, что по классификации Сидорова К.К. соответствует классу IV «Малотоксичные».

Экстракт хризантемы и лютеолин-7-глюкозид достоверно снижают САД в течение 30 минут на 30-37%. К 60-й минуте этот результат сохранялся только на фоне лютеолин-7-глюкозида.

Действие исследуемых веществ на ритм сокращений миокарда изучали на модели хлоркапьциевой аритмии, а препаратом сравнения была выбрана настойка боярышника.

Основным показателем проявления антиаритмической активности служит продолжительность жизни крыс после введения 10% раствора кальция хлорида в дозе 2 мг/кг.

Исследования влияния лютеолин-7-глюкозида и экстракта цветков хризантемы, полученного спиртом этиловым 40%, на ритм сердечных сокращений на модели хлоркальциевой аритмии показали значительное снижение продолжительности жизни крыс.

Антигипоксическую активность выявляли путем моделирования гиперкапнической нормобарической гипоксии при помощи термокамеры. Результаты эксперимента свидетельствуют о положительном влиянии всех исследуемых веществ на продолжительность жизни мышей в условиях гипоксии (таблица 6).

Таблица 6 - Продолжительность жизни мышей при гиперкапнической гипоксии (п~-6)

Исследуемый объект, доза Продолжительность жизни, мин М ±ш Изменения относительно контроля, % Изменения относительно экстракга элеутерококка жидкого, %

Контроль (физ. раствор) 18,7 ± 1,12 - -

Лютсолин-7-гдюкозид, 10 мг/кг 21,5 ±0,96 +14,97 -2,27

Экстракт, полученный 40% спиртом этиловым, 100 мг/кг 22.0 ± 1,12 + 17,65* 0,00

Экстракт элеутерококка жидкий, 0,5 мл/кг 22.0 ± 0,36 + 17,65* -

* - достоверно по отношению к контролю (Р<0,0э)

* - достоверно по отношению к экстракту элеутерококка жидкому (Р<0,05)

Изучение актопротекторной активности показало, что всс исследуемые объекты повышают физическую выносливость мышей, причем лютеолин-7-глюкозидядостоверно увеличивает этот показатель на 149% в сравнении с контролем. Относительно действия экстракта элеутерококка экстракт хризантемы в меньшей степени увеличивает выносливость мышей, а лютеолин-7-глюкозид - в большей степени (на 26%), но недостоверно.

Таблица 7 - Актопротекторное действие лютеотш-7-глюкозида и фракций, полученных аз хризантемы (п=б)

Исследуемый объект, доза Среднее время двигательной активности, сек М±т Изменение по отношению к контролю, % Изменение по отношению к экстракту элеутерококка. %

Контроль (фгп.раствор) 115,5 ±10,6 _ _

Экстракт элеутерококка жидкий, 0,016 мл/кг 229,5 ± 39,5 + 98,7* -

Экстракт хризантемы, полученный 40% спиртом, 100 мг/кг 128,5 ± 2,9 + 11,3 - 44,0*

Лютеолин-7-глюкознд, 10 мг/кг 288,25 ± 18.7 + 149,6* + 26,0

* - достоверно по отношению к контролю (Р<0,05) " - достоверно по отношению к экстракту элеутерококка жидкому (Р<0,05)

Результаты фармакологического скрининга позволяют утверждать о наличии адаптогснной активности, наиболее выраженной у лютеолин-7-О-р-О-глкжопиранозида и экстракта, полученного спиртом этиловым 40% концентрации.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Определены качественные характеристики биологически активных веществ цветков хризантемы корейской, которые представлены флавоноидами, каротиноидами, витаминами, кумаринами, производными коричной кислоты, аминокислотами и полисахаридами.

2. Количественный анализ основных групп БАВ показан, что содержание флавоноидов составляет 0,87%; свободных аминокислот - 2,52%; витамины Е, С и провитамин А, содержатся в количестве 0,10 мг/'%, 1,78 мг/% и 19,77 мг/% соответственно.

Полисахариды цветков хризантемы представлены водорастворимой фракцией (8,89%), пектиновыми веществами (17,79%), гемицеллюлозой А (1,80%) и гемицеллюлозой Б (0,51%). Среди микроэлементов количественно преобладают калий, магний и фосфор.

3. Суммарное содержание антиоксидантов в сухих экстрактах цветков хризантемы составляет: в экстракте, полученном 95 % этанолом -57,3 мг/г; 70 % этанолом - 113,6 мг/г; 40 % этанолом - 116,9 мг/г; водой - 17,1 мг/г).

4. В экстракте цветков хризантемы корейской, полученном 40 % спиртом этиловым, методом ВЭЖХ определен качественный состав фенольных соединений, который представлен флавоноидами (гесперидином, гиперозидом, рутином, виценином, кверцетином), фенолокислотами (хлорогеновой, неохлорогеновой, кофейной, цикоревой, феруловой и о-метоксикумаровой), кумарином (о-метосикумарин). Преобладающими

компонентами являются хлорогеновая, феруловая и цикореаая кислоты, а также гесперидин.

Впервые в изучаемом виде установлено наличие неохлорогеновой и о-метоксикумаровой кислот, виценина и о-метоксикумарина.

5. Методом препаративной колоночной хроматографии из сухого экстракта, полученного с применением спирта этилового 40%, выделены и идентифицированы лютеолин, лютеолин-7-О-глкжозид и 7-гликозид акацетина.

6. Из цветков хризантемы корейской выделен пектиновый комплекс и изучены его физико-химические свойства: определена средняя молекулярная масса (29093 г/моль); поверхностная активность (повышает поверхностное натяжение воды); кинетика и сорбционная емкость в отношении ионов свинца (143 мг-РЬ2+/г пектина).

7. Использование компьютерной прогностической программы PASS позволило получить информацию с высоким процентом вероятности (до 90%) о положительном влиянии лютеолин-7-глюкозида и его агликона - лютеолина на сердечно-сосудистую и нервную систему, что в дальнейшем было подтверждено экспериментально:

доказана гипотензивная, антигипоксическая и актопротекгорная активность лютеолин-7-глюкозида и суммарных фракции из хризантемы; доказано также потенцирование хлоркальциевой желудочковой аритмии исследуемыми веществами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изучение элементного и аминокислотного состава побегов вишни обыкновенной и соцветий хризантемы корейской / Известия Самарского науч. центра РАН. Спец. вып. «XII конгр. Экология и здоровье человека». - 2007. - Т.2. - С. 159-162. (Соавт. A.A. Волкова, Э.Т. Оганесян, O.A. Андреева)

2. Изучение химического состава цветков хризантемы садовой / Свег знаний - во имя здоровья человека: материалы 60 юбил. науч. студ.

конф. Пятигорской гос. фармац. акад./ Пятигорск. ГФА. - Пятигорск, 2007. - Вып. 60. - С. 32-34. (Соавт. Я.Я. Янковская).

3. Изучение физико-химических свойств пектина из соцветий хризантемы индийской (Chrysanthemum indici) / Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. - Пятигорск, 2008. - Вып.63. - С. 271-272. (Соавт. Я.Я. Янковская, О.А. Андреева, Л.П. Мыкоц, Н.А. Туховская)

4. Целенаправленный поиск веществ с заданными фармакологическими свойствами / Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - №2. - С. 37-40. (Соавт. Э.Т. Оганесян, И.П. Кодониди, Л.П. Смирнова, С.Х. Муцуева, B.C. Агаджанян, Д.С. Золотых)

5. Изучение качественного состава фенольных соединений хризантемы корейской (Chrysanthemum koreanum Makai) методом ВЭЖХ/ Курский науч.-практ. вестник «Человек и его здоровье». — Курск, 2008. — №!. — С. 120-122. (Соавт. Э.Т. Оганесян, О.А. Андреева).

6. Выделение гликозида лютеолина из соцветий хризантемы корейской (Chrysanthemum koreanum Makai) / Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр./ Пятигорск. ГФА. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 63-64. (Соавт. О.А. Андреева, Э.Т. Оганесян).

7. Количественное определение суммы флавоноидов соцветий хризантемы корейской методом дифференциальной спектрофотометрии / Человек и лекарство. Краснодар - 2008: тез. докл. конгресса 16-18 окт. 2008 г. - Краснодар: КГМУ, 2008. - С. 44 - 45. (Соавт. Э.Т. Оганесян, О.А. Андреева).

КОДОНИДИ МАКСИМ ИВАНОВИЧ

Химическое исследование цветков хризантемы корейской

(Chrysanthemum х koreanum Makai) с целью получения фармакологически активных суммарных фитокомплексов

15,00,02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « ^ » &&^4^x2009 г., формат 60 х 84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № -(йСЦ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» (357532. г Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Актуальность проблемы. Одной из проблем медицинской науки является исследование влияния активных форм кислорода (АФК) на физиологические функции организма человека. Известно, что гиперпродукция АФК приводит к нарушению перекисного окисления липидов и, как следствие, к повреждению клеточных мембран. Это является причиной тяжелых функциональных расстройств, в частности: сердечнососудистые заболевания, атеросклероз; ишемия мозга, рассеянный склероз; токсический гепатит; острые и хронические воспалительные процессы; мутагенез, злокачественные опухоли и многие другие.

Такие явления могут быть устранены не только путем применения лекарственных веществ, но и добавлением к рациону биологически активных соединений. В 2004 году НИИ питания РАМН были проведены исследования ежедневного рациона питания и опубликованы рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ, утвержденные главным государственным санитарным врачом РФ — Г. Г. Онищенко. К числу таких веществ следует отнести флавоноиды. В качестве одного из альтернативных источников полифенольных соединений, в том числе флавонов (лютеолина, апигенина, акацетина, диосметина) или С-гликозидов (витексина, изовитексина, ориентина, изоориентина) предложено использовать цветки хризантемы садовой (Chrysanthemum morifolium) [71].

Известно, что широкий спектр действия флавоноидов объясняется их избирательностью по отношению к активным формам кислорода (АФК): при гиперпродукции АФК они проявляют антиоксидантные свойства, а при низком уровне генерации АФК - прооксидантные. Удачное сочетание низкой токсичности с высокой фармакологической активностью делает их чрезвычайно перспективными для профилактики и лечения многих заболеваний.

Однако сырьевые источники флавоноидов, которые могут быть использованы как лекарственные вещества, ограничены. В то же время известны растения, которые широко применяются в народной медицине. 5

Например, в странах юго-восточной Азии растения рода Chrysanthemum используются в качестве средств, улучшающих коронарный кровоток; устраняющих симптомы вегетососудистой дистонии; снижающих артериальное давление; нормализующих обмен веществ; поддерживающих антитоксическую функцию печени; как успокаивающее и антиаллергическое средство.

Хризантема корейская широко культивируется в нашей стране как декоративное растение, но не используется в практических целях в качестве источника биологически активных соединений. Причиной этого является недостаточная изученность химического состава Chrysanthemum х koreanum Makai и отсутствие исследований фармакологического действия препаратов, выделенных из этого растения.

С этой точки зрения углубленное изучение химического состава, а также разработка доступных и легковоспроизводимых способов получения суммарных фракций из хризантемы в качестве перспективных источников для создания новых лечебно-профилактических средств является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследование химического состава цветков хризантемы корейской и разработка рациональных путей получения из них суммарных фракций, обладающих биологической активностью.

Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач: изучить качественный и количественный состав основных групп биологически активных соединений цветков Chrysanthemum х koreanum Makai.; выявить наиболее активные в фармакологическом отношении фракции, изучить их химический состав и определить содержание в них антиоксидантов;

- разработать препаративные способы выделения индивидуальных соединений из цветков хризантемы корейской; осуществить фармакологический скрининг индивидуальных веществ и отдельных фракций, полученных из хризантемы.

Научная новизна. Методами химического и физико-химического анализа доказано наличие биологически активных веществ в цветках хризантемы корейской, которые представлены флавоноидами, каротиноидами, витаминами, кумаринами, производными коричной кислоты, аминокислотами и полисахаридами. С целью полной характеристики сырья — цветков хризантемы корейской — проведено количественное определение основных групп БАВ и установлено содержание флавоноидов, каротиноидов, свободных аминокислот, витаминов (Е, С и Р-каротиноидов), а также макро-и микроэлементов.

Показано, что антиоксидантное действие определяется комплексом БАВ и найдена суммарная антиоксидантная активность в сухих экстрактах цветков хризантемы.

Изучен качественный и количественный состав фенольных соединений методом ВЭЖХ в экстракте цветков хризантемы корейской, полученном спиртом этиловым 40%.

Методом препаративной колоночной хроматографии из сухого экстракта цветков хризантемы корейской, получено 5 кристаллических веществ флавоноидной природы. Вещества, выделенные из фракций V и VI, на основании качественных реакций, хроматографического анализа, УФ-, ИК- и ПМР-спектроскопии идентифицированы как лютеолин и лютеолин-7-глюкозид.

Впервые изучены физико-химйческие свойства пектинового комплекса из цветков хризантемы.

Выявлены гипотензивная, антигипоксическая и актопротекторная активность лютеолин-7-глюкозида и суммарных фракций из хризантемы и впервые доказано их влияние на потенцирование желудочковой аритмии.

Практическая значимость работы. В результате химического и фармакологического исследования доказана возможность и перспективность использования цветков хризантемы корейской в качестве альтернативного сырья для получения БАВ и суммарных лекарственных средств.

Разработаны способы получения сухих экстрактов, полученных экстракцией сырья спиртом этиловым 70% и 40% концентрации, а также определена их фармакологическая активность.

Предложен препаративный способ выделения доминирующего флавоноида — лютеолин-7-глюкозида из цветков хризантемы, что может быть использовано для получения стандартного образца данного соединения.

Внедрение результатов в практику. По материалам диссертации составлено информационное письмо «Фармакотехнологическое исследование хризантемы корейской (Chrysanthemum х koreanum Makai)», которое передано в ПИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований, а также на кафедры фармакогнозии Пятигорской государственной фармацевтической академии и Курского государственного медицинского университета для включения полученных результатов в курс лекций. Наработанные сухие экстракты цветков хризантемы переданы ООО «МИП «Уником» для разработки экспериментальных серий фармакологических средств на их основе.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование использования цветков хризантемы корейской в качестве источника для получения биологически активных веществ;

- результаты качественного и количественного исследования химического состава цветков хризантемы корейской;

- препаративные методы получения отдельных фракций и результаты изучения их химического состава;

- способ выделения лютеолин-7-глюкозида;

- результаты предварительного фармакологического и биохимического исследования влияния лютеолин-7-глюкозида и полученных из хризантемы фракций.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно8 исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№06/1049).

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы изложены на 62-й и 63-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009 гг.). По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 141 странице текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы и 3 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 154 источника, в том числе 60 иностранных; содержит 41 таблицу, 38 рисунков и приложения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Определены качественные характеристики биологически активных веществ цветков хризантемы корейской, которые представлены флавоноидами, каротиноидами, витаминами, кумаринами, производными коричной кислоты, аминокислотами и полисахаридами.

2. Количественный анализ основных групп БАВ показал, что содержание флавоноидов составляет 0,87%; свободных аминокислот — 2,52%; витамины Е, С и провитамин А, содержатся в количестве 0,10 мг/%, 1,78 мг/% и 19,77 мг/% соответственно.

Полисахариды цветков хризантемы представлены водорастворимой фракцией (8,89%), пектиновыми веществами (17,79%), гемицеллюлозой А (1,80%) и гемицеллюлозой Б (0,51%). Среди микроэлементов количественно преобладают калий, магний и фосфор.

3. Суммарное содержание антиоксидантов в сухих экстрактах цветков хризантемы составляет: в экстракте, полученном 95 % этанолом — 57,3 мг/г; 70 % этанолом - 113,6 мг/г; 40 % этанолом - 116,9 мг/г; водой - 17,1 мг/г).

4. В экстракте цветков хризантемы корейской, полученном 40 % спиртом этиловым, методом ВЭЖХ определен качественный состав фенольных соединений, который представлен флавоноидами (гесперидином, гиперозидом, рутином, виценином, кверцетином), фенолокислотами (хлорогеновой, неохлорогеновой, кофейной, цикоревой, феруловой и о-метоксикумаровой), кумарином (о-метосикумарин). Преобладающими компонентами являются хлорогеновая, феруловая и цикоревая кислоты, а также гесперидин.

Впервые в изучаемом виде установлено наличие неохлорогеновой и о-метоксикумаровой кислот, виценина и о-метоксикумарина.

5. Методом препаративной колоночной хроматографии из сухого экстракта, полученного с применением спирта этилового 40%, выделены и идентифицированы лютеолин, лютеолин-7-О-глюкозид и 7-гликозид акацетина.

6. Из цветков хризантемы корейской выделен пектиновый комплекс и изучены его физико-химические свойства: определена средняя молекулярная масса (29093 г/моль); поверхностная активность (повышает поверхностное натяжение воды); кинетика и сорбционная л I емкость в отношении ионов свинца (143 мг-Pb /г пектина).

7. Использование компьютерной прогностической программы PASS позволило получить информацию с высоким процентом вероятности (до 90%) о положительном влиянии лютеолин-7-глюкозида и его агликона — лютеолина на сердечно-сосудистую и нервную систему, что в дальнейшем было подтверждено экспериментально: доказана гипотензивная, антигипоксическая и актопротекторная активность лютеолин-7-глюкозида и суммарных фракций из хризантемы; доказано также потенцирование хлоркальциевой желудочковой аритмии исследуемыми веществами.