Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое изучение растений рода ландыш и возможности комплексного использования его сырья

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР

Всесоюзный научно-исследовательский институт химии и технологии лекарственных средств

На правах рукописи

ВИННИК Елена Владимировна

уда 615.322:582.572.2 + [615.224 + 615.244] : 661.12.02/.09

ФОТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ РОДА. ЛАНДШ И ВОЗМОЖНОСТИ КОМПЛЕКСНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЕГО СЫРЬЯ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Харьков 1991

Работа выполнена на кафедре заводской технологии лекарств Харьковского государственного фармацевтического института.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Комиссаренко Н.Ф.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук

Батюк В,С.

доктор фармацевтических наук, профессор Сербии А.Г.

Ведущая организация - Московская академия им.И.М.Сеченова

Защита диссертации состоится "27" декабря 1991 г. в 12.00 часов на заседании специализированного совета Д.098.06.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте химии и технологии лекарственных средств (310085, г. Харьков, ул. Астрономическая, S3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИХТЛС.

Автореферат разослан "_26" ноября 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета Д.098.06.01 доктор фармацевтических наук

/

! ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В последние десятилетия наблвдается эвтйш^ереса научной и традиционной медицины к растениям как источнику сырья для производства лекарственных средств.

Непрерывно возрастает потребность здравоохранения к хими-о-фармацевтической промышленности в лекарственном раститель •ом сырье для увеличения выпуска существующих, создания и внед-ения новых препаратов.

Первое направление в решении этой проблемы связано с изыс-анием новых сырьевых источников или введением их в культуру с елью удовлетворения потребностей промышленности в лекарствен-ом растительном сырье. Второе направление - комплексное ис -ользование лекарственного сырья, в первую очередь, сопутст -ующих биологически активных веществ. Создание препаратов, ор-анизадия их выпуска и комплексная переработка сырья - задачи ¡олылой актуальности как для медицинской промышленности, так и Р1Я здравоохранения.

К важнейшим лекарственным растениям принадлежит род лан -(ыш, включающий три вида: ландаш майский, ландыш Кейске и лан-¡ыш закавказский, которые относятся к фармакопейному сырью.

В настоящее время из травы и листьев ландыша майского и шндцша кейске выпускается настойка и экстракт ландыша', кото -эые входят в. ряд комплексных препаратов и кардаотоническое ¡редсуво коргликон. Из ландыша Кейске на основе фенолышх ве -?есгв производится препарат для лечения заболеваний печени. гчитывая дефицит сырья для производства коргликона и конвафла-зина, возникла необходимость не только в поисках богатых место-1роизростаний ландыша, но также в разработке комплексной его гереработки и в создании совмещенной схемы производства коргли-<она и конвафлавина. Это позволит рационально использовать денное растительное сырье.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение основных групп биологически активных веществ и выяснение возможности комплексного использования ландыша майского и ландыша Кейске при совмещенном технологическом процессе 'Производства коргликона и конвафлавина.

Для достижения намеченной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести сравнительное изучение основных групп биоло -гически активных веществ в различных органах ландыша майского и ландыша Кейске;

- выделить обнаруженные действующие вещества из исследуемых видов ландыша, используя метода фракционирования с помощы несмешиващихся жидкостей, колоночной хроматографии на различных сорбентах;

- изучить химические свойства и провести структурный анализ выделенных биологически активных веществ даш установления их строения;

- изучить возможность совмещенного технологического про -цесса производства конвафлавина и коргликона, определить ра -циональность использования сорбентов, применяемых в производс! ве.

Научная новизна настоящей работы заключается в следующем:

- впервые проведено выделение из цветков ландыша Кейске и. ландыша майского карденолидов и флавоноидов, как основных груп биологически активных веществ;

- выделен полисахаридный комплекс из цветков ландыша майе кого ж ландыша Кейске, который охарактеризован по моносахарид-ному составу и содержанию полисахаридов, восстановленных и кис лнх Сахарову

- установлен основной карденолидный состав корневищ ланда ша майского;

- впервые выделены и идентифицированы из цветков ландыша майского: биоробин, биокверцетин, изобиоробин и изобиокверце -тин; а из цветков ландыша Кейске биоробин, биокверцетин и кейозид; установлена структура двух новых фдавоноидных биози -дов - изобиоробина и изобиокверцетина;

- сравнительные химические и технологические исследования показали, возможность комплексного использования травы и листье ландыша майского и ландыша Кейске дая получения конвафлавина и коргликона по совмещенной схеме.

Практическая ценность. Данные о химическом составе исследуемых растений использованы при разработке совмещенной технологии получения коргликона и конвафлавина.

Определена возможность многократного использования сорбен га в производстве конвафлавина, что позволило снизить затраты на производство I килограмма готового продукта на 939 рублей.

За период I988-I99I года экономический эффект составил по Опытному заводу ВНШХТЛС 186,9 тыс. рублей.

Ожидаемый экономический эффект от предложенной совмещенной технологии получения коргликона и конвафлавина составит (в ценах 1991 года) 100 тыс. рублей в год.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на Второй республиканской конференции по медицинской бога -нике (Киев, 1988); на Всесоюзной конференции по новым лекарственным препаратам Сибири и Дальнего Востока (Томск, 1989); на Всесоюзной конференции по результатам и перспективам научных исследований по биотехнологии и фармации (Ленинград, 1989); на третьем съезде фармацевтов Туркменской ССР (Ашхабад, 1989).

Публикации. Материалы диссертации отражены в 4 научных статьях и положительном решении о выдаче авторского свидетельства й 4919547/14 от 18.03.91 г.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевти -ческих наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Харьковского фармацевтического института (шифр теш ВН 10.06.0015.86, № государст -венной регистрации 0I860042I4I) и ВНШХТЛС (поисковая тематика Jí 0461014260).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, че -тырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 20 таблицами, 5 схемами, Библиографический указатель включает 150 источников, из них 20 иностранных.

В первой главе дан обзор литературы, отражающий ботани -ческую характеристику, химический состав, медицинское использование растений рода Ландыш. Приведены сведения о- комплексном использовании растительного сырья в фотохимических производствах.

Во второй и третьей главах описаны предварительные исследования химического состава, методы выделения, химического изучения соединений, полученных из ландыша майского и "ландыша Кейске.

Четвертая глава посвящена описанию результатов исследований комплексного использования травы и листьев ландыша в про -изводстве коргликона и конвафлавина.

СОДЕРЖАНИЕ РАКШ

Сырьевые источники получения биологически активных соединений

Объектом исследования служили различные органы ландыша майского Страва, корневища и корни) и ландыша Кейске (листья, цветки). —

С помощью различных качественных реакций в растениях рода Ландыш обнаружены карденолиды, производные кумарина, окси-коричные кислоты, флавоноиды, углевода, хелидоновая кислота.

Для выделения обнаруженных веществ использовалась хроматография на колонках полиамида, окиси алюминия, сшшкагеля с применением в качестве элюентов различных растворителей (вода, спирты, водно-спиртовые смеси, хлороформ, хлороформно-спирто-вые смеси).

При установлении структуры веществ использовались хими -ческие метода; кислотный и щелочной гидролизы, щелочная и йодисто-водородная деструкции, ацегилирование, метилирование, дезметилирование и другие; физико-инструментальные: УФ-, ИК-спектроскопия; биохимические - ферментный гидролиз. Количественное определение фяавоноидов проводилось хроматоспектрофо -тометрическим методом.

Из исследованных растений было выделено 25 соединений (табл. I), из них II флавоноидов, 8 карденолидов, 3 оксикорич-ные кислоты (табл. I), 2 производных кумарина (табл. I) и хелидоновая кислота (табл. I).

Химическое изучение веществ, выделенных из растений рода Ландыш

Флавоноиды

Выделенные нами флавоноидные соединения (1.01-1.11) относятся к флавонолам (табл. I). Они представлены тремя агликона-ми: кверцетином (1.01), изорамнегином (1.06), кешферолом (1.08) и 8 их гликозидами: гиперозидом (1.02), кверцимеритри -ном (1.03), биокверцетижш (1.04), изобиокверцетином (1.05); кейозидом (1.07), трифолином (1.09), бноробином (1.10), изобио-робином (1.11).

Их флавоноидная природа подтверждена цианидиновой реак -цией, характерными полосами поглощения в ИК (3400, 3030, 2900,

Таблица I

Физико-химические свойства выделенных веществ из ландыша майского и

ландыша Кейске

щ тип ! Вещество и его структурная , характеристика '! Брутто-, формула |т.пл. °С [оС]0 Источники получения

1 ! 2 ! а ! 4 ! Ь ! 6

Груша кверцетина

1.01. Кверцетин; 3,5,7,3*,4'-пента- СтсНтп07 309-311 - Тр.л.м..цв.л.м..тр.л.К. оксифлавон • А и

1.02. Гшерозид; 5,7,3',4'-тетраок- С2тН2о012 244-247 -58°(эт.) Тр.л.м. .цв.л.м. .тр.л.К. си-ЗХО--р -глюкопиранозил

флаврн 1

1.03. Кверцимеритрин; 3,5,3',4'-тет- С9ТН?П0Т? 248-250 -59°(эт.) Тр.л.м. .цв.л.м.,цв.л.К. раокси-7-(0-^ -о -глюкопиранозил флавон)

1.04. Биокверпетин; 5,7,3' ,4'-тетра- Со^НпоОт/. 200-204 -26°(мет) Тр.л.м. .цв.л.м. .цв.л.м. окси-3-(0-,й-робинобиозил фла- 00 АО

вон)

{.05. Изобиокверцетин; 5,7,3',4'- С27Н30°16 228~232 -134°(мет) Цв.л.м._, тр.л.м.

тетраокси-3-(0-р-о -галакто пиранозо (2 15-0—оС-Л -рам-нопиранозил)флавон

Группа изорамнетина

1.06. Изорамнетин; 3,5,7,4'-тетра- СТ(,НТ?07 317-319 - Тр.л.К. окси-З'-метокси флавон 10

1.07. Кейозид; 5,7,4'-триокси-3-ме- СооНозОтг ,183-186 -24,4°(мет) Тр.л.К., цв.л.К. токси-3-(0-й-робинобиозил)

флавон

I-г

г

Б-ТТ

Группа кемпферола

1.08. Кемпферол; 3,5,7,4'-тетраокси- СТгНоаОж 275-278 флакон

1.09. Трифолин; 5,7,4'-триокси-3- С21Н20°тт 224-228

—О -галактопиранозил)

флавон

1.10. Биоробин; 5,7,4'-триокси-3- С27Н30°Т^ 221-223 \Q-fi -робинобиозилОфлавон

1.11. Изобиоробин; 5,7,4'-триокси- С97%о°т^ 192-196 -3-(0-/ -л -галактопиранозил)

\2~*-1)-0-Л-Ь -рамнопирано-зил)флавон

Органические кислоты

1.12. Хелидоновая кислота С7ЬЬ0к 273-275 2,6-дикарбокси- ^-пирон

Группа строфантидина

1.13. Дезглюкохейротоксин; 3 - ОзоН/рО™ 188-189 \Q-J~ - /< -гулоглетилозопира- " чл ±и нозил)-5,14 й-дигидрокси-

19-оксо-о й-кард-20122)-енолвд

1.14. Конваллатоксин-3^-(0-/-- С9оНдрОтп 218-220 /< -рамнопиранозил-5Д4й - ^ хи дигидрокси-5.^ -кард-20(22)-

Продолжение таблицы I ! Ь ! ......й

Тр.л.м. -51°(эт.) Тр.л.м.

-72°(мет) Тр.л.К., цв.л.К. -125°(мет) Тр.л.м.,, цв.л.м.

Тр.л.м., тр.л.К.

(метУ

Цв., тр.л.К., тр. с.л.м.

0±2(мет) Цв., тр.л.К., цв. с., К.Л.М.'

" 1 Г ' 'г ! а I ~2.

1.15. Крнваллозид-Зб-[.0-5(.-/<-рашо-СосНсрОтг 1Э9-202 -10,4 Цв., тр.л.К., тр. с.К., пиранозил-(4 -£-1)-0-.Д -£>-глю~ л * кОпиранозил] 5,14.0 -дагидрокси-19-оксо-5р -кард-20(22)-енолид

1.16. Неоконваллозид; ЗйГО-^-й -рам- Сг,сНс90Тс 162-170 нопиранозо-(2 —Г)-0-/-^-глю- 010 ^ копиранозил] -5,14^ -дигидрокси-,

. 19-оксо-5_£ -кард-20(22)-енолид

(80 % эт) л.м! -Н,5(мет) Тр.л.К., с.л.м.

Группа строфантидола

Цв., тр.л.К., цв.,?р., с., к.л.м.

1.17. Конваллатоксол: 3£ (0-¿-/г - С29Н440то 170-172 -10,0-2 рамнопиранозил)-5,14в,19-три- (мет) гидрокси-5р -кард-2СГ(22) -ено -лид .

1.18. Конваллатоксолозид; 3>-[0- СосНс/Отс 161-164 -II (эт.) Тр.л.К., тр., с.л.м. <к.-и -рамнопиранозо-(4

О-Л -х> -глюкопиранозил] -5,14^ -19-тригидрокси-5р -кард-20С22) -енолид

1.19. Неоконваллатоксолозид-Зв -[0-А- СопНсЛ0Тс 161-164 I- рамнопиранозо-(2—-1)-0-> -О - ^ м 1й

_ рамнопиранозо . глюкопиранозил]-5.14л-19-тригид-рокси-5^ -капл-20(22)-енолид

Локундьезид-Зя рокси-5р-кард-20(22)-енолид

-II (эт.) Тр.л.К., тр., с.л.м.

Группа бипиндогенина

1.20. Локундьезид-Зя-(0-/-//-рам- С29Н440тп 184-187 -12,1(мет) Цв., тр., е., к.л.м., нопиранозил)-5:1Ы.,146-тригид- ** хи цв.л.К., тр.л.К.

Продолжение таблицы I

00

1.21. Т. 22.

1.23.

1.24.

1.25.

Умбеллиферон Скополетин

Оксикумарины

С9Н6°3 232-233

С10Н8°4 204-205 Оксикоричяые Кофейная кислота СдНдО^ Хлорогеновая кислота С16%8°9 Неохлорогеновая кислота ^16^18^9

кислота 195-197

203-205 -32(мег) +2,6(мет)

Тр.л.К., тр.л.м.

Тр.л.К., тр.л.м.

Тр.л.К., тр.л.м.

Тр.л.К., тр.л.м.

Тр.л.К., тр.л.м.

Примечание; Тр.л.м. - трава лаадыша майского; гр.л.К. - трава лавдыиа Кейске; цв.л.м. - цветки ландыша майского; цв.л.К. - цветки ландыша Кейске; с.л.м. - семена ландыша майского; к.л.м. - корни ландыша майского; эт. - этиловый спирт; мет. - метиловый -спирт.

1670, 1620, 1580, 1560, 1515 см-1) и УФ- (350-375, 265-268, 255 ни) областях спектра. В ЙК-спектрах веществ 1.06 и 1.07 имеется полоса поглощения в области 2980 см-1", свидетельствующая о наличии в их молекуле мегоксильной группы. С помощью УФ спектроскопии с ионизирующими и комплексообразукзцими реагентами установлено, что агликон 1.01 имеет свободные оксигрушхы в 3,5,7,3',4', а аглнкокы 1.06 и 1.08 - в 3,5,7 и 4' положениях флавоноидного ядра. Дезметилирование агликона 1.06, в ЙК-спектре которого обнаруживается полоса, характерная для ОСНд группы (2980 см-^), приводит к образованию вещества ,1.01. На эсновании спектральных данных и физико-химических свойств эти вещества отнесены к £яавоноловым агликонам и идентифицированы. : кверцетином, изорамнетином и кемпферолом соответственно.

Вещества 1,02 и 1.03 представляют собой гликозида: при зерментатквном гидролизе рамнодиасгазой расщепляются до агли -:она кверцетина (1.01) и Сахаров С-галактозы (гликозид 1.02), ¿>-глйкозы (гликозид 1.03) и робинобиозы (гликозид 1.04). Бегство 1.07 - до агликона изорашетина (1.06) и робинобиозы. есто присоединения углеводного компонента к кверцетину и изо-амнетину определяли УФ-спекгроскопией и метилированием глико-идов (1.02; 1.03; 1.04; 1.07) с последующим гидролизом полу -энного продукта. На основании полученных данных исследованные эщества идентифицированы с гиперозидом (1.02), кверцимеритри-эм (1.03), биокверцетином (1.04) и кейозидом (1.07),

Гликозида 1.05 и 1.11 (табл. I) при кислотном гидролизе % серной кислотой, как биокверцетин (1.04) и биоробин (1.10), гадепляются на агликон кверцетин ж кемлферол и сахарные компо-¡нты Ь -рамнозу и -Р -галактозу. В отличие от веществ (1.04 и 10) они не гвдролизуюгся ферментным препаратом рамнодиастазой. я метилировании и последующем гидролизе из гликозида 1.05 был лучен З-гидрокси-5,7,3',4'-тетраметоксифлавон (О^^Оу, пл. 196-198 °С), а из гликозида 1.11 - З-гидрокси-5,7,3'-ме -ксифдавон (С^д^дО^ Т.пл. 159-164 °С), что указывает на при-единение сахарных компонентов по гидроксилу при С-З кверцети-и кемпферола.

В продуктах гидролиза метильных производных веществ 1.05 [.II хроматографией на бумаге обнаружили 2,3,4-три-0-метил--рамнозу и 3,4., 6-три-0-мегил-Т) -галактозу. Анализируя ре -штаты метилирования, можно заключить, что сахара лрисоеда-ы между собой I-»- 2 связью. Дня подтверждения порядка при-

соединения Сахаров в исследуемых гликозидах проведен ступен -чатый гидролиз 2 % раствором серной кислоты при комнатной температуре в течение двух недель»

В продуктах гидролиза вещества 1.05 обнаружили гиперозид (1.02), а 1.11 - трифолин (1.09). Полученные данные также по -лазали, что конечным сахаром в биозидах 1.05 и 1.11 является Ь -рамноза (схема I). Конфигурацию гликозидных связей определяли сравнением молекулярных вращений с соответствующими фе -тал- и метил-О-гликозидами.

Исходя из полученных данных структуру исследуемых фяаво-гоидов можно представить как 5,7,3' ,4'-тетраокси-3-(0-^ --Р-^алактопиранозо (2 ¿-рамнопиранозил)флавон (глико-

¡ид 1.05) и 5,7,4'-триокси-3-(0-ув--£>-галактопиранозо (2^-1)-)_/._Д -рамнопиранозил)флавон (гликозид 1.11), которые оказа -шсь новыми природными соединениями и названы наш изобиоквер-цетином и изобиоробином соответственно.

В листьях и цветках ландыша Кейске эти гликозида не обнажены. Характерной особенностью их является сочленение саха ->ов между собой 1~>-2 связью. Подобная связь между сахарами 'становлена в карденолидных гликозидах неоконваллозиде и нео -шваллатоксолозиде. Для флавоноидных бкозидов изобиробша и :зобиокверцетина, полученных из ландыша майского, также харак-ерен аналогичный порядок связи. Эти вещества являются новыми.

Вещество 1,10 обнаруживается на хромагограммах в УФ-свеге виде темного пятна, что говорит о замещении третьего доложе-ия агликона, гидролизуется кислотами до агликона кеглиферола, 9-галактозы и Л -рамнозы. С помощью УФ-спектроскопии с диаг -остическими и ионизирующими добавками установлено, что угле -одннй компонент присоединен по третьему положению кемпферо'ла. ля определения порядка присоединения Сахаров проведен фермен-ативный гидролиз рамнодиастазой. Гликозид при этом расщепляет-я на кемпферол и робинобиозу. Все это дало основание иденти -ицировать вещество 1.10 с биоробином.

Кверцимеритрин, биокверцетин, биоробин, трифолин из рода андыш выделены впервые.

Хелидоновая кислота (1.12). По хими -зскому строению она представляет собой /Чтирон-дикарбоновую юлоту (табл. I). Для выделения хелидоновой кислоты сырье «зтрагируют 80° этанолом, экстракт упаривают до водного остат-

ка, из которогв хлороформно-спиртовой смесью (3:1) отделяют карденолида, водные фракции наносят на колонку полиамида и элюируют водой. После упаривания элюагов. в вакууме выпадают кристаллы хедидоновой кислоты. Ее физико-химические свойства представлены в таблице I. Содержание хелидоновой кислоты в сырье колеблется от 3,5 до 5,0 %.

Карденолида

Сердечные гликозиды, выделенные из исследуемых видов ландышей (табл. I), представлены тремя агликонами (строфантидин, строфантидол, бшшндогеюш), относящиеся к цис-А/В карденолид-ному ряду и тремя моносахаридами ( ¿-раынозой, Л -гулометило -зой,V -глюкозой). Сахара в биозидах присоединены между собой 1-*-4 (конваллозид, конваллатоксолозид), а также 1—2 (нео -конваллозид и неоконваллатоксолозид) связью.

Группа сгрофзатидинз. Она представлена четырьмя веществами: дезглкжохейротоксином, конваллатоксином, конваллозидом, неоконваллозидом.

Дезглюкохейротоксин (1.13) является моногликозидом. Б УФ-области спектра - два максимума: один при 220 нм характерен для пятичленного ненасыщенного лактонного кольца у С-17, второй максимум в области 304 нм указывает на наличие в агликоне карбонильной группы при С-10.

После кислотного гидролиза выделили агликон, в ИК-спектре которого.обнаружена полоса при 1030 см""1", характерная для 3,5 р -стероидов.

При сравнении Ж-спектров 3р ,5,1443 -тригидрокси-19-оксо-5-р -кард-(20:22)-енолида (строфантидина) и агликона вещества 1.13 наблюдается их тождественность.

Параллельное хроматографирование и Ь пл. смешанной пробы с достоверным строфангидином свидетельствует об их идентичности.

С помощью хроматографии на бумаге в системе н-бутанол-ме-тилэтилкетон-боратный буфер (1:1:2) установлено, что сахарным компонентом гликозвда 1.13 является и -гулометилоза.

Таким образом вещество 1.13 то выше приведенным данным идентифицировали с Ър (0-^/5 -Х)-гулометилпиранозид)-5Д4^& -ди-гидрокси-19-оксо-5^> -кард-(20:22)-енолидом или дезглюкохейро-

токсином.

Конволлатоксин (1.14) в УЗ-области дает два максимума: 1-220 нм; П-304 нм, что указывает на наличие пятичленного лактонного кольца в 17 положении и карбонильной группе при С-10, После гидролиза выделили аглигсон - отрофвн-тидин и сахарный компонент к -рамнозу.

Вещество 1.14 идентифицировано с конваллатоксином и представлено 3р (О-^-А -рамнопиранозид)-5,14/ -дигидрокси-19-ок- ' со-5-£ -кард-(20:22)-енолид и идентично конваллатоксину (1.14).

Конваллозид (1.15) является биозидом. Продукты кислотного гидролиза анализировали при помощи хроматографии на бумаге и установили, что агликоном вещества 1.15 является стро-фантидин, а сахарный компонент состоит из остатков Ь -рамнозы и 3 -глюкозы. Ступенчатый гидролиз ферментами виноградной улитки приводит к образовании конваллатоксина (1.14) и .Р-глюкоза. На основании физико-хюличесних свойств исходного вещества и продуктов деструкции вещества 1.15 идентифицировано с 3£> (0-/. -Ь -рамнопиранозо <4-^-1) -О-]} -V -глюколиранозвд)-5,14£> -дигидрокси-19-оксо-5р -кард-(20:22)-енолидом или кон -валлозидом.

Неоко'нваллозид (1.16). В УФ-области спектра обнаружено два максимума в области 220 и 303 нм, характерны для бутенолидного кольца и альдегидной группы карденолидов. Кислотный гидролиз по Манниху и Зиверту приводит к его рас -щепленшо на -Р -глюкозу, Ь -рамнозу и ряд продуктов агликоново-го характера, два из которых по величине в различных 'системах совпадают со строфантидином и 5-ангидрострофантидином.

На основании полученных результатов можно предположить, что вещество является конваллозидом. Однако, в отличие от него, оно не гидролизуется ферментами виноградной улитки, что связано с порядком присоединения сахароз в молекуле исследуемого гликозида.

Ступенчатый гидролиз неоконваллозида ОД н серной кислотой приводит к образованию хонваллогохсина и V-глюкозы. Это указывает на то, чтоI) -глюкоза является концевым сахаром.

В продуктах периодатного окисления исследуемого гликозида мы не ббйаружйли А -рамнозу, что свидетельствует об отсутствии I 3 связи между сахарами.

Таким образом, вероятно присоединение V -глюкозы в нео-конваллозиде к Л -рамнозе I 2 гликозидной связью., Для подтверждения этого предположения провели восстановление выделенного гликозида боргидрпдом натрия. £ результате получили нео-конваллотоксолозид (1.19).

На основании полученных данных структуру неоконваллозида можно представить как строфантидин-3-0-^--Л -рамнопиранозил-2 -_£> -глюкопиранозад.

Группа сгросГантидола. Данная группа представлена тремя веществами: конваллатоксолом 1.17, конведлатоксолозидом 1.18, неоконваллатоксолозидом 1.19.

Конваллатоксол (Г. 17) относится к моногли-козидам. В УФ-области нет максимума при 303-305 нм, что свидетельствует об отсутствии карбонильной группы при С-10. После кислотного гидролиза зещества 1.17 и последующего хроматогра -фирования на бумаге продуктов гидролиза растворимых в хлоро форме установлено, что агликоном этого вещества является стро-фантидол. Сироп из водной части гидролизата давал после хрома-тографирования на бумаге в системе и-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) пятно, соответствующее ^ -рамнозе.

При хроматографии на бумаге вещества 1.17 и достоверного образца конваллатоксола юс пятна имели одинаковое значение величины , 1 пл. пробы смешения вещества 1.17 с подлинным образцом конваллатоксолом не дала депрессии.

Таким образом, вещество -1.17 является 3£ (0-Д,- Ь -рамно-пиранозил)-5-19-тригидрокси-5^ -кард~(20:22)-енолидом и идентично конваллагоксолу.

Конваллотоксолозид (1.18). Для выяснения строения вещества 1.18 мы провели его кислотный гидролиз. Хроматографированием на бумаге в системах растворителей про -дуктов гидролиза установлено, что агликоном является строфан-тидол, а,сахарными компонентами; 6 -рамноза и ф -глюкоза. При ферментном гидролизе получен моногликозид конваллатоксол (I.17) и сахар О -глюкоза.

< Следовательно, вещество 1.18 является 3-^-(0-^-^-рам-ноЬиранозо-О-^ -_р-глюкопиранозил)-5,1^& -19-тригидрокси-5£ -кард-(20:22)-енолидом и идентичен конваллатоксозиду.

Неоконваллатоксолозид (1.19) не вос-

анавливается боргидридом натрия. В его УФ-свете обнаружива-зя лшпь максимум в области 220 нм, характерный дая бутенолид-го кольца карденолидов.

При кислотном гидролизе по ГЛанниху и Зиверту неоконвалла-•ссолозид расщепляется на V -глюкозу, и -рамнозу я агликон рофантидол. В отличие от конваллатоксолозида гликозвд 1.19, I и неоконваллозид, не гидролизуется ферментами виноградной

1ТКИ.

Для определения порядка присоединения Сахаров провели сту-иатый гидролиз неоконваллатоксолозида 0,1 н серной кислотой, результате выделен конваллатоксол (1.17) и хроматографически знтифицировали 3 -глюкозу. В продуктах перяодагного окисле -I мы не обнаружили //-рамнозу, что дает возможность исключить 1зъ 1-"3 между сахарами. На основании полученных результатов заключили,-чтоР-глюкоза в неоконваллатоксолозиде присоеди-1а к Л-рамнозе I гликозидной связью. В продуктах мети -зования гликозида 1.19 хроматографией на бумаге в системе ¡творителей метилэтилкетон, насыщенный водой, обнаружили 3,4,6-тетраметил-^>-глюкозу и 3,4-диметил-4-рамнозу.

На основании полученных данных структуру неоконваллаток -юзида можно представить как строфантидол-З-О-Х-А -рамнопи-юзил-(2I)-Р-глюкопиранозцд.

Группа бипиндогенина. Представлена одним веществом - до -[дъезидом (1.20).

Локундъезид (1.20) в ультрафиолетовой области :т лишь максимум в области 219 нм, характерный дая бутено -рого кольца. После кислотного гидролиза из водной фазы вышли сахар, идентичный-А -рамнозе, а из органической - агли-[ - билиндогенин.

Сравнивая свойства агликонов, содержащих вторичные 0Н-ппы в различных положениях, а также цветные реакции близких строению стероидов, мы пришли к выводу, что четвертичный роксил находится в П-¿¿-положении.

Сравнивая полученные данные по изучению вещества 1.20 с .естными в.литературе гликозидами, мы пришли к выводу, что своей структуре оно идентично с локундьезидом и по структу-представляет собой 3>-(0-<А-/|-рамнопиранозил) 5 Д1Х, 14/ь -:гидрокси-5£>-кард-(20:22)-енолид.

Производные кумарина

Умбеллиферон (1.21), скополетин (1.22). Физико-химическое сво|ства веществ 'представлены в таб-г лице I.

Вещества расщепляются под действием Н1 в среде жидкого фенола и уксусного ангидрида до кумарина, что позволило отнести их к производным бензо-</- -пирона.

МК-спектры веществ имеют полосу поглощения при 1714-1730 см-*, что характерно для карбонильной группы ¿¿--пиронового кольца. Гидроксильные группы веществ дают полосы поглощения при 3200 см-*, а вещество 1.22 имеет также полосы при 2985, 2843 см-*, что указывает наличие в нем метоксильной группы.

Максимумы поглощения в УФ-области находятся в пределах 345-340 нм и при 250-190 нм.

Дня веществ 1.21 и 1.22 характерна ярко-голубая флуоресценция в УФ-свете, усиливающаяся при обработке параш аммиака или этанольным раствором калия гидроксида.

При взаимодействии с железа (Ш) хлоридом вещество 1.22 образует зеленое окрашивание, что указывает на наличие орто-гидроксигруппировки в кумариновом ядре.

Метальное производное вещество 1.21 идентифицировали с 7-метоксккумарином (гернкарином,- С^о^Од, Т.пл. 117-118 °С). Следовательно, вещество 1.21 идентично умбеллиферону (7-окси-кумарину). При метилировании вещества 1.22 образуется 6,7гдн-метоксикумарин (скопорон, СцНэдО^, Т.пл. 144-146 °С).

Температура плавления пробы смешения с достоверными об -разцами умбеллиферона и скополетина подтверждает их идентич -ность.

Таким образом, вещество 1.21 является 7-оксикумарином __ (умбеллифероном), а вещество 1.22 представляет собой 6-меток-си-7-оксикумарин (скополетин).

Оксикоричные кислоты

Оксикоричные кислоты, физико-химические свойства которых представлены в табл. I, дают положительную реакцию с железа (Ш) хлоридом, диазотированной сульфаниловой кислотой, что определяет их фенольную природу. Кислотные свойства этих веществ обнаружены с бромтимоловым синим.

Щелочная деструкция вещества 1.23 приводит к образованию

1.6

протокатеховой кислоты. При взаимодействии с аммиачным раствором серебра оксида образуется коричневая окраска с веществами 1.23, 1.24, 1.25, что можно объяснить наличием О-диоксигрупш в этих веществах.

УФ-спектральная характеристика веществ доказывает принадлежность их к оксикоричным кислотам, максимумы поглощения ко -торнх находятся в диапазоне волн при 310-325 и 230-250 нм.

Багохроюш при ионизации калия гидроксидом указывает на свободные гидроксильные группы веществ.

При щелочном гидролизе веществ 1.24 и 1.25 образуется кофейная и V -хинная кислоты в эквимолекулярных количествах." Дня установления места присоединения кофейной кислоты к Х> -хинной веществ 1.24 и 1.25 провели нагревание их с ледяной уксусной кислотой. Параллельно проводили аналогичный опыт с £> -хинной кислотой. При этом вещество 1.24 осталось неизменным, а вещество 1.25 и кислота Х>-хинная образовали лактон хинина. Следовательно, остаток кофейной кислоты в веществе 1.24 присоединяется по С-3 Дислоты хинной, а в 1.25 - в С-3 положении находится свободная гцдронсильная группа, по которой возможно образова -ние лактона.

Проба смешения вещества' 1.24 с хлорогеновой кислотой не давала депрессии температуры плавления, что подтверждает идентичность его 5-0-кофеил-.Р -хинной кислоте (хлорогеновой). ,

При хроматографии вещества 1.25 с образцом неохлорогеновой кислоты получали одно пятно. Следовательно, вещество 1.25 яв -ляется З-0-кофенл-.С -хинной кислотой (неохлорогеновой).

На основании хроматографических исследований, качествен -ных реакций анализа УФ-спектров определили, что вещества.являются: 1.23 - 3,4-диоксикоричной кислотой (кофейной); 1.24 -5-0-кофеил-Р-хинной кислотой (хлорогеновой); 1.25 - 3-0-кофеил-9-хинной кислотой (неохлорогеновой) (табл. I).

Углеводы цветков ландыша майского и ландыша Кейске

Для выделения и анализа углеводного состава были исполь -зованы методики, которые сводятся к следуицему: для удаления веществ лшофильной природы сырье обрабатывают хлороформом,затем фракционируют в зависимости от свойств соединений: опжрто-растворимые полисахарида (СР) экстрагируют. 82 %-шм этиловым спиртом, водорастворимые полисахарида (БИРС) - водой, пектиновые ьещества (ПВ) - извлекали 0,5 ^-ным раствором щавелевой

кислоты, гемицеллюлозн (ГМ) - 7 %-кш раствором едкого калия.

Спирторастворимые сахара после очистки от неуглеводных компонентов концентрировали в вакууме, осаждали ацетоном и высушивали в вакуутл-эксикаторе над пятиокисью фосфора. Методом хроматографии на бумаге в системах: а) н.-бутанол-пиридин-вода (6:4:3) и б) этилацетат-уксусная кислота-муравьиная кислота-вода (18:3:1:4) обнаружили & -глюкозу, Х> -галактозу, Л -рамно-зу, и -арабннозу, V -ксилозу, О -галактуроновую кислоту. Б качестве проявителя использовали раствор аншшнфталата в йутано-ле. После осаждения метанолом водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозн гидролизовали 10 %-тм раствором серной кислоты и исследовали их моносахаридный со -став. Результаты приведены в таблице 2.

Основными мономерами полисахарида ландаша майского является Р-галактоза и I-рамноза, а ландаша Кейске -^-галактоза, // -арабиноза, Л -чсилоэа.

Таким образом, из цветков ландаша-майского и ландаша Кейске впервые выделены различные фракции углеводов, которые оха -растеризованы по моносахарйдному составу и содержанию полисахаридов, восстановленных и кислых в них Сахаров.

Возможность практического использования результатов исследования

Вторая часть наших исследований посвящена выяснению воз -мокности получения конвафлавина-и коргликона'по совмещенной схеме. В основу положены данные о близости карденолидного и фдавоноцдного состава ландыша майского и ландыша Кейске.

Выделенный из травы или листьев ландыша Кейске суммарный фенольный препарат, названный конвафлавином, при фармакологическом исследовании показал желчегонное и противовоспалительное 'действие. В настоящее время производится Опытным заводом ЕНИИХГЛС. Метод получения конвафлавина сводится к следующей схеме:

Сухую измельченную траву ландыша дальневосточного экстрагируют десятикратным количеством 80 % этанола. Полученное извлечение упаривают до водного остатка. Выпавший хлорофил отде -ляют фильтрованием, фильтрат обрабатывают при перемешивании хлороформно-спиртовой смесью (8:2). Водную фазу отделяют, упаривают, смешивают с порошком полиамидного сорбента и вдсуши -вают на воздухе. Высушенный сорбент с нанесенным на него очи-

Полисахарида цветкЬв ландыша майского и ландыша Кейске

Таблица 2

(О

Фракция полисахаридов

| по отношению к-

•шению к сырью,

ВРПС цв.л.м. ВРПС цв.л.К, ПВ цв.л.м. ПВ цв.л.К. ГМ цв.л.м. ' Ш цв.л.К.

14,88 9,02 12,09 8,63 3,43 3,40

к "ПОЛИ ■кислые !сахара сахарин» , Белок ой Фтакции •Восстанав-¡ливающие ' сахара (ВС] Зола 1 -! Моносахаридный состав !

35,14 6,90 23,33 17,33 Асо.Хуб, Ыъ.вяШ

14,13 7,10 14,29 27,70

33,30 2,35 22,55 12,05 &ое. , И», С^ещ

39,25 1,57 27,90 6,68

0,73 0,17 6,62 41,93

0,56 0,12 7,32 39,63

Примечание: цв.л.м. - цветки ландыша майского; цв.л.К. - цветки ландыша Кейске; подчеркнутое означает наибольшее содержание вещества.

щенным экстрактом помещают, на колонку полиамидного сорбента в соотношении сумма веществ-сорбент (1:10), заполненную влажным методом. Колонку промывают дистиллированной водой до появле -кия в элюате положительной цианидиновой пробы (металлический магний с соляной кислотой). После этого полифенолы десорбируют 50 % спиртом. Полученный элюат упаривают до сухого остатка.Высушенную массу измельчают до порошкообразного гомогенного со -стояния. Выход препарата составляет 0,8-1 % от воздушно-сухого сырья.

Нетоксичным фенольным веществам ландыша сопутствуют силь-нодействущие сердечные гликозиды, обладавшие высокой кардао -тонической активностью. Поэтому одной из основных стадий в производстве конвафшавина является отделение сердечных гликози-дов путем жидкостной экстракции (схема 2, операция 3 второй стадии), при этом извлекаются гликозиды малой и средней полярности (периплорамнозид, дезглкжохейротоксин, конваллатоксин, конваллатоксол, локундьезид), а полярные гликозиды (конвалло-зид, конваллатоксолозид, неоконваллатоксолозид) не отделяются от фенольных веществ. Для разделения этих групп веществ использовано свойотво фенолов сорбироваться на полиамидном сорбенте. При этом фенолыше соединения, обуславливающие желчегонные' и противовоспалительные действия препарата, удерживаются на по -лиамиде, а водорастворимые сердечные гликозиды и другие гидрофильные вещества нефенольной природы вышваются водой (стадия 3, операция I). После отделения упомянутых веществ фенолыше соединения десорбируются 50 % этиловым спиртом. Элюаты упари -ваются, остаток высушивают досуха. Полученный остаток представляет собой лекарственное средство - конвафдавин.

Как следует из описания способа получения конвафлавина, хлороформно-спиртовое извлечение (3:1), содержащее коргликоно-вую фракцию сердечных гллкозидов (дезглшохейротоксин, конвал-лахоксин, конваллатоксол и локундьезид) ранее не использова -лось. Применяя методы очистки суммы сердечных гликозвдов, из отходов производства конвафлавина мы получили препарат, соответствующий требованиям субстанции коргликона (®С 42-765-73). Это позволило разработать способ получения конвафлавина и коргликона по совмещенной технологии, которая апробирована на Опытном заводе ШИИВДЮ.

"Узким местом" в производстве конвафлавина является ста -дня хроматографической очистки на полиамидном сорбенте.;Причи-

Схема 2

Совмещенная схема производства корглякона и конвафлавияа

Получение концентрированного экстракта

I. Измельчение растительного сырья

2. Приготовление экстрагента

3. Экстракция

4. Упаривание экстракта

Разделение экстракта на карде-нолидную и полифенольную фракции

I. Фильтрация экстракта

2. Приготовление экстрагента (смесь хлороформно-спирго-вая 3:1)

3. Жидкостная экстракция

4. Упаривание хлороформно-спир-гов.ого извлечения Выделение коргли-кона

5. Упаривание водного раствора I. Отделение сердечных гликози-дов

*

Выделение конвафлавина 2. Жидкостная экстракция суммы сердечных глико-звдов

I. Хроматографичеокая очистка

2. Упаривание элвата 3. Хроматотоафичес-кая очистка

3. Сушка, измельчение, фасовка

t 4. Извлечение сердечных гликози-дов. Сушка.

Регенерация полиамидного сорбента

\

ной этого является высокая стоимость сорбента (24 рубля за I килограмм, в ценах 1290 года), сравнительная его дефицитность, так как изготовляет его ПО "Здоровье" только для производства ликвиритона. Мы задались целью выяснить возможность многократного использования полиамидного сорбента. Для этой цели сорбен: после хроматографической очистки препарата обрабатывали 5 % водньши растворами щелочи, затем промывали дистиллированной вода до нейтральной реакции. Емкость сорбента определяли по рутину (Стандарт предприятия 64-0471-51-83 "Показатели качества гра -нул полиамидного сорбента, применяемого в производстве").

Таблица 2

Показатели емкости полиамидного сорбента

Исходный сорбент ¡После I регенерации ! После П регенерации

^ ! Ед ! ! Ед ! ! Ед

0,43 1,37 0,13 1,02 0,05 0,8 ~

0,38 1,31 0,08 0,71 0,03 0,41

Примечание: Е^ - рабочая емкость; Е - динамическая емкость.

В соответствии с нормативно-технической документацией (Стандарт предприятия 64-0471-51-83 "Показатели качества гра*-нул полиамидного сорбента, применяемого в производстве") рабочая емкость должна быть не менее 0,1 %; динамическая - 0,7 %. Исходя из этих требований и данных таблицы 2 следует, что по -лиамидный сорбент в производстве конвафлавина можно использо -вать после его одноразовой регенерации. Это позволило сократит! расходные нормы сорбента и уменьшить затраты производства при получении I килограмма конвафлавина на 939 рублей.

Наш проведены исследования по'выяснению возможности использования ландыша майского для получения конвафлавина. Кон-вафлавин, полученный из ландыша майского, по своей специфической активности - желчегонному действию - соответствует конва -флавину, полученному из ландыша Кейске. Это подтверждается отсутствием разницы в силе проявления желчегонного эффекта пре -паратов в острых опытах на крысах. Так, под влиянием конвафлавина из двух видов ландыша в дозах 80 мг/кг и 160 мг/кг развивается желчегонный эффект одинаковой силы. Максимальное увели-

чение желчеотделения под влиянием ландыша Кейске в опытах на крысах составляет 34,5 % и 34,8 %, майского - 28,1 % и 37,7 %. В одинаковой степени под влиянием обоих препаратов увеличивается и скорость секреции желчи: соответственно на 22,8 - 23,3 % и 20,1 - 27,2 %. Общее количество желчи, выделенное животным за 4 часа под влиянием препарата, также увеличивается, причем при действии препарата из ландыша майского. По токсичности, как показали острые опыты на мышах и крысах, конвафлавин из ландыша майского близкий к препарату из ландыша Кейске. Препарат из исследуемых видов сырья по классификации Сидорова К. К. (1973 г.) относится к практически нетоксичным веществам.

Полученные по совмещенной схеме препараты коргликона и конвафлавина по специфической активности и химическому составу тоздественны этим препаратам в отдельных производствах.

ВЫВОДЫ

1. Проведено сравнительное изучение биологически активных веществ ландыша майского и ландыша Кейске. Установлены следующие классы соединений: флавоновды, оксикоричные кислоты, окси-кумарины, полисахариды, хелидоновая кислота и карденолида.

2. Для разделения фенольных веществ использовали колоночную хроматографию на полиамиде и сшшкагеле. Карденолида раз -деляли на окиси алюминия и силикагеле. Получено 25 веществ, из которых II флавоноидов (кверцетин, гиперозид, кверцимеритрин, биокверцетин, изобиокверцетин, изорамнетид, кейозид, кемпферол, трифолин, биоробин, изобиоробин); 3 оксикоричные кислоты (ко -фейная кислота, хлорогеновая кислота и неохлорогеновая); 2 ок-сикумарина (умбеллиферон и скополетлн), органическая кислота -хелидоновая, 8 карденолидов (дезглюкохейротоксин, конваллозид, неот,онваллозид, конваллотоксин, конваллотоксол, конваллатоксо-лозид, неоконваллатоксолозид, локундьезид). Строение выделен -ных веществ доказывали с использованием химических, физико-химических, биохимических и биологических методов.

Изобиоробин и изобиокверцетин являются новыми природными соединениями и представляют собой 5,7,4'-триоксй-3-(0-^ -О -галактопиранЬзо (2 1) -0-/— 6 -рамношранозил)флавон; 5,7,3* ,4*-теграокси-3-(0-/ -3> -галактопиранозо <2 -¿-I) -0- /-¿-рамнопиранозил)флавон соответственно.

Биоробин, биокверцетин, трифолин, кверцимеритрин выделены

из рода впервые.

3. Показано, что химический состав ландаша Кейске и лан-

туре некоторых фпавоноидов, что дало основание<провести исследования по комплексному использованию сырья ландыша Кейске и ландыша майского. ~

4. Идентичность карденолццного и близость флавонодцного состава ландыша шйского к ландыша Кейске позволила усовершенствовать технологию получения конвафлавина и предложить совмещенную "технологическую схему производства корглнкона и конва -фшвина, которая апробирована на Опытном заводе ВНШХТЛС.

5. Разработан способ регенерации полиамидного сорбента в производстве конвафлавина на стадии хроматографической очистки, что позволило многократно использовать сорбент. Это дало воз -можность сократить затраты производства при получении конвафяа-вина на 939 рублей при производстве I килограмма готового про -дукта.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях

Винник Е.В., Ступакова Э.П., Комиссаренко Н.Ф. Карденолиды корней ландыша майского // Гез.докл.Всесоюз.конф. "Результаты и перспективы, научных исследований по биотехнологии и фармации". - Ленинград, 1980. - С. 159-160.

2. Ступакова З.П,, Винник Е.В., Зинченко В.В. Флавоноиды и карденолиды цветков ландаша Кейске // Тез.докл.Всесоюз. конф. "Ноше лекарственные препараты иь растений Сибири и Дальнего Востока". - Томск, 1989. - С. 169-170.

3. Комиссаренко К.Ф., Ступакова З.П., Винник Е.В..Зинченко В.В. Флавоноида листьев ландыша майского // Тез.докл.Второй респ. конф. ло мед. ботанике. - Киев, 1988. - С. 260-261.

4. Комплексное использование растительного сырья в получении лекарственных препаратов / Комиссаренко Н.Ф., Левашова И.Г., Ступакова Э.П. и др. // Тез. докл. Ш съезда фармацевтов

. Туркменской ССР. - .Ашхабад, 1Э89. - С. 259-260.

5. Положительное решение о выдаче авторского свидетельства

Л 4919547/14 от 18.03.91 г. Способ получения препарата желчегонного действия / В.В.Зинченко, И.Ф.Комиссаренко, В.А.ОДцгва-

дыша майского сравнительно близкий, имеется различие в струк-

рели и др.