Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое исследование коры ивы остролистной

ООЗОТ1ВВ2

На правах рукописи

БОНЦЕВИЧ АНДРЕЙ ИВАНОВИЧ

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОРЫ ИВЫ ОСТРОЛИСТНОЙ

15 00 02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

003071662

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Лозовая Галина Федоровна кандидат фармацевтических наук, доцент Климова Любовь Дмитриевна

Ведущее учреждение — Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «2$» f\JL&->-k_ 2007 г в ) L часов на заседании

Диссертационного совета К 208 085 03 при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (443079, г Самара, проспект К Маркса, 165 Б)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (г Самара, ул Арцыбушевская, 171)

Автореферат разослан " 2% " 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

Е В Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время потребность медицинской и фармацевтической практики в использовании лекарственных растений и препаратов на их основе значительно возросла Этот все возрастающий интерес связан с многочисленными положительными свойствами лекарственных средств растительного происхождения Фитопрепараты, как правило, обладают достаточно высокой эффективностью, комплексным действием на организм человека, широким спектром терапевтического действия и относительно низкой токсичностью

Особое значение в медицинской практике имеют противовоспалительные лекарственные средства растительного происхождения

Одним из перспективных сырьевых источников для получения эффективных фитопрепаратов является ива остролистная (Salix acutifolia Willd) семейства Ивовых - Sahcaceae В настоящее время в официальной медицине применяют лишь листья ивы остролистной Их используют для получения Государственных стандартных образцов лютеолина и цинарозида, а также противовирусного препарата «Салифозид» Кору видов ивы используют в зарубежной медицине для получения ряда противовоспалительных, противокашлевых и других препаратов («Бронхикум», «Урофлукс»), однако в отечественной медицине данное сырье не является фармакопейным

В этой связи проблема фотохимического исследования коры ивы остролистной и создания препаратов на ее основе в настоящее время является для отечественной фармации актуальной Решение ее позволит расширить ассортимент эффективных и доступных широким слоям населения лекарственных средств Для этого необходимо не только тщательное изучение химического состава коры ивы, но и разработка современных методик качественного и количественного анализа с соблюдением принципа унификации в ряду «сырье-субстанция-лекарственная форма» (Самылина И А, 1995), отвечающих параметрам валидации (Арзамасцев А П и др , 2000, 2001), а также

создание соответствующей нормативной документации Кроме того, кора ивы остролистной является перспективной в плане получения Государственного стандартного образца (ГСО) изосалипурпозида, который может быть использован для стандартизации сырья и препаратов ивы остролистной

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фотохимическое исследование коры ивы как перспективного сырьевого источника для получения новых препаратов на основе флавоноидов и ГСО изосалипурпозида

Для достижения этой цели решались следующие задачи

1 Изучение химического состава коры ивы остролистной, произрастающей на территории Самарской области

2 Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов коры ивы остролистной с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье — субстанция — лекарственная форма

3 Разработка методик качественного анализа коры ивы остролистной

4 Разработка методик количественного анализа коры ивы остролистной

5 Разработка методик качественного и количественного анализа лекарственного средства «Ивы экстракт жидкий»

6 Разработка способа получения ГСО изосалипурпозида

7, Разработка проектов нормативной документации на новый вид лекарственного растительного сырья «Ивы остролистной кора» и лекарственное средство «Ивы экстракт жидкий»

Научная новизна. В результате изучения химического состава ивы остролистной (Salix acutifolia Willd), произрастающей в Самарской области, впервые выделены и идентифицированы 9 индивидуальных веществ, относящихся к простым фенолам (салицин, саликортин), фенилпропаноидам (триандрин) и флавоноидам (изосалипурпозид, салипурпозид, прунин, нарингенин, катехин, кумароилизосалипурпозид) Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были

использованы УФ- , 'Н-ЯМР-спектроскопия и масс-спектрометрия наряду с традиционными методами химического анализа

Разработан способ получения Государственного стандартного образца изосалипурпозида

Разработаны подходы к стандартизации сырья и препаратов ивы остролистной на основе принципа унификации в ряду сырье-субстанция-лекарственная форма, заключающиеся в анализе флавоноидов

Разработаны новые методики качественного и количественного анализа сырья и препаратов коры ивы остролистной с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ТСХ Показана целесообразность проведения стандартизации сырья и галеновых препаратов ивы остролистной по доминирующему флавоноиду - изосалипурпозиду Обоснована необходимость использования в методиках качественного и количественного анализа ГСО изосалипурпозида

Практическая значимость.

Разработаны методики качественного и количественного анализа коры ивы остролистной, которые включены в проект ФС на новое лекарственное растительное сырье «Ивы остролистной кора»

Разработаны методики качественного и количественного анализа препаратов ивы остролистной («Ивы экстракт жидкий») с использованием ТСХ -анализа и ВЭЖХ, в которых предусмотрено определение изосалипурпозида -доминирующего флавоноида сырья данного растения

Показана целесообразность разработки нового лекарственного средства коры ивы остролистной «Ивы экстракт жидкий» для использования в медицинской практике, перспективного в качестве противовоспалительного и желчегонного лекарственного средства

Разработан проект ФС «Ивы остролистной кора» для включения в Государственную фармакопею XII издания, который принят к рассмотрению

Фармакопейным государственным комитетом Министерства здравоохранения и социального развития РФ (письмо № 133 от 27 01 05 г )

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Самарского государственного медицинского университета

Положения, выносимые на защиту:

1 Результаты изучения химического состава коры ивы остролистной, произрастающей в Самарской области

2 Данные исследований по разработке методов стандартизации сырья и галенового препарата ивы остролистной («Ивы экстракт жидкий»)

3 Методики качественного и количественного анализа лекарственного растительного сырья (JIPC) и препаратов «Ивы экстракт жидкий»

4 Показатели качества JTPC и препаратов на основе ивы остролистной для включения в разрабатываемую нормативную документацию

5 Способ получения ГСО изосалипурпозида

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (№ Государственной регистрации 01200105332) и Республиканской программы «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536)

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на XXII Международной конференции по полифенолам (Хельсинки, 2004), на Международной научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2003), на VII, VIII и IX Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2002, 2003, 2004), на

межрегиональной конференции «Аспирантские чтения» (Самара, 2003, 2004), на VI Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006)

Объем и стрл ктура работы. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 24 таблиц, 14 рисунков Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования (глава 2), 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение (главы 3-5), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 220 источников, из которых 72 - на иностранных языках

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту

Гюва 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований ивы остролистной, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике

В гпаве 2 представлены характеристика объектов и методов исследования Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также методики контроля качества лекарственных средств на основе ивы остролистной

В гчавах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава коры ивы остролистной, совершенствованию методов стандартизации данного сырья и препаратов на его основе, разработке нового препарата «Ивы экстракт жидкий» и оценке их качества

В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Изучение морфоюго-анаточических признаков сырья - коры ивы остролистной

С целью выявления диагностических морфолого-анатомических признаков сырья коры ивы остролистной нами изучено 5 серий образцов воздушно-сухого сырья - коры ивы остролистной, произрастающей на территории Самарской области и некоторых других регионов Российской Федерации (Московская, Пензенская, Рязанская обл), заготовленное в период активного сокодвижения (апрель-май) в 2002-2005 гг Внешиие признаки

Изучение морфологических особенностей сырья ивы остролистной позволило сформулировать раздел «Внешние признаки»

Цельное сырье Трубчатые или желобоватые куски коры различной длины, толщиной от 0,5 до 1 мм Наружная поверхность коры гладкая или слегка сморщенная, желто-бурая или желто-серая Внутренняя поверхность гладкая, желтая Запах слабый, характерный Вкус горький

Измельченное сырье Кусочки коры различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм Цвет желто-бурый Запах слабый Вкус горький

Микроскопия

Диагностическими признаками сырья (препарат коры ивы остролистной -поперечный срез коры) являются тонкий слой пробки, состоящей из плотно расположенных клеток, окрашиваемой суданом-3 в красный цвет, волокна твердого луба и слой склеренхн мы (рис 1 и 2)

Рис Л. Микроскопия коры ивы остролистной (х280, окраска суданом-3)

1 — пробка

2 - склеренхима

3 - волокна твердого луба

Рис. 2. Микроскопия коры ивы остролистной (х280, окраска анилина сульфатом).

1 - волокна твердого луба

2 — склеренхима

3 — пробка

2. Изучение химического состава коры ивы остротстпой Для изучения химического состава коры ивы остролистной использовались различные экстракционные и хроматографические методы

С использованием колоночной хроматографии изучался химический состав коры ивы на этапе препаративного разделения веществ Измельченную (3-5 мм) кору ивы остролистной (250,0 г) экстрагировали 70 % спиртом этиловым методом модифицированной мацерации Для полного истощения сырья экстракцию осуществляли в три этапа, из которых первое и второе настаивание производили при комнатной температуре в течение двух суток, третья экстракция была термической — в течение 1 часа на водяной бане при 8085 °С с обратным холодильником Полученные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом при температуре не выше 60 °С

Для колоночной хроматографии суммарного экстракта использовали следующие сорбенты полиамид «Woelm» (Германия), силикагель марки L 40/100 мкм и L 100/250 мкм (Чехия), сефадекс LH- 20 (Швеция)

Для элюирования использовали смеси растворителей хлороформ — этиловый спирт, этиловый спирт — вода в различных соотношениях Эффективное разделение и очистка веществ достигались чередованием сорбентов и соответствующих систем растворителей

Для тонкослойно-хромаграфического анализа спирто-водных извлечений из коры ивы и выделенных соединений использовали пластинки «Силуфол УФ-254» (Чехия) и «Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ» (Россия) Система растворителей хлороформ-метанол-вода 26 14 3, хлороформ-метанол 6 1, хлороформ-этанол 2 1,9 1,19 1

Пластинки «Силуфол УФ 254» для активации предварительно выдерживали в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С в течение 1 ч Хроматографическую камеру насыщали парами растворителей в течение 1 ч Анализ проводили при комнатной температуре, фронт прохождения растворителя составлял около 9 см (Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ) или 13 см (Силуфол УФ-254)

Обнаружение пятен проводили УФ-облучением (254 и 366 нм) до и после обработки хроматограмм 1% спиртовым раствором А1С1з (флавоноиды), обработкой 1% спиртовым раствором РеС1з и щелочным (ТЧагСОз), свежеприготовленным раствором диазобензолсульфокислоты (фенольные соединения)

Для установления структуры выделенных веществ использовались данные УФ-, 'Н-ЯМР- и масс-спектров и непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировалось методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции

Выделенные и охарактеризованные соединения показаны в таблице 1

Таблица 1 - Физико-химические константы выделенных соединений

№ Название, химическая формула Состав м+ Т пл °С МЕЮН), нм

1 Саликортин ОН но^^г Х)(Т С20Н24О10 424 215, 271

2 Салицин С13Н18О7 124 198- 212,

ОН /он но-^^ он II) 200° 268

3 Прунин НО^—1 I ОН ОН О С21Н22О10 .н2о 168170° 284

4 Салипурпозид S" W но-л-Л^Д 1 ¿ НоЛ^^-Д/ он С21Н22О10 .н2о 158161° 227, 285

5 Нарингенин он о С15Н1205 272 249251° 286

6 Изосалипурпозид он L 11 I но—к ¿ он С21Н22О10 169172° 371

7 6"-Кумароил-изосалипурпозид J w^ HO—y^-—"Я о о он С30Н28О12 180182° 370

8 (+)-Катехин (3,5,7,3',4'-пентагидроксифлаван) НО. .О. JL он С15Н1406 290 146148° 276

1 Сапщин ф-Р-глюкозид салигенина) [2-(гидроксиметил)-фенил-0-Р-Р-глюкопиранозид! Белые кристаллы состава С13Н18О7, т пл 198-200° (водный этанол), |aJ*°-62° (С 3,6, вода), EtOH 212, 270 им Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, дейтеропиридин) 8, м д : 7,77 (дц, 7 8 и 2 Гц, Н-6), 7,65 (дц, 7,3 и 1 Гц, Н-3), 7,26 (ддд, 7,8, 7,3 и 2 Гц, Н-4), 7,11 (ддд, 7,8, 7,8 и 1 Гц, Н-5), 5,5 (д, 7 Гц, Н-Г), 5,35 (дц, 13 и 2 Гц, 2Н-7), 4,6-3,9 (м, 6Н глюкозы) Масс-спектр при 120° М+ агликона 124 (100%) При ферментативном гидролизе |3-глюкозидазой образуется салигенин (М+ 124) и глюкоза При ацетилировании салицина образуется пентаацетат, в ПМР-спектре которого имеются сигналы 5 алифатических ацетоксигрупп Это свидетельствует о гликозилировании фенольной ОН-группы салигенина

2 Саликортин (З-Р-глюкозид 2-ацилсалигенина) 2-[[[(1-гидрокси-6-оксо-2-циклогексен-1 -ил)=карбонил] окси]метил] фенил-Р-Р-глюкопиранозид

Белое аморфное гигроскопичное соединение состава С20Н24О10, УФ-спектр X^ EtOH 215 нм, 271 нм Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, СРС13,) 5, м д: 7,30 (д, 8 Гц Н-3), 7,21 (д, 8 Гц, Н-6), 7,02 (м, Н-4), 6,97 (т, 8 Гц, Н-5), 6,11 (д, 9 Гц, Н-11), 5,77 (д, 9 Гц, Н-10), 5,34 (д, 13 Гц, Н-7), 5,22 (д, 13 Гц, Н-7), 5,01 (д, 8 Гц, Н-1"), 3,90-2,90 (м, 6Н глюкозы), 2,80 (м, 2Н-13), 2,52 (м, 2Н-12) Масс-спектр при 150° (30 эВ), m/z: 244 (3 %), 162, 145, 124 (100 %), 106 Гликозид саликортии расщепляется (3-глюкозидазой с образованием глюкозы и агликона, который по качественным цветным реакциям на ТСХ совпадает с ацил-салигенином

3 Прутш (нарингенин-7-0-[3-Р-глюкозид) Бесцветные кристаллы состава С21Н22О10. Н20, тпл 168-170° (метанол), -70,6° (С 0,6, метанол), - 85° (С 0,5, ацетон), ^тах МеОН 285 нм Спектр 'ГТ-ЯМР в дейтероацетоне содержит синглетный сигнал 5-ОН группы (12,04 мд), остальные сигналы практически совпадают с сигналами салипурпозида

4 Салипурпозид ("-)-нарингенин-5-0-[3-Р-глюкозид) Бесцветные кристаллы состава C2iH22O10. Н20, тпл 158-161° (водный спирт), [с/.]®-120° (С 1,3, СН3ОН) Яшах EtOH 227, 283 нм, Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, дейтероацетон) 8, м д : 7,36 (д, 9 Гц, Н-2',6'), 6,88 (д, 9 Гц, Н-3',5'), 6,21 (д, 2 Гц, Н-8), 6,08 (д, 2 Гц, Н-6), 5,41 (дд, 4 и 12 Гц, Н-2а), 5,10 (д, 7 Гц, Н-1"), 3,30-4,10 (м, 6Н глюкозы), 2,8 (кв, 12 и 16 Гц, Н-За), 2,6 (кв, 3 5 и 16 Гц, Н-Зе), сигнал 5-ОН группы отсутствует

5 Нарингенин Г5.7.4,-тригидроксифлаванон') Бесцветные кристаллы состава С15н1205 (М+272), тпл 249-251° (водный спирт) ?пг1ах МеОн286 ilm (log £ 4,20)

6 Изосспипурпозид (б'-О-Р-Р-глюкозид 4.2'.4'.6'-тетрагидроксихалкона') Игольчатые кристаллы оранжевого цвета состава С^НггОю, т пл 169-172 , -58° (С 1,0, этанол) УФ-спектр в этаноле интенсивный максимум поглощения при длине волны 372 нм (Е™ 760) Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, CD3COCD3) 5, м д : 8,08 (д, 16 Гц, Н-(3), 7,72 (д, 16 Гц, Н-сх ), 7,70 (д, 9 Гц, Н-2,6), 6,92 (д, 9 Гц, Н-3,5), 6,34 (д, 2 Гц, Н-5'), 6,07 (д, 2 Гц, Н-3'), 5,26 (д, 7 Гц, Н-1"), 3,5-4,0 (м, 6Н глюкозы)

7 6"-Кумароил-изосалип\рпозид Игольчатые кристаллы оранжевого цвета состава C3oH2gOi2, тпл 180-182° (водный этанол) УФ-спектр в этаноле максимумы поглощения при длинах волн 370 нм, 317 нм, 227 нм Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, C5D5N) 5, м д : 8,18 (д, 16 Гц, Н-(3), 7,74 (д, 16 Гц, Н-a ), 7,72 (д, 9 Гц, Н-2,6), 7,62 (д, 16 Гц, H-fr), 7,48 (д, 8 Гц, Н-2"',6"'), 6,93 (д, 9 Гц, Н-3,5), 6,88 (д, 8 Гц, Н-3'",5"'), 6,38 (д, 2 Гц, Н-5'), 6,36 (д, 16 Гц, Н-а,), 6,06 (д, 2 Гц, Н-3'), 5,28 (Д, 7 Гц, Н-1"), 4,4-4,9 (м, 2Н-6"), 3,4-3,9 (м, 4Н глюкозы)

8 (+)-Катехин (3,5,7,3',4'-пеитагидроксифчавап) Белые игольчатые кристаллы состава Ci5Hi406 (М+ 290), тпл 146-148° (водный этанол), +10,9° (С 1,0, ацетон), ¡^«МеОН 281 им Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, CD3COCD3) 8, м д : 8,0 (м, 4 ОН), 6,9 (м, Н-2',5',6'), 6,05 (д, 2 Гц, Н-8), 5,9 (д, 2 Гц, Н-6), 4,6 (д, 8 Гц, Н-2а), 4,0 (секстет, 6 и 8 Гц, Н-За), 2,94 (дд, 6 и 16 Гц,) и 2,60 (дд, 8 и 16 Гц) -сигналы 2Н-4 Масс-спектр при 150°, m/z М' 290 (15%), 152 (40), 139 (100), 124 (27), 123 (46), 110 (9)

9 Ттандрин (9-0-Р-0-глюкоггаранозид 4-гидроксикоричного спирта) Игольчатые кристаллы белого цвета состава С15Н20О7 . НгО, т пл 178-180° (из воды), [а] о-62,3° (С 0,5, вода), ЕЮН 264 нм Спектр 'Н-ЯМР (200 МГц, D20) 8, м д : 7,82 (д, 9 0 Гц, Н-2,6), 7,30 (д, 9 0 Гц, Н-3,5), 7,07 (д, 16 Гц, Н-7), 6,52 (дт, 16 Гц и 5 Гц, Н-8), 5,00 (д, 7,8 Гц, Н-1'), 4,76 (дд, 12,5 и 6 Гц, Н-9), 4,60 (дд, 12 и 2 Гц, Н-6"), 4,44 (дд, 12 5 и 6,5 Гц, Н-9), 4 42 (дд, 12 и 5,5 Гц, Н-6"); (100 МГц, C5D5N) 8, м д: 7,40 (д, 9,0 Гц, Н-2,6), 7 14 (д, 9,0 Гц, Н-3,5), 6 74 (д, 16 Гц, Н-7), 6,35 (дт, 16 Гц и 6 Гц, Н-8), 5,00 (д, 8 Гц, Н-1'), 4,9-3,9 (м, 2Н-9 и 6Н глюкозы)

3. Стандартизация сырья и разработанных препаратов ивы остролистной

Необходимость разработки методов стандартизации, создания соответствующей нормативной документации продиктована рядом обстоятельств Целесообразность в создании нормативной документации обусловлена требованиями принципов доказательной медицины, расширением спектра представлений о химическом составе и повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств

На сегодняшний день ряд работ отечественных и зарубежных ученых демонстрируют перспективность дальнейшего изучения фенольных соединений коры обсуждаемого растения, особенно, флавоноидов

В частности, нами проведены исследования по разработке нового галенового препарата на основе фенольной составляющей коры ивы остролистной «Ивы экстракт жидкий»

В связи с этим нами изучена возможность оценки качества сырья по группе БАС — флавоноидам Результаты исследований свидетельствуют о том, что для этих целей целесообразно использовать изосалипурпозид в качестве вещества-стандарта

3.1. Качественный анализ сырья и препаратов Для определения подлинности сырья ивы остролистной использовали ТСХ-анализ, основанный на обнаружении и идентификации доминирующего флавоноида растения - изосалипурпозида

В ходе разработки методики были проведены исследования по выбору оптимальных условий хроматографирования, позволяющих эффективно разделить основные компоненты сырья и идентифицировать в первую очередь доминирующий флавоноид изосалипурпозид (табл 2)

Таблица 2 - Характеристика хроматографа ее кой иодвижностп изос алн пу р пози да ____

№ п/п Хроматографическая система Иг изосалипурпозида

1. хлороформ-мета нол-вода, 26:1А :3 0,60-0,65

2. хлороформ-этанол, 2:1 0,70-0,75

3. хлороформ-метанол, 6:1 0,30-0,35

4. хлороформ-этанол, 6:1 0,15-0,20

5. хлороформ-этанол, 9:1 0,03-0,05

В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами, содержащими в различных соотношениях хлороформ, этанол, метанол и воду, было установлено, что наиболее четкое отделение доминирующего вещества от других БАС удается достичь в системе растворителей хлороформ - метиловый спирт - вода (26:14:3) (Рис, 3).

1-водно-спиртовое извлечение коры ивы при визуальном просмотре;

2- экстракт ты остролистной 1:1 на 70% этаноле, проявление диазоре активом;

3- ГСО изосалипурпозида.

Рис. 3. Хроматограмма в одно-спиртового извлечения коры ивы остролистной.

При просмотре хроматограммы водно-спиртовых извлечений коры ивы в УФ свете при длине волны 254 нм изосалипурпозид обнаруживается в виде доминирующего пятна коричневого цвета с величиной 0,6 на уровне пятна ГСО изосалипурпозида (рис 3), присутствуют также пятна других флавоноидов, среди которых преобладают вещества салипурпозид и прунин, с величиной 0,7

В предлагаемой методике используются готовые пластинки "Силуфол" или "Сорбф ил-ПТСХ-П-А-У Ф"

Аналогичные подходы были спользованы нами и при разработке раздела «Подлинность» для нового препарата «Ивы экстракт жидкий»

3.2 Количественное определение изосалипурпозида в сырье и препаратах Учитывая тот факт, что биологическая активность препаратов ивы остролистной обусловлена в значительной мере флавоноидами, в частности, основными компонентами растения — изосалипурпозидом, салипурпозидом и другими соединениями, причем изосалипурпозид является доминирующим среди них, представляется целесообразным проводить анализ данного сырья и разработанного препарата «Ивы экстракт жидкий» именно по этому веществу

С целью разработки методики количественного определения биологически активных веществ в данном лекарственном растительном сырье нами были изучены ВЭЖХ-хроматограммы исходного водно-спиртового извлечения, выделенного го него изосалипурпозида и некоторых модельных смесей веществ, полученных из фракций при последовательном хроматографировании на колонках

Рис 4 ВЭЖХ-хроматограмма выделенного изосалипурпозида

В процессе разработки методики изучены следующие стадии степень измельченности сырья, выбор экстрагента, режим экстракции сырья (время экспозиции, соотношение сырье-экстрагент), аналитическая длина волны, разведение, состав элюента, скорость элюирования

В качестве аналитической длины волны хроматографа, на наш взгляд, целесообразно использовать 360 нм, так как максимум поглощения в этой области УФ-спектра обусловлен гоосалипурпозидом - доминирующим веществом В качестве стандарта нами рекомендовано использовать Государственный стандартный образец изосалипурпозида

Метрологические характеристики методики количественного определения изосалипурпозида в сырье ивы остролистной рассчитаны из результатов анализа в 11 независимых повторностях (табл 3)

Таблица 3 - Метрологические характеристики ВЭЖХ-методики

количественного определетш изосалипурпозида в коре ивы ___остролистной___

/ X 5 Р,% Ах Е,%

10 2,83 0,0570 95 2,23 0,13 ±4,60

Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет 4,60%

Опыты с добавками ГСО изосалипурпозида к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики

4. Исследования по разработке способа получения ГСО изосалипурпозида Полученные в ходе предварительных фотохимических исследований данные и систематизированный литературный материал показал перспективность создания на основе сырья ивы остролистной Государственного стандартного образца изосалипурпозида

Нами предложена схема получения изосалипурпозида из коры ивы остролистной (Рис 5)

В ходе проведенных исследований были приготовлены образцы экстракта ивы остролистной Использовались методы перколяции и модифицированной мацерации Оптимальным по содержанию изосалипурпозида оказался экстракт на 70% этаноле Сырье исчерпывающе экстрагировали 70% этанолом в режиме троекратной экстракции в соотношении сырье экстрагент 1 5, 1 5, 1 1, причем последнее настаивание проведено в течение 1 ч на водяной бане Полученные образцы экстрактов использовались для дальнейшего выделения целевого вещества

Полученное извлечение высушивали на полиамиде и переносили в колонку (высота сорбента - 4,0 см, диаметр — 5 см) Колонку элюировали водой, водным раствором спирта этилового (10 %, 20 %, 40 %, 70 %), этанолом

Фракции на 40% и 70% этаноле, содержащие целевые вещества, высушивали на силикагеле Ь 40/100 (20,0 г)

Сухой порошок (экстракт+силикагель) переносили в колонку со сформированным в хлороформе слоем силикагеля (высота сорбента - 8,0 см,

Измельченное (3 мм) сырье

Экстракт коры ивы 1 1 на 70% этаноле

Колоночная хроматография на полиамиде

Фракции на 40% и 70% этаноле, содержащие целевое вещество

Фракции на воде и 20% этаноле

Колоночная хроматография на силикагеле

Фракции на 15% и 20% этаноле в хлороформе, содержащие изосалитрпозид

Фракции на чистом хлороформе и 10% и 20% этаноле в хлороформе

Гель-хроматография на сефлексе

1

Течни га оса лш ческий ГфПОЗИД

Перекристаллизация в ацетоне, метаноле и водном этаноле

I СО тосалипурпозид ВЫХОД 0,1%

Рис 5 Схема выделения ГСО изосалипурпозида

диаметр - 7 см) Колонку элюировали хлороформом, спиртом этиловым в хлороформе (1 %, 3 %, 5 %, 7 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 70 %), этанолом

Фракции на 40% этаноле в хлороформе, содержащие изосалипурпозид, наносили на слой сефадекса ЬН-20, сформированного в хлороформе (высота сорбента 7 см, диаметр 1,5 см) и промывали хлороформом, спиртом в хлороформе, 96 % этанолом Выделение веществ контролировали методом ТСХ Технический изосалипурпозид получен из фракций на 40% этаноле

Фракции, содержащие целевое вещество, подвергали перекристаллизации с использованием растворителей ацетон и вода В результате получен образец ГСО изосалипурпозида с выходом 0,5%, с содержанием индивидуального вещества не менее 99,5%

5. Разработка нормативной документации на кору ивы остротстной и препарат «Ивы экстракт жидкий»

Для подготовки проекта фармакопейной статьи на сырье - кору ивы остролистной нами был проведен ряд исследований, посвященных фармакогностическому анализу коры данного растения Показатели качества, определенные в ходе исследований, показаны в табл 5

Таблица 5. - Показатели качества лекарственного растительного сырья "Ивы остролистной кора"

№ п/п Показатель качества Нормируемое значение

1 Внешние признаки Соответствие морфологическим признакам при просмотре невооруженным глазом и под лупой с увеличением (Юх)

2 Микроскопия Соответствие анатомическим признакам при просмотре под микроскопом с увеличением (не менеее 40х)

3 Качественные реакции 1) Тонкослойная хроматография 1) Кг около 0,6 (изосалипурпозид)

(ТСХ-анализ)

Числовые показатели

4 Количественное определение 1) ВЭЖХ содержание изосалипурпозида 1) не менее 0,5%,

6 Влажность не более 13 % (по ГФ XI, вып 1, сгр 285)

7 Золы общей не более 15 % (по ГФ XI, вып 2, стр 24)

8 Золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты не более 7 %

9 Органической примеси не более 3 %

10 Минеральной примеси не более 1,5 %

11 Микробиологическая чистота В соответствии с ГФ XI, вып 2, стр 187 и Изменением № 3 к ГФ XI от 19 06 03 г, категория 4А

12 Содержание радионуклидов В соответствии с требованиями ВДУ ГН 2 6 005-93

Изучены также показатели качества препарата «Ивы экстракт жидкий» В качестве показателя «количественное определение» введен нижний предел содержания изосалипурпозида не менее 0,4%

Показана перспективность использования препарата «Ивы экстракт жидкий» в медицинской практике в качестве противовоспалительного, желчегонного и актопротекторного лекарственного средства

ВЫВОДЫ

1 В результате изучения химического состава коры ивы остролистной (Salix acutifolia Willd), произрастающей в Самарской области, выделены 9 индивидуальных соединений, относящихся к флавоноидам, простым фенолам и фенилпропаноидам

2 Выделенные вещества идентифицированы с использованием УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также различных химических превращений как салицин, саликортин, нарингенин, прунин, салипурпозид, изосалипурпозид, (+)-катехин, 6"-кумароилизосалипурпозид и триандрин

3 Разработаны подходы к стандартизации сырья и препаратов ивы остролистной с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье — субстанция — лекарственная форма, заключающиеся в анализе флавоноидов

4 Разработана методика качественного анализа коры ивы остролистной, основанная на обнаружении с использованием ТСХ доминирующего флавоноида растения - изосалипурпозида

5 Разработана методика количественного определения изосалипурпозида в коре ивы остролистной с использованием метода ВЭЖХ Ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,60 %

6 Разработаны методики качественного и количественного анализа сырья и препарата «Ивы экстракт жидкий» с использованием тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ Ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида в сырье и препаратах ивы с помощью разработанных методик с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,61 %

7 Разработан способ получения ГСО изосалипурпозида из сырья ивы остролистной (выход 0,1%)

8 На основании экспериментальных данных, полученных в ходе химического изучения и анализа различных образцов коры ивы остролистной (Salix acutifoha Willd) оформлен проект ФС для включения в ГФ XII издания (письмо № 133 от 27 0105), который принят к рассмотрению Фармакопейным государственном комитетом Минздравсоцразвития РФ

Список научных работ по теме диссертации

1 Куркин В А, Флавоноиды как экопротекторы антиоксидаштюго действия / В А Куркин, И Ф Шаталаев, К С Пименов и др // Труды VIII Всероссийского Конгресса «Актуальные проблемы экологии человека» Самара, 2002, С 132

2 Использование тонкослойной хроматографии для идентификации сырья некоторых лекарственных растений / Бонцевич А И, Замесова О Ю, Воробьева Г В // Сборник тезисов докладов 70-й итоговой конференции СНО Самара, 2002, С 55

3 Бонцевич А И , Разработка методик качественного и количественного анализа сырья коры ивы остролистной / А И Бонцевич, - Аспирантский вестник Поволжья, №1/2005 ~ C.-HtD

4 Куркин В А, Сравнительная актопротекторная активность фенштпропаноидов и растительных препаратов / В А Куркин, А В Дубищев, В Н Ежков и др // Фармация, 2005, №5 - С 32-34

5 Браславский В Б, Перспективы использования антибактериальных растительных средств в медицинской практике / В Б Браславский, О Е Правдивцева, А В Куркина и др // Труды X Всероссийского конгресса «Экология и здоровье человека», Самара, 2005, С 42

6 Куркин В А , Флавоноиды как стандартные вещества растений / В А Куркин, Г Г Запесочная, Е В Авдеева // VI симпозиум по фенольным соединениям Тезисы докладов Москва, 2004 ~ С■ ЛС>{

7 The new possibilities in the standardization of the some medicinal plants containing the flavonoids Polyphenols communications 2004, XXII International Conference on Polyphenols Helsinki, Finland, 2004 - p 621- 6'¿'Z

8 Куркин В A, Современные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды / В А Куркин и др //II всероссийский съезд фармацевтических работников Материалы съезда Сочи, 2005 - С <? ЧЬ.

9 Куркин В А, Фармакоэкономическое исследование номенклатуры иммуномодуляторов, представленных на фармацевтическом рынке Самарской области / В А Куркин, В Н Ежков, Е В Авдеева и др И ХШ Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» - сборник материалов конгресса Москва, 2006. - С 711

Подписано в печать 26 04 2007 Формат 60x84/16 Б\*мага офсетная Печать оперативная Уел печ л 1 39 Тираж 100 экз Заказ 432

Отпечатано в типографии ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара, у 7 Революционная, 70, чшера Л Тел 372-00-56,372-00-57