Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение некоторых видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе

На правах рукописи

ХИТЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ИВЫ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

1

АВТОРЕФЕРАТ 1

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск 2012

005012101

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор, Компанцева Евгения Владимировна

Официальные оппоненты:

Оганесян Эдуард Тоникович,

доктор фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой органической химии

Олешко Григорий Иванович,

кандидат фармацевтических наук, профессор, ГБОУ ВПО Пермская ГФА Минздравсоцразвития России, профессор кафедры фармакогнозии

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Самарский ГМУ Минздравсоцразвития России

Защита состоится «28» марта 2012 года в II00 на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

Автореферат разослан « 2£>» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболевания опорно-двигательного аппарата относятся к одной из распространенных патологий среди населения и требуют длительного лечения. Ассортимент лекарственных средств включает достаточно большое число наименований противовоспалительных, хондропротекторных, обезболивающих препаратов. Однако абсолютное большинство из них являются синтетическими препаратами, которые при длительном применении оказывают негативное влияние на желудочно-кишечный тракт, почки, кроветворные органы и др. (Машковский М.Д., 2011). В то же время известно, что природные биологически активные вещества (БАВ) проявляют значительно меньшее или вовсе не проявляют побочного действия. К числу растений, обладающих противовоспалительным и анальгетическим эффектом, относятся различные виды ивы. В настоящее время выявлено также наличие хондропротекторной, гемостатической, антиоксидантной, иммуномодулирующей активности извлечений ивы; пролонгированносгь эффекта; отсутствие ульцерогенности, что, несомненно, является преимуществом перед синтетическими лекарственными средствами. Проведенные до настоящего времени исследования показывают, что фармакологическое действие извлечений ивы обеспечивается не только салицином (природный предшественник кислоты ацетилсалициловой), а комплексом БАВ, состав которых изучен не полностью.

Отличительной особенностью ивы является способность к быстрому росту, заселению субстрата и размножению. Все это обуславливает большие сырьевые запасы данного растения в нашей стране, а также возможность культивирования в различных эдафо-фитоценотических условиях. В настоящее время кора ивы включена в Европейскую, Американскую и Британскую травяные фармакопеи, однако в России разрешены для применения только в качестве биологически активных добавок средства с измельченной корой ивы и экстрактом. Причиной этого является то, что, несмотря на многочисленные сведения по химическому исследованию растения рода Ива, произрастающих в нашей стране, отсутствует единый подход к стандартизации сырья, не обоснован выбор критериев оценки качества, отсутствует научное обоснование применения некоторых видов в медицине. Кроме того, для внедрения в медицинскую практику необходимо доказать пригодность сырья, заготовленного в различных регионах.

В качестве объектов исследования нами выбраны наиболее распространенные на Северном Кавказе виды ивы: белая (Salix alba L.), трехтычинковая (S.triandra L.) и пурпурная (S.purpurea L.)- При этом представляет интерес не только традиционно применяемая кора, но альтернативное сырье - однолетние побеги (ветви с листьями), химическое и фармакологическое изучение которых на данный момент не выполнялось. Проведенные ранее профессором Компанцевым В.А. (1970, 1993) исследования ив Северного Кавказа касались в основном выделения и определения строения отдельных индивидуальных соединений, методы требовали больших затрат времени и сырья. Для включения в нормативную документацию (НД) необходимо использование современных методов качественного и количественного определения БАВ, которые просты в исполнении. Решение этих вопросов позволит обосновать возможность использования некоторых видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе, в медицинскую практику, что является актуальной проблемой для фармацевтической науки и практики.

Цель настоящей работы - изучить химический состав коры и однолетних побегов некоторых видов ивы Северного Кавказа, установить наличие фармакологической активности и провести исследования по стандартизации коры и однолетних побегов ивы белой.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• с помощью современных методов определить качественный и количественный состав основных групп БАВ видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе, оценить его соответствие данным литературы, а также исследовать малоизученные фуппы БАВ;

• подтвердить безопасность и фармакологическую активность извлечений коры и однолетних побегов ивы белой;

• провести исследования по стандартизации для разработки проектов фармакопейных статей (ФС) на сырье «Ивы белой кора» и «Ивы белой побеги» (установить макро- и микродиагностические признаки сырья, числовые показатели, разработать и валидировать методики определения основных групп БАВ, изучить динамику накопления БАВ в сырье в зависимости от времени года и места произрастания, экологическую чистоту и сроки годности).

Научная новизна. Проведено изучение химического состава коры трех видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе. Химическими и физико-химическими методами показано наличие и установлено содержание основных групп БАВ: салицина (0,2-0,9%); дубильных (окисляемых) веществ (6,2-9,4%); флавоноидов (0,2-1,4%); фснолкарбоновых кислот (0,3-0,5%). Изучен качественный и количественный состав ранее не исследованных компонентов дубильных веществ (обнаружены катехин, эпигаллокатехин, эпикатехин, эпикатехингадпат, катехингаллат). Впервые в отечественных ивах установлено наличие и содержание тритерпеновых сапонинов (0,14-1,10%). Амперометрическим методом определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов (7,6-9,6 мг/г).

В ранее не изучавшихся однолетних побегах ивы белой определено содержание некоторых групп БАВ: салицина (0,05-0,19%), флавоновдов (рутина, кверцетина) в сумме 0,3-1,5% в пересчете на рутин; фенолокислот (феруловой, салициловой, коричной) в сумме 0,8%; тритерпеновых сапонинов (0,5%). Установлено высокое содержание дубильных веществ конденсированной группы (катехина, эпигаллокатехина, эпикатехина, эпикатехингаллата, катехингаллата) - в сумме от 3,5 до 9,0% в различные фазы вегетации растения.

На основании химических и фармакологических исследований научно обоснована возможность использования коры и побегов ивы белой в качестве растительного сырья для официальной медицины. Впервые изучена острая токсичность и фармакологическая эффективность водных извлечений из коры и однолетних побегов ивы белой, произрастающих на Северном Кавказе. Выявлена их выраженная антиэкссудативная и антипролиферативная активность, сравнимая с кислотой ацетилсалициловой. Отвары достоверно снижают количество болевых реакций и сопоставимы по активности с метамизолом натрия. При этом отвары коры и побегов ивы белой не вызывают раздражения слизистой оболочки желудка. Доза 1Л)50 превышает 100 мл/кг, что позволяет предположить отсутствие острой токсичности отваров.

Впервые проведены комплексные исследования по стандартизации ивы белой коры и однолетних побегов (определены макро- и микроскопические признаки, числовые показатели, нормы качества с учетом региональных особенностей и

сезонной динамики накопления БАВ, определены предварительные сроки годности и экологическая чистота сырья).

Практическая значимость. Проведенные химические исследования коры трех видов ив Северного Кавказа и однолетних побегов ивы белой свидетельствуют о возможности их использования в качестве источников лекарственного растительного сырья (JIPC). Использование однолетних побегов позволит в значительной мере расширить сырьевую базу и уменьшить наносимый растению при заготовке вред.

Фармакологические исследования показали, что ивы белой кора и побеги являются перспективным лекарственным сырьем для внедрения в медицинскую практику как эффективного и безопасного противовоспалительного средства.

Комплекс выполненных химических и фармакогностических исследований позволил составить проекты ФС на сырье ивы белой. В них включены современные физико-химические методы: тонкослойная (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), спектрофотометрия (СФМ), которые объективны, просты и экспрессны в исполнении. Относительная погрешность выбранных методик количественного определения не превышает 5%. Предложенные подхода по стандартизации могут быть использованы и для сырья других видов ивы.

Внедрение результатов исследования. Методики, включенные в разработанные проекты ФС «Ивы белой кора Cortex Salicis albae» и «Ивы белой побеги Cormus Salicis albae» апробированы в ГУП Ростовской Области «Фармацевтический центр» и ГУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» МЗ Республики Северная Осетия-Алания.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития России.

Положения, выдвигаемые на защиту: - результаты химического исследования изучаемого растительного сырья;

б

- фармакологическое обоснование использования коры и однолетних побегов ивы белой в качестве безопасного и эффективного противовоспалительного лекарственного средства (ЛС);

- нормы качества ивы белой коры и однолетних побегов.

Апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы доложены и обсуждены на 65-й, 66-й и 67-й региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», проводимых на базе ПятГФА (Пятигорск, январь 2010 г., январь 2011 г., январь 2012 г.); на 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов в ВолГМУ (Волгоград, сентябрь 2010 г.). Материалы диссертации были представлены на конкурсе исследовательских проектов и научно-технических разработок молодых изобретателей, проводимом в рамках реализации социально-значимого проекта «Золотой век инноваций» (Ставрополь, март 2010 г.), и на конкурсе «У.М.Н.И.К», проводимом в рамках региональной научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные идеи молодёжи Северного Кавказа - развитию экономики России» (Пятигорск, апрель 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 183 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 247 источников, в том числе 86 иностранных; содержит 39 таблиц, 17 рисунков и 4 приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Массовую заготовку коры изучаемых видов ивы проводили в Ставропольском крае (окрестности г. Пятигорска, берег реки Подкумок). Кроме того, объектом исследования явилось альтернативное сырье - однолетние побеги ивы белой. При исследованиях по стандартизации коры ивы белой были использованы образцы, собранные в различных регионах страны. Для установления сезонной динамики накопления БАВ заготавливали образцы в 2009-2011 гг. весной (после начала

сокодвижения), летом (во время цветения) и осенью (до пожелтения листьев).

7

Химическое изучение коры и однолетних побегов ив Северного Кавказа

Качественное определение биологически активных веществ На первом этапе проводили химический скрининг некоторых групп БАВ в объектах исследования. Его результаты представлены в сводной таблице 1. Темным выделены те соединения, которые ранее не описаны в источниках литературы для изучаемых видов ивы.

Таблица 1- Изучение качественного состава БАВ в объектах исследования

Исследуемая группа БАВ Объект исследования

Кора ивы белой Побеги ивы белой Кора ивы трехтычинковой Кора ивы пурпурной

Феноло-гликозиды салицин 5 не идеитиф. веществ салицин 4 не идентиф. вещества салицин, триандрин 5 не идентиф. веществ салицин 5 не идентиф. веществ

Дубильные вещества лейкоанто-цианидины, эпигаллокатехин, катехин, эпикатехин, эпикатехингаллат, катехингаллат лейкоанто-цианидины, эпигаллокатехин, катехин, эпикатехин, эпикатехингаллат, катехингаллат лейкоанто-цианидины, катехин, эпикатехингаллат лейкоанто-цианидины, эпигаллокатехин, катехин, эпикатехин, эпикатехингаллат, катехингаллат

Флаво-ноиды рутин кверцетин 3 не идентиф. вещества рутин кверцетин 3 не идентиф. вещества 4 не идентиф. вещества нарингин кверцетин изосалипурпозид 2 не идентиф. вещества

Фенол-карбо-новые кислоты к-та феруловая к-та салициловая к-та коричная 2 не идеитиф. вещества к-та феруловая к-та салициловая к-та коричная к-та галловая 1 неидентиф. вещество к-та феруловая к-та паракумаровая к-та коричная 1 неидентиф. вещество к-та кофейная к-та коричная к-та галловая 1 неидентиф. вещество

Сапонины 2 неидентиф. вещества 1 неидентиф. вещество к-та урсоловая 1 неидентиф. вещество к-та олеанолевая

Идентификацию фенольных гликозидов проводили методом тонкослойной

хроматографии. В каждом исследованном образце было подтверждено наличие

салицина, а в коре ивы трехтычинковой - салицина и триандрина.

Наличие в исследуемых образцах дубильных веществ (ДВ) определяли

химическими реакциями с железоаммониевыми квасцами; с кислотой уксусной и

свинца ацетатом. Во всех образцах были определены ДВ конденсированной группы,

8

а в коре ивы трехтычинковой - и конденсированные, и гидролизуемые ДВ. Качественный и количественный состав данной группы полифенольных соединений ранее в объектах исследования не изучался. Интерес к ним вызван выраженной антиоксидантной активностью. Исследования проводили методами ТСХ и бумажной хроматографии (БХ). При обработке хроматограмм кислотой хлористоводородной концентрированной в извлечениях всех объектов исследования были обнаружены ярко-красные зоны адсорбции со значением =0,12-0,15 (лейкоантоцианидины), наибольшие по площади в коре ивы трехтычинковой. Кроме того нами был применен метод ВЭЖХ, позволяющий достоверно разделить компоненты ДВ. Испытания проводили в лаборатории НТЦ «Хроматография» на базе НПО «Химавтоматика», г. Москва. Для ВЭЖХ использовали водные извлечения, полученные без нагревания (во избежание окисления нативных катехинов). Экспериментально подобранный режим элюирования позволил достичь оптимального разделения пиков производных катехина и других БАВ, содержащихся в извлечениях. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты определения производных катехина в исследуемых

образцах методом ВЭЖХ

Название вещества Время удерживания, мин Найдено, %

Кора ивы белой Побеги ивы белой Кора ивы пурпурной Кора ивы трехтычинковой

эпигаллокатехин 15,34 0,410 0,035 0,563 -

кагехин 16,21 1,020 0,110 0,667 0,521

эпикагехин 18,03 0,140 0,028 1,030 -

эпикатехин-галлат 21,23 0,020 0,017 0,472 0,065

катехингаллаг 21,59 0,010 0,069 0,194 -

Экспериментальные данные позволяют судить не только о качественном, но и о количественном составе ДВ в исследуемых объектах. Было обнаружено наибольшее содержание катехина в коре ивы белой, а эпикатехина - в коре ивы пурпурной.

Качественный анализ флавоноидов и фенолокислот в извлечениях коры и однолетних побегов ивы белой проводили методом ТСХ. Полученные данные подтверждают наличие БАВ, описанных в источниках литературы для коры и листьев видов ивы Северного Кавказа, и дополняют их. Так, в коре ивы белой впервые были определены рутин и кверцетин, феруловая, салициловая и коричная кислота; в побегах ивы белой - рутин, феруловая, салициловая, коричная и галловая

9

кислота; в коре ивы трехтычинковой - п-кумаровая и коричная кислота; в коре ивы пурпурной - кверцетин, галловая и коричная кислота.

Сапонины являются практически неизученной группой БАС отечественных видов ивы. Методом ТСХ и с помощью качественных реакций во всех анализируемых образцах сырья ивы были обнаружены тритерпеновые сапонины. По значению Яг и окраске зон адсорбции можно предположить наличие в коре ивы пурпурной кислоты олеаноловой, в коре ивы трехтычинковой - кислоты урсоловой, в коре и побегах ивы белой - неидентифицированных тритерпеновых производных.

Таким образом, результаты скрининга с помощью современных методов не только подтверждают опубликованные ранее сведения о видах ивы, произрастающих на Северном Кавказе, но и расширяют представления о малоизученных группах БАВ (ДВ, фенолокислотах, сапонинах).

Количественное определение биологически активных веществ Имеющиеся сведения о количественном содержании в коре и листьях различных видов ивы БАВ (фенологликозидов, флавоноидов, ДВ) противоречивы, что обусловлено отсутствием единства применяемых методик. Многие из них сложно использовать при дальнейшей стандартизации сырья. Это послужило причиной для определения содержания БАВ в сырье изучаемых видов ивы с помощью современных методик. Результаты представлены в сводной таблице 3.

Таблица 3— Количественное содержание БАВ в объектах исследования

Содержание групп БАВ (среднее значение из трех параллельных определений) Объект исследования

Кора ивы белой Побеги ивы белой Кора ивы трехтычинковой Кора ивы пурпурной

Салицин, % 0,92±0,02 0,19±0,01 0,20±0,01 0,81±0,03

Дубильные (окисляемые) вещества в пересчете на конденсированные, % 8,49±0,42 6,38±0,30 9,38±0,35 6,17±0,29

Флавононды в пересчете на рутин, % 0,16±0,01 1,38±0,02 0,41±0,01 1,36±0,02

Фенолкарбоновые кислоты, % 0,27±0,01 (в пересчете на кислоту феруловую) 0,76±0,03 (в пересчете на кислоту феруловую) 0,29±0,01 (в пересчете на кислоту феруловую) 0,53±0,03 (в пересчете на кислоту кофейную)

Сапонины в пересчете на эсцин, % 0,24±0,01 0,53±0,03 0,14±0,01 1,13*0,06

Водорастворимые антиоксидангы в пересчете на кислоту галловую, мг/г 9,60±0,45 . 2,00 ±0,10 7,60 ±0,35 8,50±0,41

Количественное определение салицина проводили методом ВЭЖХ в изократическом режиме элюирования. Изучались водные извлечения после осаждения ДВ. Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют, что максимальное содержание салицина было обнаружено в коре ивы белой, минимальное - в коре ивы трехтычинковой. В однолетних побегах ивы белой содержание салицина составило 0,19% (практически как в коре ивы трехтычинковой). Таким образом, в объектах исследования определено содержание салицина методом ВЭЖХ, который прост, удобен в исполнении, позволяет одновременно идентифицировать и количественно определить салицин, при этом исключается влияние на результаты анализа других групп БАВ.

Количественное определение суммы дубильных (окисляемых) веществ в анализируемых образцах проводили перманганатометрическим методом согласно требованиям ГФ XI изд.. Поскольку в общей фармакопейной статье пересчет ведется на танин, а в объектах исследования преобладают конденсированные ДВ, пересчет вели на них. Экспериментальные данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют, что максимальное содержание ДВ было обнаружено в коре ивы трехтычинковой и коре ивы белой, минимальное - в коре ивы пурпурной. В однолетних побегах ивы белой содержание ДВ составило 6,4% (практически как в коре ивы пурпурной). Таким образом, с помощью фармакопейного метода определено количественное содержание суммы дубильных (окисляемых) веществ.

Содержание флавоноидов в объектах исследования определяли методом дифференциальной СФМ, основанным на реакции образования комплекса с алюминия хлоридом. Пересчет вели на рутин, поскольку максимум поглощения для спиртовых извлечений исследуемых образцов находился в области максимума поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом (410 нм). Полученные результаты представлены в таблице 3. Максимальное содержание флавоноидов обнаружено в побегах ивы белой и коре ивы пурпурной (около 1,4%), минимальное — в коре ивы белой — менее 0,2%. Для данных видов ивы количественное содержание флавоноидов ранее не определялось СФМ методом, который прост в исполнении и на данный момент включен в большинство НД на ЛРС.

Ввиду того, что нами не найдены данные о количественном содержании в объектах исследования фенолокислот (ФК), их количественное определение проводили экстракционно-спектрофотометрическим методом. Он используется в

случае высокого содержания в сырье флавоноидов. Содержание пересчитывали на доминирующий компонент, выявленный при ТСХ. Результаты определения представлены в таблице 3. Содержание ФК в образцах коры ивы белой и ивы трехтычинковой (в пересчете на кислоту феруловую) составило около 0,3%. В побегах ивы белой оно оказалось выше (0,8%). В коре ивы пурпурной было обнаружено 0,5% ФК в пересчете на кислоту кофейную.

Для количественного определения тритерпеновых сапонинов (ТС) осуществляли селективную экстракцию агликонов ТС хлороформом. Далее проводили спектрофотометрическое определение продуктов их взаимодействия с кислотой серной концентрированной при длине волны 321 нм. Поскольку задачей исследования не являлось установление структуры ТС, то пересчет вели на сапонин, который по данным литературы имеет наиболее близкий максимум поглощения в УФ-свете - эсцин. Содержание ТС (таблица 3) оказалось максимальным в коре ивы пурпурной, минимальным - в коре ивы трехтычинковой.

Также в связи с наличием в сырье больших количеств фенольных соединений, обладающих выраженным антиоксидантным действием, амперометрическим методом было определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов. Максимальным оно оказалось в коре ивы белой.

В качестве характерных отличий коры трех видов ивы можно выделить высокое содержание дубильных (окисляемых) веществ в коре ивы трехтычинковой. Кора ивы пурпурной содержит в значительном количестве флавоноиды, фенолокислоты и сапонины. Кора ивы белой отличается высоким содержанием салицина и дубильных (окисляемых) веществ, в целом именно она обладает наивысшей антиоксидантной активностью. Побеги ивы белой имеют богатый химический состав (высокое содержание флавоноидов, дубильных (окисляемых) веществ, фенолокислот). Это является предпосылкой для более глубоких дальнейших их исследований. Важно подчеркнуть экологическую направленность данного решения: использование молодых побегов позволит уменьшить наносимый растению при заготовке вред. Возможный объем сырьевой базы побегов существенно больше, чем коры. Кроме того, процесс их сбора значительно менее трудоёмкий.

Таким образом, в результате исследований был определен качественный состав и количественное содержание БАВ в коре и побегах ивы белой, коре ивы

трехтычинковой и ивы пурпурной. Полученные данные дополняют сведения о химическом составе сырья ивы: изучены компоненты ДВ, подтверждено наличие салицина, флавоноидов, фенолокислот, в том числе нескольких ранее не описанных Для объектов исследования соединений, впервые в отечественных видах ивы определено содержание сапонинов. По-видимому, комплекс обнаруженных БАВ обеспечивает суммарный фармакологический эффект и преимущества применения извлечений ивы перед синтетическими ПВС.

Фармакологическое изучение извлечений коры и однолетних побегов ивы белой

На сегодняшний день в литературе имеется большой объем информации о фармакологической активности коры и листьев различных видов ивы. Научными исследованиями доказана эффективность коры зарубежных ведов ивы при остеоартрозе, положительная динамика при радикулите (СЬпЛ^к Б., 2007). Однако во многих публикациях отсутствуют сведения о происхождении и способе получения экстракта, изучаемом виде ивы и содержании в нем БАВ. Для коры и побегов видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе, фармакологическое изучение не проводилось. В связи с этим одной задач нашего исследования явилось подтверждение эффективности и безопасности коры и однолетних побегов ивы белой. При выборе сырья именно этого вида ивы руководствовались данными о химическом составе и географической распространенностью не только на Северном Кавказе, но и на большей части Европейской территории России. Кроме того, в предварительных скрининговых исследованиях именно извлечения коры и побегов ивы белой проявили наибольшую противовоспалительную активность по сравнению с другими изучаемыми объектами.

Фармакологические исследования проводились на кафедрах фармакологии и биологической химии Пятигорской ГФА совместно с к.ф.н. доцентом Лысенко Т.А., к.ф.н. Сергеевой Е.О. и асп. Савенко И.А.. Для проведения экспериментов получали наиболее часто применяемую в народной медицине лекарственную форму извлечений ивы - отвары (приготовленные в соответствии с требованиями ГФ XI изд.) и вводили их натощак перорально с помощью зонда. Объем выборки п=6 в каждой группе животных (для каждой модели указан вид и пол). Достоверность расчетных результатов оценивали параметрически по ^критерию Стьюдента. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.

В экспериментах было установлено, что:

1. Доза IX)50 отваров, определенная методом Кербера на мышах и крысах обоих полов, превышает 100 мл/кг, что позволяет предположить отсутствие острой токсичности.

2. В опытах на крысах (самцах) на модели хронического пролиферативного воспаления (ватной гранулемы) отвар коры и побегов ивы белой обладает антиэкссудативной и антипролиферативной активностью, сравнимой с лекарственным средством - кислотой ацетилсалициловой (АСК), а отвар побегов - и с отваром корневищ сабельника (таблица 4). Вводимая доза составляла 17 мл/кг, что соответствует приему человеком 200 мл отвара в сутки.

3. Отвары коры и побегов ивы белой в отличие от кислоты ацетилсалициловой и отвара сабельника в опытах на крысах (самцах) не вызывают раздражения слизистой желудка, определяемого визуально (таблица 4). Следовательно, их длительное пероральное применение при воспалительных заболеваниях более безопасно. Это обусловлено высоким содержанием ДВ конденсированной группы, которые образуя комплекс с белками слизистой оболочки желудка, защищают ее от повреждения.

Таблица 4 -Противовоспалительная активность и ульцерогенное действие отваров коры и побегов ивы белой и препаратов сравнения

Группа животных Экссудация (мг) Пролиферация (МГ) Оценка ульпсрогенности

* контроль 295,48±5,31 49,62±2,70 0 баллов

# АСК, 125мг/кг 190,54±21,63* 30,06±1,96* 3 балла

§ отвар корневищ сабельника, 17 мл/кг 182,06±4,27* 25,84±0,75* 1 балл

отвар коры ивы белой, 17 мл/кг 210,35±7,76*§ 39,49±3,47*§ 0 баллов

отвар побегов ивы белой, 17 мл/кг 185,61±0,79* 32,56±3,85* 0 баллов

Примечание * - достоверно относительно контроля; # - достоверно относительно АСК; § - достоверно относительно отвара корневищ сабельника

4. Огвар коры и побегов ивы на модели химического болевого раздражения в опытах на мышах (самцах) проявляют анальгетическую активность, сопоставимую с

препаратом сравнения метамизолом натрия (таблица 5).

Таблица 5 - Результаты определения аиальгетической активности отваров _коры и побегов ивы белой и препарата сравнения_

Объект М±т Снижение числа корчей относительно контрольной группы, %

Контроль 22,Ш,7 -

Метам изол натрия, 125 мг/кг 10,0±0,5* 54,5%*

Отвар коры ивы белой, 17 мл/кг 10,0±0,7* 54,5%*

Отвар побегов ивы белой, 17 мл/кг 11,0±0,9* 50%*

Примечание М- выборочное среднее, т - ошибка среднего; *- достоверно относительно контроля

Таким образом, по предварительным исследованиям и отвар коры ивы белой, и отвар побегов ивы белой обладают противовоспалительным и анальгетическим действием, при этом не токсичны и не вызывают раздражения слизистой оболочки желудка. В связи с этим следует рассматривать их как перспективное ЛРС для применения при заболеваниях опорно-двигательного аппарата. В целом отвар побегов ивы белой оказался эффективнее отвара коры ивы белой по угнетению обеих стадий воспалительного процесса. Возможно, это обусловлено более высоким содержанием в побегах флавоноидов, для которых характерна противовоспалительная активность. Данный факт подтверждает гипотезу о том, что комплексное фармакологическое действие извлечений ивы обеспечивает не только салицин.

Исследования по стандартизации ивы белой коры и однолетних побегов Для внедрения ивы белой коры и однолетних побегов в широкую медицинскую практику необходимы комплексные исследования по их стандартизации и составление проекта НД. С этой целью нами были предложены методы контроля и обоснованы нормы качества коры и побегов ивы белой.

На кафедре фармакогнозии Пятигорской ГФА совместно с профессором Поповой О.И. были определены основные морфологические характеристики коры и побегов ивы белой (цвет и характер поверхности, запах и вкус), установлена совокупность микродиагностических признаков, необходимых для идентификации коры: многоугольная форма и коричневатая окраска клеток наружной коры (рис. 1 А), наличие пигментных (пробковых) пятен (рис. 1 Б); на поперечном срезе (рис. 2) в пластинчатой колленхиме имеются обособленные овальные скопления клеток светлой окраски; во внутренней коре - группы оранжево-желтых толстостенных лубяных волокон, образующих концентрические пояса; наличие в паренхиме коры клеток с флобафенами; лубяные полокна окружены кристаллоносной обкладкой (рис. 3); характерные формы кристаллов-друзы, призматические.

При рассмотрении анатомического строения побега (рис. 4) можно выделить три блока тканей, характерные для древесных растений: покровную ткань, кору, центральный цилиндр (рис. 4 А-Г). Проводящая система также имеет типичное строение.

А- покровная ткань Б - пигментное пятно

Рисунок 1 - Препараты с поверхности коры ивы (увеличение 160)

Рисунок 3 - Кристаллические включения в коре ивы (увеличение 160)

1 - чечевички, 2 - обособленные овальные скопления клеток (группы лубяных волокон), 3 -сердцевинные лучи, 4 - концентрические пояса одревесневших лубяных волокон, 5 — флобафены Рисунок 2-Фрагмент поперечного среза коры ивы (увеличение 160)

А - Схема поперечного среза (ув.80) Б - Перидерма и первичная кора (ув.200)

Д-Поперечный срез листа (ув. 160)

; ■им—

ъ - .шШШЯШ

Е - Нижний эпидермис (ув.300)

I

Ж

Яр:, їЩЖ'ЗЯШЩ

ї." ч - ,

II »•

¡¡¡і і

щг.

Шй

ж

3 - Край листа. Желёзка (ув. 160)

Ж - Кристаллические включения (ув. 160)

Рисунок 4 - Анатомическое строение побега ивы белой

Лист ивы белой дорзовентрапьный. Форма черешка ладьевидная (4Д). При рассмотрении верхнего и нижнего эпидермиса (рис. 4 Е) были отмечены характерные признаки: замыкающие клетки некоторых устьиц заполнены оранжево-коричневым содержимым. Волоски с обеих сторон листа простые, одноклеточные, полые, удлиненные, иногда согнутые. У основания волосков образуется розетка из клеток розетка из клеток эпидермиса, заполненных оранжево-коричневым содержимым.

Кристаллические включения представлены друзами кальция оксалата, расположенными в пространстве между жилками, и призматическими кристаллами, расположенными вдоль жилок (рис. 4 Ж). По краю листа на вершине каждого зубчика располагаются крупные желёзки (эмергенцы) щитковидной формы, состоящие из темно-коричневых клеток (рис. 4 3).

Комплекс морфолого-анатомических характеристик позволяет подтвердить подлинность ивы белой коры и побегов.

Для идентификации ЛРС в проекты ФС были включены химические реакции и ТСХ (в коре ивы белой - на салицин и конденсированные ДВ; в побегах — на салицин, флавоноиды и конденсированные ДВ). Нормирование качества коры ивы белой предложено проводить по количественному содержанию 2-х групп фармакологически активных веществ: салицина (ВЭЖХ) и ДВ (фармакопейная методика - перманганатометрия). Для методики определения содержания салицина проведена валидационная оценка (таблица 6).

Таблица 6- Результаты валидационной оценки ВЭЖХ-методики количественного определения салицина

Показатель Норматив Результат Соответствие

Специфичность однородность пика пик салицина четко отделяется от пиков др. БАВ +

Линейность коэффициент корреляции < 0,99 0,9994 +

Огкрываемость 11=97-103% для содержания вещесгва<1% 98,64 +

Правильность ^критерий Стьюдента < 2,57 +

Повторяемость относительное стандартное отклонение ИБО < 3% 2,7% +

Нормирование качества побегов ивы белой было предложено проводить по 2 группам фармакологически активных веществ: флавоноидам (дифференциальная СФМ) и ДВ (перманганатометрическое титрование).

Далее было проведено обоснование норм качества предлагаемого ЛРС. При этом руководствовались результатами изучения сезонной и межгодовой динамики накопления БАВ за период 2009-2011 гг. (таблица 7). При нормировании коры ивы белой также изучали накопление БАВ в коре ивы белой, заготовленной в различных регионах России (таблица 8).

Таблица 7 - Сезонная динамика накопления БАВ в коре и побегах ивы белой

Год загот. сырья Дубильные (окисляемые) вещества, % Фенологликозиды, % Флавоноиды, %

весна 1 лето 1 осень весна 1 лето 1 осень весна 1 лето 1 осень

Кора ивы белой

2009 8ДЗ 16,31 10,16 1,50 0,46 0,42 0,17 0,14 0,17

2010 8,09 8,36 6,92 0,94 0,44 0,41 0,16 0,08 0,07

2011 7,56 7,69 8,52 0,95 0,51 0,48 0,21 0,11 0,15

Побеги ивы белой

2009 5,70 7,99 5,28 0,06 0,06 0,055 1,52 1,38 1,46

2010 6,33 4,81 4,04 0,19 0,12 о,п 1,27 0,59 0,31

2011 7,52 7,34 9,01 0,10 0,08 0,07 0,81 0,54 0,77

Таблица 8 - Результаты количественного определения БАВ в коре ивы белой, _заготовленной в различных регионах России

Определяемая группа БАВ Регион заготовки сырья

Волгогр. обл Карачаево-Черкесская Респ. Красиод. край Курская обл. Сгаврои. край Томская обл.

Сялнцнн, % 1,00 1,06 0,41 1,26 1,50 1,02

ДВ, V. 5,50 7,44 9,21 10,60 7,64 9,47

В результате были обоснованы нормы содержания БАВ, которые не превышают минимальных полученных значений (выделены в таблицах темным).

Также в образцах сырья были определены необходимые числовые показатели, что позволило обосновать нормативы, внесенные в проект ФС. На базе филиала ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в г. Пятигорске CK» была установлена радиологическая чистота коры и побегов ивы белой. В условиях естественного хранения были определены сроки годности ивы белой коры и побегов, которые составили 2 года.

Проведенные исследования позволили обосновать нормы качества исследуемого ЛРС (таблица 9) для создания проектов ФС «Ивы белой кора Cortex Salicis albae» и «Ивы белой побеги Cormus Salicis albae».

19

Показатели Методы Нормы (кора) | Нормы (побеги)

Внешние признаки Визуальный, ГФХ1, вып.1,с.252-267 Соответствие морфологическим признакам

Микроскопия Микроскопический ГФХ1, вып. I.e. 277 Соответствие анатомическим признакам

Подлинность: Салицин тех Наличие красновато-розовой зоны адсорбции со значением Яс 0,48-0,56, соотв. СОВС салицина

ВЭЖХ соответствие по времени удерживания с пиком СОВС салицина -

Дубильные вещества Реакция с железо-аммониевыми квасцами - черно-зеленое окрашивание

Флавоноиды Качественная реакция -цианидиновая проба; -тех - -красное окрашивание; -наличие зоны адсорбции коричневато-желтого цвета со значением Яг 0,47-0,55, соотв. СОВС рутина

Чвсловые показателя

Количественное определение: Салицин ВЭЖХ Не менее 0,35%

Дубильные (окисляемые) вещества Перманганатометрия ГФ XI, вып. 1, стр. 286 Не менее 5,0% Не менее 4,0%

Сумма флавоиоидов в пересчете на рутин Дифференциальная СФМ по реакции комплексообразования с алюминия хлоридом - Не менее 03%

Влажность ГФ XI, вып. 1, стр. 285 Не более 10%

Зола обща* ГФХ1, вып. 2, стр. 24 Не более 10%

Зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной ГФ XI, вып. 2, стр. 25 Не более 1%

Содержание частиц, изменивших окраску и др. частей, не соответств. описанию ГФХ1, вып. 1, стр. 275 Не более 5%

Органическая примесь ГФ XI, вып. 1, стр. 275 Не более 1%

Минеральная примесь ГФ XI, вып. 1, стр. 275 Не более 0,5%

Микробиологическая чистота ГФХП,ч.1,с. 160 ОФС 42-0067-07 Категория 4Б

Масса содержимого упаковки ОСТ 64-492-85 Соответствует требованиям ОСТ

Срок годности 2 года

Условия хранения В сухом, защищенном от света месте

Общие выводы

1. Проведены химические исследования коры трех видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе: ивы белой (Salix alba L.), ивы трехтычинковой (S.triandra L.) и ивы пурпурной (S.purpurea L.). Подтверждено наличие в объектах исследования ряда БАВ. Впервые обнаружены:

• в коре ивы белой: эпигаллокатехин, катехин, эпикатехин, эпикатехингаллат, катехингаллат, рутин, кверцетин, феруловая, салициловая и коричная кислота;

• в коре ивы трехтычинковой: катехин, эпикатехингаллат, п-кумаровая, феруловая, коричная и урсоловая кислота;

• в коре ивы пурпурной - эпигаллокатехин, катехин, эпикатехин, эпикатехингаллат, катехингаллат, кверцетин, галловая, коричная и олеаноловая кислота.

2. С помощью современных методов установлено количественное содержание в коре трех видов ивы некоторых групп БАВ: салицина - от 0,2 до 0,9% (ВЭЖХ); суммы дубильных (окисляемых) веществ - от 6,2 до 9,4% (перманганатометрия); суммы флавоноидов - от 0,2 до 1,4% (дифференциальная СФМ). Впервые проведено количественное определение в объектах исследования фенолкарбоновых кислот экстракционно-спектрофотометрическим методом (03-0,5%) и тритерпеновых сапонинов (0,14-1,10%). Амперометрическим методом определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов (7,6-9,6 мг/г). Химический состав свидетельствует о возможности использования коры ивы белой, ивы трехтычинковой и ивы пурпурной в качестве лекарственного растительного сырья.

3. Впервые изучены некоторые группы БАВ однолетних побегов ивы белой. Установлено высокое содержание дубильных веществ конденсированной группы (эпигаллокатехина, катехина, эпикатехина, эпикатехингаллата, катехингаллата) - в сумме от 3,5 до 9,0% в различные периоды заготовки; флавоноидов (рутина, кверцетина и 2 неидентифицированных веществ) в сумме 0,5-1,5% в пересчете на рутин; фенолокислот (феруловой, салициловой, коричной) в количестве 0,8% в пересчете на кислоту феруловую; тритерпеновых сапонинов (0,53%). Содержание салицина составило 0,05-0,19%. Оно ниже, чем в коре ивы белой (традиционном сырье), однако возможный объем заготовок существенно больше. Использование однолетних побегов позволит в значительной мере расширить сырьевую базу и уменьшить наносимый растению вред.

4. Изучена острая токсичность и фармакологическая эффективность отваров коры и однолетних побегов ивы белой (одного из наиболее распространенных на территории России видов). В предварительных исследованиях выявлена выраженная антиэкссудативная и антипролиферативная активность отваров коры и побегов ивы белой, сравнимая с кислотой ацетилсалициловой. Отвары достоверно снижают количество болевых реакций и сопоставимы по активности с метамизолом натрия. При этом отвары коры и побегов ивы белой не вызывают раздражения слизистой оболочки желудка. Доза LD50 превышает 100 мл/кг, что позволяет предположить отсутствие острой токсичности отваров. В связи с этим кору и однолетние побеги ивы белой следует рассматривать как перспективное лекарственное растительное сырье для включения в Государственный Реестр JIC РФ как эффективных и безопасных противовоспалительных лекарственных средств, применяемых при заболеваниях опорно-двигательного аппарата.

5. Впервые проведены комплексные исследования по стандартизации ивы белой коры и однолетних побегов (определены макро- и микроскопические признаки, числовые показатели, нормы качества с учетом региональных особенностей и сезонной динамики накопления БАВ, определены предварительные сроки годности и экологическая чистота сырья). В проекты нормативной документации включены методы ТСХ, ВЭЖХ и СФМ, которые современны, просты и относительно экспрессны в исполнении. Относительная погрешность выбранных методик количественного определения не превышает 5%. Для ВЭЖХ-методики определения салицина доказана валидность по показателям специфичность, линейность, правильность, повторяемость и пригодность хроматографической системы.

6. Подготовлены проекты ФС на сырье «Ивы белой кора» и «Ивы белой побеги», что является необходимым этапом для внедрения данных видов лекарственного растительного сырья в широкую медицинскую практику. Предложенные подходы по стандартизации могут быть использованы и для сырья других видов ивы.

Публикации по теме диссертации:

1. Морфолого-анатомическое изучение коры ивы белой (Salix alba L.), произрастающей в различных регионах Российской Федерации / Е.В. Компанцева, О.И. Попова, О.О. Хитева [и др.] // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье».-2010.-№2.-С.156-159 (издание, рекомендованное ВАК).

2. Изучение противовоспалительной активности водных извлечений из коры и однолетних побегов ивы белой / Т.А.Лысенко, О.О. Хитева [и др.] // Вестник новых

22

медицинских технологий. - 2011.- Т.18, №3. - С.288-290 (издание, рекомендованное ВАК).

3. Фитохимическое изучение коры ивы белой (Salix alba L.), произрастающей в различных регионах Российской Федерации / Е.В. Компанцева, О.И. Попова, А.И. Игнатенко, О.О. Хитева [и др.] Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы 7 междунар. конф. 10-11 апреля 2009 г..-Минск: БГУ, 2009. -С.265-268.

4. Компанцева, Е.В. Морфолого-анатомическое изучение однолетних побегов ивы белой (Salix alba L.) / Е.В. Компанцева, О.И. Попова, О.О. Хитева // Здоровье и образование в XXI веке: науч. тр. 10 междунар. конгресса 9-12 декабря 2009 г..- М.: РУДН, 2009.-С. 719-721.

5. Получение и исследование водных извлечений из коры ивы белой / О.О. Хитева [и др.] // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ: материалы 4 Всерос. с междунар. участием науч.-метод. конф. «Фармобразование-2010» 20-21 апреля 2010 г..-Воронеж: ВГУ, 2010.-С.391-393.

6. Компанцева, Е.В. Сравнительное фитохимическое изучение коры трех видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе / Е.В. Компанцева, О.О. Хитева И Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы 8 междунар. конф. 2-3 апреля 2010 г..-Минск: БГУ, 2010.- Ч. 2.-С.144-146.

7. Изучение противовоспалительного действия водных извлечений из коры ивы белой / О.О. Хитева [и др.] // Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов: тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием 20-22 мая 2010г.- Бюллетень Федерального Центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова.-2010.-№2.-С.244.

8. Хитева, О.О. Сравнительное фитохимическое изучение коры и однолетних побегов ивы белой (Salix alba L.), произрастающей на Северном Кавказе / О.О. Хитева // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: материалы 68откр. науч.-практ. конф. 9-13 сентября 2010 г.. - Волгоград: ВолГМУ, 2010. - С. 324-325.

9. Хитева, О.О. Сравнительное морфолого-анатомическое изучение коры трёх видов ивы, произрастающих на Северном Кавказе / О.О. Хитева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск. ГФА. - Пятигорск, 2010. - Вып.65.- С.139-142.

10. Компанцева, Е.В. Определение полифенольных соединений в коре и однолетних побегах ивы белой (Salix alba L.) / Е.В. Компанцева, О.О. Хитева // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорск.ГФА,- Пятигорск, 2011. - Вып. 66. - С.208-210.

11. Анальгетическая активность отваров коры и однолетних побегов ивы белой / О.О. Хитева [и др.] II Успехи современного естествознания.- 2012.-№2.

<

ХИТЕВА ОЛЬГА ОЛЕГОВНА

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ИВЫ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 21.02.2012 г. Формат бумаги 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 2'О

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)