Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование эхинацеи пурпурной как источника иммуномодулирующих лекарственных средств

На правах рукописи

Вельмяйкина Екатерина Ивановна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭХИНАЦЕИ ПУРПУРНОЙ КАК ИСТОЧНИКА ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

16 МАП ДШ

Самара-2013

005059645

Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

Киселёва Татьяна Леонидовна - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии, профессор кафедры

Пупыкина Кира Александровна — доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, профессор кафедры

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « У » МИМЛ-_ 2013 г. в /Р СО часов на заседании

диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171.

Автореферат разослан « с/_ ' 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время в условиях повышенной техногенной нагрузки особую значимость приобретают иммуномодулирующие фитопрепараты, которые показаны для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний, в том числе экологически обусловленных.

В этой связи разработка и создание лекарственных препаратов для коррекции иммунодефицитов становится все более значимым и актуальным направлением исследований. Однако среди препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием и представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации, преобладают лекарственные средства синтетического происхождения. Эти препараты оказывают выраженное стимулирующее действие на иммунную систему, однако при этом они не лишены побочных эффектов. В этом отношении средства на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) обладают рядом преимуществ, поскольку характеризуются эффективностью, безопасностью, широтой терапевтического действия и низким риском развития аллергических реакций (Киселева Т.Л. и др., 2008; Куркин В.А., 2007; Самылина И.А. и др., 2003; 2010).

В этой связи перспективным является использование сырья эхинацеи пурпурной [.Echinacea purpurea (L.) Moench.]. Лекарственные препараты на основе данного растения, благодаря наличию в химическом составе фенилпропаноидов, оказывают не только иммуномодулирующее действие, но также обладают противовоспалительными, ранозаживляющими, антимикробными,

противовирусными свойствами. Однако на фармацевтическом рынке Российской Федерации доминируют дорогостоящие зарубежные лекарственные средства («Иммунал», «Эхинацея Гексал» и др.) и биологически активные добавки на основе эхинацеи. Кроме того, отсутствуют отечественные иммуномодуляторы на основе данного растения, применяемые в педиатрической практике.

На фоне дефицита в структуре фармацевтического рынка РФ эффективных отечественных лекарственных средств на основе эхинацеи следует отметить и отсутствие общих подходов в анализе сырья данного растения, унифицированных методик качественного и количественного анализа препаратов эхинацеи. Это

обстоятельство также не способствует решению проблемы лекарственного обеспечения населения РФ.

Таким образом, актуальными являются углубленное фармакогностическое изучение эхинацеи пурпурной и разработка новых отечественных импортозамещающих лекарственных препаратов на основе данного растения, обладающих иммуномодулирующим действием. Значимой является и возможность расширения сырьевой базы растения с учетом проблемы безотходного использования растительных ресурсов. Решение обозначенных проблем будет способствовать реализации Стратегии лекарственного обеспечения населения Российской Федерации на период до 2025 г.

Цель работы и основные задачи исследования. Целью настоящей работы является фармакогностическое исследование эхинацеи пурпурной, направленное на разработку и совершенствование методов стандартизации сырья и лекарственных препаратов на основе данного растения.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести анатомо-гистологическое исследование различных органов эхинацеи пурпурной и ее близкородственных видов.

2. Провести сравнительное фотохимическое исследование различных органов эхинацеи пурпурной.

3. Изучить флавоноидный состав надземной части эхинацеи пурпурной, культивируемой в Самарской области.

4. Разработать методики качественного анализа и количественного определения действующих веществ травы эхинацеи пурпурной свежей.

5. Обосновать состав и технологию новых лекарственных средств на основе эхинацеи пурпурной («Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки»).

6. Разработать методики качественного и количественного анализа лекарственных препаратов эхинацеи пурпурной («Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки»).

7. Определить показатели качества разработанных лекарственных препаратов («Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки»).

8. Разработать проекты фармакопейных статей (ФС) на эхинацеи пурпурной траву и эхинацеи пурпурной траву свежую.

9. Обосновать целесообразность создания лекарственных средств на основе корневищ с корнями эхинацеи пурпурной.

Научная новизна. Сравнительное исследование анатомо-гистологического строения надземных и подземных органов эхинацеи пурпурной позволило выявить диагностические признаки сырья данного растения. Впервые изучено строение черешка листа (петиолярная анатомия) эхинацеи пурпурной и ее близкородственного вида — рудбекии глянцевитой, не являющейся фармакопейным растением, но также культивируемой в РФ. Изучены вопросы таксации и предложен метод анализа петиолярной анатомии, позволяющий отличать сырьё целевого вида от примесного близкородственного растения.

Изучение химического состава эхинацеи и данные микроскопического исследования позволили обозначить перспективу и целесообразность применения корневищ с корнями эхинацеи пурпурной в качестве лекарственного растительного сырья в рамках комплексного использования растения.

Впервые из травы эхинацеи пурпурной в результате фотохимических исследований выделены и идентифицированы флавоноиды — никотифлорин (3-0-рутинозид кемпферола) и рутин (З-О-рутинозид кверцетина).

Разработан состав и способ получения новых лекарственных препаратов на основе эхинацеи пурпурной. «Эхинацеи пурпурной сироп» - оригинальный препарат эхинацеи, предназначенный для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний у взрослых и детей с первого года жизни (получен Патент РФ на изобретение № 2468810 от 10 декабря 2012 г. «Лекарственное средство для лечения иммунодефицитных состояний»; заявка № 2011109427, приоритет изобретения 11 марта 2011 г.; Патент на полезную модель № 109018 от 10 октября 2011г. «Устройство для извлечения биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья»; заявка № 2011105616, приоритет

полезной модели 15 февраля 2011 г.; удостоверение на рационализаторское предложение № 207 от 20 июня 2012 г. «Способ получения сиропа эхинацеи пурпурной»).

Предложен состав и способ получения лекарственного препарата «Эхинацеи экстракта таблетки».

Разработаны методики анализа сырья и лекарственных препаратов эхинацеи пурпурной, основанные на определении действующих веществ (суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту) с применением методов тонкослойной хроматографии (ТСХ) и УФ-спектроскопии.

Практическая значимость. Разработан раздел «Микроскопия» в проекте ФС на траву эхинацеи пурпурной свежую, а также раздел «Микроскопия» на перспективное ЛРС - корни эхинацеи пурпурной. Переработан и дополнен раздел «Микроскопия» в ФС на траву эхинацеи пурпурной воздушно-сухую.

Предложены методики качественного и количественного анализа различных видов сырья эхинацеи пурпурной, определены показатели их качества, которые нашли отражение в разработанных и принятых на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» ФС «Эхинацеи пурпурной трава» и «Эхинацеи пурпурной трава свежая» (вх. № 1018 от 28.01.13г.).

Разработаны состав, способ получения, определены показатели качества и методы их оценки для лекарственных препаратов на основе эхинацеи пурпурной: «Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки».

Предложены методики качественного и количественного анализа действующих веществ в лекарственных формах, отвечающие принципам унификации, предъявляемым к современному фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др. 1994; 2006).

Результаты диссертационных исследований используются в учебных процессах на кафедрах фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, фармацевтической технологии, управления и экономики фармации, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, ГБУ

здравоохранения «Центр контроля качества лекарственных средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы».

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России (№ Гос. регистрации 01200900568).

Положения, выдвигаемые па защиту.

1. Результаты анатомо-гистологических исследований различных органов эхинацеи пурпурной и ее близкородственных видов.

2. Результаты фотохимического исследования различных видов сырья эхинацеи пурпурной.

3. Результаты исследований по разработке способов получения лекарственных препаратов на основе эхинацеи («Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки»).

4. Результаты исследований по стандартизации сырья и лекарственных препаратов эхинацеи пурпурной и разработке методик их качественного и количественного анализа.

5. Данные по изучению показателей качества разработанных лекарственных препаратов («Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки»). Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на XIV

Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2009); XV Всероссийской конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2010); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2011); II Съезде натуротерапевтов России (г. Москва, 2011); конференциях дипломированных специалистов «Аспирантские чтения «Молодые ученые — медицине» (г. Самара, 2010; 2011; 2012). Выполнение фрагментов диссертационного исследования осуществлялось по линии программы «Участник Молодежного Научно-Инновационного Конкурса - 2009» («У.М.Н.И.К.»), Самарского областного конкурса «Молодой ученый - 2012».

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 19 научных работах, из них 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором. Автором выполнены исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических особенностей строения различных органов эхинацеи, выявлены основные диагностические признаки. Разработаны методики анализа различного вида сырья эхинацеи пурпурной, предложены состав и технология получения препаратов «Эхинацеи пурпурной сироп» и «Эхинацеи экстракта таблетки». Автором разработаны методики качественного и количественного анализа предложенных препаратов с применением методов ТСХ и УФ-спектрофотометрии. Изучена стабильность препарата «Эхинацеи пурпурной сироп», определены основные показатели его качества. Автором разработаны проекты ФС «Эхинацеи пурпурной трава» и «Эхинацеи пурпурной трава свежая».

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 49 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы 3-5), общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 170 источников, из которых 50 — на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, показаны научная новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту. Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований эхинацеи пурпурной, в котором систематизированы сведения по изучению химического состава, фармакологических свойств, применению в медицине, стандартизации сырья и препаратов на основе данного растения. В главе 2 приведена характеристика объектов и методов исследования. Глава 3 отражает результаты анатомо-гистологического исследования различных органов эхинацеи пурпурной. В 4 главе обсуждаются результаты сравнительного изучения химического состава и

вопросы стандартизации различных видов сырья эхинацеи пурпурной. В главе 5 приведены результаты исследования по стандартизации и созданию лекарственных препаратов на основе сырья эхинацеи пурпурной.

В Приложение вынесены акты внедрения, проекты ФС на траву эхинацеи свежую и воздушно-сухую, патент РФ на изобретение, патент РФ на полезную модель, рационализаторское предложение, а также таблицы, отражающие характеристику иммуномодуляторов, представленных на фармацевтическом рынке РФ и Самарской области.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Анатомо-гистологическое исследование различных органов эхинацеи пурпурной

В рамках диссертационных исследований нами проведены анатомо-гистологические исследования некоторых органов эхинацеи пурпурной. При этом изучены диагностические признаки подземных органов данного растения, применяемых в качестве ЛРС за рубежом и являющихся перспективным видом сырья в РФ.

V, ,1 л

113 *

/ А ЗшЕ. и

ДО. сд %

Рис. 1. Диагностические признаки некоторых вегетативных органов эхинацеи

Обозначения: А-Г - корни диаметром до 1 мм; Д-3 - корни диаметром более 4 мм; И-М -эпидермальные особенности рудбекии глянцевитой; Н-Р - эпидермальные особенности эхинацеи пурпурной.

Кроме того, для повышения качества стандартизации используемого сырья травы эхинацеи пурпурной нами проведено сравнительное анатомо-гистологическое исследование близкородственных видов эхинацеи. Были изучены вопросы таксации и предложен метод анализа петиолярной анатомии, позволяющий отличать сырьё целевого вида от примесного близкородственного растения. Для выявления диагностических особенностей строения, позволяющих отличать родственные таксоны, нами впервые изучены особенности петиолярной анатомии эхинацеи пурпурной и ее примесного вида - эхинацеи глянцевитой.

Анализ корней различного диаметра изучаемого растения позволил выявить в качестве диагностических особенностей корней эхинацеи пурпурной следующие признаки:

1. Корни вторичного строения непучкового типа (рис. 1: А, Д).

2. В коровой части корней (с! > 4 мм), над вторичной флоэмой, имеется кольцо секреторных клеток (рис. 1 Г), древесина таких корней имеет годичные кольца (рис. 1 Д).

3. В корнях (с! = 4 мм и >) имеется небольшая сердцевина (рис. 1: Д-Ж), в молодых корнях (<1 до 1 мм) сердцевина отсутствует (рис. 1: А-В). Сравнительный анатомо-гистологический анализ листовых пластинок

эхинацеи пурпурной и рудбекии глянцевитой позволил сделать вывод о высокой степени сходства образцов и невозможности диагностики лекарственного вида по эпидермальным признакам листьев (рис. 1: И-Р).

В соответствии с принципами петиолярной анатомии после сравнения близкородственных видов в качестве диагностических признаков сырья эхинацеи пурпурной нами предложено использовать следующие характеристики (рис. 2):

1. Форма поперечного сечения черешка - ромб, имеющий У-образный вырез с адаксиальной стороны.

2. Черешок листа выполнен основной паренхимой; эпидермальные клетки черешка листа с поверхности вытянутые, многоугольные, разновеликие.

3. Устьичные аппараты аномоцитного типа встречаются изредка.

4. Эпидермис черешка опушен простыми многоклеточными волосками; форма клеток у основания трихом округлая, приплюснутая, конечная клетка длиннее всех остальных и сильно заужена, часто отламывается.

5. Рыхлый мезофилл остатков нисбегающей листовой пластинки представлен клетками округлой формы с зеленым протопластом.

6. В паренхиме черешка локализовано в среднем 6-7 закрытых коллатеральных проводящих пучков. Самый крупный пучок - центральная жилка, армирован и локализован в углу ромба с абаксиальной стороны. Характерно наличие мощной склеренхимы с одревесневшими оболочками клеток.

Рис. 2. Диагностические признаки петиолярной анатомии эхинацеи

Обозначения: А-М - особенности петиолярной анатомии рудбекии глянцевитой; Н-Щ - особенности петиолярной анатомии эхинацеи пурпурной.

По результатам анатомо-гистологических исследований впервые в РФ разработан раздел «Микроскопия» в проекте ФС на траву эхинацеи пурпурной свежую, а также раздел «Микроскопия» на перспективное ЛРС - корни эхинацеи пурпурной. Переработан и дополнен раздел «Микроскопия» в ФС на траву эхинацеи пурпурной воздушно-сухую.

2. Фитохимическое исследование эхинацеи пурпурной 2.1. Сравнительное исследование травы и корневищ с корнями эхинацеи пурпурной

Методом ТСХ проведен фотохимический анализ некоторых образцов сырья (надземная и подземная часть) эхинацеи пурпурной. Результаты качественного анализа методом ТСХ показали: на хроматограмме во всех образцах сырья обнаруживается цикориевая кислота в виде доминирующего пятна с сине-фиолетовой флуоресценцией с величиной Яг около 0,5 (пятно А). Менее заметными были пятна других фенилпропаноидов. Предположительно, с учетом данных научной литературы, пятно В соответствует эхинакозиду, С - кофейной кислоте, Б - хлорогеновой кислоте (рис. 3). Полученные результаты соответствуют данным научной литературы по химическому составу эхинацеи пурпурной.

о О

с О о О

*0 0 0 0

О о

в О о 0

0 о

1 2 3 4

Рис. 3. ТСХ извлечений из образцов сырья эхинацеи пурпурной (в системе хлороформ: этанол: вода в соотношении 26:14:3)

Обозначения: 1 - трава (фармакопейный участок СамГМУ); 2 - трава (Средне-Волжский филиал ГНУ «ВИЛАР»); 3 - корневища с корнями (фармакопейный участок СамГМУ); 4 - раствор цикориевой кислоты.

Количественное определение действующих веществ в сырье (трава свежая и воздушно-сухая, корневища с корнями) проводили с помощью спектрофотометрического метода по адаптированным (Куркин В.А. и др., 2001), а также разработанным нами методикам. В качестве экстрагента использовали

спирто-водные растворы различной концентрации. Извлечение из травы и корневищ с корнями получали с применением 40% этанола, действующие вещества из травы эхинацеи свежей извлекали 70% этиловым спиртом. Экстрагирование проводили при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 минут.

В результате анализа нами были получены кривые поглощения в УФ-спектре (рис. 4-6).

АЬкнЪапсе

А

1.75 ; : ; .....;..............-;.......;......; • - -

Рис. 4. УФ-спектр водно-спиртовых извлечений из травы эхинацеи пурпурной

А,

200 250 300 350 400 450 МИ 550 ООО 050

Рис. 5. УФ-спектр водно-спиртовых извлечений из травы эхинацеи пурпурной свежей

ЛЬкиЪапм

200 250 300 350 400 450 500 650 600 050

Рис. 6. УФ-спектр водно-спиртовых извлечений из корневищ с корнями эхинацеи пурпурной Полученные кривые поглощения УФ-спектров для всех образцов сырья имеют максимум поглощения при длине волны 328 нм, что соответствует цикориевой кислоте и является характерным для препаратов на основе эхинацеи. Расчет содержания суммы производных гидроксикоричных кислот (X, %) в

пересчете на цикориевую кислоту и абсолютно сухое сырье осуществляли по формуле:

Б х 50 х ЮО х 100

Х =-,

ш х 782 х (100 —

где Б - оптическая плотность исследуемого раствора (раствор Б); т - масса сырья, г;

782 — удельный показатель поглощения цикориевой кислоты при 328 нм; — потеря в массе при высушивании сырья, %.

Таблица 1

Метрологические характеристики спектрофотометрических методик количественного определения суммы феннлпропаноидов в различных видах сырья

эхинацеи пурпурной

Вид сырья / X 5 Р, % АХ Е, %

Трава эхинацеи пурпурной свежая 10 3,90 0,1009 95 2,23 0,225 ±4,75

Трава эхинацеи пурпурной воздушно-сухая 10 4,50 0,0847 95 2,23 0,189 ±4,20

Корневища с корнями эхинацеи пурпурной 10 2,90 0,0572 95 2,23 0,1276 ±4,40

Содержание суммы феннлпропаноидов в пересчете на цикориевую кислоту в траве эхинацеи пурпурной высушенной варьирует от 3,70%±0,12% до 5,20%±0,17%; в траве эхинацеи пурпурной свежей находится в пределах от 2,71%±0,15% до 5,00%±0,13%; в корневищах с корнями эхинацеи - от 2,11%±0Дб% до 3,70%±0,П%.

2.2. Изучение флавоноидного состава надземной части эхинацеи пурпурной С целью изучения флавоноидного состава исследована трава эхинацеи пурпурной, а также извлечения из сырья этого растения 70% этиловым спиртом. Исследования показали, что соединения флавоноидной природы содержатся во всех анатомических органах растения, однако наибольшее их количество отмечено в цветках. Поэтому именно цветки использовались в качестве исходного сырья.

Измельченные воздушно-сухие цветки (7 мм) эхинацеи пурпурной (120 г) подвергали исчерпывающему экстрагированию 70% этиловым спиртом, сочетая при этом способ мацерации (24 ч) с последующей термической экстракцией при температуре кипения растворителя. Водно-спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка. Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100. Полученный сухой порошок наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе (высота колонки 30 см, диаметр — 7,5 см). Колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях (97:3; 95:5; 93:7; 90:10; 88:12; 85:15; 80:20; 70:30; 60:40; 50:50; 40:60). Это привело к получению блока фракций (29-67), содержащих целевые вещества. Фракции объединяли по три и наносили на полиамид с целью дальнейшей очистки. Сухой порошок (экстракт+полиамид) переносили в хроматографическую колонку (высота сорбента — 4,0 см, диаметр - 5,0 см), элюировали водой и водным раствором спирта этилового (20%; 40%; 70%; 96%). Контроль за разделением осуществлялся с помощью ТСХ-анализа.

В результате проведенной очистки на колонке были получены фракции (70% этиловый спирт), содержащие вещество I и II. Этот блок фракций упаривали, объединяли, растворяли в небольшом количестве 96% этилового спирта и высушивали на полиамиде. Сухой порошок переносили на хроматографическую колонку (высота сорбента — 0,5 см, диаметр — 2,5 см). Колонку элюировали хлороформом, содержащим 96% этиловый спирт в различных соотношениях (5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%).

В результате были выделены вещества I и II флавоноидной природы. Очистку целевых веществ проводили перекристаллизацией из водного ацетона: вещество II переходило в маточный раствор, вещество I оставалось в осадке.

Для изучения выделенных флавоноидов (I, II) были использованы спектральные методы анализа (УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия), метод тонкослойной хроматографии, а также результаты химических превращений. Полученные в результате исследования данные позволяют идентифицировать соединение I как никотифлорин (З-О-рутинозид

кемпферола), а соединение II как рутин (З-О-рутинозид кверцетина) (табл. 2). Установлено, что никотифлорин является доминирующим флавоноидом травы эхинацеи пурпурной и наряду с рутином впервые описан для данного растения, культивируемого в Российской Федерации и странах СНГ.

Таблица 2

Флавоноиды травы эхинацеи пурпурной_

4*1 о Никотифлорин C27H3öOib масс-спектр (m/z): 286 (М+ агликона); т.пл. 182-185 °С (водный спирт); УФ-спектр: /,„„ 266, 352 нм; 'Н-ЯМР-спсктр в DMSO-d6 (S, м.д.): 12,56 (с, 1Н, 5-ОН), 8,05 (д, 9 Гц, 2Н, Н-2',61), 6,85 (д, 9 Гц, 2Н, Н-3',51), 6,42 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,20 (д, 2,5 Гц, Н-б), 5,30 (д, 7 Гц, Н-1" глюкозы), 4,38 (д, 2 Гц, Н-11" рамнозы), 3,70-3,10 (м, 6Н глюкозы + 4Н рамнозы), 1,08 (д, 6 Гц, ЗН, СН3 рамнозы).

ш 1 г т Sif"4'"""^ cm а Рутии С27Н30О15 масс-спектр (m/z): 302 (М+ агликона); т.пл. 192-194 °С (водный спирт); УФ-спсктр: 257, 266 пл. 362 нм. 'Н-ЯМР-спектр в DMSO-d6 (5, м.д.): 12,60 (с, 1Н, 5-ОН), 7,70 (дд, 2,5 и 9 Гц, Н-61), 7,54 (д, 2,5 Гц, Н-2'), 6,87 (д, 9 Гц, Н-51), 6,40 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,18 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,32 (д, 7 Гц, Н-1" глюкозы), 4,40 (д, 2 Гц, Н-1"' рамнозы), 3,70-3,05 (м, 6Н глюкозы + 4Н рамнозы), 1,06 (д, 6 Гц, ЗН, СН3 рамнозы).

3. Стандартизация и создание импортозамещающих лекарственных препаратов на основе эхинацеи пурпурной

Разработка лекарственных препаратов предполагает обоснование состава, способа их получения и показателей качества. При разработке лекарственного препарата «Эхинацеи пурпурной сироп» нами был проведен анализ научной литературы, который, наряду с расчетами и экспериментальными данными, позволил выбрать дозировку действующих веществ, оптимальный состав и количество вспомогательных ингредиентов (формообразующее вещество, концентрация спирта этилового).

На основании проведенных исследований нами предложен сироп следующего состава: настойки эхинацеи пурпурной - 5,0 г

сиропа сорбитного 64% - 95,0 г.

Технологическая схема производства сиропа с настойкой эхинацеи включает стадии: 16

• ВР-1 - санитарная подготовка производства;

• ВР-2 — подготовка лекарственного растительного сырья и экстрагента;

• ТП-3 - получение настойки эхинацеи;

• ТП-4 - получение сорбитного сиропа с настойкой эхинацеи;

• УМО-5 - фасовка, маркировка, упаковка.

Для проведения качественного анализа лекарственного препарата «Эхинацеи пурпурной сироп» нами был предложен метод ТСХ. Метод хроматографии в тонком слое является универсальным для идентификации большинства биологически активных соединений лекарственных растений. Однако при анализе сиропов метод ТСХ не применяется, поскольку при нанесении сиропа на пластинку не удается добиться достаточного разделения веществ. В связи с этим, нами была разработана методика качественного анализа препарата, основанная на экстрагировании действующих веществ из сиропа ацетоном с последующим нанесением извлечения на хроматографическую пластику. Данные ТСХ-анализа (рис. 7) свидетельствуют об идентичности качественного состава исходного сырья и готового продукта, а также о пригодности предлагаемой методики для проведения качественного анализа.

О О

О О О о

о

12 3 4

Рис. 7. ТСХ сиропа эхинацеи пурпурной (в системе хлороформ: этанол: вода в соотношении 26:14:3, просмотр в УФ-свете)

Обозначения: 1 - «Эхинацеи пурпурной сироп»; 2 - ацетоновое извлечение из препарата «Эхинацеи пурпурной сироп»; 3 - настойка эхинацеи пурпурной; 4 — PCO — цикориевая кислота.

Количественное содержание гидроксикоричных кислот в сиропе проводили методом УФ-спектрометрии (табл. 3). При реализации методики количественного анализа сиропа был получен УФ-спектр, характерный для препаратов эхинацеи пурпурной («плечо» при длине волны 280±2 нм, максимум поглощения при 328±2 нм). По величине оптической плотности при длине волны 328 нм определяли концентрацию действующих веществ (рис. 8).

200 235 250 275 МО 325 30 375 «30 «50 «75

Рис. 8. УФ-спектр раствора лекарственного препарата «Эхинацеи пурпурной сироп»

Таблица 3

Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы фенилпропаноидов в лекарственном препарате

/ X 5 Р, % ЮС Е, %

10 0,020 0,000349 95 2,23 0,00078 ±3,90

Нами определены также другие показатели качества препарата «Эхинацеи пурпурной сироп» (плотность, показатель преломления, рН, концентрация спирта, микробиологическая чистота).

Исследована стабильность сиропа эхинацеи при хранении в естественных условиях в течение двух лет. Результаты периодического контроля показателей качества образцов сиропа, заложенных на хранение, позволяют сделать вывод об отсутствии необходимости в использовании консервантов и стабилизаторов, что особенно важно для детских лекарственных препаратов, а также прогнозировать ориентировочный срок хранения препарата - два года.

С целью расширения ассортимента препаратов на основе эхинацеи пурпурной нами проведены исследования по разработке таблеток с сухим экстрактом эхинацеи.

Сухой экстракт эхинацеи пурпурной получали высушиванием густого экстракта. Извлечение из травы эхинацеи проводили 40% этиловым спиртом методом дробной мацерации. После очистки первичную вытяжку выпаривали под вакуумом при температуре не более 60°С, а затем сушили под вакуумом в том же температурном режиме. Стандартизацию экстракта проводили по содержанию влаги (ГФ XI, ч. 2, с. 161) и действующих веществ (суммы фенилпропаноидов в пересчете на цикориевую кислоту) по разработанным нами методикам с использованием ТСХ и УФ-спектрофотометрии.

Учитывая результаты количественного определения суммы фенилпропаноидов в сухом экстракте и в настойке эхинацеи, определили, что содержание действующих веществ в суточной дозе настойки соответствует 0,01 г сухого экстракта эхинацеи пурпурной. Таким образом, нами была обоснована доза сухого экстракта эхинацеи в таблетках.

Преимущества технологии прямого прессования таблеток послужили основанием для изучения возможности получения таблеток с экстрактом эхинацеи этим методом. По данным научной литературы, сорбит находится в перечне вспомогательных веществ, перспективных для прямого прессования. Рядом зарубежных фармацевтических компаний выпускается сорбит для прямого прессования, однако он относительно дорог. В этой связи был исследован в качестве наполнителя в таблетках сорбит пищевой, использованный нами в составе сиропа. Результаты проведенных экспериментов показали, что основные технологические характеристики сорбита пищевого (гранулометрический состав, насыпная плотность, сыпучесть, прессуемость) имеют значения, приемлемые для прямого прессования.

Для однородного распределения малого количества сухого экстракта эхинацеи в таблетируемой массе и предупреждения расслаивания экстракта и сорбита по плотности нами предложено вводить экстракт в спиртовом растворе. Раствор экстракта 1:50 в 40% этиловом спирте распыляли из пульверизатора на сорбит при перемешивании, затем проводили сушку таблеточной массы. При этом был получен однородный порошок, который подвергали таблетированию.

Состав на одну таблетку: экстракта эхинацеи сухого - 0,01 г

сорбита - до получения таблетки массой 0,2 г.

Качество таблеток с экстрактом эхинацеи пурпурной соответствует требованиям ГФ XI издания по показателям: отклонение от средней массы, однородность дозирования, прочность на истирание, распадаемость и растворимость. Для проведения качественного анализа таблеток применяли метод ТСХ, содержание действующих веществ (гидроксикоричных кислот в пересчете на цикориевую кислоту) определяли методом УФ-спектрофотометрии.

ВЫВОДЫ

1. В результате изучения анатомо-гистологических особенностей строения корней эхинацеи пурпурной, культивируемой в Самарской области, выявлено, что это корни вторичного строения непучкового типа. Установлено, что в коровой части молодых корней над вторичной флоэмой имеется кольцо секреторных клеток, древесина таких корней имеет годичные кольца, причем в старых корнях имеется небольшая сердцевина, а в молодых корнях сердцевина отсутствует.

2. В ходе анатомо-гистологического исследования петиолярных признаков (строение черешка листа) эхинацеи пурпурной и ее близкородственного вида - рудбекии глянцевитой выявлены основные признаки растений, позволяющие на уровне микроскопического анализа провести диагностику лекарственного вида по форме поперечного сечения черешка, расположению и характеру проводящих пучков, наличию трихом нескольких типов, наличию, локализации и особенностям строения механических тканей.

3. Из цветков травы эхинацеи пурпурной, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы два соединения флавоноидной природы - никотифлорин (З-О-рутинозид кемпферола) и рутин (3-0-рутинозид кверцетина). Установлено, что никотифлорин является доминирующим флавоноидом травы эхинацеи пурпурной, причем выделенные вещества впервые описаны для данного растения.

4. Разработаны методики качественного и количественного определения ведущей группы действующих веществ - фенилпропаноидов в различных видах сырья эхинацеи пурпурной (эхинадеи пурпурной трава, эхинацеи пурпурной трава свежая, корневища с корнями) с использованием методов тонкослойной хроматографии и спектрофотометрии.

5. В результате фитохимического анализа нескольких видов сырья эхинацеи пурпурной, культивируемой в различных районах Самарской области, определено содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на цикориевую кислоту, которое в траве эхинацеи пурпурной воздушно-сухой варьирует в диапазоне от 3,70%±0,12% до 5,20%±0,17%; в траве эхинацеи свежей находится в пределах от 2,71%±0,15% до 5,00%±0,13%; в корневищах с корнями - от 2,11%±0,16% до 3,70%±0,11%.

6. Обоснованы состав и способ получения лекарственных препаратов «Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки».

7. Разработаны методики качественного и количественного анализа лекарственных препаратов «Эхинацеи пурпурной сироп», «Эхинацеи экстракта таблетки» с применением методов тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии, заключающиеся в определении суммы фенилпропаноидов в пересчете на цикориевую кислоту.

8. Установлена стабильность сиропа при хранении в естественных условиях в течение двух лет, определены показатели качества препаратов «Эхинацеи пурпурной сироп» (величина pH, показатель преломления, плотность, микробиологическая чистота, количественное содержание действующих веществ), «Эхинацеи экстракта таблетки» (отклонение от средней массы, однородность дозирования, прочность на истирание, распадаемость, растворимость, количественное содержание действующих веществ).

9. Разработаны и приняты на рассмотрение ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ проекты ФС «Эхинацеи пурпурной трава» и «Эхинацеи пурпурной трава свежая».

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Куркин, В.А. Флавоноиды травы эхинацеи пурпурной / В.А. Куркин, A.C. Акушская, Е.В. Авдеева, Е.И. Вельмяйкина, Е.Д. Даева, В.И. Каденцев II Химия растительного сырья. - 2010. - № 4. - С. 87-89.

2. Куркин, В.А. Разработка методик анализа сиропа эхинацеи пурпурной / В.А. Куркин, Е.И. Вельмяйкина // Фармация. — 2011. - № 7. - С. 10-12.

3. Куркин, В.А. Новые подходы к диагностике лекарственного растительного сырья эхинацеи пурпурной // В.А. Куркин, Е.И. Вельмяйкина, В.М. Рыжов, JI.B. Тарасенко // Традиционная медицина. - 2012. - № 1 (28). - С. 38-42.

4. Вельмяйкина, Е.И. Исследование по созданию иммуномодулирующего лекарственного средства — сиропа с настойкой эхинацеи пурпурной / Е.И. Вельмяйкина, В.А. Куркин, Л.Д. Климова, О.В. Бер // Известия Самарского научного центра РАН. - 2009. - Т. 11. - С. 1265-1268.

5. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих лекарственных растительных препаратов / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, A.B. Дубищев, О.Л. Кулагин, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров,

B.М. Рыжов, В.В. Стеняева, О.В. Шарова, М.М. Анисимова, JI.H. Зимина, Н.Р. Шагалиева, A.B. Егорова, Е.И. Вельмяйкина, A.C. Акушская, Т.К. Рязанова, А.И. Хусаинова // Традиционная медицина. - 2011. - № 5 (28). -

C. 230-232.

6. Вельмяйкина, Е.И. Анализ ассортимента иммунотропных лекарственных препаратов / Е.И. Вельмяйкина // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. —2012. - № 9. — С. 19-21.

7. Абдулманова, Е.Л. Сравнительный анализ ассортимента иммуностимулирующих препаратов, представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации и Самарской области / Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: материалы X международной конференции. - Минск, 2012. - С. 341-342.

8. Куркин, В.А. Флавоноиды и фенилпропаноиды как биологически активные соединения лекарственных растений / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.М. Рыжов, В.В. Стеняева, О.В. Шарова, A.B. Егорова, Д.Г. Буланкин, Л.Н. Зимина, М.М. Анисимова, Н.Р. Шагалиева, Е.И. Вельмяйкина, А.И. Закиева // Актуальные проблемы химии природных соединений: материалы международной конференции. - Ташкент, 2010. - С. 8.

9. Куркин, В.А. Перспективы создания и внедрения импортозамещающих лекарственных растительных средств / В.А. Куркин, Е.В. Авдеева, В.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, О.В. Шарова, JI.H. Зимина, М.М. Анисимова, Н.Р. Шагалиева,

A.B. Егорова, Е.И. Вельмяйкина, Д.Г. Буланкин, JI.P. Сулейманова, A.A. Шмыгарева, М.Х. Ламрини // XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сборник материалов конгресса. - Москва, 2011. - С. 507.

10. Вельмяйкина, Е.И. Разработка иммуномодулирующего лекарственного средства — сиропа эхинацеи пурпурной / Молодые ученые в медицине: материалы XV Всероссийской конференции. - Казань, 2010. — С. 249-250.

11. Куркин, В.А. Перспективы создания импортозамещающих нейротропных, иммуномодулирующих, антиоксидантных и гепатопротекторных фитопрепаратов / В.А. Куркин, A.B. Дубищев, Е.В. Авдеева, О.Л. Кулагин,

B.Б. Браславский, O.E. Правдивцева, A.B. Куркина, М.В. Егоров, В.В. Стеняева, В.М. Рыжов, О.В. Шарова, М.М. Анисимова, Л.Н. Зимина, Н.Р. Шагалиева, A.B. Егорова, Е.И. Вельмяйкина, Д.В. Корчагина, A.A. Царева, E.H. Зайцева, М.Х. Ламрини, Т.К. Рязанова, А.И. Хусаинова // II Съезд натуротерапевтов России: материалы научных трудов. — Москва, 2011. - С. 23-24.

12. Вельмяйкина, Е.И. Исследование по созданию и стандартизации нового лекарственного средства «Эхинацеи пурпурной сироп» / Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты: сборник

материалов III Всероссийской (77-й итоговой) студенческой конференции. -Самара, 2009.-С. 50-51.

13. Вельмяйкина, Е.И. Фотохимическое исследование по стандартизации и созданию нового лекарственного средства «Эхинацеи пурпурной сироп» / Е.И. Вельмяйкина // Тезисы докладов XXXV Самарской областной студенческой научной конференции. - Самара, 2009. - С. 188.

14. Вельмяйкина, Е.И. Сравнительное изучение химического состава некоторых образцов сырья эхинацеи пурпурной (Echinacea purpurea) / Е.И. Вельмяйкина // Тезисы докладов XXXIII Самарской областной студенческой научной конференции. - Самара, 2007. - С. 184-185.

15. Удостоверение на рационализаторское предложение № 207 ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России от 20 июня 2012 г. «Способ получения сиропа эхинацеи пурпурной» / Е.И. Вельмяйкина, В.А. Куркин.

16. Патент РФ на изобретение № 2468810 «Лекарственное средство для лечения иммунодефицитных состояний» от 10 декабря 2012 г.; заявка № 2011109427, приоритет изобретения 11 марта 2011 г. Авторы: Куркин В.А., Вельмяйкина Е.И., Климова Л.Д.

17. Патент РФ на полезную модель № 109018 «Устройство для извлечения биологически активных веществ из лекарственного растительного сырья» от 10 октября 2011г.; заявка № 2011105616, приоритет полезной модели 15 февраля 2011 г. Авторы: Куркин В.А., Вельмяйкина Е.И., Климова Л.Д.

Подписано в печать 19.04.2013. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Объем 1,39 усл. печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 644.

Отпечатано в типографии ООО «Офорт». 443080, г. Самара, ул. Революционная, 70, литера П. Тел.: 372-00-56,372-00-57, 932-00-50. E-mail: ofort-samara@mail.ru.