Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое исследование горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока

/У^е/с^

На правах рукописи

ТИХОНОВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГОРЕЧАВОК ФЛОРЫ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

15.00.02 - Фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь-1999

Работа выполнена в Сибирском государственном медицинском университете

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Березовская Т.П.

Научный консультант - доктор фармацевтических наук, профессор Калинкина Г.И.

Официальные оппоненты- доктор фармацевтических наук,

профессор, академик РЭА, член корреспендент АН ТКУ Фурса Н.С. - кандидат фармацевтических наук, доцент Калина М.А.

Ведущая организация - Башкирский государственный медицинский университет

Защита состоится

190?года в "/з часов на заседании Диссертационного Совета Д 084.70.01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу : 614600, г.Пермь, ул.Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии.

Автореферат разослан

" ииЦпЭ^^ 1994 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

Метелева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение и использование природных' ресурсов Сибири и Дальнего Востока для разработки новых лекарственных средств является актуальной задачей фармацевтической практики.

Актуальность проблемы обусловлена неблагоприятной экологической обстановкой в традиционных местах сбора лекарственного растительного сырья в Европейской части России, уменьшением природных запасов и нарушением естественных фитоценозов многих лекарственных растений, а также в связи с необходимостью расширения использования ресурсов лекарственных растений Сибири и Дальнего Востока.

Одним из мало изученных таксонов флоры Сибири и Дальнего Востока являются горечавки (Gentiana s.l.). Горечавки как лекарственные растения пользуются большой популярностью у народов Сибири и Дальнего Востока, являются частыми компонентами рецептов тибетской медицины. Литературные данные свидетельствуют о наличии в горечавках флавонондов, ксаптонов, ирндоидов, определяющих желчегонный эффект , противовоспалительную, диуретическую, фунгицидиую и антивирусную активность, положительное действие на гомеостаз. Однако недостаточная химико-фармакологическая изученное гь горечавок затрудняет их практическое использование в медицинской практлке.

Цель диссертационной работы: На основании результатов химико-фармакологического исследования выявить перспективные епды горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока и показать возможность их использования в медицинской практике.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:

- провести предварительный фотохимический анализ горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока на содержание основных групп биологически активных веществ i. выявить наиболее перспективные вида;

- установить качественный состав и количественное содержание феноль-ных соединений горечавок секции Aptera;

-выделить индивидуальные фенольные соединения а установить их строение;

-провести оценку фармакологических свойств суммарных комплексов горечавки крупнолистной;

-провести сравнительное анатомо-ыорфологическое исследование вегетативных органов надземной части горечавки крупнолистной, а также систематически близких и морфологически трудно различимых видов и выявить их диаг ностические признаки;

- разработать нормативную документацию (проект ВФС) на сырье горечавки, рекомендованной для использования в медицинской практике.

Научная новизна'работы. В диссертации впервые проведено химическое исследование 36 видов горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока. Установлено, чго из биологически активных веществ наибольший интерес представляют фенольные соединения (флавонои/цд кумарииы, ксантоиы) горечавок секции Apiera Кит. (горечавки крупнолистой, г. лежачей, г. Кауфмана, г. даурской, г. кресгошмлой) и показано, что наиболее перспективной для дальнейшего

углубленного изучения является горечавка крупнолистная. Изучен качественный состав и определено количественное содержание кумаринов, флавоиоидов, маи-гиферина в горечавках секции Aptera.

Выделено и установлена структура 11 индивидуальных соединений, относящихся к оксикумаринам, флавоноидам, ксантонам. Из исследуемых горечавок данные вещества выделены впервые.

Практическая значимость работы. Установлено, что горечавка крупнолистная является перспективным источником растительного сырья для получения препаратов противовоспалительного, рэнозаживляющего, противоопухолевого действия, а также средств, влияющих на реологические свойства крови л функциональное состояние желудка.

На основании данных химического, анатомического и товароведческого анализа разработан проект Временной фармакопейной статьи "Трава горечавки".

Материалы выполненных исследований включены в монографию В.В.Зуева "Горечавковые Сибири (эволюция, филогения)", глава у-пнроновые соединения горечавковых и методическую разработку "Набухание растительного сырья", используемую в учебном процессе и научной работе на кафедрах химии, технологии лекарств и фармакогнозйи Сибирского государственного медицинского университета (СГМУ). Материалы исследований включены в раздел "Биосинтез, химическая природа и локализация ксантонов и иридондов" учебника для студентов фармацевтических факультетов и вузов "Фариацевтическая ботаника", подготовленноги коллективом кафедры фармакогнозии с курсом ботаники СГМУ и рекомендованного к изданию МЗ РФ.

Анатомо-морфологическое исследование 40 видов горечавок Сибири и Далтлего Востока сведены в "Атлас микроскопической структуры вегетативных органов горечавок (Gentiana s.l.) флоры Сибири и Дальнего Востока", который используется в учебном процессе и научгой работе на кафедре фармакогнозии СГМУ.

На защиту выносятся результаты химического и анатомо-морфологического исследования 36 видов горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока. Обоснование возможности использс_.ания горечавки крупнолистной и горечавки лежачей в медицинской практике в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего и желудочного средства, а также средства, понижающего вязкость крови.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Сибирского Государственного медицинского университета и комплексной целевой программой СО РАМН "Здоровье человека в Сибири" (№ гос. регистрации 01.85.0069848).

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены па IV Всесоюзном съезде фармацевтов (Казань, 1986), Сибирских конференциях "Лекарственные растения Алтайского края" (Tomcí 1926), "Актуальные проблемы фармакологии и поиск новых лекарственных препаратов" (Томск, 1986), "Н?.учно-тех1л;ческий прогресс в медицине и биологии" ЦТомгч, 1988), "Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Далык-v Востоке" (Томск, 1991), II Республиканской конференции по медицинской бежишь (K:iei>, 1988), Всесоюшой конференции "Новы, лекарственные препараты из раск;г,м1

Сибири и Дальнего Востока" (Томск, 1988), конференции посвященной 90-летию Л. Н. Березнеговскон (Томск, 1996), Международной конференции по анатомии и морфологпл растений (С.-Петербург, 1997), международном совещании, посвященном памяти В.Г. Минаевой (Новосибирск, 1998), Международной конференции по природным продуктам и физиологически активным веществам (ГСМРАЗ-98) (ТТ -осибирск, 1998).

Публикации. Содержание работы отражено в 20 статьях и тезисах докладов.

Работа выполнена иа базе кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Сибирского Государственного медицинского университета. Отдельные разделы фармакологии на базе института фармакологии ТНЦ РАМН (г. Томск).

Объем и структура диссертации. Работа изложена иа 152 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком, 27 таблицами и состоит цз введения, 5 глав, общих выводов и приложения. Список щггируемой литературы включает 245 наименований, из них 70 на иностранных языках. В приложеннп представлены проект ВФС "Трава горечавки", Атлас микроскопической структуры вегетативных органов горечавок флоры Сибири и Дальнего Востокз, "у-пироиовые соединения горечавковых": материалы диссертации Л.А.Тихоновой, использованные в монографии В.В.Зуева "Горечавковые Сибири (эволюция, филогения)".

В обзоре литературы (Первая глава) рассмотрены вопросы систематики горечавок , их распространения в Сибири и на Дальнем Востоке. Приводятся подробнь е сведения о применении горечавок в народной и традиционной медицине; проанализирована степень химической изученное™ горечавок н дана характерно .пка основных групп БАВ этого рода; обоснована цель диссертационной раб лы.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе приведены результаты химического исследования горечавок Сибири и Дальнего Востока. На основании данных предварительного анализа для дета :ьного исследования выбраны флавоноиды, кумарннов и ксан-тоны горечавки крупнолистной и близких к ней видов. Проведено выделение индивидуальных соединений и установление их структуры.

В четвертой главе изложены мзтериалы оценки фармакологических свойств суммарных комплексов гчречавки крупнолистной по различным тестам.

Пятая глапа посвящена решению вопросов практического использования сырья горечавки: разработке проекта ВФС "Трава горечавки" на основании данных анатомо-морфо.-огического и товароведческого анализа; разработке методики извлечения БАВ из сырья горечавки.

В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАШ1Е 1'АБОТЫ

Объекты и методы исследования

Сырьем для исследования служила надземная часть 36 видов растений семейства горечавковые, собранная в у азу цветения в различных районах Сибири и Дальнего Востока п пределах естественного ареала. Сушка сырья воздушно-теневая. Расчет производи!ш на абсолютно сухую массу сырья. Сырье собрано в

период с 1986 по 1991 год во время полевых экспедиций студентам» фармацевтического факультета СГМУ под руководством доктора биол. наук В.В. Зуева (Центральный Сибирский ботанический сад, г. Новосибирск) и доктора биол. наук Т.А. Асеевой (Бурятский институт биологии '""О РАН, г. Улан-Удэ) и любезно предоставлено нам для исследования. Частично гсрбарный материал для исследования был предоставлен сотрудниками ЦСБС, ботанического сада Томского госуниверсотета, а также сотрудниками кафедры фармакогнозии СГМУ. Определение гербарного материала проведено сотрудником ЦСБС СО АН РФ д.б.н. В.В.Зуевым. За что всем приношу искреннюю благодарность.

Качественный состав фенольных соединений горечавок исследовали с по-иощыо современных методов и приемов фотохимического анализа: избирательная жидкостная экстракция, адсорбционная колоночная хроматография на снлн-кагсле, полиамиде; бумажная и тонкослойная хроматография, дробная кристаллизация. Выделенные вещества идентифицировали методами УФ-, ПК-спектроскопии с использованием ионизирующих и комплексообразующих добавок (СФ-26, Specord UV VIS). Количественное определение флавоноидов и ман-гиферина проводили хроматоспектроскопнческим методом, кумарннов - спек-трофотометрпческн.

Исследование противовоспа]штельных и ранозаживляющнх свойств экстрактов горечавки проводили на кафедре технологии лекарств СГМУ под руководством доцента Беловой JI.C.; оценку гемореологических свойств - в лаборатории фармакологии кровообращения НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН под руководством доктора биологических наук, профессора Плотникова М.Б.; влияние на пролиферацию опухолевых клеток в научно-исследовательской лаборатории биомедицинского моделирования ТНЦ СО РАМН иод руководством м.н.с. Буторина И.Ю.; влияние на секрецию.желудочного сока в институте биологии БНЦ СО АН РФ (г.Улан-Удэ) под руководством сг.н.с. Хапкина И.С.; исследование кинетики набухания сырья и экстрагирования БАВ из трапы горечавки иро-руководством доктора химических наук, профессора

, за что выражаю всем искреннюю признательность и благодар-химичкское исследование горечавок флоры

Сибири и Дальнего Востока f

Нами проведен химический анализ 36 видов горечавок на содержание флавоноидов, кумаринов, ирвдондов, алкалоидов и фенолокислот общепринятыми качественными реакциями. Поскольку ксантоновыс соединения практически невозможно достоверно отличить от флавоноидов с помощью качественных реакций, нами проведено их обнаружение хроматографическнм методом. При этом установлено, что ксантоны в горечавках секции Aptera представлены только ман-гнферином, что согласуется с литературными данными. Кроме тою, выявленные в горечавках монотерпеноиды - иридоиды, представляют ишсрес не только, как БАВ, а также в качестве химических маркеров этого рода.

Результаты качественного анализа, приведенные в таблице 1, показывают, что для всех видов горечавок характерно наличие флавоноидов, кумаринов, фенолокислот и ирндоидов. Мангиферип обнаружен нами лишь в К) видах. Качественными реакциями в горечавках пока tano присукгвне алкалоидов.

водили под А.Н.Плюсшша

ность.

Таблица I.

Результаты качественного анализа растений семейства горечавковых на __содержание БАВ_ _____. __ .

Вид Ф Ксалтоны К Ф И А

л a (мангифернн) У м е н Р и л к

в а о Д а

0 Р л о л

и и о я о

o н к д 11

и ы и ы д

Д с ы

Ы л о т ы

1 2 3 4 5 6 7

Gentiana macrophylla + - + + + +

G. dahurica + + + + + 0

G. decumbens + - + + + +

G. kaufmanniana + - + + + +

G. cniciata + + + + + +

G. .elauca + - + + + 0

G. nípula + - + + + +

Dasystephana vodopjanovae + - + + + 0

Gentiana septemlída + - + + + +

G. scabra + - + + + +

G. triflora + - + + + +

G. pneumonanthe + + + + + +

G. axilliflora + - + + + +

G. uniflora + - + + + 0

G. angulosa + + + + + 0

G. grandiflora + - + + + +

G. karelinii + + + + + +

G. riparia + - + + + 0

G. pseudoaquatica + - + + + 0

G. squarrosa + - + + + +

G. prostrata + - + + + +

G. leucomelaena _ + - + + + 0

Ciininalis variegata + - + + + +

Gentiana aquatica + - + + + 0

Comastoma falcatum + - + + + +

C. tencllum + - + + + +

C. malysclievii + - + + + +

C. pulmonarium + - + + + +

C. azurcum + - + + + +

Gentianella acula + + + + + 0

G. sibirica + + + + + 0

G. amarella + - + + + +

G. auriculata + + + + + +

G. atrata + + + + + +

Gcntmnopsis barbata + + + + -

G. ciliata + - + + + -

Примечание: "О" анализ не проводился;"+" БАВ присутствуют;"-" БАВ отсугстиуют.

Ограниченное количество сырья некоторых редких видов не позволило нам провести в них обнаружение алкалоидов.

Количественное определение основных групп фенольных соединении проведено в горечавках секции Aptera, фенольный комплекс которых ранее не был изучен.

Нами исследовано 5 видов горечавок секции Aptera. Результаты представлены в таблице 2. Анализируя полученные данные, можно сделать заключение о том, что все исследованные виды являются полифенолпродуцирующими растениями, что согласуется с немногочисленными литературными данными.

Таблица 2.

Количественное содержание флавоноидов, кумаринов и мангиферина в горечавках секции Aptera

Вид Содержанке в % на абсолютно сух; ^ю массу (М±т)

Флавоноиды, в том числе Кумари-ны Мангиферин

Сумма Гомоориснтин Сапонаретин

Gentiana macrophylla 0,95±0,05 U,16±0,01 0,1110,01 0,2610,01 -

G. decumbcns 0,74i0,04 0,13±0,01 0,1110,01 0,17±0,01 -

G. dahurica 0,65±0,03 0,10±0,С1 0,08+0,01 0,1510,01 0,1010,01

G. kaufmanniana 0,7810,04 0,1110,01 0,^710,01 0,18+0,01 -

G. cruciata 0,84±0,04 0,1710,01 0,0710,01 0,2810,01 0,2310,01

Данные, приведенные в таблице 2, показывают равноценность всех горечавок секции Aptera по содержанию флавоноидов, в том числе характерных для этого рода С-гликозидов гомоориентина и сапонаретина. Содержание кумаринов во всех видах составляет 0,15-0,28% . Мангиферин, идентифицированный нами в горечавке даурской и горечавке крестовидной, содержится в пределах 0,10-0,23%, отмеченных по литературным данным для горечавок. Таким образом, на основании предварительного химического анализа для детального исследования нами выбран один из видов горечавок секции Aptera -Gentiana macrophylla Pall., горечавка крупнолистная. На территории Сибири и Дальнего Востока горечавка крупнолистная является наиболее распространенным видом. Кроме того, она успешно интродуциропана в Центральном Сибирском ботаническом саду на экспериментальном участке. Для выделения некоторых фенольных соединений использовали другие виды сибирских горечавок, содержащие эти вещества в большем количестве, чем горечавка крупнолистная.

Выделение и разделение суммы фенольных соединений на индавидуальные компоненты проводили по схеме (рис. I), используя метод избирательной экстракции кумаринов, флзвоноидов и ксантонов хлороформом, этилацетатом, н-бутанолом из мегганольнот зкетракта.

Выделение и идентификации кумаринов. Индивидуальные вещества выделяли из хлороформной фракции на колонке с енликагелем. Для этого сухой хлороформный экстракт массой 7.8 г наносили на колонку (cl=3.8 cm"1i=5G см) с сорбентом в соотношении 1:10. Элюировали последоватн.но гексаном, смесью ick-сан-хлороформ с увеличением концентрации хлороформа и смесью хлороформ Mi-ганол (9:1; 8;Г: 7:3).

70% метанол

-»■ Сырье

водно-спиртовой экстракт

I

сгуп^1шс

очистка от липофнльных ве^ств

ОЩПЦМШЫЙ водный .остаток

хлороформное извлечение

сгушеиие

очистка от липофилъных веществ

хроматогрлфня на силика! е. "с

XX

обработка хлороформом

водный обработка остаток Н-буганолом

этилацетат

этилацетатное извлечение

сгущение

хроматография на полиамиде

I

элюированнг смесью хлороформ - этанол

1

бутанолыюе извлечение

сгущение

хроматография на полианите

1

¥

1 8:2 Г-7

эпючроатте водно• метанолы iLU.ni смесями

, 4

Г-7 Г-8 Г-9.Г-10 /

препаративная хроматография па целлюлозе

Г

Г-9

1

"1 Г-Ю

Рис. 1. Схема выделения фе^ольных соединений из надземной части горечавок

Вещества Г-1, Г-2, Г-3, Г-4 были получены из G. macrophylla. Из надземной части Gentianella acuta были выделены 2 индивидуальных вещества кумарнновой природы при элюировании бензолом колонки с силикагелем, на которую была нанесена сумма кумаринов из G. acuta, полученная rio схеме (рис. 1). Эти вещЛт-ва были обозначены как Г-5 и Г-6. Все полученные вещества перекристаллнзовы-вали из горячего метанола. Идентификацию выделенных соединений проводили по хроматографическому поведению в сравнении с достоверными образцами и поданным УФ-, ИК-спектроскопии (табл.3).

Табтица 3.

УФ- и ИК-спектральная характеристика кумаринов горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока

Вещество и его шифр Поглощение в УФ-области, нм Поглощение в ИК-областн, см 1

96% этанол этклат натрия —С=С— бею. кольцо -ОН —OCHj ¡ >с=о I 1730

Кумарин (Г-6) 275, 311 _ 1620-1596 -

Умбеллиферон (Г-3) 230, 328 231,370 1616-1576 3260 - 1720

Герниарнн (1"-5) 220-228, 319 1610-1505 3064 2980, 2840 1715

Скополетин (Г-4) 230, 256, 298,343 240, 393 1613-1570 3340 2850 1707

Эскулетнн (Г-2) 230, 250, 271,316 240, 390 1610-1590 33403225 - 17101690

Эскулин (Г-1) 231, 257 240, 395 1620 3530, 3500, 3300 17201680

Таблица 4.

Физико-химические свойства кумаринов, выделенных из горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока

Вещество и его шифр Общая формула

Кумарин (Г-6) СяНбОз 67-68

Умбеллиферон (Г-3) CoHeOj 232-234

Герниарин (Г-5) CioHgOj 117-118 1

Скополетин (Г-4) CioH»0< 203-205

Эскулстмн (Г-2) С5ШО4 269-271

Чсхулин (Г-1) CisHiíOo 202-205

Выделение и идентификация флавоноидов. Этз.лацстатнук- и бутанольную фракции (рис. 1) использовали для выделения флавоноилов. Предварительно фракции анализировали хроматографически. Из пилацетатиого извлечения удаляли растворитель и получали сумму флавоноидов. По данным, двумерной бумажной хроматографии в системах: 15%-пая кислое уксусная и б\танол-1 кислота уксусная - пода (4:1:2) в этилацекинои фракции содс-ржакн дна нс-шества флавоноидной природа, которые обозначили как Г-7 и Г-8.

Выделение флавоноидов проводили колоночной хроматографией. Эгила-цетатную фракцию, содержащую сумму флавоноидов, массой 2 г наносили на колонку полиамида марки \VoeIm высотой 60 см и диаметром 2,8 см. Элнлгрова-ли хлороформом и смесью хлороформ-метанол с увеличением концентрации метанола. Было изолировано 2 вещества флавоноидной природы (Г-7 и Г-8).

В бутанолыюн фракции по данным одно- и двумерной бумажной хроматографии содержатся 4 вещества флавоноидной природы - Г-7, Г-8, Г-9 и Г-10.

Для выделения индивидуальных веществ 5 г бутанольнон фракции помещали на колонку с полиамидом марки \Voelm высотой 90 см и диаметром 3 см, элюировали хлороформом и смесью хлороформ - метанол с увеличением концентрации метанола.

Было выделено 4 вещества флавоноидной природы, которые очищали пе-рекристаллиззцией из метанола (Г-7, Г-8, Г-9, Г-10). О флавоновой природе выделенных веществ свидетельствуют УФ-спектры, имеющие максимумы поглощения в области 270-275нм и 325-330 им (табл.5).

Вещество Г-7 (50 мг) - Тш, -229-231 °С (метанол), [а£° +22 (метанол),

^•гаа . нм 257 пл, 272, 350. Йодистоводородной кислотой оно рзсщепляется до лютеолнна и О-ппокозы. Изомернзуется 5%-ной кислотой хлористоводородной в лютеолин-8-С-р-0-глюкопнранозид (ориентин). Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что вещество Г-7 представляет собой гомоориен-тан (изоорие1гшн)-517,3',4'-тетрагидроксн-6-С-р-0-глюкопнранозилфлавон.

Вещество Г-8 (281 мг) - Тщ, =193-194°С (метанол), 1^=0,4 (15%-ная кислота уксусная, бумага НЫ-6); Ш'его изомера 0,18 (кислотный гидролиз 5%-ной кислотой хлористоводородной, 120 мин.), , нм 271, 333.

При воздействии кислоты йодистоводородной вещество Г-8 расщепляется на апигенин и О-глюкозу; изомернзуется 5%-ной кислотой хлористоводородной в апнгенин-8-0-р-1>гл1окопиранозид (витексин). На основании данных УФ-сиектроскопии, а также по продуктам расщепления и изомеризации Г-8 идентифицировали с сапонаретином (5,7,4'-тригидрокси-6-С-0-В-глюкопираношлфлавоном).

Веществ?. Г:9.1«_ГгА0 по хроматографическому поведению являются глико -зидами более полярными, чем вещества Г-7 и Г-8. Для установления природы аг-ликонов и сахарных остатков проводили кислотный гидролиз веществ Г-9 и Г-10 10%-ной кислотой серной в течение одного часа на кипящей водяной бане. Гид-ролизат нейтрализовали, упаривали и исследовали на содержание флавоноидов.

Кислотный гидролиз соединений Г-9 и Г-10 дает соответственно гомоорн-ентин (Г-7) и сапонаретин (Г-8), которые частично изомеризуются в ориентин (Г-7') и витексин (Г-81), сахарным компонентом является Э-глюкоза. Идентификацию продуктов гидролиза проводили бумажной хроматографией в системе 15%-ная кисло га уксусная. По физико-химическим данг гм, хроматографическому поведению до и после гидролиза, УФ-спектрам с диагностическими добавками вещества Г-9 и Г-10 были идентифицированы как 4'-0-глюкознд гомоориенлша (Г-9) и 4'-0-глюкозид санонаретина (Г-10) соответственно.

Вещеегво Г-9 - Т™ =216"0, А.^0", нм 272, 335.

Вещество Г-10 - Т„„.=206-207иС (раза), , ,!М 274, 326.

Таблица 5.

УФ-спектральная характеристика флавоноцдов, выделенных из горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока

Вещество и его шифр Поглощение в УФ-области, X, нм

Полоса поглощения 2*10-' Мр-р в абсол. этаноле Алюминия хлорид Алюминия хлорид + кислота соляная Натрия ацетат Натрия этилат

Г-7 гомоориентин. ;1к>теол1П1-6-С-Р-0- глюкопиранозид I II 350 272, 257 пл. 406, 340 278 398, 328 280, 270 426, 338 280, 270

Г-8 сапонаретнн, апигенин- 6-с-П-п- глк'кч'пиронозид 1 II 333 271 380. 350,. 304. 279 383, 350 21' 397, 330 277

Г-9 4'-0-ГЛКЖОЗИД гомоорнентнна I II 335 272 352. 380 282. 295 348, 380 280, 295 278 276 ЗП 268

4'-0-гльжозид сапоиареснна I II 326 274 342. 380 283. 302 340,380 282, 300 375 280 375 282

Рис. 3. Схема химических превращении сапонаретнна и 4'-0-гтокоч1ща сапонаретина

Химические превращение веществ Г-7. Г-8, Г-9, Г-10 представлены на рнс. 2, 3. Нами проведено исследование этанольных экстрактов из надземной о части горечавок секции Aptera. Одно- н двумерной хроматографией на бумаге п системах 15%-ная кислота уксусная и бутанол-1 - кислота уксусная - вода (4:1:2) установили наличие в горечавке лежачей, г. даурской, г. Кауфмана четырех флавоновых глнкозидов: гомоорнентина, сапонаретина, 4'-0-ппокозида гомоориентина, 4'-0-глюкоэида сапонаретина. Описанные флавоновые соединения выделены нами из горечавки крупнолистной, г. лежачей, г. Кауфмана и г. даурской впервые. Ранее описанные пещества были выдег^ны из Gentiana cruciata зарубежными авторами .

Выделение и идентификация мангнферина. По хроматографическому поведению ксантоновый С-гликозид - мангиферин (2-С-Р-0-глюкопиранозил-1,3,6,7-тетрапщроксиксантон) отличзется от других т-пнроновых соединений: ксантонов и флавонов. При проявлеииии в УФ-свете на хроматограмме пятно имеет оранжевое свечение до обработки и яркое зеленовато-голубое - после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорида.

В этилацетатной фракции из трапы горечавки даурской одномерной хроматографией на бумаге марки FN-6 в системах: 15% кислота уксусная (Rf=0,5l) и бутанол-1 - кислота уксусная - вода (4:1:2) (Rf=0,41), было обнаружено вещество, обозначенное нами Г-11. При хроматографировании этилацетатной фракции с достоверным образцом мангнферина величины Rf пятен вещества Г-11 я мангнферина в обеих системах, а также характер свечения до н после обработки 5% спиртовым раствором алюминия хлорнда были одинаковы.

Всщсство_[Ч! было получено из этилацетатной фракции горечавки даурской препаративной тонкослойной хроматографией на целлюлозе в системе 15% кислота уксусная. Пятна на хроматограмах, имеющие оранжевое свечение в УФ-свете, снимали с пластинки и экстрагировали горячим этанолом, растворотель удаляли. Вещество перекрнсталлизовывзли из смеси диоксан - вода (1:1). Получено желтое вещество Г-11. Т„л. 258-2604:, 242, 259, 317, 367 им; AlClj 270, 347, 432 нм; AICb+HCI 268. 310, 400 нм; ClhCOONa 270, 306, 309 пи; CHjCOONa+HjBOj 265, 324, 373 нм; C2H5ONa 275, 310, 400 нм.

Данные УФ-спектров с комплексообразующимп и ионизирующими добавками подтверждают к'ангоновую природу вещества Г-1 ] (характерный рисунок спектра с четырьмя максимумами с определенным соотношением шгтенспвно-стен), а также присутствие групп —ОН в положениях 1, 3, 6 и 7 ксантонозого ядра .

По хроматогшфическому поведению, данным УФ-спектров и по сравнению с достоверным образцом вещество Г-11 было идентифицировано как ксантоновый С-гликознд - мангиферин (2-С-р-0-глюкопиранозил-1,3.6.7-тетрагидроксикса1ггон).

В траве горечавки даурской мангиферин обнаружен впервые.

Качественный состав у-пироновых соединений, выделенных нами впервые !Г5 некоторых горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока, представлен в таблице 5.

Таблица 5.

Качественный состав у-пироновых соединений горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока

Вид гомоорн- canoua- 4'-0-глю- 4-О-глю- ыаиги-

С1ГПШ рстин КОЭНД козид ферип

гомоори- сапона-

cimura penma

Gentiana macrophylla + + + + -

G. decumbcns + + + + -

G. dahurica + + + + +

G. kaufmanniana + + + + -

G. glauca + + - -

G. algida + + - + -

Dasystephana vodopjanovae + + . - + -

Gentiana unuflora + - - - -

G. angulosa + - - - +

Gentianella auriculata + - - - +

G. aírala + - - - +

G. sibirica + - - +

Изучение фармакологи .еских своПств горечавки крупнолистной.

Противовоспалительное действие сухого экстракта горечавки крупнолистной изучали на модели острой воспалительной реакции, вызванной введением каррагенина.

Опыты проведены на 20 крысах - самцах массой 130-150 г. Экстракт горечавки вводили внутрибрюшинно в виде 3% масляного раствора в дозе 100 мг/кг.

Результаты показали, что процент угнетения отека на пике воспаления (3 часа) составил 45%, что свидетельствует о выраженном противовоспалительном действии экстракта горечавки крупнолистной.

Репаративную способность экстракта горечавки крупнолистной изучали при заживлении ран у крыс.

Опыты поставлены на 40 белых крысах обоего пола весом 180-200 г. Установлено, что 3% масляный раствор экстракта горечавки крупнолистной стимулирует процесс заживл*. лия асептических ран на всех стадиях репарационного процесса. Ускорение заживления ран составило 12%, что соответствуег препарату сравнения 10%-ной мази цигерола. Экстракт горечавки несколько уступает мази цигерола по срокам заживления раны.

Таким образом, экспериментальные данные характеризуют экстракт горечавки крупнолистной как достато«г.о акпшное ранозаживляющее средство с выраженным противовоспалительным действием.

Влияние на параметры желудочной секреции изучали на белых беспородных крысах обоего пола массой 150-200г. Экстракты горечавки вводили в виде водных растворов перорально. О степени активности исследуемых препаратов судили по обье 'у желудочного сока и по его кислотности.

Полученные результаты показали, что водный экстракт достоверно повышает все исследуемые показатели желудочной секреции, что свидетельствует о з гастростимулирующей активности препарата. Экстракт на 70%-ном этаноле из надземной части в дозах 100 и 300 мг достоверно стимулирует сокоотделение - в первой дозе на 33,3%. а во второй на 22,2%. В дозе 100 мг этот экстракт на 41,8% увеличивает уровень общей кислотности, а в дозе 300 мг существенно не изменяет ее. В обеих дозах препарат существенно понижает концентрацию свободной HCl: на 48,8% в nei .ioii л 35,3% во второй группе. Понижение концентрации свободной НС-1 на фоне высоких значений общей кислотности свидетельствует о связывании излишков кислоты белково-углеводными компонентами желудочного сока.

Из полученных результатов следует, что экстракт на 70%-ном этаноле из травы горечавки крупнолистной можно использовать для терапии атро-фического (гипоцидного) гастрита.

Влияние на реологические свойства крови. Для оценки реологических свойств горечавки крупнолистной из трапы был получен экстракт на 40%-ном этаноле методом реиерколяции. Изучение реологических свойств сухого экстракта проводили на 10 крысах - самцах линии Вистар массой 200-250 г. Предварительное исследование действия экстракта на реологию креви проводит т vitro на модели, воспроизводящей синдром повышенной вязкости крови. Экстракт горечавки п концентрации 105 г/мл ограничивал повышение вязкости крови, но не оказывал существенною влияния на агрегационные свойства эритроцитов, а в концентрации 106 г/мл проявил выраженный эффект, предотвращая возрастание вязкое in крови и спои тайной ai регации эритроцитов.

Для углубленного исследования гемореологических свойств экстракта нз горечавки крупнолистной в сравнении с кверцетином нспэльзовали модель синдрома повышенной вязкости крови, воспроизводимую у крыс путем создания ишемии мозга. Курсовое введение экстракта горечаь и в дозе 50 мг/кг приводило к снижению всех изучаемых гемореологических параметров по сравнению с контрольными данными.

Таким образом, проведенные исследования показали, что экстракт горечавки крупнолистной в дозе 50 мг/кг оказывает существенное влияние на реологические свойства кропи и может быть использован в комплексном лечении различных заболевай: й, сопровождающихся развитием синдрома повышенной вязкости крови.

Влнянне на пролиферацию опухолевых клеток in vitro. Клеточная пролиферация оценивалась по включению 'Н-тимидина. Использовали клетки опухоли, проинкубированные с водным раствором 70% метанольного экстракта горечавки крупнолистой в концентрациях 2.0; 0,2; 0,02 и 0,002 мг/мл.

Было пока то, что экстракт горечавки на 70%-ном метаноле в дозе 2 Mi /мл приводит к достоверному еннженшо пролиферации опухолевых клеток ас-цитного рака Эрлнха на 10% и мастоцитомы Р815 на 60%, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения препарата в качестве противоопухолевого средства.

Токсикологическая характеристика экстрактов горечавки крупнолистной. Остр\ю юксичносп. iKcipak'Ton определяли на двух видах животных при внут-рпж1лудочпом введении водного раствора экстрактов однократно в дозах 1000-

ЗОООмг/кг. Согласно гигиенической классификации ядов по ГОСТ 12-1007-76 препараты горечавки следует отнести к IV классу "Вещества малоопасные".

Некоторые вопросы практического использования сырья горечавки

Разработка проекта ВФС "Трава горечавки". В данном разделе приведены результаты изучения признаков, характеризующих подлинность и доброкачественность лекарственного сырья. Среди микроскопических особенностей горечавки следует выделить клетки эпидермы с извилистыми стенками и складчатой кутикулой. На обеих сторонах листа, преимущественно на нижней, имеются устьица, в том числе и погруженные в мезофилл. Усгьичный аппарат аномощпного типа. Встречаются клетки эпидермы с папнллами.

Приведены данные, показывающие возможность сбора сырья (трава) от фазы вегетации до. цветения включительно. С целью установления доброкачественности сырья были определены числовые показатели, включенные в проект ВФС: содержание флавонондов, влажность, зольность и другие. Срок годности сырья рекомендуется установить до 3 лет.

Разработка методики получения экстрактов из сырья горечавки. Предложен упрощенный способ изучения кинетики набухания растительного сырья и расчета основных параметров. Метод является универсальным. Предложенным методом установлено, что оптимальными условиями экстрагирования БАВ из горечавки водно-этанольнон смесью является: продолжительность процесса -около 4 часов, оптимальное число ступеней 3-4. Изучение кинетики набухания горечавки крупнолистной в воде и водно-спиртовой смеси можно рассматривать как пример приложимости метода к системам растительное сырье-экстрагент.

ВЫВОДЫ

1. Проведен химический анализ надземной части 36 видов горечавок флоры Сибири и Дальнего Востока на содержание БАВ. Установлено, что для всех исследуемых видов характерно наличие флавоноидов (0,65-0,95%), кумаринов (0,15-0,28%), фенолокислот и иридоидов. Ксантоновый С-гликозид мангиферин обнаружен нами только в 10 видах.

2. Показано, «гго по распространенности, возможности создания сырьевой базы и содержанию БАВ наиболее перспективными для внедрения в медицинскую практику являются горечавка крупнолистая и горечавка лежачая.

3. Из горечавки крупнолистной и некоторых других видов этого рода нами впервые выделены н идентифицированы кумарины: кумарин, умбеллнферон, гер-ниарин, скополетпн, эскулетин, эскулин; флавоноиды: гомоориентин, сапонаре-тин 4'-0-глюкозид гомоориентина, 4'-0-глюкозид сапонаретнна; ксантоновый С-гликозид - мангиферин (Genliana dnhurica. G. angulosa. Gemían fila anata, G. uuriculaia. G. sibiricá).

4. Хроматографически доказана близость химического состава фенольных соединений горечавок секции Aptera, в частности, горечавки крупнолистной и горечавки лежзчей, что показывает возможность равноценного использования обоих видов получения лекарственных средств.

5. В эксперименте установлено, что водно-спиртовые экстракты горечавки крупнолистной проявили выраженное противовоспалительное, ранотз-з живляющее дейстпие. положительное влияние на реологические свойства крови и могут быть рекомендованы для дальнейшего углубленного фармакологического исследования. Экстракта характеризуются низкой токсичностью.

6. Изучена динамика накопления флапопоидов п надземной части горечавки крупнолистной и горечавки лежачей в зависимости от места произрастания. по органг ! н фазам развития растений. Установлено, что листья и цветки накапливают до 2% флавонондов; заготовку сырья (травы) рекомендовано проводить от фазы вегетации до цветения растений включительно.

7. Проведено исследование анатомических признаков 40 видоз горечавковых. Установлены диагностические признаки лекарственного сырья горечавки крупнолистной и г. лежачей. Анатомические признаки других видов горечавковых, наряду с результатами химических исследований, были использованы для уточнения филогенетической системы рода.

8. Установлены нормативные числовые показатели, регламентирующпг доброкачественность сырья горечавки: содержание флапопоидов, органической и минеральной примесей, влажность, зольность и другие. На основании данных химического, анатомического и товароведческого анализа разработан проект Временной фармакопейной статьи "Трава горечавки".

9. Разработаны теоретические основы получения экстракционных препаратов из сырья горечавки. Оптимальными условиями экстрагирования БАВ из травы горечавки водно-спиртовыми смесями являются: продолжительность процесса около 4 часов; количество ступеней 3-4.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Дмнтрук С.Е. и др. Антигрибковая активность экстрактов некоторых растений Сибири и Дальнего Востока /С.ИДмитрук, С.И.Дмптрук, Е.Н.Салышкова, ,\1.А. Ихсанова, Г.И.Калшпшна, М.В.Клокова, Н.И.Белоусопа, А.К.Нежувака, Л.А.Тихонова и др. //Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов.-Томск.- 1986.- Т.2.-С.52-55

2. Березовская Т.П. и др.Итоги фармакогностнческого исследования некоторых дикорастущих растений флоры Сибири / Т.П.Березовская, Н.И.Белоусова, Г.И.Высочина. A.B.; ришин. С.Е.Дмитрук, С.И.Дшггрук, Н.В.Дошинская, М.А.Ихсанова, Г.И.Калинкина, Т.Г.Кул! пина, Е.А.Серых, Л.А.Тнхонова и др. // Актуальные проблемы фармакс гогин и поиска новых лекарственных препара-тов.-Томск,- 1986,-Т.2.- С.56-60

3. Тихонова .П.А., Серых Е.А. Анатомическое строение горечавки крупнолистой // Сб,тезисов Всесоюзной конференции по исследованию растений Сибири и Дальнего Востока.-Томск.- 1986.-С.143-144.

4. Березовская Т.П. и др. Поиск новых источников биологически активных веществ средч растений флоры Сибири. / Т.П.Березовская, Г.И.Высочина, 'Г.Г.Кулышна, Е.А.Серых. Л.А.Тнхонова // Сб.тезисоп IV Всесоюзного сьезда фармацевтов.-Казань.- i 9S6.-C.439-440.

.■>. Тихонова Л.А. Перспективы исследования сибирских горечавок // Лекарственные растения Алтайского края.-Томск.- 1986.-С.^6-78.

6. Тихонова JI.A., Серых Е.А., Березовская Т.П. Сибирские горечавки -перспективные для медицины растения II Материалы П республиканской конференции по медицинской ботанике.-Киев.- 1988.-С.89-90.

7. Тихонова JI.A., Комиссаренко Н.Ф., Березовская Т.П. Флавоновые С-глшсозиды Gentiana macrophylla//Химия природ, соедин,- 1986.- №2.-С.287-288.

8. Тихонова Л.А., Березовская Т.П., Серых Е.А. О перспективах исследования сибирских горечавок // Научно-технический прогресс в медицине и биологии. Тез.докладов.-Томск.- 1988.-С.91.

9. И.С.Хапкин И.С. и др. К фармакологии препаратов горечавки крупнолистной /И.С.Хапкин, Н.Н.Федотовских, Л.В.Полынцева, Л.А.Тихонова /7 Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Восто-ка.Тез.докл адов.-Томск,- 1989.-T.2.-C.183-1S4.

10. Тихонова Л.А., Березовская Т.П. Флавононды из горечавки лежачей II Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке.-Томск.- 1991.-Ч.1.-С.190.

11. Тихонова Л.А. и др. Фенольные соединения горечавок секции Aptera / Л.А. Тихонова, Е.А.Серых, Т.П.Березовская, М.А.Ханина II Ресурсоведческое и фитохнмическое изучение лекарственной флоры СССР.-Научные труды ВНИ-ИФ.-Москва.- 1991.- Т.ХХ1Х.-С.84-89.

12. Плюснин А.Н., Тихонова Л.А. Кинетика набухания лекарственного сырья растительного происхождения. Набухание горечавки крупнолистной в воде и водно-спиртовой смеси II Хим.-фарм.журнал,- 1996.-№2.-С39-41.

13. Тихонова Л.А. н др. Кумарины Gentiana barbata Froel. / Л.А.Тихонова, М.А.Ханина, Т.П.Березовская, Е.А.Серых // Кимё ва. Фармация,- 1996,-№2,-С.27-29.

14. Тихонова Л.А. и др. Кумарины горечавок флоры Сибири и Дальнею Востока II Л.А.Тнхонова, М.А.Ханина, Е.А.Серых, Т.П.Березовская II Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений (материалы совещания, посвященного памяти Л.Н.Берешеговской).-Томск.- 1996.-С.167-170.

15. Плотников М.Б. и др. Изучение действия флавоноидосодержащих растений на реологические свойства крови in vitro / М.Б.Плотников, A.A.Колтунов, О.И.,\лиев, Г.И.Калпнкина, Т.П.Березовская, Л.А.Тихонова // Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений (материалы совещания, посвященного памяти Л.Н.Березнеговскон). -Томск.-' 1996.-С.130-131.

16. Плюснин А.Н., Тихонова Л.А. Кинетика экстрагирования прнро.шых соединений из горечавки крупнолистной водно-метанолыюй смесыо // Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений (материалы совещания, посвященного памяти Л.Н.Берешеговской).-Томск.- 1996.-С.132-134.

17. Тихонова JI.A., Березовская Т.П., Серых. Е.А. Анатомо-морфологическое исследование структуры вегетативных органов представителей рода Gentiana флоры Сибири и Дальнего Востока // Труды международной конференции по анатомии и морфологии растений (посвящаются 150-летию со дня рождения И.П.Бородина).- С.-Петербург: Диада.-1997.-С. 133-134.

18. Плотников М.Б. и др. Гемореологическне свойства экстрактов из некоторых растений, содержании флавононды / М.Б.Плотников, А.А.Колтунов, О.И.Алиев, Г.и.Калинкина, т.П.Березовская, В.Ю.Андресва, Л.А.Тихонова // Раст.ресурсы,- 1998.-Т.34.-вып..1 .-С.87-90.

19. Тихонова Л.А., Бугорин И.Ю., Березовская Т.П. Влияние экстракта горечавки крупнолистной на пролиферацию опухолевых клеток in vitro // Физполо-го-биохимические аспекты изучения лекарственных растений (материалы международного совещания, посвященного памяти В.Г.Минаевой).-Новосибирск.-1998.-С.159-160.

20. Tikhonova L.A., Beresovskaja Т.Р. Prospects of Using Gentians of Siberian and Eastern Flora in Medicine // Book of Abstracts. Inernational Conference on Natural Products ard Physiologically Active Substances (ICNPAS-98).-1998.-P. 169.