Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическая характеристика Orthilia secunda (L.) House и разработка на ее основе лекарственной формы

На правах рукописи

ЛОМБОЕВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ORTHILIA SECUNDA (L.) HOUSE И РАЗРАБОТКА НА ЕЕ ОСНОВЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Улан-Удэ - 2005

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

Научный руководитель доктор фармацевтических наук, профессор

Асеева Тамара Анатольевна

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Кашин Владимир Капсимович

кандидат фармацевтических наук Петров Евгений Васильевич

Ведущая организация ФГОУ ВПО Иркутский государственный

медицинский университет

Защита состоится «-/У» сентября 2005 г. в о °°на заседании диссертационного совета К 003.028.01 в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН по адресу: 670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6. Факс: 8 (310-2) 43 30 34

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятского научного центра СО РАН

Автореферат разослан «15» августа 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Хобракова В.Б.

и>чгч

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Использование растений с лечебной целью известно с глубокой древности и, несмотря на прогресс в области синтеза лекарственных препаратов, растительные лекарственные средства продолжают занимать значительное место в современной медицине. Возрастающая популярность и эффективность препаратов растительного происхождения во многом объясняется тем, что содержащиеся в них биологически активные вещества воздействуют на организм комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют побочных эффектов при длительном применении.

Известно, что практически все синтетические препараты, используемые при лечении заболеваний, в основе которых лежит воспалительная реакция, оказывают побочное действие и имеют противопоказания к применению [Бо-дяжина, 1990; Машковский, 1994]. В связи с этим поиск новых источников биологически активных веществ природного происхождения, обладающих высокой противовоспалительной активностью, является актуальной задачей медицинской и фармацевтической науки.

Одной из отправных точек такого поиска является использование опыта народной медицины, который содержит огромный фактический материал, являющийся надежным ориентиром для выбора новых перспективных видов лекарственного сырья. В качестве объекта исследования нами была выбрана ор-тилия однобокая - Orthilia secunda (L.) House (сем. Pyrolaceae - грушанковые), которая издавна использовалась в Сибири в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего, гемостатического, диуретического средства, широко применялась при лечении гинекологических заболеваний [Телятьев, 1985]. В результате исследований, проведенных в Отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, установлено выраженное противовоспалительное и антиокислительное действие извлечений из данного растения [Ботоева, 2001; Николаев и др., 2002].

Выраженная фармакотерапевтическая эффективность, подтверждающая целесообразность применения ортилии однобокой в народной медицине, является предпосылкой для проведения фармакогностического исследования данного растения, которое предусматривает макро- и микроскопический анализ растения, выявление анатомо-диагностических признаков, изучение качественного и количественного содержания биологически активных веществ, стандартизацию сырья. Кроме того, неотъемлемой частью этих исследований является выявление ресурсной базы. Для разработки научных основ и определения путей рационального использования ресурсов этого перспективного лекарственного растения необходимо изучение его эколого-биологических особенностей (установление эколого-фитоценотической приуроченности, жизненной формы, способов размножения, выявление особенностей развития, условий достижения оптимального состояния и т.д.).

Наиболее перспективным направлением в области создания фитопрепаратов является производство сухих экстрактов, представляющих собой легко-

для дозирования ГОС НАЦИОНАЛЬНА .

библиотека \

растворимый в воде или в

комплекс биологически активных веществ со стабильными показателями качества.

В связи с вышеизложенным целью настоящих исследований стало бота-нико-фармакогностическое исследование ортилии однобокой, стандартизация сырья, разработка способа получения и стандартизация противовоспалительного средства, представляющего собой сухой экстракт.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- в рамках изучения ресурсной обеспеченности выявить эколого-фитоценотическую приуроченность ортилии однобокой, изучить биологические особенности, выявить влияние эколого-фитоценотических факторов на морфометрические параметры растения и продуктивность природных ценопо-пуляций;

- выявить анатомо-диагностические признаки надземной части ортилии однобокой;

- определить качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ в надземной части и сухом экстракте ортилии однобокой;

- установить локализацию биологически активных веществ в отдельных органах растения, изучить динамику их накопления по фенофазам, в онтогенезе растения, в зависимости от эколого-фитоценотических факторов и определить оптимальные условия сбора;

- разработать способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью;

- разработать нормативную документацию на лекарственное сырье и сухой экстракт.

Научная новизна работы. Изучены эколого-биологические особенности ортилии однобокой в условиях Западного Забайкалья: получены данные по особенностям онтогенеза, на основании комплекса признаков установлены оп-тимумы организма и ценопопуляции вида. Определены показателя сырьевой продуктивности и запасы сырья данного вида. Установлены анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой.

Установлено наличие в надземной части и сухом экстракте флавоноидов в виде флавоноловых агликонов (кверцетин и кемпферол) и их гликозидов, фе-нольных кислот (галловой, хлорогеновой и др.), гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ, простых фенолов и их гликозидов, углеводов, аминокислот, органических кислот, тритерпеновых сапонинов, иридоидов, производных кумарина; кроме того, качественно и количественно определены 26 макро- и микроэлементов. Определено количественное содержание в надземной части и сухом экстракте дубильных веществ, аскорбиновой кислоты, органических кислот - яблочной, янтарной и лимонной, простых фенолов и их гликозидов.

Разработана спектрофотометрическая методика определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин в надземной части ортилии однобокой и сухом экстракте, с использованием которой изучена динамика нако-

пления этих веществ по фенофазам, в онтогенезе растения, в зависимости от эколого-фитоценотических факторов.

Разработан способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью, установлены оптимальные параметры экстрагирования сырья и определены показатели качества средства.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработан способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью (патент № 20021156666/14(06475), положительное решение о выдаче патента на изобретение от 25.11.2002 г.). Составлены проекты Фармакопейных Статей предприятия на сырье - надземную часть ортилии однобокой и на сухой экстракт из нее. Разработан лабораторный регламент на производство сухого экстракта.

Доклиническое изучение сухого экстракта ортилии однобокой, проведенное в лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, показало, что данное средство не токсично и обладает выраженной противовоспалительной, антиоксидантной, мембрано-стабилизирующей, жаропонижающей, седативной, обезболивающей, антимикробной, спазмолитической, диуретической и гонадотропной активностью. Полученные данные обусловливают перспективность клинического исследования сухого экстракта ортилии однобокой в целях использования при терапии гинекологических заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: II Всероссийской научной конференции "Агроэкология и устойчивое развитие регионов" (Красноярск, 2000), Международной научной конференции «Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья» (Чита, 2000), VIII и XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002), II Международном Тихоокеанском конгрессе «Традиционная медицина: научные и практические аспекты» (Владивосток, 2001), Всероссийской научной конференции «Биологически активные добавки и здоровое питание» (Улан-Удэ, 2001), научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ, 2001), Южно-Сибирской международной конференции «Экология Южной Сибири» (Абакан, 2001), научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИрГСХА (2003,2004,2005).

Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Настоящая работа выполнена в Отделе биологически активных веществ в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме "Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов" (№ гос. регистрации 01.9.40003183).

На защиту выносятся:

- результаты фармакогностического и фитохимического исследования ортилии однобокой;

- разработанный способ получения средства, обладающего противовоспали-

тельной и антиокислительной активностью;

- предлагаемые методы стандартизации сырья и сухого экстракта;

- обоснование возможности и перспективности использования ресурсов ор-тилии однобокой, полученное в результате изучения эколого-биологических и биохимических особенностей вида в природе.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, общих выводов и приложений, списка литературы, включающего 246 источников, в том числе 61 на иностранных языках. Иллюстративный материал представлен 48 рисунками и 35 таблицами.

В первой главе освещены вопросы лекарственной терапии воспалительных заболеваний, представлены сведения о применении лекарственных растений с противовоспалительным действием, о систематическом положении орти-лии однобокой, ее ареале, экологии, применении в народной медицине и фармакологической активности.

Во второй главе изложены методы исследований.

В третьей главе приведены данные по изучению эколого-биологических особенностей вида, сырьевых запасов, анатомического строения, данные товароведческого анализа.

В четвертой главе, посвященной фитохимическому изучению ортилии однобокой, приведены результаты качественного и количественного определения биологически активных веществ.

В пятой главе приводятся данные по разработке методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на ГСО рутина в надземной части ортилии однобокой и определению динамики накопления флавоноидов и экстрактивных веществ в зависимости от фенофаз, возрастного состояния, эколого-фитоценотических условий.

В шестой главе изложены результаты разработки способа получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью, методики стандартизации, показателей качества; приводятся результаты исследования содержания биологически активных веществ и установления срока годности сухого экстракта.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования служила надземная часть ортилии однобокой, образцы которой заготовлены в 1999-2003 гг. Сбор сырья и полевые исследования проводились на территории Западного Забайкалья, в четырех районах Республики Бурятия - Баргузинском, Прибайкальском, Иволгинском, Тар-багатайском и пригородной зоне г. Улан-Удэ (местность Верхняя Березовка).

В работе использовались реактивы и стандарты веществ, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Исследование качественного состава ортилии однобокой проводили методами одномерной и двумерной хроматографии на бумаге (БХ) марки РПй-ак РГ>М2, 14 (ГДР), тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках "5Пий>1"

марки UV 254 (ЧССР), «Армсорб» (Россия) с использованием следующих систем растворителей: I - этил ацетат : уксусная кислота (8:2); П - н-бутанол : уксусная кислота : вода (БУВ) (4:1:5); Ш - фенол : этанол : вода (15:4:1); IV - этанол : хлороформ (1:1); V - гексан : бензол : этанол (5:4:1); VI - хлороформ; VII -этиловый эфир - муравьиная кислота - вода (18:5:5); VIII - бутанол - муравьиная кислота - вода (18:2:9); IX - хлороформ : этанол (9:1); X - хлороформ : этанол (7:3); XI - 15 % уксусная кислота; ХП - н-бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:2); ХП1 - 5% уксусная кислота.

Анализ извлечений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили в градиентном и изократическом режимах элюиро-вания с использованием колонки (2 х 75 мм), заполненной сорбентом Nucleosil 100-5 С18,на хроматографе «Милихром - А-02» (Россия). Спектры поглощения в УФ- и видимой областях регистрировали на приборах СФ-46 (Россия), Agilent 8453 Е UV-Vis (Англия) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Эмиссионно-спектральный анализ проводили на спектрографе ДФС-8.

Анатомическое исследование ортилии однобокой проводили по общепринятым методикам с использованием микроскопа типа МБР-1, а также сканирующего электронного микроскопа Philips SEM 525-М (Япония).

Работа по изучению эколого-биологических особенностей и определению запасов сырья проводилась в 11 ценопопуляциях ортилии однобокой в разных точках ареала в Западном Забайкалье, различающихся по эколого-фитоценотическим условиям. Названия ценопопуляций (ЦП) даны по их местонахождению. Геоботанические описания проводились по общепринятой методике. Экологические факторы оценивали количественно. Механический состав почв - по Добровольскому [1973]. В образцах почвы, взятых из корнеоби-таемого слоя, определяли ряд агрохимических показателей по общепринятым методикам [Аринушкина, 1961; Агрохимические..., 1975]. Оценка ресурсов сырья проводилась согласно общепринятой методике определения запасов лекарственных растений [Методика..., 1986].

В работе использован ценопопуляционно-онтогенетический анализ [Це-нопопуляции..., 1976, 1988; Заугольнова, 1982, 1993; Злобин, 1989]. В качестве методической основы приняты принципы дискретного описания онтогенеза, предложенные Т.А. Работновым [1950], дополненные А.А. Урановым [1967, 1969] и другими [Смирнова, 1972, 1987; Gatsuk et al., 1980]. Исследования морфогенеза выполнены в соответствии с методическими подходами И.Г. Серебрякова и Т.И. Серебряковой [1952,1962,1965].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Ботанико-фармакогностическая характеристика ортилии однобокой

1.1. Эколого-биологические особенности ортилии однобокой. Выявлено, что на территории исследования ортилия однобокая произрастает в различных ассоциациях сосновых лесов, встречается также в березняках и осинниках, образуя местами скопления, что обусловлено биоморфологическими и онтогенетическими особенностями растения. Отмечено, что растение произрастает при различной освещенности - от глубокой тени до открытых мест (сомкну-

тость крон варьирует от 0.3 до 0.7). Довольно требовательно к содержанию гумуса, мало требовательно в отношении кислотности почв. Влажность верхнего горизонта почв составляет 8-15 %, подстилки - 50-60 %.

Видовая насыщенность ценозов колеблется от 11 до 20 видов высших растений. Проективное покрытие ортилии однобокой в изученных ценопопуля-циях составляет от 2 до 7 %.

Подробно изучен онтоморфогенез растения, что связано с необходимостью получения надежных данных по ресурсной базе для вновь разрабатываемого лекарственного средства. Онтоморфогенез характеризуется следующей последовательностью фаз: первичный побег - первичный куст - система первичного и парциальных кустов и побегов - система парциальных кустов и побегов - парциальный куст. В онтогенезе выделено четыре периода - латентный, прегенеративный, генеративный и постгенеративный и шесть возрастных состояний - проростки, ювенильное, виргинильное, генеративное, субсенильное и сенильное. Ортилия однобокая - многолетнее вечнозеленое длиннокорневищ-ное травянистое растение, отнесено нами к явнополицентрическому типу биоморф с преимущественным вегетативным размножением, сопровождающимся активным вегетативным разрастанием при помощи плагиотропных корневищ с образованием дочерних надземных побегов и приводящим к образованию диффузных клонов. Общая длительность полного онтогенеза не поддается измерению, если учесть многократно повторяющееся омоложение дочерних особей при вегетативном размножении.

Выявленная в ряду различных местообитаний изменчивость морфомет-рических параметров, обусловленная влиянием экологических и фитоценотиче-ских факторов, дала возможность установить реальные оптимумы организма и ценопопуляции ортилии однобокой (табл. 1). Полученные данные дают возможность определения оптимальных условий сбора сырья этого растения, поскольку во всех местообитаниях, характеризующихся благоприятными эколого-фитоиенотическими факторами (сосновые и смешанные леса на обеспеченных элементами питания почвах и с достаточной освещенностью нижних ярусов), определены более высокие показатели биологической продуктивности и ценопопуляции изучаемого вида образуют здесь наиболее значительные по площади заросли, в которых сосредоточены наибольшие запасы сырья.

Сырьевая продуктивность фитомассы в исследованных ценопопуляциях варьирует в пределах 7.28±0.66 - 14.411.22 г/м2, эксплуатационные запасы сырья на конкретных зарослях, определенные в 11 местообитаниях, составили 73.33 кг, объем возможных ежегодных заготовок - 14.66 кг. Принимая во внимание особенности частного и полного онтогенеза изучаемого вида, мы рекомендуем производить сбор сырья путем срезания надземных побегов, оставляя нижние метамеры (2-3 см) с боковыми пазушными почками возобновления и считаем, что периодичность заготовок на одном и том же месте не должна превышать одного раза в 4-5 лет; при сборе сырья необходимо оставлять не менее 20 % генеративных побегов.

Таблица 1

Оценка оптимума ценопопуляций ортилии однобокой по совокупности признаков _и запасы сырья ортилии однобокой в изученных местообитаниях ___

Ценопопуляция(ЦП) Надземная фитомасса, г/м2 Средняя плотность ЦП, шт/м2 Доля растений прегенератив- ного периода, % Доля генеративных растений, % Средний балл Урожайность, г/м2 Площадь заросли м2 Эксплуатационный запас сырья, кг Объем возможных ежегодных заготовок, кг

а б а б а б а б

Горячинск-1 (березово-сосновый лес душекиево-разнотравный) 9.51 1 25 7 2 78 5 1 11.6 3 1 75 9 51±0 82 1240 9.75 1 95

Горячинск-2 (сосняк рододендроново-брусничный) 144 3 37 9 3 83 2 12 8 3 2 75 14.4±1 22 1125 13 45 2 69

Горячинск-3 (сосняк душекиево-разнотравный) 8.4 1 23 1 1 76 2 1 98 3 1 5 8 43±0.74 736 5 11 1 02

Максимиха (сосняк душекиево-линнево-разнотравный) 13.3 3 34 9 3 72 6 1 132 3 25 13.26±1 14 980 10 76 2 15

Уро (осинник разнотравный) 79 1 22 2 1 74 1 1 120 3 1.5 7 9±0.55 460 3 13 0 63

В Березовка-1 (сосняк душекиево-бадановый) 10 8 2 301 2 91 4 3 76 2 2 25 10 8±0 94 1131 10 09 2 02

В Березовка-2 (березняк разнотравный) 90 1 22 6 1 98 9 3 1 1 1 1 5 9 04±0 79 462 3.45 0 69

В Березовка-3 (сосняк редкопокров-ный) 7.3 1 182 1 87 5 2 122 3 1 75 7.28 ± 0 66 528 3 14 0 63

Большой Куналей (березово-сосновый лес разнотравный) 9 1 1 25 0 2 88 3 2 74 2 1 75 9.13 ±0 78 928 7 02 1 40

Омулевая гора (сосняк злаково-рашотравный) 3.6 1 22 7 1 84 6 2 7.7 2 1 5 8 63 ± 0 75 520 3.71 0 74

Петуховка (сосняк редкопокровный) 8 1 1 22 3 1 97 7 3 1 3 1 1 5 8 14 ± 0 66 546 3 72 0 74

Всего 8656 73.33 14 66

Примечание: а - абсолютные показатели, б - баллы.

1.2. Анатомическое строение и анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой. При проведении анатомического исследования цельного, измельченного и порошкованного сырья ортилии однобокой был выявлен ряд анатомо-диагностических особенностей: извилистостенность клеток эпидермиса листа с сосочкообразными выростами; наличие многочисленных устьиц ра-нункулоидного типа на нижнем эпидермисе листа и редких - на верхнем; наличие сосочкообразных выростов у клеток эпидермиса вегетативного и генеративного побега, черешка листа; наличие закрытых коллатеральных пучков со спиральными сосудами в листе, чешуе и чашелистике; беспучковое строение стебля, где сосуды расположены группами от 3 до 9 в виде одно-двурядных радиальных тяжей; расположение уголковой колленхимы в листе (в выступах крупных жилок); наличие однородного мезофилла губчатого типа в листе; наличие друз кристаллов в эпидермисе и мезофилле чешуй, паренхиме черешка листа и первичной коры стебля, наличие склеренхимы в генеративном побеге и расположение в нем флоэмы в виде прерывистых тяжей; наличие сосочков и зубчиков по краю лепестка и чашелистика, образованных клетками эпидермиса. Установленные анатомо-диагностические признаки могут использоваться для определения подлинности сырья данного растения.

1.3. Товароведческий анализ сырья. В результате проведенного товароведческого анализа установлены следующие показатели качества лекарственного сырья: потеря в массе при высушивании не более 10 %, содержание экстрактивных вешсств не менее 19 %, содержание минеральных примесей не более 0,5 %, органических - не более 1 %, содержание общей золы не более 5 %, золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, не более 2 % Эти показатели легли в основу проекта Фармакопейной статьи предприятия на надземную часть ортилии однобокой.

2. Фитохимическое исследование надземной части ортилии однобокой

2.1. Исследование качественного состава. Аминокислотный состав изучаемого растения представлен девятью свободными аминокислотами (водное извлечение, хроматография в тонком слое сорбен га (ТСХ), система растворителей III), идентифицированы L-аспарагин (Rf 5 0.18), DL-P-аланин (Rf40.15), DL-серин (Rf3 0.10), L-цистеин (Rfi 0 29), DL-метионин (Rf70.26). Установлено наличие аскорбиновой кислоты (водное извлечение. Rf 0.47, система растворителей I, (ТСХ)), четырех органических кислот, три из которых идентифицированы при сравнении с аутентичными образцами как лимонная (БХ, Rf 0.56 в системе VII, Rf 0.48 в системе VIII), яблочная (Rf 0.63 (VII), Rf 0.68 (VIII)), янтарная (Rf 0.90 (VII), Rf 0.85 (VIII)) кислоты Фенолокислоты представлены четырьмя веществами, две из них идентифицированы в сравнении с аутентичными образцами: галловая (Rf 0,42 (XIII, БХ), Rf 0,32 (IX, БХ)), хлорогеновая (Rf 0,61 (VIH, БХ), Rf 0,53 (IX, БХ)).

Установлено наличие трех веществ, относящихся к группе иридоидов (водно-спиртовое извлечение, система растворителей П, БХ), пяти - к группе кумаринов (хлороформная фракция, V, ТСХ), четырех - к сапонинам тритерпе-новой природы (хлороформная фракция, IX, ТСХ), трех - к простым фенолам (водное, водно-спиртовое извлечения, X, ТСХ). Кроме того, при помощи каче-

ственных реакций обнаружены гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества, полисахариды.

Методом хроматографии на бумаге в системах растворителей XII (I направление) и XI (II направление) при обработке хроматограмм 2 % раствором алюминия хлористого в водно-спиртовом извлечении обнаружено 9, в этилаце-татной фракции - около 19 зон с характерной для флавоноидов желтой и желто-зеленой флуоресценцией, после обработки 2 % раствором алюминия хлористого ярко-желтого цвета. По хроматографическому поведению и флуоресценции в УФ-свете до и после обработки 2 % раствором А1С13 флавоноидные соединения Orthilia secunda отнесены к группе флавонолов. Поскольку флавоноиды изучаемого растения представлены в основном гликозидами, мы провели их расщепление кислотным гидролизом. Хроматографирование гидролизатов, полученных после восьмичасового гидролиза, в системах XII (I направление) и XI (П направление) привело к обнаружению и идентификации при сравнении с аутентичными образцами флавоноловых агликонов - кверцетина (Rf 0.65 (I), Rf 0.08 (II)) и кемпферола (Rf 0.80 (I), Rf 0.08 (II)).

2.2 Количественное определение биологически активных веществ. Для некоторых групп БАВ, обнаруженных в ортилии однобокой - дубильных веществ, простых фенолов, аскорбиновой и органических кислот было проведено определение количественного содержания. Результаты количественного анализа, проведенного на образцах надземной части ортилии однобокой, собранных в фазу цветения, приведены в таблице 2.

Таблица 2

Количественное содержание некоторых биологически активных веществ

в надземной части ортилии однобокой, %

Дубильные вещества г Простые фенолы Аскорбиновая кислота Органические кислоты

Общая сумма Лимонная Яблочная Янтарная

1 12 62 ±0 56 6 88 ±0 33 0 05 + 0 002 5 58 + 0 08 1 09 ± 0 02 0 94 ± 0 03 0 67 ± 0 03

Количественное определение дубильных веществ проводили с использованием комплексонометрического метода, простых фенолов - с использованием методики, изложенной в ГФ XI, аскорбиновой кислоты - с использованием методики ГФ XI, основанной на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндо-фенолят натрия, органических кислот - с использованием метода потенциометрического титрования. Кроме того, при помощи эмиссионного спектрального анализа было проведено определение качественного состава и количественного содержания макро- и микроэлементов в надземной части ортилии однобокой. Согласно полученным данным, элементы располагаются в порядке убывания количественного содержания в следующем ряду: Са > > Р > > Мп > № = А1 > "Л > Ре > Ва > Ъъ > Си > 2х > 8г > V > № > Сг = РЬ > 5с = У > Со > Мо = Бп > УЪ = Ве > Ag. О концентрировании элементов судили путем сравнения их количеств со средними величинами содержания этих же элементов в растениях сходных зон произрастания, взятыми

из литературных источников; выявлено, что исследуемое растение концентрирует 8 элементов, является умеренным накопителем железа, меди, кобальта, сверхконцентратором марганца и хрома, что согласуется с данными о специфической роли этих элементов в образовании и накоплении фенольных соединений, сапонинов, аскорбиновой кислоты.

3. Разработка методики количественного определения суммарного

содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой

Одним из важнейших аспектов молекулярно-клеточных механизмов противовоспалительного действия извлечений ортилии однобокой является наличие у них высокой антиокислительной и мембраностабилизирующей активностей, реализация которых связана, главным образом, с наличием в них комплекса фенольных соединений и, в большей мере, флавоноидов. Данное обстоятельство позволяет предложить в качестве критерия доброкачественности сырья содержание в нем веществ фенольного характера - флавоноидов.

Разработка методики количественного определения флавоноидов осуществлялась на основе метода дифференциальной спектрофотометрии. Данный метод, преимуществами которого являются высокая точность и экспрессность проведения анализа, базируется на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом, сопровождающейся батохромным сдвигом первой полосы поглощения флавоноидов. Применение в качестве контроля испытуемого раствора без реактива позволяет исключить влияние сопутствующих веществ.

В качестве стандартного вещества, по которому проводилось определение количественного содержания флавоноидов, выбран рутин, максимумы поношения комплексов которого и суммы флавоноидов ортилии однобокой с алюминия хлоридом лежат в одной области при длине волны 414 нм (рис. 1).

Рис. 1. Дифференциальные спектры пот т ощени я спиртового извлечения ортилии однобокой и ГСО ругана

■И

3- - спиртовое извлечение из ортилии однобокой

-------- спиртовый раствор ГСО рутина

<

Эта область спектра достаточно удалена от максимумов поглощения сопутствующих соединений, содержащихся в извлечениях из сырья, что позволяет исключить их влияние на результаты анализа.

Были подобраны оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из надземной части ортилии однобокой: максимальное извлечение данных веществ достигается экстракцией сырья с размерами частиц 1 - 0.5 мм 70 % спиртом этиловым на кипящей водяной бане в течение 60 минут при первом контакте фаз и соотношении сырье : экстрагент 1 : 100, 60 минут - при втором и соотношении 1 : 50,30 минут при третьем контакте и соотношении 1: 50.

Относительная ошибка определения разработанной методики определена в результате анализа одного образца в десяти повторностях и не превышает 5 % (табл. 3).

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были проведены опьггы с добавками ГСО рутина при экстракции сырья (табл. 4). Результаты эксперимента свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки.

Таблица 3

Метрологические характеристики методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин в надземной части

ортилии однобокой

f X, 52 8 Р Цр, Д х Дх АотН} Аотн,

% % %

9 2.62 0.00221 0.04701 95 2.26 0.01487 0 03361 0.10624 4.06 1.28

Таблица 4

Влияние добавок ГСО рутина на суммарное содержание флавоноидов ______в надземной части ортилии однобокой___

Флавонои- Введено ру- Должно Найдено флавонои- Абсолют- Относи-

дов в над- тина. г быгь фла- дов в пересчете на ная ошиб- тельная

земной воноидов в рутин, г ка, г ошибка, %

части в пе- пересчете

ресчете на на рутин, г

рутин, г

0.02414 0.00603 0.03017 0.02920 0.00097 3.21

0.02408 0.00597 0.03005 0.02970 0.00035 1.16

0.02392 0.01206 0.03598 0.03561 0.00037 1.03

0.02421 0.01220 0.03641 0.03754 -0.00113 3.10

0.02367 0.01809 0.04176 0.04225 -0.00049 1.17

0.02394 0.01796 0.04190 0.04268 -0.0078 1.86

4. Изучение динамики накопления флавоноидов ортилии однобокой

В целях рационального использования ресурсов ортилии однобокой важно установить оптимальные сроки сбора сырья (период максимального накопления суммы флавоноидов), выявить морфологическую часть растения, наиболее богатую флавоноидами, изучить влияние эколого-ценотического окружения

на накопление флавоноидов в сырьевой фитомассе.

Исследование проводили при помощи разработанной методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на ГСО рутина, параллельно определяли содержание экстрактивных веществ по методике, рекомендованной ГФ XI.

4.2. Суммарное содержание флавоноидов и экстрактивных веществ в органах ортилии однобокой и динамика их накопления в течение вегетационного периода. В результате проведенных исследований выявлены различия в суммарном содержании флавоноидов и экстрактивных веществ в различных органах растений, собранных в одну фазу вегетации (бутонизации - начала цветения) (табл. 5). В качестве модельных экземпляров использовали растения виргинильного и генеративного возрастного состояния ценопопуляции Горя-чинск-3. Проведенный анализ показал, что в целом суммарное содержание флавоноидов и экстрактивных веществ в надземных органах значительно выше, чем в корневищах и, соответственно, в качестве лекарственного сырья следует использовать надземные побеги ортилии однобокой.

Таблица 5

Суммарное содержание флавоноидов и экстрактивных веществ в органах

ортилии однобокой, %

Виргинильные растения Генеративные растения

Флавоновды, % Экстрактивные вещества, % Флавоноиды, % Экстрактивные вещества, %

Ст ебель 2 05 ± 0.06 17.65 ± 0.85 2.22 1 0.08 17 71 ±0.75

Л,!СТ 3 72 ± 0 11 20 24 + 087 4 49 ±0 16 19 74 ± 0 74

Г енерагавные органы - - 2.33 х 0.09 24.07 ± 0.94

Корневище 0 52 ± 0 02 12 75 ± 0 46 0.50 ± 0 02 13.49 ±0.57

Для выяснения закономерностей накопления флавоноидов в течение вегетационного периода и сезонного развития растения, анализировали их суммарное содержание по фазам вегетации. Как показали результаты определения, в надземной части ортилии однобокой во все периоды активной вегетации происходит постоянное изменение суммарного содержания флавоноидов (рис. 2).

3,2

з 2,8 2,6 2,4 2.2 2

—надземная часть ■ генеративные органы

Рис 2 Динамика накопления флавоноидов в надземных органах ортилии однобокой по фе-нофазам 1 - вегетативная, 2 - бутонизации-начала цветения, 3 - цветение, 4 - плодоношение, 5 - конец плодоношения. По оси абсцисс - фазы вегетации, по оси ординат - сумма флавоноидов, %

В репродуктивных органах наибольшее содержание флавоноидов наблюдается в бутонах в начале цветения, наименьшее - в плодах. Максимальное их количество в надземной части наблюдается в период бутонизации - начала цветения, а затем происходит постепенное снижение содержания флавоноидов до минимального их значения в период окончания плодоношения и осенней вегетации.

4.3. Динамика накопления флавоноидов в онтогенезе ортилии однобокой. Изучение динамики накопления флавоноидов в онтогенезе ортилии однобокой показало повышение содержания этих веществ с увеличением биологического возраста растения, за исключением постгенеративного периода (рис. 3). Наибольшим суммарным содержанием флавоноидов - 3.02-3.05 % - характеризуются генеративные растения, причем значения для разных по календарному возрасту побегов практически не меняются. Относительно стабильные величины - от 2.8 до 2.89 % - получены и при определении суммарного содержания флавоноидов у группы растений виргинильного периода, куда также вошли растения разных календарных возрастов. Содержание флавоноидов падает с переходом растений к постгенеративному периоду, и у субсенильных растений значение их составляет 2 36 %. Наименьшее количественное содержание этих веществ - 2.25 % - выявлено у ювенильных растений. Полученные данные свидетельствуют об изменении интенсивности биохимических процессов в онтогенезе и могут служить в качестве дополнительного признака, характеризующего возрастные состояния ортилии однобокой. В качестве лекарственного сырья ортилии однобокой целесообразно использовать надземные побеги генеративного и виргинильного возрастного состояния - вегеттивные 2-4 -летние побеги, ввиду стабильности довольно значшельного содержания в них флавоноидов. Лучшими сроками для сбора сырья ортилии однобокой является период бутонизации и цветения растений с середины июня по конец июля, так как на него приходится максимум содержания этих веществ

1 2 3 4 5 6 7 8

Вювенильные Ввиргинильные О генеративные Псубсенильные

Рис 3 Суммарное содержание флавонокаов в надземной части ортилии однобокой в зависимости от возрастного состояния. По оси абсцисс I - однолетние побеги, 2, 3, 4 - двух-, трех-, четырехлетние парциальные побеги, 5, 6, 7 - трех-, четырех-, пятилетние парциальные

побеги, 8 - пяти-, шестилетние парциальные побеги По оси ординат - сумма флавоноидов, %

4.4. Суммарное содержание флавоноидов в надземной части орткпии однобокой в зависимости от эколого-фитоценотических условий. Анализу подвергали образцы надземной части растений виргинильного возрастного состояния из 11 ценопопуляций ортилии однобокой. Изучение количественного содержания флавоноидных соединений в растениях разных местообитаний показало значительное межпопуляционное варьирование по этому показателю -от 2.52 до 3.39 % (табл. 6).

Таблица 6

Суммарное содержание флавоноидов в надземных частях ортилии однобокой ___из разных местообитаний______

Местообитание, ценопопуляция Тип почвы Обеспеченность элементами минерального питания Сомк ну-тость крон Сумма флавоноидов, %

Гумус, % N общий, % РгОз, мг/ 100г К20, мг/ 100г

1 Горячинск-2, сосняк рододендроново- брусничный Дерново-лесная супесчаная 5.58 0.203 13.5 10.5 00.3 3.39 ± 0.12

2 Петуховка, сосняк ред-копокровный Дерново-лесная суглинистая 5.41 0.189 25.0 30.75 0.3 3.37 ± 0.11

3 В Березовка-3, сосняк редкопокровный Дерново-лесная супесчаная 8.53 0.280 27.5 22.0 0.3 3.33 ± 0.09

4 Омулевая гора, сосняк злаково-разногравныи Дерново- лесная су1 -линистая 12 3 0.245 23 25 15.0 0.4 3.15 ± 0.10

5 Большой Куиапей, бе-резово-сосновый лес разнотравный Дерново-лесная суглинистая 5.96 0.210 23.25 23.0 0.4 3.14± 0.13

6 Горячинск-3, сосняк душекиево- разнотравньж Дерново-лесная суглинистая 4.96 6.81 0.182 4.75 15.0 0.4 2.88 ± 0.09

7 Максимиха, сосняк ду- шекиево-линнево- разнотравный Дерново-лесная супесчаная 0.175 8.5 37.0 0.5 2.79 ± 0.12

8 Уро, осинник разнотравный Дерново-лесная суглинистая 4.11 0.133 4.5 15.0 0.4 2.75 ± 0.07

9 Горячинск-1, березово-сосновый лее душекие-во-разнотравный Дерново-лесная суглинистая 6.56 0.224 1.25 9.5 0.5 2.64 ± 0.10

10 В. Березовка-1, сосняк душекиево-бадановый Дерново-лесная суглинистая 15.77 0.322 4.0 18.25 0.6 2.56 ± 0.09

и В Березовка-2, березняк разнотравный Дерново-карбонатная супесчаная 18.39 0.218 17.75 25.0 0.7 2.52 ± 0.08

Наименьшее накопление флавоноидов наблюдается в образцах ортилии однобокой, собранных в березняке разнотравном (ЦП В. Березовка-1), макси-

мальное - в сосняке рододендроново-брусничном (ЦП Горячинск-2). Также высоким содержанием флавоноидов (выше 3 %) характеризуются растения, произрастающие в сосняках: редкопокровных (ЦП Петуховка, В. Березовка-3), зла-ково-разнотравном (ЦП Омулевая гора), разнотравном (ЦП Б. Куналей); необходимо отметить, что в первых трех сообществах растение произрастает в условиях пониженной межвидовой конкуренции вследствие разреженности и скудности травяного покрова.

При сопоставлении данных о накоплении флавоноидов со степенью плодородия почв выявлено положительное влияние такого показателя, как обеспеченность подвижными формами фосфора. В местообитаниях, почвы которых характеризуются высоким содержанием этого элемента питания, растения накапливают значительное количество флавоноидов (сосняки редкопокровные -ЦП В. Березовка-3 и Петуховка, сосняк злаково-разнотравный - ЦП Омулевая гора, березово-сосновый лес разнотравный - ЦП Б. Куналей).

Отмечено, что в растениях более освещенных местообитаний суммарное содержание флавоноидов выше, нежели у растений, произрастающих в более затененных условиях (табл. 6). Так, максимальное накопление флавоноидов -3.39 % - отмечено в надземной части ортилии однобокой, произрастающей на открытых участках соснового леса в условиях хорошего освещения (ЦП Горячинск-2), минимальное - 2.52 % - у растений, произрастающих в условиях глубокого затенения при сомкнутости крон 0.7 в березняке разнотравном (ЦП В.Березовка-2).

5. Разработка способа получения средства, обладающего антиокислительной и противовоспалительной активностью

5.1. Разработка способа получения сухого экстракта. Оптимизация процесса экстрагирования проводилась по выходу из сырья суммы флавоноидов и экстрактивных вещее I в.

При разработке способа получения сухого экстракта учитывалось влияние состава и природы экстрагента, его соотношения с сырьем, температурного режима, степени измельчения сырья, продолжительности и кратности числа экстракций на выход биологически активных веществ из исследуемого лекарственного растения. В результате проведенных исследований установлено, что оптимальными для получения сухого экстракта ортилии однобокой (с максимальным извлечением суммы флавоноидов и экстрактивных веществ) являются следующие параметры: экстракция сырья с размерами частиц 1 мм 40 % спиртом этиловым в соотношении с экстрагентом 1: (12-14) при температуре 60°С в течение 60 минут при первом и втором контактах фаз и 30 минут при третьем контакте. На основании проведенных исследований разработан способ, технологическая схема (рис. 4) и лабораторный регламент получения экстракта ортилии однобокой сухого.

Рис. 4. Технологическая схема производства сухого экстракта ортилии однобокой

Спирт утиловый Вода

Сырье

тп 21 Приготовление 40% спирта этилового и экстракция измельченного сьгоья

ТП 22 Фильтрация экстракта

ТП 23 Концентрирование экстракта

ТП 24 Сепарирование концентрированного Экстракта

ТП 25 Доупарка очищенного экстракта

ТП 26 Сушка

ТП 27 Измельчение готового продута

ТП 1 Измельчение растительного сырья

ТП 2 Получение готового продукта

Потери

Шрот

Отгон спирта эти-

Балластные вещества

УМО Фасовка и

1 упаковка

сухого

экстракта

на гклад

Потери

5.2. Изучение химического состава сухого экстракта ортилии однобокой. Результаты качественного анализа, проведенною с использованием качественных реакций, методов хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента, показали наличие в сухом экстракте ортилии однобокой основных групп биологически активных веществ, содержащихся в исходном сырье: углеводов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, органических кислот (яблочной, янтарной и лимонной), фенольных кислот (галловой, хлорогеновой и др.), тритерпеновых сапонинов, иридоидов, производных кумарина, гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ, флавоноидов в виде флавоноловых агликонов (кемпферол и кверцетин) и гликозидов, простых фенолов, 26 макро- и микроэлементов. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии подтверждено присутствие в сухом экстракте галловой кислоты в количестве 1.18 ± 0.06 %, флавонолов кверцетина и кемпферола с количественным содержанием 1.46 ± 0.07 % и 0.053 ± 0.005 %, соответственно. Результаты количественного определения некоторых биологически активных веществ представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Содержание некоторых биологически активных веществ _ в сухом экстракте ортилии однобокой_

БАВ Содержание, %, по сериям

1 2 3 4 5

Дубильные вещества 28.65±0.66 29.31±0.76 28.72*0.67 28.60*0.64 29.05±0.73

Простые фенолы 15.22±0.22 14.98±0.21 15.64±0.26 14.86±0.21 15.16±0.20

Органические кислоты 11.50±0.35 11.10±0 21 11,63±0.23 11.54±0.19 11.55±0.22

Аскорбиновая кислота 0.12*0.01 0.15*0.02 0.10*0.01 0.12*0.01 0.13±0.01

5.3. Стандартизация сухого экстракта ортилии однобокой. Для стандартизации сухого экстракта предложен метод дифференциальной спектрофо-тометрии. В качестве стандартного вещества, по которому проводилось определение количественного содержания флавоноидов, выбран рутин, максимумы поглощения комплексов которого и суммы флавоноидов ортилии однобокой с алюминия хлоридом лежат в одной области при длине волны 414 нм.

Таблица 8

Метрологические характеристики методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин в сухом экстракте

ортилии однобокой

Г х, % в2 в Р КР. Д х Ах Аотн> % Аотн, %

6 6.59 0.00859 0.09269 95 2.45 0.03504 0.08584 0.22711 3.50 1.32

Как следует из таблицы 8, данная методика воспроизводима, ошибка единичного определения при доверительной вероятности 95 % не превышает 5 %. Данные, представленные в таблице 9, свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки методики.

Таблица 9

Влияние добавок ГСО рутина на суммарное содержание флавоноидов

в сухом экстракте ортилии однобокой

Флавоноидов в сухом экстракте, в пересчете на рутин, г, г Введено рутина, г Должно быть флавоноидов, в пересчете на рутин, г Найдено флавоноидов в пересчете на рутин, г Абсолютная ошибка, 1 Относительная ошибка, %

0.06594 0.01603 0.08197 0.08320 -0.00123 1.52

0.06528 0.04597 0.11025 0.10876 0.00249 2.25

0.06591 0.01922 0.08313 0.08356 0.00157 1.89

Разработанные показатели антиокислительного и противовоспалительного средства: описание внешнего вида, подлинность, растворимость, потеря в массе при высушивании, микробиологическая чистота, содержание тяжелых металлов, суммарное содержание флавоноидов в пересчете на рутин включены в проект ФС предприятия на сухой экстракт ортилии однобокой. При хранении сухого экстракта в обычных условиях установлен предварительный срок годности сухого экстракта - 2 года.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ортилия однобокая, многолетнее вечнозеленое длин-нокорневищное травянистое растение, на территории исследования произрастает в различных ассоциациях сосновых лесов, а также в березняках и осинниках, образуя местами значительные скопления, что обусловлено биоморфологическими и онтогенетическими особенностями растения. В онтогенезе растения выделено четыре периода и шесть возрастных состояний. Относится к явнопо-лицентрическому типу биоморф с третьим типом вегетативного размножения, сопровождающимся активным вегетативным разрастанием и приводящим к образованию диффузных клонов, в которых отмечается неопределенно долгая задержка старения, вызванная неглубоким омоложением дочерних особей неопределенно большого числа поколений.

2. Получены данные по установлению оптимума организма и ценопопу-ляции орт илии однобокой, которые дают возможность определения оптимальных условий сбора сырья этого растения, поскольку во всех местообитаниях, характеризующихся благоприятными эколого-фитоценотическими факторами (сосновые и смешанные леса на обеспеченных элементами питания почвах и с достаточной освещенностью нижних ярусов), определены высокие показатели биологической продуктивности и ценопопуляции изучаемого вида образуют здесь наиболее значительные по площади заросли, в которых сосредоточены наибольшие запасы сырья.

3. Сырьевая продуктивность фитомассы в исследованных ценопопуляци-ях варьирует в пределах 7.28±0.66 - 14.4±1.22 г/м2, эксплуатационные запасы сырья на конкретных зарослях, определенные в 11 местообитаниях составили 73.33 кг, объем возможных ежегодных заготовок - 14.66 кг. Принимая во внимание особенности частного и полного онтогенеза изучаемого вида, мы рекомендуем производить сбор сырья путем срезания надземных побегов, оставляя нижние метамеры (2-3 см) с боковыми пазушными почками возобновления и считаем, что периодичность заготовок на одном и том же месте не должна превышать одного раза в 4-5 лет; при сборе сырья необходимо оставлять не менее 20 % генеративных побегов.

4. Определены анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой: извилистостенность клеток эпидермиса листа с сосочкообразными выростами; наличие многочисленных устьиц ранункулоидного типа на нижнем эпидермисе листа и редких, расположенных над жилками - на верхнем; наличие сосочкооб-разных выростов у клеток эпидермиса вегетативного и генеративного побега, черешка листа; наличие закрытых коллатеральных пучков со спиральными со-

судами в листе, чешуях, чашелистиках, лепестках; беспучковое строение стебля, где сосуды расположены группами от 3 до 9 в виде одно-двурядных радиальных тяжей; расположение уголковой колленхимы в листе (в выступах крупных жилок); наличие однородного мезофилла губчатого типа в листе; наличие друз кристаллов в эпидермисе и мезофилле чешуй, паренхиме черешка листа и первичной коры вегетативного побега, наличие склеренхимы в генеративном побеге и расположение в нем флоэмы в виде прерывистых тяжей; наличие сосочков и зубчиков, образованных клетками эпидермиса по краю лепестка и чашелистика.

5. В надземной части и сухом экстракте ортилии однобокой с использованием химических и физико-химических методов исследования установлено содержание флавоноидов в виде флавоноловых агликонов (кверцетин и кемп-ферол) и гликозидов, фенольных кислот (галловой, хлорогеновой), гидролизуе-мых и конденсированных дубильных веществ, простых фенолов, углеводов, аминокислот (Ь-аспарагина, ОЬ-метионина, ОЬ-р-аланина, Ь-цистеина, БЬ-серина), органических кислот, тритерпеновых сапонинов, иридоидов, производных кумарина; кроме того, обнаружены и количественно определены 26 макро- и микроэлементов. Определено количественное содержание в надземной части и сухом экстракте дубильных веществ (12.62+0.56 % и 28.65±0.66 % соответственно), аскорбиновой кислоты (0.05±0 002 % и 0.12±0.01 %), органических кислот - яблочной (0.94±0.03 % и 1.8410.41 %), янтарной (0.67±0.03 % и 1.2910.33 %) и лимонной (1.0910.02 % и 4.62Ю.29 %), простых фенолов (6.88Ю.ЗЗ %и 15.22±0.22).

6. Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на ГСО рутина в надземной части ортилии однобокой с учетом оптимальных параметров экстракции: максимальное извлечение суммы флавоноидов достигается экстракцией сырья с размерами частиц 1 - 0.5 мм 70 % спиртом этиловым на кипящей водяной бане в течение 60 минут при первом контакте фаз и соотношении сырье : экстрагент 1 : 100, 60 минут при втором контакте фаз и соотношении 1 : 50, 30 минут при третьем контакте и соотношении 1 : 50. Относительная ошибка методики не превышает 5%.

7. Установлено, что в качестве лекарственного растительною сырья ортилии однобокой целесообразно использовать надземные побеги генеративного и виргинильного возрастного состояния - вегетативные 2-4 -летние побеги, ввиду более высокого содержания в них флавоноидов - 3.02-3.05 %; \ - 2.8 -2.89 %). Лучшими сроками для сбора сырья ортилии однобокой является период бутонизации и цветения растений с середины июня по конец июля, так как на него приходится максимум содержания этих веществ. Установлена зависимость накопления флавоноидов в надземной части исследуемого растения от экологических условий: у растений, произрастающих в сосновых сообществах с разреженным травяным покровом в условиях хорошей освещенности (при сомкнутости крон 0.1 - 0.3) и обеспеченности подвижными формами фосфора, наблюдается более высокое суммарное содержание флавоноидов и при плани-

ровании заготовок сырья данного вида мы рекомендуем учитывать данные обстоятельства.

8. Выбраны оптимальные технологические параметры получения сухого экстракта: экстрагент - 40 % спирт этиловый, степень измельчения сырья - 1 -0,5 мм, соотношение сырье-экстрагент - 1:12-14 (с учетом коэффициента водо-поглощения сырья), температура экстракции - 60 °С, трехкратная экстракция -60, 60 и 30 минут, соответственно. На основании этого разработана технологическая схема производства сухого экстракта - средства, обладающего противовоспалительной активностью.

9. Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в сухом экстракте ортилии однобокой, лабораторный технологический регламент на производство сухого экстракта, проект Фармакопейной Статьи предприятия на сырье ортилии однобокой, показатели качества сухого экстракта, которые включены в проект Фармакопейной Статьи предприятия на экстракт ортилии однобокой сухой.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ломбоева С.С. Виды рода Orthilia как перспективные лекарственные растения // Агроэкология и устойчивое развитие регионов: Мат-лы II Всеросс науч. конф.- Красноярск, 2000. - С. 23-24.

2. Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Асеева Т.А. Биологически активные вещества ортилии однобокой // Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья: Мат-лы междунар. науч. конф. - Новосибирск, 2000,- Т.1.- С. 36-37.

3. Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Асеева Т.А. Фитохимическое исследование ортилии однобокой // Человек и лекарство: Мат-лы VIII Росс, национ. конгр. - М., 2001.- С. 586.

4. Чукаев С.А., Бураева Л.Б., Ботоева Е.А., Ломбоева С.С. Антиокси-дантные и мембраностабилизирующие свойства сухого экстракта ортилии однобокой // Человек и лекарство: Мат-лы VIII Росс, национ. конгр,- М., 2001.- С. 636.

5. Ботоева Е.А., Ломбоева С.С., Бураева Л.Б., Цыренжапов A.B. Противовоспалительное действие сухого экстракта ортилии однобокой // Разработка и внедрение новых методов и средств традиционной медицины,- М., 2001.- Т.2.-С. 182-183.

6. Ломбоева С.С. Динамика накопления действующих веществ в ортилии однобокой // Экология Южной Сибири: Мат-лы Южно-Сибирской междунар. науч. конф.- Абакан, 2001,- Т.1.- С. 65-66.

7. Ботоева Е.А., Ломбоева С.С., Бураева Л.Б., Чукаев С.А. Мембраноста-билизирующее действие сухого экстракта ортилии однобокой // Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении: Мат-лы науч.-практ. конф. с междунар. участием.- Улан-Удэ, 2001.- С. 61-62.

8. Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Асеева Т.А. Количественное определение суммы флавоноидов в надземной части Orthilia secunda (L.) House Н Биологически активные добавки и здоровое питание: Мат-лы Всеросс. науч. конф,-Улан-Удэ, 2001.- С. 27-28.

9. Ботоева Е.А., Бураева Л.Б., Цыренжапов А.В., Ломбоева С.С. Влияние сухого экстракта ортилии однобокой на течение воспалительной реакции в эксперименте // Человек и лекарство: Мат-лы IX Росс, национ. конгр. - М., 2002.-С. 588.

10. Николаев С.М., Ботоева Е.А., Ломбоева С.С. и др. Влияние сухого экстракта ортилии однобокой на течение экспериментального эндометрита // Сибирский медицинский журнал.-2002.-Ы 5.- С. 78-81.

11. Ломбоева С.С., Ботоева Е.А., Николаев С.М., Танхаева Л.М., Асеева Т.А. и др. Способ получения средства, обладающего антиокислительной и противовоспалительной активностью // Заявка N 2002115666/14(016475); решение о выдаче патента от 25.11.2002 г.

12. Ботоева Е.А., Ломбоева С.С., Бураева Л.Б., Чукаев С.А. Химическое и фармакологическое исследование ортилии однобокой Orthilia secunda (L.) House //Сибирский медицинский журнал.-2003.-Ы 1.- С. 69-71.

13. Ломбоева С.С. Возрастная структура ценопопуляций Orthilia secunda (L.) House II Мат-лы per. науч.-практ. конф. ИрГСХА.- Иркутск, 2003.- С. 62-63.

14. Ломбоева С.С. Элементный состав и особенности накопления микроэлементов в надземной части Orthilia secunda (L.) House II Мат-лы регион, науч.-практ. конф. ИрГСХА,- Иркутск, 2003.- С. 64-65.

15. Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Асеева Т.А. Разработка способа получения сухого экстракта ортилии однобокой и его стандартизация // Мат-лы науч.-практ. конф., поев. 70-лет. службы ККЛС в Бурятии.- Улан-Удэ, 2003.- С. 82-85.

16. Ломбоева С.С., Олейников Д.Н. Органические кислоты Orthilia secunda (L.) House II Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении: Мат-лы науч.-практ. конф.- Улан-Удэ, 2003.- С. 3132.

»148 4 6

\

I

РНБ Русский фонд

2006-4

10424 j

Актуальность темы. Использование растений с лечебной целью известно с глубокой древности и, несмотря на прогресс в области синтеза лекарственных препаратов, растительные лекарственные средства продолжают занимать значительное место в современной медицине. Возрастающая популярность и эффективность препаратов растительного происхождения во многом объясняется тем, что содержащиеся в них биологически активные вещества воздействуют на организм комплексно, легко включаются в обменные процессы и практически не проявляют побочных эффектов при длительном применении.

Известно, что практически все синтетические препараты, используемые при лечении заболеваний, в основе которых лежит воспалительная реакция, оказывают побочное действие и имеют противопоказания к применению [22, 94]. В связи с этим поиск новых источников биологически активных веществ природного происхождения, обладающих высокой противовоспалительной активностью, является актуальной задачей медицинской и фармацевтической науки.

Одной из отправных точек такого поиска является изучение опыта,использования растений в народной медицине, который содержит огромный фактический материал, являющийся надежным ориентиром для выбора новых перспективных видов лекарственного сырья. В качестве объекта исследования нами была выбрана ортилия однобокая - Orthilia secunda (L.) House (сем. Pyrol-aceae - грушанковые), которая издавна использовалась в Сибири в качестве противовоспалительного, ранозаживляющего, гемостатического, диуретического средства и широко применялась при лечении гинекологических заболеваний [140]. В результате исследований, проведенных в Отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, установлено выраженное противовоспалительное и антиокислительное действие извлечений из данного растения [26, 103].

Выраженная фармакотерапевтическая эффективность, подтверждающая целесообразность применения ортилии однобокой в народной медицине, является предпосылкой для проведения фармакогностического исследования данного растения, которое предусматривает проведение макро- и микроскопического анализа и выявление анатомо-диагностических признаков, изучение качественного и количественного содержания биологически активных веществ, стандартизацию сырья. Кроме того, неотъемлемой частью этих исследований является выявление ресурсной сырьевой базы, так как разработка и внедрение новых лекарственных растительных средств невозможна без изучения их сырьевой обеспеченности. Для разработки научной основы и определения путей рационального использования ресурсов этого перспективного лекарственного растения необходимо изучение его эколого-биологических особенностей (установление эколого-фитоценотической приуроченности, жизненной формы, особенностей развития, способов размножения и т.д.).

Наиболее перспективным направлением в области создания фитопрепаратов является производство сухих экстрактов, представляющих собой легкорастворимый в воде или в водно-спиртовых смесях и удобный для дозирования стандартизованный комплекс биологически активных веществ в их естественной природной композиции со стабильными показателями качества, служащий субстанцией для получения различных лекарственных форм. В связи с вышеизложенным, целью настоящих исследований стало ботанико-фармакогностическое исследование ортилии однобокой, стандартизация сырья, разработка способа получения и стандартизация противовоспалительного средства, представляющего собой сухой экстракт.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- в рамках изучения ресурсной обеспеченности выявить эколого-фитоценотическую приуроченность ортилии однобокой, изучить биологические особенности, выявить влияние эколого-фитоценотических факторов на морфометрические параметры растения и продуктивность природных ценопо-пуляций;

- выявить анатомо-диагностические признаки надземной части ортилии однобокой;

- определить качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ в надземной части и сухом экстракте ортилии однобокой;

- установить локализацию биологически активных веществ в отдельных органах растения, изучить динамику их накопления по фенофазам, в онтогенезе растения, в зависимости от эколого-фитоценотических факторов и определить оптимальные условия сбора;

- разработать способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислителыюй активностью;

- разработать нормативную документацию на лекарственное сырье и сухой экстракт.

Научная новизна работы. Определены показатели сырьевой продуктивности и запасы сырья данного вида. Изучены эколого-биологические особенности ортилии однобокой в условиях Западного Забайкалье: получены данные по особенностям онтогенеза, на основании комплекса признаков установлены оп-тимумы организма и ценопопуляции вида. Установлены, анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой.

Установлено наличие в надземной части и сухом экстракте флавоноидов в виде флавоноловых агликонов (кверцетин и кемпферол) и их гликозидов, фе-нольных кислот (галловой, хлорогеновой и др.), гидролизуемых и конденсипо-ванных дубильных веществ, простых фенолов и их гликозидов, углеводов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, органических кислот (яблочной, янтарной и лимонной), тритерпеновых сапонинов, иридоидов, производных кумарина; 26 макро- и микроэлементов.

Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой и сухом экстракте в пересчете на ГСО рутина, с использованием которой изучена динамика накопления флавоноидов по фенофазам, в онтогенезе растения, в зависимости от эколого-фитоценотических факторов.

Разработан способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислителыюй активностью и установлены оптимальные параметры экстрагирования сырья, обеспечивающие максимальное извлечение биологически активных веществ, определены показатели качества полученного средства.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработан способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислителыюй активностью (патент № 20021156666/14(06475), положительное решение о выдаче патента на изобретение от 25.11.2002 г.). Составлены проекты Фармакопейных Статей предприятия на сырье - надземную часть ортилии однобокой и на сухой экстракт из нее. Разработан лабораторный регламент на производство сухого экстракта.

Доклиническое исследование сухого экстракта ортилии однобокой проведенное в лаборатории экспериментальной фармакологии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, показало, что данное средство не токсично и обладает выраженной противовоспалительной, антиоксидантной, мем-браностабилизирующей, жаропонижающей, седативной, обезболивающей, антимикробной, спазмолитической, диуретической и гонадотропной активностью. Полученные данные обусловливают перспективность клинического исследования сухого экстракта ортилии однобокой в целях использования при терапии гинекологических заболеваний.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: II Всероссийской научной конференции "Агроэкология и устойчивое развитие регионов" (Красноярск, 2000), Международной научной конференции «Флора, растительность и растительные ресурсы Забайкалья» (Чита, 2000), VIII и XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2002), II Международном Тихоокеанском конгрессе «Традиционная медицина: научные и практические аспекты» (Владивосток, 2001), Всероссийской научной конференции «Биологически активные добавки и здоровое питание»

Улан-Удэ, 2001), научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ, 2001), Южно-Сибирской международной конференции «Экология Южной Сибири» (Абакан, 2001), научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ИрГСХА (2003, 2004, 2005).

Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Настоящая работа выполнена в Отделе биологически активных веществ в соответствии с программой и планом научно-исследовательских работ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН по теме "Создание информационного банка данных по тибетской медицине и разработка новых лекарственных препаратов" (№ гос. регистрации 01.9.40003183).

На защиту выносятся:

- результаты фармакогностического и фитохимического исследования ортилии однобокой;

- способ получения средства, обладающего противовоспалительной и антиокислительной активностью;

- предлагаемые методы стандартизации сырья и сухого экстракта;

- обоснование возможности и перспективности использования ресурсов ортилии однобокой.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлено, что ортилия однобокая, многолетнее вечнозеленое длин-нокорневищное травянистое растение, широко распространенное на территории исследования и произрастающее в различных ассоциациях сосновых лесов, а также в березняках и осинниках, образующее местами значительные скопления, что обусловлено биоморфологическими и онтогенетическими особенностями растения. В онтогенезе растения выделено четыре периода и шесть возрастных состояний. Относится к явнополицентрическому типу биоморф с третьим типом вегетативного размножения, сопровождающимся активным вегетативным разрастанием и приводящим к образованию диффузных клонов, в которых отмечается неопределенно долгая задержка старения, вызванная неглубоким омоложением дочерних особей неопределенно большого числа поколений.

2. Полученные данные по установлению оптимума организма и ценопопуляции ортилии однобокой дают возможность определения оптимальных условий сбора сырья этого растения, поскольку во всех местообитаниях, характеризующихся благоприятными эколого-фитоценотическими факторами (сосновые и смешанные леса на обеспеченных элементами питания почвах и с достаточной освещенностью нижних ярусов), определены высокие показатели биологической продуктивности и ценопопуляции изучаемого вида образуют здесь наиболее значительные по площади заросли, в которых сосредоточены наибольшие запасы сырья.

3. Сырьевая продуктивность фитомассы в исследованных ценопопуляци-ях варьирует в пределах 7.28±0.66 - 14.4±1.22, эксплуатационные запасы сырья, определенные на конкретных зарослях в 11 местообитаниях, составили 73.33 кг, объем возможных ежегодных заготовок - 14.66 кг. Принимая во внимание особенности частного и полного онтогенеза изучаемого вида, мы рекомендуем производить сбор сырья путем срезания надземных побегов, оставляя нижние метамеры (2-3 см) с боковыми пазушными почками возобновления и считаем, что периодичность заготовок на одном и том же месте не должна превышать одного раза в 4-5 лет; при сборе сырья необходимо оставлять не менее 20 % генеративных побегов.

4. Определены анатомо-диагностические признаки ортилии однобокой: извилистостенность клеток эпидермиса листа с сосочкообразными выростами; наличие многочисленных устьиц ранункулоидного типа на нижнем эпидермисе листа и редких, расположенных над жилками - на верхнем; наличие сосочкооб-разных выростов у клеток эпидермиса вегетативного и генеративного побега, черешка листа; наличие закрытых коллатеральных пучков со спиральными сосудами в листе, чешуях, чашелистиках, лепестках; беспучковое строение стебля, где сосуды расположены группами от 3 до 9 в виде одно-двурядных радиальных тяжей; расположение уголковой колленхимы в листе (в выступах крупных жилок); наличие однородного мезофилла губчатого типа в листе; наличие друз кристаллов в эпидермисе и мезофилле чешуй, паренхиме черешка листа и первичной коры вегетативного побега, наличие склеренхимы в генеративном побеге и расположение в нем флоэмы в виде прерывистых тяжей; наличие сосочков и зубчиков, образованных клетками эпидермиса по краю лепестка и чашелистика.

5. В надземной части и сухом экстракте ортилии однобокой с использованием химических и физико-химических методов исследования (качественных реакций, методов хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и высокоэффективной жидкостной хроматографии, эмиссионного спектрального анализа) установлено содержание флавоноидов в виде флавоноловых агликонов (кверцетин и кемпферол) и гликозидов, фенольных кислот (галловой, хлороге-новой и др.), гидролизуемых и конденсированных дубильных веществ, простых фенолов и их гликозидов, углеводов, аминокислот (L-аспарагина, DL-метионина, DL-P-аланина, L-цистеина, DL-серина), органических кислот, три-терпеновых сапонинов, иридоидов, производных кумарина; кроме того, обнаружены и количественно определены 26 макро- и микроэлементов. Определено количественное содержание в надземной части и сухом экстракте дубильных веществ (12.62±0.56 % и 28.65±0.66 % соответственно), аскорбиновой кислоты

0.05+0.002 % и 0.12±0.01 %), органических кислот - яблочной (0.94+0.03 % и 1.84±0.41 %), янтарной (0.67±0.03 % и 1.29+0.33 %) и лимонной (1.09±0.02 % и 4.62±0.29 %), простых фенолов и их гликозидов (6.88±0.33 % и 15.22±0.22).

6. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина в надземной части ортилии однобокой с учетом оптимальных параметров экстракции: максимальное извлечение суммы флавоноидов достигается экстракцией сырья с размерами частиц 1 - 0.5 мм 70 % спиртом этиловым на кипящей водяной бане в течение 60 минут при первом контакте фаз и соотношении сырья : экстрагента 1 : 100, 60 минут при втором контакте фаз и соотношении 1 : 50, 30 минут при третьем контакте и соотношении 1 : 30. Относительная ошибка методики не превышает 5%.

7. Установлено, что в качестве лекарственного растительного сырья ортилии однобокой целесообразно использовать надземные побеги генеративного и виргинилыюго возрастного состояния - вегетативные 2-4 -летние побеги, ввиду более высокого содержания в них флавоноидов (g - 3.02-3.05 %; v - 2.8 -2.89 %). Лучшими сроками для сбора сырья ортилии однобокой является период бутонизации и цветения растений с середины июня по конец июля, так как на него приходится максимум содержания этих веществ. Установлена зависи-' мость накопления флавоноидов в надземной части исследуемого растения от экологических условий: у растений, произрастающих в сосновых сообществах с разреженным травяным покровом в условиях хорошей освещенности (при сомкнутости крон 0.1 - 0.3) и обеспеченности подвижными формами фосфора, наблюдается более высокое суммарное содержание флавоноидов и при планировании заготовок сырья данного вида мы рекомендуем учитывать данные обстоятельства.

8. Выбраны оптимальные технологические параметры получения сухого экстракта: экстрагент - 40 % спирт этиловый, степень измельчения сырья - 1 — 0,5 мм, соотношение сырье-экстрагент - 1:12-14 (с учетом коэффициента водо-поглощения сырья), температура экстракции - 60 °С, трехкратная экстракция -60, 60 и 30 минут соответственно. На основании этого разработана технологическая схема производства сухого экстракта - средства, обладающего противовоспалительной активностью.

9. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в сухом экстракте ортилии однобокой, лабораторный технологический регламент на производство сухого экстракта, проект Фармакопейной Статьи предприятия на сырье ортилии однобокой, показатели качества сухого экстракта, которые включены в проект Фармакопейной Статьи предприятия на экстракт ортилии однобокой сухой.

160