Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Ботанико-фармакогностическое изучение различных сортов гороха посевного

На правах рукописи

Сухарев Дмитрий Николаевич

БОТАНИКО-ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ ГОРОХА ПОСЕВНОГО

15.00.02. - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова и ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор фармацевтических наук, профессор Светлана Геннадьевна Зайчикова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор фармацевтических наук, профессор Казьмина Эмма Максимовна.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (РАСХН).

заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова по адресу: Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49.

доктор медицинских наук

Федор Витальевич Доненко

Кандидат фармацевтических наук

Деханова Ольга Алексеевна.

Защита диссертации состоится «

г. в часов на

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09 Доктор фармацевтических наук, профессор

Наталья Петровна Садчикова

Актуальность темы: Настоящий период развития отечественной медицины и фармации характеризуется отчетливой тенденцией к более интенсивному использованию лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим одной из важных проблем фармации является изыскание новых растительных источников биологически активных веществ и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов.

Горох посевной широко известен как ценный пищевой продукт. Он нашел применение в народной медицине как мочегонное, гипогликемическое средство, как источник витаминов, каротина, белка, минеральных веществ (калия, фосфора, магния, кальция, йода, натрия, железа). Наружное использование измельченных семян гороха рекомендовано для лечения воспалений кожи, экземы, гнойных ран. Комплекс незаменимых аминокислот, протеинов, фитоэстрогенов обусловливают его широкую

фармакотерапевтическую активность. В научной медицине горох посевной до настоящего времени не применялся. В настоящее время несомненный интерес могут представлять также высокомолекулярные белковые компоненты из растений рода Pisum - лектины. Так, например, из фасоли выделены лектины (фитогемагглютинины - ФГА), обладающие гемагглютинирующей способностью и имеющие применение в медицинской практике.

Отсюда очевидно, что научное обоснование применения представителей рода Pisum в медицине и фармации в качестве источника сырья богатого белками растительного происхождения, фитоэстрогенами и лектинами, обладающими выраженным иммуномодулирующим действием является, несомненно, актуальным в настоящее время.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы является ботанико-фармакогностическое изучение представителей рода Pisum и экспериментальное обоснование возможности их использования в медицине.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить особенности ритма сезонного развития представителей рода Pisum с установлением морфолого-анатомических характеристик различных сортов гороха посевного;

- изучить химический состав сырья некоторых сортов гороха для выявления комплекса биологически активных веществ (флавоноидов, аминокислот, фитоэстрогенов, белков и лектинов);

- провести исследования по стандартизации сырья представителей рода Pisum;

- провести фармакогностическое исследование по разработке оптимальных условий сбора, сушки и хранения сырья гороха посевного;

- разработать способ выделения лектинов и провести исследования по изучению их биологической активности;

- изучить фармакологическую активность лектинов гороха посевного (цитотоксичность, противоопухолевое, фитогемагглютинирующее, иммуномодулирующее) и провести исследование по определению острой токсичности;

- разработать технические условия на семена гороха посевного.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты химического изучения (состав протеинов в семенах гороха, состав флавоноидов, аминокислот и фитоэстрогенов в траве и семенах гороха);

- результаты выделения лектинов из семян гороха посевного;

- результаты фармакогностического изучения гороха посевного с выявлением анатомо-диагностических признаков сырья;

- результаты исследований по стандартизации сырья гороха;

- результаты исследования фармакологического действия лектинов гороха посевного (цитотоксичность, противоопухолевую, фитогемагглютинирующую и иммуномоделирующее действие).

Научная новизна: Впервые проведена анатомо-морфологическая характеристика сортов гороха посевного. Произведена съемка микропрепаратов листа и стебля различных сортов гороха посевного и выявлены их анатомо-диагностические особенности. Полученные данные позволяют оценить анатомо-морфологические особенности рассматриваемых сортов гороха и могут быть использованы для составления научно-технической документации.

Проведен в сравнительном аспекте химический анализ сырья сортов гороха: состав аминокислот, флавоноидов, протеинов, лектинов, фитоэстрогенов в траве и семенах некоторых сортов гороха. В работе использованы современные физико-химические методы газовой хроматографии с масс-спекрометрией, а также способы выделения лектинов с использованием колоночной хроматографии (гель-фильтрации и аффинной). Степень очистки лектинов подтверждалась посредством электрофореза.

Разработаны характеристики подлинности, показатели качества, их нормы для изучаемого сырья. Изучена стабильность сырья семян гороха посевного в процессе хранения.

Впервые разработан метод выделения лектинов из семян гороха посевного, и выявлены особенности биологического действия лектинов (цитотоксичность, противоопухолевое, фитогемагтлютинирующее и иммуномодулирующее действие). По результатам определения токсичности лектины гороха отнесены к четвертому классу малотоксичных веществ.

Учитывая высокое содержание лектинов в семенах гороха, был исследован спектр фармакологической активности этих природных соединений. В экспериментальных условиях было установлено, что лектины гороха стимулируют продукцию основных регуляторных пептидов

(противовоспалительных и регуляторных цитокинов), следствием, которого является усиление противоопухолевой активности лимфоцитов крови.

Полученные нами данные могут быть в дальнейшем использованы при разработке препаратов содержащих лектины, так как к настоящему времени, несмотря на имеющийся обширный экспериментальный материал по лектинам, препараты на их основе отсутствуют.

Практическая значимость: Проведенные исследования показали возможность использования в медицинской практике нового лекарственного растительного средства - лектинов гороха. Разработаны технические условия на семена гороха и поданы материалы на патент: «Способ диагностики онкологического заболевания путем анализа лимфоцитов крови» (приоритетная справка №2004121099 от 12.07.2004г.).

Личное участие автора в получении научных результатов: все экспериментальные исследования выполнены автором лично. Изучены анатомо-морфологические особенности представителей рода гороха, проведено изучение химического состава различных сортов гороха, выделены и охарактеризованы лектины из семян гороха. Исследован спектр биологической активности лектинов гороха, установлено, что лектины гороха обладают выраженным иммуномодулирующим действием.

Внедрение в практику. Разработана методика выделения лектинов из семян гороха. На основании проведенных исследований разработаны технические условия на семена гороха.

Апробация диссертации состоялась 30 июня 2004 г. на совместной научной конференции кафедр ботаники, фармакогнозии, общей химии с курсом стоматологического материаловедения ММА им. И.М.Сеченова; лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 155 страницах с приложением, содержит 20 таблиц и 35 фотографий и рисунков. Диссертация содержит введение, обзор литературы, экспериментальную часть, состоящую из

4 глав, общие выводы, список литературы содержит 163 процитированных источника (из них 27 отечественных) и приложение.

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цели и задачи работы, охарактеризована научная новизна, практическая значимость полученных результатов и личное участие автора в их получении.

В первой главе, посвященной обзору литературы, приведены данные ботанической характеристики семейства Бобовых - Leguminosae Juss, краткое анатомо-морфологическое описание отдельных представителей рода Pisum, характеристика некоторых белков рода Pisum, определение и общие характеристики лектинов гороха, использование лектинов в биологии и медицине, а также их фармакодинамика в организме млекопитающих.

Во второй главе экспериментальной части изложены методики проведения полевых работ и камеральной обработки материала и анатомических исследований. Результаты изучения ритма сезонного развития различных сортов гороха посевного, морфологической характеристики вегетативных органов различных сортов гороха, анатомо-диагностические признаки эпидермы листьев гороха.

В третьей главе экспериментальной части приведены результаты изучения содержания флавоноидов в семенах и траве различных сортов гороха. Результаты изучения химического состава семян и травы гороха с использованием ГЖХ хроматографии масс-спектрометрии. Определено содержание белка и аминокислотный состав в семенах различных сортов гороха. Подробно изучен качественный и количественный состава лектинов

семян различных сортов гороха, определена специфичность связывания лектина по сахарам методом проточной цитофлуорометрии.

Четвертая глава посвящена исследованиям биологической активности лектина гороха, изучена его острая и хроническая токсичность, его митогенная

и пролиферативная активность, изучены особенности связывания лектинов с лейкоцитами мышей на фоне роста опухоли.

Пятая глава содержит данные по стандартизации и нормативной документации на семена гороха.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ.

I. Ботаническое изучениеразличных сортов гороха посевного.

Для составления нормативной документации на сырье необходимо было изучить его диагностические признаки. Поэтому нами проведен сравнительный морфолого-анатомический анализ восьми сортов гороха. В качестве объектов исследования выбраны сорта гороха, произрастающие в различных регионах Земли для того, чтобы выявить сорта с наибольшим содержанием БАВ. Сорта были получены из коллекции ВИР им. Вавилова. Выявленные анатомо-диагностические особенности приведены в таблице 1.

Для всех изученных сортов гороха характерен округлый, нечетко четырехгранный стебель, внутри полый. На поперечном срезе видно, что выступы образованы крыловидными выростами коры и идущими по стеблю и несколько выступающими тяжами склеренхимных волокон, которые окаймляют по периферии медиальные пучки листовых следов. Эти грани соответствуют отросткам на побеге при листорасположении. Эпидерма надземных стеблей богата железистыми клетками. Под эпидермой развивается хлорофилоносная паренхима коры, в ребрах под покровной тканью хорошо выражена колленхима. Отчетливая граница между корой и центральным осевым цилиндром отсутствует. Открытые коллатеральные пучки стелы располагаются по кругу. Сердцевина заполнена паренхимой или имеется центральная воздушная полость. Узел трехлакунный, листовой след двухпучковый. Серединный пучок включается в стель (Рис.1). В центральный осевой цилиндр через медианную лакуну входит 1 медианный пучок. Медианные лакуны включают медианные пучки другого листового следа листа,

расположенного на одно междоузлие выше. Латеральные листовые пучки, которые входят из листа в стебель на уровне рассматриваемого листа не

Таблица 1

Анатомические особенности эпидермы листа восьми сортов PISUM

Признак Сорта гороха

8854 Атлант. 7071 Альфа 8856 Беркут. 8734 Эврика. К-9036 Саламат. 8790 Татог А.С. 8789 Эквадор. 8887(и-583561) ЯаЛеу

Верхняя эпидерма Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые Стенки слабоизв илистые

Нижняя эпидерма Стенки извилист ые Стенки извилист ые Стенки извилист ые Стенки извилист ые Стенки извилист ые Стенки извилист ые Стенки извилист ые Стенки извилист ые

Четковид ные утолщени я клеточны х стенок Не обнаруже ны Не обнаруже ны Не обнаруже ны Не обнаруже ны Не обнаруже ны Не обнаруже ны Не обнаруже ны Не обнаруж ены

Простые волоски Слабо выражен ы Не выражен ы Не выражен ы Не выражен ы Не выражен ы Не выражен ы Не выражен ы Не выражен ы

Головчат ые волоски 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточная ножка с булавови дной головкой 1 клеточна я ножка с булавови дной головкой

Кристалл оносная обкладка Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон Есть над крупным и жилками с двух сторон

Складчат ость кутикулы Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не • обнаруже на Не обнаруже на • Не обнаруже на Не обнаруж ена

Тип устьичног О аппарата аномоцит ный аномоцит ный аномоцит ный аномоцит ный аномоцит ный аномоцит ный аномоцит ный аномоци тный

Сосочков идные выросты Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруж ена

Аэренхим а Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруже на Не обнаруж ена

включаются в стель, а проходят междоузлие по коре и ее ребрам и входят в стель на одно междоузлие ниже по побегу.

Волоски на стебле простые, многочисленные, примерно одинакового размера, направлены по длине стебля, полуовальные, двуклеточные (состоят из короткой базальной клетки и длинной терминальной, с едва заметной полостью и очень толстой оболочкой). Длинная терминальная клетка волоска лежит под углом к базальной клетке, поэтому волосок прижат к поверхности стебля -простой изогнутый (Рис 2).

Рис.1. Строение открытого коллатерального пучка стебля гороха.

Рис.2. Простые изогнутые волоски стебля гороха.

Также у всех изученных сортов гороха в мезофилле обнаружена кристаллоносная обкладка, призматические кристаллы оксалата кальция вдоль крупных жилок листочка. На более мелких жилках листочка кристаллоносная обкладка отсутствует. Кристаллоносная обкладка вдоль крупных жилок листочка является характерным признаком для большинства представителей Семейства: Fabaceae - Бобовые.

2. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ ГОРОХА.

Содержание флавоноидов в семенах и траве различных сортов гороха.

Биофлавоноиды - это биологически активные вещества и как любые биологически активные вещества, они имеют строго определенный интервал доз, превышение которого будет сопровождаться появлением токсичности. Этот класс веществ был выбран не случайно: большинство представителей семейства бобовых имеют высокое содержание биофлавоноидов. Это, например, люпин ^^тш), который имеет высокое содержание биофлавоноидов и некоторые его виды токсичны для животных. Проведение же селекционных работ по снижению содержания биофлавоноидов приводит к

снижению устойчивости растений к заболеваниям. Поэтому биофлавоноиды можно рассматривать как фактор защиты растений как от микро- так и макроорганизмов.

Поэтому в настоящей работе было проанализировано 8 сортов гороха (трава и семена) на содержание биофлавоноидов. Известно, что содержание флавоноидов в растениях может сильно изменяться в зависимости от климатических условий. Поэтому сорта гороха были выбраны с таким расчетом, чтобы представлять различные регионы Земли.

Выделение суммы флавоноидов из сырья травы гороха, собранной в фазу массового цветения, проводили по общепринятой методике: 150 г сырья обрабатывали 70% этанолом троекратно в соотношении 1:30 при нагревании, объединенные извлечения упаривали, водный остаток очищали хлороформом, флавоноиды извлекали из водного раствора этилацетатом, который затем отгоняли. Количественное определение суммарного содержания флавоноидов проводили спектрофотометрически с использованием рутина в качестве стандарта. Этот метод базируется на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминием хлоридом. Это свойство позволяет за счет батохромного сдвига УФ-спектра флавоноидов в сторону длинных волн, отделить группу флавоноидов от других веществ фенольного характера.

Следуя стандартной методике, был приготовлен раствор с концентрацией рутина 46 мкМ или 3057.16 мг на 100 мл. Спектр поглощения раствора был снят по сравнению со спектром поглощения растворителя от 200 до 480 нм. Видно, что сам рутин имеет 4 максимума поглощения - 208 нм, 259 нм, 270 нм и 362 нм. Пик в области 415 нм у рутина отсутствует. При добавлении соли алюминия и уксусной кислоты, спустя 40 минут действительно наблюдается пик с максимумом поглощения 415 нм. Коэффициент молярной экстинции батохромного сдвига в нашем случае составил при использовании

кюветы с длиной оптического пути 1 см. Из данных представленных в (таблице 2.) видно, что в семенах всех изученных сортов гороха, флавоноиды содержатся

в следовых количествах. В траве содержание флавоноидов выше, но не превышает 0.37 %.

Таблица 2.

Содержание флавоноидов в семенах и траве различных сортов гороха.

N Сорт, место произростания Содержание флавоноидов (в % сырья)

семена трава

1 7071 Альфа 0.03+0.005 0.37+0.06

2 8734 Эврика 0.03+0.005 0.31+0.05

3 8789 Эквадор 0.03+0.005 0.13+0.03

4 8790 ТатогА.С. 0.03+0.005 0.06+0.01

5 8854 Атлант 0.03+0.005 0.07+0.01

6 8856 Беркут 0.03+0.005 0.97+0.01

7 8887(и-583561)ЯаШеу 0.03+0.005 0.12+0.02

8 К-9036 Саламат 0.03+0.005 0.19+0.03

Установили, что содержание биофлавоноидов довольно сильно колеблется от сорта к сорту для травы. Содержание было минимальным для 8790 Татог А.С. Канада урожая 1998 г. 0.06 % г сухого сырья, а максимальным у К-9036 Саламат Татарстан урожай 2002 г. и составило 0.19 % сухого сырья. В семенах гороха биофлавоноиды содержались в следовых количествах у всех изученных сортах, что объясняет их низкую токсичность с одной стороны и широкое использование этой пищевой культуры.

Таким образом, общее содержание флавоноидов в семенах и траве различных сортов гороха низкое и уступает по этому показателю другим представителям семейства бобовых, например, чине посевной. Поэтому более подробное исследование по качественному составу флавоноидов в траве и семенах считаем нецелесообразным.

Изучение химического состава семян и травы различных сортов гороха с использованием ГЖХхроматографии масс-спектрометрии.

Газохромато-массспектрометрия - это метод, который позволяет идентифицировать практически все известные вещества. Поэтому нами был проведен анализ ГЖХ на присутствие в семенах гороха других биологически активных соединений, в частности, фитоэстрогенов (Рис. 3).

К сожалению, более подробное исследование о влиянии фитоэстрогенов гороха на организм человека выходит за рамки данного исследования. Но обнаруженный нами факт без сомнения заслуживает дальнейшего изучения. Результаты ГЖХ хроматографии по обнаружению химических веществ

стероидного происхождения отражены на рисунке 3.

<|*гт ащ|» ]<кш» (см|

махе дым«и (см|

Мтк-СггНяО *

М№ЗМСи*ЗМММ>Т* НА|0*Ш49Г0»|аЪ*Г» ОМгМьМам

еапмаыдг ««»■ п июм ?о кицоирмйск

МЯ1| М8вв1| И14П| 146МОI МПЩ 279 2* | ИЭЩ 29029*1 10В3931 21) 2901

» в ( а 253 * ГШ 213 1 М" ш яг 2П I I I I II II 17 > л» я

90 то т 901Й11» Ф14014« 1» 1*оА>2ю аийогк ж 2&йог(о Агким 11« Л Л з4о з*о (¿0 410

М»я|г ¡«этапам (Зли зху (СМ) Г«тик.С2вН440

и# ШС*£* 5747-4МВТ» МВШ ».>*у7а 0№аг№ Нал*

СаккаМ ОМГ. 1Ш1 »и ям 10кчи1рм1к

ШЯ| «<П| ЭИ9»| «73701 149X91 2ЯЗ»| Ш2*7) 2112901 1912901 Я71771

Рис. 3. Масс-спектры стероидных соединений, содержащихся в

семенах гороха.

Изучение качественного и количественного состава пектинов в семенахразличных сортов гороха.

В настоящей работе особо пристальное внимание было уделено лектину гороха. Лектины - это одна из самых загадочных групп белков. Действительно среди них встречается самое ядовитое вещество в мире - рицин, множество токсинов растительного и бактериального происхождения и абсолютно нетоксичные вещества. Об их функциях высказано множество предположений и гипотез. Нами был использован один из наиболее высоко специфичных и эффективных способов очистки лектинов гороха - аффинная очистка.

Элюирование с колонки с сефадекеом 6100 пектина гороха 0 2 М глюкозой.

«Г I

X

9

О 10 20 30 40 90

Время элюции (мин)

Рис. 4. Профиль элюции пектина гороха при аффинной очистке.

Уже сам метод очистки позволяет продемонстрировать те возможности, которые дают лектины при изучении пространственной структуры биологических макромолекул. На рисунке 4 видно, что белок имеет один пик элюации.

При сравнительном изучении содержания лектинов в различных сортах гороха, было установлено, что его количество изменяется в значительных пределах от 56,3 % до 103,3 %. Максимальное его содержание было отмечено у сорта 8854 Атлант, выращенного в Краснодарском крае урожая 2002 г. и составило 103.3 мг/г семян и сорт 8856 Беркут Краснодарский край урожая 2001 г. - 95.4 мг/г. (Таблица 3).

Таблица 3.

Содержание пектина в семенахразличных сортов гороха.

N Сорт, место произростания, год сбора. Номер по каталогу ВИР Содержание в мг на 100 г семян.

1 Альфа Краснодарский край 2001 г. 7071 82.6

2 Эврика Иркутская область 2001 г. 8734 77.5

3 Эквадор 1998 г. 8789 93.4

4 Tamor A.C. Канада 1998 г. 8790 56.3

5 Атлант Краснодарский край 2002 г. 8854 103.3

6 Беркут Краснодарский край 2001 г. 8856 95.4

7 (U-583561) Radley Великобритания 2000 г. 8887 69.4

8 Саламат Татарстан 2002 г. К-9036 95.7

Однако полученный таким образом лектин может содержать изоформы с различными константами сродства к сахарам. Поэтому на следующем этапе необходимо было разделить лектины по их сродству к сахарам. Для этого было использовано шаговое повышение концентрации глюкозы 0.01, 0.05 и 0.2 М. На рисунке 5 показано, что элюированный лектин удалось разделить на три отдельные фракции, которые подвергали диализу против 0.15М раствора №С1 в 0.01 М фосфатном буфере (рН 7.2). Белок стерилизовали микрофильтрацией с помощью 0.22ц МИШроге фильтра.

Электрофорез пектина гороха (ЛГ).

Видно, что в присутствии додецилсульфата натрия на электрофоретической дорожке определяется одна полоса с молекулярным весом около 23 кДа (полоса 3). В то же время проведение электрофореза с добавлением гуанидин хлорида и додецилсульфата натрия дает две полосы с молекулярными весами 17 кДа и 6 кДа (полоса 2) (Рис.5).

1 2 3

Рис. 5. SDS - электрофорез ЛГ. 1 - маркерные белки с известной молекулярной массой, 2 - электрорфорез ЛГ в присутствии гуанидинхлорида, 3 - электрофорез ЛГ в присутствии меркаптоэтанола.

После того как были получены результаты, подтверждающие чистоту выделенного лектина, нами было изучено его биологическое действие. Одно из самых известных свойств лектинов - агглютинация эритроцитов. Это свойство лектинов даже дало им название - гемагглютинины. Выделенный белок

вызывал гемагглютинацию эритроцитов человека при концентрации выше 7.5 мкг/мл, а эритроцитов кролика - 4 мкг/мл.

Для того, чтобы доказать специфичность связывания меченного ЛГ с сахарами клеточной мембраны лимфоцитов, был поставлен эксперимент по изучению влияния глюкозы на связывание лектина с клетками. Из периферической крови мышей были получены лимфоциты. Исходно данная популяция клеток имела флуоресценцию со средним значением Gm =4.11 у.е. После инкубации с меченным ЛГ уровень флуоресценции клеток возрос до Gm = 27.66 у.е. Возрастание флуоресценции лимфоцитов указывает на то, что Л Г связался с клетками. Добавление же глюкозы возвращает уровень флуоресценции практически к исходному уровню с G„, = 4. 59 у.е. Наблюдаемое уменьшение флуоресценции клеток на фоне добавления глюкозы можно объяснить только вытеснением меченного лектина сахаром. Изучение фармакологической активности лектина гороха. Изучение острой токсичности лектина гороха проводили по ГФ X. Наши эксперименты выявили, что лектины гороха относятся по токсичности к четвертому классу малотоксичных веществ и в небольших концентрациях обладают митогенным эффектом.

Влияние пектинов растительного происхождения на противоопухолевую цитотоксическую активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

На первом этапе работы была исследована прямая цитотоксическая активность исследуемых лектинов на клетки линии К-562 и Colo и МНПК (Таблица 4). В данных условиях установлено, что ФГА и Л Г не оказывают цитопатогенного действия в концентрации 10,0 мг/мл. Для выявления собственного влияния рицина на МНПК и опухолевых линий К562 и колоректального рака культивировали в течение 72 часов в присутствии различных концентраций ЛГ( в диапазоне концентраций 0.05 - 0.25 мг/мл).

Таблица 4.

Влияние пектина гороха на жизнеспособность опухолевых клеток и МНПК(% погибших клеток)

ЛГ мг/мл МНПК К562 Colo

0,05 9,0±0,70 15,40±0,87 18,60±0,93

0,1 7,90±0,33 15,0±1,09 19,20±1,80

0,15 8,20±0,73 22,0±0,71 24,0±1,70

0,2 12,0±0,71 32,10±0,70 35,80±1,53

0,25 16,0±1,96 36,0±1,0 33,0±2,10

Наши эксперименты выявили, что лектины гороха растительного происхождения в небольших концентрациях (от 0.1 до 10 мкг/мл) усиливают спонтанную цитотоксичность МНПК по отношению к линии опухолевых клеток Colo и К562.

Особенности связывания пектинов с лейкоцитами мышей на фоне роста опухоли.

На следующем этапе исследования нами было изучено связывание лектинов с поверхностью лимфоцитов периферической крови интактных мышей и мышей на 20 день после перевивки опухоли СаО1 и карциномы Эрлиха (рис.6).

Рис.6. Гистограмма флуоресценции в канале FL-1H лимфоцитов периферической крови до и после их окраски лектином гороха, меченного флуоресцеином мышей.

По оси абсцисс - интенсивность флуоресценции клеток в канале FL-1H, по оси ординат - число событий.

В

Таким образом, окраска лектинами лимфоцитов периферической крови мышей показало, что на фоне роста опухолей наблюдается уменьшение доступности для лектинов на поверхности клеток. Кроме этого, характер гистограммы, который получается после окраски клеток лектинами, отличается для опухолей различного происхождения. Этот факт дает возможность предположить, что изменение гликозилирования на фоне роста опухоли носит специфический характер. Специфический характер гликозилирования белков клеточной мембраны можно объяснить следующим образом. На поверхности опухолевых клеток содержатся различные антигенные детерминанты, которые представляют собой определенные атомы, имеющие свой заряд и пространственную структуру с которыми взаимодействуют другие заряженные структуры молекул организма. Соотношение этих структур, их взаимодействие необходимы для функционирования организма. Рост опухоли будет приводить к тому, что концентрация структур, расположенных на ее поверхности, в организме возрастает, что будет способствовать агрегации молекул на их поверхности.

Стандартизация и разработка нормативной документации на семена

гороха.

Ранее проведенные исследования позволяют выбрать один сорт, который содержит максимальное количество лектина - сорт 8854 Атлант. Именно для этого сорта было проведено более детальное исследование по влиянию условий хранения на выход лектина в семенах гороха. Для использования этого сорта в медицинской практике и пищевой промышленности, необходимо было провести химический анализ БАВ, а также выявить анатомо-диагностические признаки сырья, для составления НД.

При разработке НД (ТУ) были использованы результаты анализов проб тестируемых партий, заготовленных в 2002 - 2004 годах в Московской области.

Отбор проб семян и принятие их на анализ временно проводят по ГОСТ 13586.3, определение запаха и цвета - по ГОСТ 10967, определение влажности

по ГОСТ 3040, определение засоренности, испорченных и поврежденных зерен по ГОСТ 13586.2, определение чистоты по ГОСТ 12037-81, всхожести по ГОСТ1238-84, жизнеспособности по ГОСТ 12041-82, массы 1000 зерен по ГОСТ 12041-80, подлинности по ГОСТ 12043-88, поражения болезнями по ГОСТ 12044-81, поражения вредителями по ГОСТ12045-81, арбитражный анализ по ГОСТ 12047-85.

Содержание лектинов в тестируемых партиях составляло от 0.069% до 0,103 %. Для количественной оценки белка лектина гороха была определена удельная оптическая плотность. Из высушенного порошка готовили 0.1% раствор в 0.1 М NaOH и измеряли оптическую плотность при 280 нм. Установили, что указанный раствор имеет оптическую плотность 1.49 отн.ед.

На основании проведенных анализов нами предложено регламентировать этот показатель - не менее 0,1%. Потеря в массе при высушивании семян по данным таблицы имела колебания в диапазоне от 9,80% до 14,7% . На основании этих данных рекомендуем установить норму влажности семян не более 15% (Таблица 5.).

Таблица5.

Нормы качества семян гороха

Культура Сортовая Содержание семян Зсхожесть, Влажность,

Pisum чистота, Основные Других видов, тт %, тах

sativum %, тт культуры, шт./кг. тах

Ь. %.тт

Годы культурных сорняков

2003 98,0 98,0 15 3 92 14,5

2004 96,8 97,0 25 5 87 15

Настоящий стандарт распространяется на зерно гороха, используемый для получения лектина.

Определение содержания сухого остатка, плотности, тяжелых металлов, микробиологической чистоты проводится в соответствии с ГФ XI изд. и регламентируются: Сухой остаток. Не менее 1,6 %_(ГФ XI, вып2, с.148). Плотность. 0,80,90 (ГФХ1, вып.2, с.24). Тяжелые металлы. Не более 0,001% (ГФ.Х1,вып.2,с.148).

Результаты анализа семян гороха в процессе хранения представлены в таблице 6, из которой видно, что семяна при хранении в условиях, предусмотренными ТУ по всем показателям, отвечаеттребованиям в течение 2лет.

Таблица 6.

Результаты исследования влияния хранения семян гороха сорта 8854

Атлант на содержаниелектинов.

Дата загото вки Дата анали -за Влажность, % Золы общей, % Минераль ной примеси, % Органическ ой примеси Содержал ие лектинов, в мг Продолж ительнос ть хранения, г

09.02 09.02 12,8 6,80 0,60 1,15 1,07 исходно-

09.03 13,6 6,79 0,58 1,13 1,03 1 год

09.04 14,2 6,77 0,61 1,14 1,05 2 года

Поставщик сырья Всесоюзный институт растениеводства им. Н.И. Вавилова.

Условия хранения сырья: сухое не отапливаемое помещение, бумажный мешок.

По содержанию токсичных элементов, пестицидов, радионуклидов соответствуют требованиям СанПиН 2.3.2.560 (индекс 6.10.2.1).

ВЫВОДЫ

1. Семена гороха являются пищевым источником белка с содержанием последнего от 22.5 до 29.2%, и суммы незаменимых аминокислот, витамина Е и производных стероидов.

2. Семена гороха содержат следовые количества биофлованоидов, содержание которых не превышает 0.37 %.

3. Семена гороха содержат лектины с манозной и глюкозидной специфичностью.

4. Лектины гороха обладают выраженным иммуномодулирующим действием от 5 до 20 мкг/мл. Лектин гороха вызывает статистически значимый цитотоксический эффект МНК по отношению к клеткам колоректального рака.

5. При опухолевом росте отмечается снижение связывания лектинов гороха с лимфоцитами периферической крови экспериментальных животных более 50%.

6. Лектины гороха можно использовать для мониторинга развития опухоли в организме.

7. Лектин гороха относится к 4 классу нетоксичных веществ.

8. Разработаны ТУ на семена гороха.

Списокработ опубликованныхпо теме диссертации. 1. Симонов Е.А., Зайчикова С.Г., Сухарев Д.Н.

Изучение химического состава гороха посевного с применением газовой хроматографии // Тезисы докладов IX Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2004-С.894.

2. Сухарев Д.Н., Зайчикова С.Г., Аманджолов Б. С. Доненко Ф.В., Ситдикова С.М., Киселевский М.В. Динамика связывания лектина гороха с лимфоцитами мыши на фоне роста карциномы СаО-1 у мышей линии СВА// Тезисы докладов IX Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2004-С.840.

3. Сухарев Д.Н., Зайчикова С.Г., Аманджолов Б.С., Доненко Ф.В., Ситдикова С.М., Киселевский М.В. Изучение влияния лектина гороха на противоопухолевую активность лимфоцитов человека in vitro// Тезисы докладов IX Российского Национального конгресса «Человек и лекарство». -Москва, 2004-С.357.

4. Сухарев Д.Н., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Зайчикова С.Г., Верескунов А.М., Киселевский М.В. Влияние лектинов растительного происхождения на пролиферативнию активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров// В сб.: «Лекарственные растения в фармокологии и фармации».- Барнаул, 2004-С.20-24.

5. Сухарев Д.Н., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Зайчикова С.Г., Верескунов А.М., Киселевский М.В. Влияние лектинов растительного происхождения на цитотоксическую активность мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров// В сб.: «Лекарственные растения в фармокологии и фармации».- Барнаул, 2004-С.25-29.

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н Н. Блохнна РАМН Подписано в печать (7./. Заказ № £ Тираж 100 экз

16 ФЕВ 2005 1264

Актуальность темы: Настоящий период развития отечественной медицины и фармации характеризуется отчетливой тенденцией к более интенсивному использованию лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим одной из важных проблем фармации является изыскание новых растительных источников биологически активных веществ и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов.

Горох посевной широко известен как ценный пищевой продукт. Он нашел применение в народной медицине как мочегонное, гипогликемическое средство, как источник витаминов, каротина, белка, минеральных веществ (калия, фосфора, магния, кальция, йода, натрия, железа). Наружное использование измельченных семян гороха рекомендовано для лечения воспалений кожи, экземы, гнойных ран. Комплекс незаменимых аминокислот, протеинов, фитоэстрогенов обусловливают его широкую фармакотерапевтическую активность. В научной медицине горох посевной до настоящего времени не применялся. В настоящее время несомненный интерес могут представлять также высокомолекулярные белковые компоненты из растений рода Pisum -лектины. Так, например, из фасоли выделены лектины (фитогемагглютинины - ФГА), обладающие гемагглютинирующей способностью и имеющие применение в медицинской практике.

Отсюда очевидно, что научное обоснование применения представителей рода Pisum в медицине и фармации в качестве источника сырья богатого белками растительного происхождения, фитоэстрогенами и лектинами, обладающими выраженным иммуномодулирующим действием является, несомненно, актуальным в настоящее время.

Цель и задачи исследования: Целью настоящей работы является ботанико-фармакогностическое изучение представителей рода Pisum и экспериментальное обоснование возможности их использования в медицине.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить особенности ритма сезонного развития представителей рода Pisum с установлением морфолого-анатомических характеристик различных сортов гороха посевного;

- изучить химический состав сырья некоторых сортов гороха для выявления комплекса биологически активных веществ (флавоноидов, аминокислот, фитоэстрогенов, белков и лектинов);

- провести исследования по стандартизации сырья представителей рода Pisum;

- провести фармакогностическое исследование по разработке оптимальных условий сбора, сушки и хранения сырья гороха посевного;

- разработать способ выделения лектинов и провести исследования по изучению их биологической активности;

- изучить фармакологическую активность лектинов гороха посевного (цитотоксичность, противоопухолевое, фитогемагглютинирующее, иммуномодулирующее) и провести исследование по определению острой токсичности;

- разработать технические условия на семена гороха посевного.

Научная новизна-. Впервые проведена анатомо-морфологическая характеристика сортов гороха посевного. Произведена съемка микропрепаратов листа и стебля различных сортов гороха посевного и выявлены их анатомо-диагностические особенности. Полученные данные позволяют оценить анатомо-морфологические особенности рассматриваемых сортов гороха и могут быть использованы для составления научно-технической документации.

Проведен в сравнительном аспекте химический анализ сырья сортов гороха: состав аминокислот, флавоноидов, протеинов, лектинов, фитоэстрогенов в траве и семенах некоторых сортов гороха. В работе использованы современные физико-химические методы газовой хроматографии с масс-спекрометрией, а также способы выделения лектинов с использованием колоночной хроматографии (гель-фильтрации и аффинной). Степень очистки лектинов подтверждалась посредством электрофореза.

Разработаны характеристики подлинности, показатели качества, их нормы для изучаемого сырья. Изучена стабильность сырья семян гороха посевного в процессе хранения.

Впервые разработан метод выделения лектинов из семян, гороха посевного, и выявлены особенности биологического действия лектинов, (цитотоксичность, противоопухолевое, фитогемагглютинирующее и иммуномодулирующее действие). По результатам определения токсичности лектины гороха отнесены к четвертому классу малотоксичных веществ.

Учитывая высокое содержание лектинов* в. семенах гороха, был исследован, спектр фармакологической активности этих природных соединений. В экспериментальных условиях было установлено, что лектины гороха стимулируют продукцию основных регуляторных пептидов (противовоспалительных и регуляторных цитокинов), следствием, которого является усиление противоопухолевой активности лимфоцитов крови.

Полученные нами данные могут быть в дальнейшем использованы при разработке препаратов содержащих лектины, так как к настоящему времени, несмотря на имеющийся обширный экспериментальный материал по лектинам, препараты на их основе отсутствуют.

Практическая значимость'. Проведенные исследования показали возможность использования в медицинской практике нового лекарственного растительного средства - лектинов гороха. Разработаны технические условия на семена гороха и поданы материалы на патент: «Способ диагностики онкологического заболевания путем анализа лимфоцитов крови».

Личное участие автора в получении научных результатов: все экспериментальные исследования выполнены автором лично. Изучены анатомо-морфологические особенности представителей рода гороха, проведено изучение химического состава различных сортов гороха, выделены и охарактеризованы лектины из семян гороха. Исследован спектр биологической активности лектинов гороха, установлено, что лектины гороха обладают выраженным иммуномодулирующим действием.

Внедрение в практику. Разработана методика выделения лектинов из семян гороха. На основании проведенных исследований разработаны технические условия на семена гороха.

выводы.

1. Семена гороха являются пищевым источником белка с содержанием последнего от 22.5 до 29.2%, и суммы незаменимых аминокислот, витамина Е и производных стероидов.

2. Семена гороха содержат следовые количества биофлавоноидов (0.03 %), в траве содержание флавоноидов выше, но не превышает 0.97 %.

3. Семена гороха содержат лектины с маннозной и гликозидной специфичностью.

4. Лектины гороха обладают выраженным иммуномодулирующим действием от 5 до 20 мкг/мл. Лектин гороха вызывает статистически значимый цитотоксический эффект МНК по отношению к клеткам колоректального рака.

5. При опухолевом росте отмечается снижение связывания лектинов гороха с лимфоцитами периферической крови экспериментальных животных более 50%.

6. Лектины гороха можно использовать для мониторинга развития опухоли в организме.

7. Лектин гороха относится к 4 классу нетоксичных веществ.

8. Разработаны ТУ на семена гороха.