Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде

Исследования такого плана способствуют расширению знаний о поведении популяций бактерий в окружающей среде. Кроме того, актуальность работы обусловливает большое практическое значение, т.к. открывает перспективу принципиально новых подходов к воздействию на патогенные бактерии в окружающей среде, к использованию сапрофитных бактерий антагонистов • продуцентов биологически-активных веществ (БАВ) для оптимизации микробиоценозов водных, почвенных и других экосистем.

Цель работы

Дать теоретическое обоснование закономерностей развития популяций бактерий в колониях патогенных, потенциально-патогенных и сапрофитных бактерий в процессе их естественного развития и при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды с использованием методов электронной микроскопии.

Задачи исследования

1. Разработать методики, позволяющие при сохранении естественной архитектоники изучать строение колоний бактерий, гетеромофизм и Ь-трансформацию, процессы адгезии и колонизации, внутрипопуляционные взаимоотношения бактерий.

2. Изучить строение колоний различных видов бактерий на плотных и жидких питательных средах, объектах окружающей среды.

3. Исследовать гетероморфизм и Ь-трансформацию популяций бактерий в условиях естественного роста колоний и под влиянием абиотических и биотических факторов среды.

4. Изучить адгезию и колонизацию бактерий на различных объектах окружающей среды и влияние на этот процесс абиотических и биотических факторов.

5. Методом количественно-качественного анализа исследовать внутрипопуляционные взаимоотношения бактерий антагонистов -продуцентов БАВ на колонии бактерий.

6. Изучить на электронно-микроскопическом уровне ультраструктуру отдельных колоний бактерий и бактериальных клеток до и после воздействия дезинфицирующих средств.

Научная новизна

Представленная диссертационная работа является развитием нового направления в исследовании бактерий на популяционном уровне.

На основании экспериментальных исследований установлено, что бактерии в колониях находятся во взаимосвязи за счет межклеточного матрикса, от степени развития которого зависит образование покровов на поверхности колоний. Покровы в колониях грамотрицательных и грамположительных бактерий различаются по строению, что определяется различной природой экзопродуктов клеток.

Доказано, что покровы на поверхностях колоний различных видов бактерий следует рассматривать как морфологическую особенность, представляющую собой внеклеточное образование. Роль покровов в существовании колоний бактерий полифункциональна: межклеточные связи, участие в адгезии и колонизации, защита клеток от воздействия абиотических и биотических факторов окружающей среды. В условиях естественного роста бактерий в колониях выявлен гетероморфизм клеток, что свидетельствует о пластичности и изменчивости бактерий, присущей циклу развития бактериальной популяции. Этот цикл имеет общие закономерности в морфологических проявлениях у различных видов бактерий и рассматривается как один из этапов Ь-трансформации.

В процессе исследований был установлен феномен образования новых микроколоний с участием нитевидных: структур, являющихся элементами покровов и не выявляемых в световом микроскопе. На поверхности и внутри таких структур выявлялись мелкие клетки - Ь-формы размером 0,25-0,7 мкм, которые, располагаясь на субстрате, реверсировали в исходное состояние, образуя новые микроколонии. Это явление можно рассматривать как дополнительную возможность сохранения вида в условиях, неблагоприятных для развития клеток в популяции.

Экспериментально показано, что при благоприятных условиях развития ( оптимальной температуре, влажности, питательном субстрате) потенциально-патогенные и патогенные бактерии способны адгезироваться с последующей колонизацией на объектах окружающей среды. Процесс колонизации сопровождается развитием покровов на поверхности колоний.

Показано, что в жидких питательных средах (в логарифмической фазе роста) бактерии существуют, главным образом, в ассоциациях за счет межклеточного матрикса, объединяющего клетки в микроколонии. Поверхности микроколоний со всех сторон закрыты покровами. По морфологическим критериям они аналогичны изученным колониям, наблюдаемым на плотных питательных средах и на объектах окружающей среды.

Впервые показано, что условия- голодания бактерий в водной среде вызывают переход клеток в гетероморфизм с различной глубиной Ь-трансформации с образованием Ь-форм. Экспериментально установлено, что такие клетки с измененными биологическими свойствами и сниженной патогенностью могут при благоприятных условиях реверсировать в исходную форму и сохранять свой патогенный потенциал.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ 9 6МБЛИОГСКА '

Несомненный интерес представили исследования сапрофитных флокулирующих бактерий активного ила Zoogloea гап^ега. Показано, что они существуют в водной среде в виде колоний, объединенных во флоки, с поверхностей закрытых мощным матриксом-покровом полисахаридной природы. В эксперименте показано, что патогенные бактерии адгезируются к поверхности водонерастворимого вязкого матрикса Х.гатщега, который служит «ловушкой» для патогенных бактерий, снижая их численность в 3-4 раза. Этот процесс представляет собой проявление крайней степени антагонизма-хищничестча, свойственного обитателям водных экосистем (простейшие, микроскопические грибы, микроводоросли и др.)

Проведенные исследования позволили выявить закономерности существования различных видов бактерий в колониях, представляющих собой ограниченную часть популяции со сложным строением, развитие которых определяется условиями среды обитания.

Практическая значимость

Разработаны новые методические подходы и методики для исследований бактерий на популяционном уровне с применением электронной микроскопии.

Существование многих патогенных бактерий в окружающей среде -почве, воде и прочих естественных экосистемах, сопровождается изменением их биологических свойств, что создает трудности в их идентификации.

Разработан метод, позволяющий наряду с изучением морфологии колоний и микроколоний бактерий без нарушения их естественной архитектоники, исследовать различные проявления гетероморфизма, процессы Ь-трансформации и реверсии Ь-форм в исходное состояние. Основой метода является использование двойных мембранных фильтров с различным диаметром пор («Владипор» МФА-МА), помещенных на влажную поверхность плотной питательной среды. Метод может быть широко использован при различных микробиологических исследованиях в научных и практических целях, включая выделение и идентификацию микроорганизмов на объектах окружающей среды. Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что в определенных случаях подбор новых дезинфицирующих и лекарственных средств следует осуществлять с использованием колоний бактерий, а не изолированных клеток, лишенных естественной защиты.

С помощью разработанных методов установлено, что высокая температура и действие ПАВ резко снижают адгезивные свойства потенциально-патогенных и патогенных бактерий, предотвращая процесс колонизации, а, следовательно, снижают опасность распространения и возникновения инфекционного очага.

Разработаны препараты нового класса «Инахол», основанные на антиадгезивных свойствах медицинской желчи для профилактики и лечения диарейных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных (Патенты 1617701, 1617702). Разработаны и утверждены методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе.

Выделены и идентифицированы сапрофитные флокулирующие бактерии активного ила Хоо$оеа гап^ега; штамм 19-а Z.ramщeтa депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФН РАН (г. Пущино, 1996), аналоги в коллекции отсутствуют. Материалы работы о ведущей роли г.гап^ега в очистке сточных вод от патогенных и потенциально-патогенных бактерий вошли в "Методические рекомендации по определению степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках" и в "Технологию формирования доминирующих микробных сообществ активного ила при аэробной биологической очистке сточных вод в условиях продленной аэрации". Технология может быть использована при запуске новых аэротенков для инициации процесса очистки сточных вод флокирующими бактриями 2.гагш§ега, а также для оптимизации микробиоценозов сточных вод в работающих аэротенках.

Впервые разработан метод оценки действия бактерий антагонистов -продуцентов БАВ на патогенные и потенциально-патогенные бактерии, основанный на применении компьютерной морфоденситометрии и сканирующей электронной микроскопии. Метод позволяет осуществлять количественно-качественную оценку процессов Ь-трансформации и степени ингибирующего эффекта БАВ, обеспечивает целенаправленный отбор перспективных штаммов продуцентов БАВ с различным механизмом действия на клетки патогенных и потенциально-патогенных микроорганизмов.

Разработан препарат «Средство для дезинфекции», представляющий композицию глутарового альдегида с катионным ПАВ. Действие препарата основано на эффекте синергизма, что позволило снизить дозы составляющих компонентов в 3-4 раза (а.с.).

Материалы исследований использованы в следующих документах:

- "Методические указания по ускоренному контролю качества дезинфекции воздуха животноводческих помещений и индикации микроорганизмов в аэрозоле", утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 19.11.1987.

- "Технология формирования доминирующих микробных сообществ активного ила при аэробной биологической очистке сточных вод в условиях продлённой аэрации", утвержденная Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 1998.

- "Методические рекомендации по определению степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 7.05.1999.

- "Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе", утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 16.01.1999.

- A.c. 713000 Препарат «Дезинфектол». Приоритет 12.07.1978.

- A.c. 944194 Препарат "Средство для дезинфекции". Приоритет 13.03.1980.

- A.c. 303219. Приоритет 10.09.1987.

- A.c. 1673119 Препарат "Бронхопневмозоль". Приоритет 7.03.1989.

- Патент 1617701 "Способ лечения гастроэнтеритов молодняка сельскохозяйственных животных". Приоритет 31.05.1989.

- Патент 1617702 "Способ профилактики гастроэнтеритов молодняка сельскохозяйственных животных". Приоритет 31.05.1989.

На защиту выносятся

1. Использование новых методических подходов к исследованию популяций бгйстерий с сохранением их естественной архитектоники при различных условиях существования.

2. Установление закономерностей развития колоний различных видов бактерий в процессе их существования в окружающей среде.

3. Исследование влияния среды обитания на изменчивость популяций бактерий.

4. Изучение процессов адгезии, колонизации бактерий и влияния антиадгезивных препаратов на эти процессы.

Публикации результатов работы

Основное содержание работы опубликовано в 40 печатных работах, в том числе в 2-х монографиях.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на отчетных заседаниях Ученого совета ВНИИВСГЭ (1974-1999), на научных конференциях и координационных совещаниях, на Всесоюзной научно-производственной конференции "Ветеринарно-санитарные мероприятия на животноводческих комплексах и хозяйствах промышленного типа"

Москва, 1977), Всемирном ветеринарном конгрессе (Москва, 1979), Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Таллинн, 1979), Международной конференции (Прага, 1988), Третьей Всесоюзной конференции по эпизоотии (Новосибирск, 1991), Международном симпозиуме (Москва, 1995), Международном координационном совещании "Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных" (Воронеж, 1997), Международной конференции "АКВАТЭК" (Москва, 1998), Всесоюзной научно-исследовательской конференции, посвященной 75-летию со дня рождения Э.Ф.Чуклова (Щелково, 1998). Прочитаны лекции по материалам диссертации в научно-исследовательских институтах: Микробиологии РАН, ВИЭВ, ВНИДиС, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, МГУ (кафедра микробиологии).

Результаты работы экспонировались на ВДНХ СССР; Главным комитетом выставки дважды отмечены медалями (1983-1985). За препарат "Средство для дезинфекции" получена медаль "Изобретатель СССР" (1981). «Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных» используется в лекциях для студентов медицинских и ветеринарных вузов, а так же в научно-исследовательских работах. В 1993 г. получен гранд Сороса по проблеме изучения строения колоний бактерий.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использованы штаммы бактерий с типичными культурально-биохимическими свойствами: грамотрицательные - Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Providensia rettgeri, Zoogloea ramigera; грамположительные: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium bovis, M.avium, M.fortuitum, Bacillus licheniformis.

Указанные бактерии получены из музейных коллекций ВНИИВСГЭ, ВГНКИ, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, ГИСК им. Тарасевича.

Культуры микроорганизмов выращивали по общепринятым методам на соответствующих для вида питательных средах. Z.ramigera культивировали на жидкой и плотной питательных средах: Casiton-Yeast (CY) по P.F.Unz (1967). Для определения полисахаридной природы покровов у грамотрицательных бактерий проводили цитохимические исследования по методу электронной цитохимии в реакции с рутением красным по Pate and Ordal (1967). Полисахаридную природу капсулы и покровов у Z.ramigera изучали с применением центавлона (Методическое руководство по микробиологии для студентов МГУ, 1987). Дегидрогеназную активность бактерий определяли по методу В.Ф.Шмитд и др. (1964).

Из дезинфицирующих средств были использованы следующие: высокая температура, препараты гипохлорит натрия, "Дезоксон-1", перекись водорода, глутаровый альдегид, катамин АБ (ПАВ), "Глак", "Белас", "Дезинфектол", "Средство для дезинфекции".

Исследовали динамику гибели бактериальных клеток по методу А.В .Куликовского (1976); на популяционном уровне - с применением модифицированной нами методики "Ускоренного способа количественного учета микроорганизмов" (Е.И.Васильева, 1988).

Для определения степени патогенности популяций стафилококков после длительного обитания в водной среде нами был модифицирован общепринятый метод определения гемолитической и ДНК-азной активности. Основа модификации метода - количественно-качественная оценка результатов исследования. Количественную оценку проводили по изменению величины зон гемолиза и просветления агара. При этом бактериальную суспензию вносили в каплях полужидкого агара, содержащих определенную концентрацию клеток. Качественная оценка основывалась на исследовании контрольных и опытных образцов колоний бактерий в сканирующем электронном микроскопе.

Для исследования неспецифической адгезии нами разработана методика, согласно которой можно проводить количественнокачественную оценку этого процесса (см. п.2.6.). Для изучения адгезии бактерий на объектах окружающей среды (лист капусты, куриное яйцо, корма, резиновая трубка) поверхности предварительно промывали стерильной теплой водой, наносили 0,01 мл 0,5 млрд взвеси тест-культур бактерий, помещали в увлажненную стерильную чашку Петри и выдерживали при комнатной температуре от одного до семи дней. Изучение адгезии стафилококков на эритроцитах крупного рогатого скота проводили согласно «Методическим рекомендациям по определению адгезии бактерий кишечного происхождения к эпителиальным клеткам тонкого и толстого кишечника» (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, Москва, 1989). Для исследований процессов адгезии с использованием метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) разработаны методические рекомендации, позволяющие проводить морфологический анализ этого процесса, изложенные в разделе "Практическое использование результатов исследований".

Количественную оценку эффекта ингибирования тест-культур под действием БАВ антагонистов проводили с применением компьютерно-телевизионной системы анализа изображений "ДИАМОРФ" (НИИФХМ) и программного комплекса "ДИАМОРФО" на установке УВА8-2 (Ор1оп).

Для сохранения естественной архитектоники колоний и возможности изучать процессы изменчивости бактерий с использованием СЭМ нами разработана методика выращивания популяций бактерий на двойных мембранных фильтрах с различным диаметром пор - от 0,45-0,65 мкм для бактериальных клеток и 0,15-0,25 мкм для изучения клеток с дефектной клеточной стенкой. Через 24-48 ч первый фильтр удаляют с поверхности твердой питательной среды. На фильтр с меньшим диаметром пор оседают клетки с дефектной клеточной стенкой, легко проходящие через первый фильтр. На этом фильтре рост колоний трудно различим, однако СЭМ выявляет наличие дефектных клеток, характерных для Ь-трансформации.

Для выявления процесса реверсии клеток в исходную форму, а также установления стабильности L-форм, фильтр № 2 помещают для подращивания на обогащенные питательные среды при 37°С. Срок наблюдения от 3 до 7 сут. Исследовали морфологию колоний различных видов бактерий по методам, позволяющим без нарушения их структуры изучать процессы естественного развития популяции бактерий до и после воздействия различных абиотических и биотических факторов.

Образцы препаратов для исследования в СЭМ фиксировали парами 25%-го глутарового альдегида и обезвоживали парами ацетона или пропиленоксида. Напыляли платиной или золотом в течение 10 мин на установке "Hitachi-E-102". Работу проводили на электронном микроскопе "Hitachi-800" со сканирующей приставкой "Hitachi-8010", при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении от 1 до 30000.

Для изучения ультраструктуры бактерий препараты фиксировали по Kellenberger et al. (1958). Обезвоживание и заливку образцов в эпоксидные смолы проводили по методу В.И.Бирюзовой с соавт. (1963). Ультратомию осуществляли на ультратоме ЛКБ-4800, срезы контрастировали по Watson (1958). Просмотр ультратонких срезов осуществляли на микроскопах "Hitachi-12", "Hitachi-800". Всего проанализировано более 10000 фотоматериалов.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2. ¡.Морфология популяций бактерий в процессе их естественного развития на плотных питательных средах.

В настоящее время ультраструктура различных видов грамотрицательных и грамположительных бактерий достаточно хорошо изучена и представлена в монографии отечественных исследователей (А.А.Авакян, Л.Н.Кац, И.Б.Павлова «Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных, 1972).

Однако необходимость продолжения исследований поведения бактерий в окружающей среде требует новых методических подходов к изучению не изолированных клеток, лишенных естественной защиты, а в колониях и микроколониях.

Новое направление в науке, позволяющее на популяционном уровне изучать строение, развитие и существование колоний различных видов бактерий, расширяет наши представление об их структурно-функциональных особенностях и позволяет по-новому подойти ко многим практическим проблемам воздействия на возбудителя как в окружающей среде, так и в макроорганизме, а также переосмыслить и научно обосновать подбор новых дезинфицирующих и лекарственных препаратов.

Разработанные нами методы исследования морфологии колоний бактерий с использованием мембранных фильтров с различным диаметром пор, щадящей фиксации и обезвоживания объектов позволили при исследовании в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) получить объективную информацию о строении поверхностей колоний, выявить взаимосвязи бактериальных клеток, а также особенности их естественного развития в процессе роста.

Объектом исследований служили грамотрицательные микроорганизмы - Salmonella typhimurium, Providencia rettgeri, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli й грамположительные - Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis.

При исследовании колоний S.typhimurium, P.rettgeri, P.vulgaris, K.pneumoniae, P.aeruginosa, E.coli в логарифмической фазе роста с помощью методов СЭМ на их поверхности выявлены покровы. Морфология покровов у изученных грамотрицательных бактерий однотипна; они имеют вид плотных плёнок или сферических вздутий различной величины с гладкой поверхностью (рис. 1). При этом отдельные клетки или их ассоциации наблюдались в участках нарушения целостности покрова или на периферии колонии, где покровы имели вид тонкой пленки.

Важно отметить, что у некоторых бактерий, например, S.typhimurium, массивный покров выявлялся у свежевыделенных штаммов или у культур, пассированных 4-5 раз через обогащенные питательные среды, но при длительном хранении культур в холодильнике при +4°С способность формировать покровы исчезала. Поверхность колонии S.typhimurium была разделена на сектора, клетки имели определенную ориентацию и находились в ассоциации (рис. 2). На поверхности колоний Р.vulgaris и К.pneumoniae всегда выявляли массивные покровы независимо от температуры хранения культур. При интенсивном встряхивании смыва колоний вышеуказанных бактерий на электровстряхивателе клетки протея полностью освобождались от покровов, на отдельных участках которых были видны следы "выпавших" клеток. У K.pneumoniae тесный контакт клеток с покровом всегда сохранялся.

На ультратонких срезах клеток K.pneumoniae на поверхности выявлены элементы капсулы в виде длинных тонких бесструктурных нитей, равномерно отходящих от клеточной стенки. Благодаря этому клетки клебсиелл имеют более прочную взаимосвязь в популяции и не так легко могут быть освобождены от покровов, чем объясняется их высокая устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов.

В колониях P.aeruginosa наблюдали плотный покров, через который отдельные клетки не дифференцировались. Покровы имели вид сферических вздутий с гладкой поверхностью, в чем имели сходство с другими грамотрицательными бактериями. При нарушении целостности участков покрова наблюдали длинные тяжи, представляющие собой полые трубочки. Возможно, такие микроканалы участвуют в транспортных процессах внутри популяции.

При изучении морфологии поверхностей колоний некоторых грамположительных бактерий выявлены особенности в их строении. На поверхности колоний S.agalactiae закономерно определяется покров,

Рис.1. Фрагменты колоний S.typhimurium (a), P.rettgeri (б), P.vulgaris (в), ELpneumoniae (г), S.aureus (д), Str.agalactiae (е). На поверхности клеток видны покровы. Сканограмма, х 8000.

Рис. 2. Фрагмент колонии БЛурЫтипит. Видно разделение колонии на сектора, в которых клетки находятся в определенной ориентации и взаимосвязи. Сканограммы, х 1000 и х 6000. гладкая поверхность которого имеет вид плотной пленки или повторяет очертания округлых клеток. При исследовании ультратонких срезов клеток на уровне одной колонии в межклеточном пространстве выявлены фибриллы, с помощью которых клетки находились в ассоциации. Обнаруживаемые фибриллы не имели определённой длины и структуры и являлись элементами покрова.

На поверхности колоний Б.аигеш не всегда выявлялся покров и отдельные шаровидные клетки хорошо дифференцировались. Они находились в ассоциации за счёт межклеточного матрикса, продуцируемого клетками. Покровы на поверхностях колоний наблюдались у свежевыделенных патогенных штаммов стафилококков или при культивировании их на обогащенных питательных средах.

Изучение морфологии поверхностей колоний различных видов микобактерий (М.Ьоу1з, М.аушт, М.йжикит) показало, что покровы независимо от вида, патогенности и возраста культуры микобактерий несколько различались по строению. Так, у М.Ытэ и М.аушт поверхности колоний плотные, бугристые или складчатые. На поверхности клеток потенциально-патогенных бактерий М.йЛшШт покров также хорошо дифференцировался, но имел меньшую толщину. На ультратонких срезах микобактерий, полученных через одну колонию, показано, что группы клеток заключены в общий слой средней электронно-оптической плотности, где переходы этого слоя от одной клетки к другой чётко контурированы и представляли собой сохранившуюся часть покровов (рис.3). Учитывая данные литературы о высоком содержании в составе поверхностных структур микобактерий липидов, мы обработали колонии растворами, содержащими 0,5 - 1% катамина АБ (ПАВ). Это привело к полному или частичному удалению покровов, в результате чего в сканирующем электронном микроскопе хорошо просматривались отдельные палочковидные клетки М.аушт и ветвящиеся - М.йэгЩкит (рис.4).

Рис. 3. Ультратонкий срез через колонию М.Ьоу1з. Видны межклеточные связи, объединяющие клетки в группы. ТЭМ, х 40000.

Рис. 4. Фрагменты колоний М.аушт и М.:£оПшШт. Воздействие на колонии растворов катионного ПАВ (катамин АБ) нарушает покров, в результате чего хорошо видны клетки бактерий. Сканограмма, х 10000.

Наличие покровов и межклеточного матрикса в колониях микобактерий, обеспечивают защиту клеток от воздействия различных неблагоприятных факторов. Кроме того, гидрофобность липидов, входящих в состав клеточных стенок микобактерий, а также в состав межклеточного матрикса, обеспечивает данным микроорганизмам высокую устойчивость ко многим дезинфицирующим средствам и лекарственным препаратам.

Таким образом, наличие покровов на поверхностях колоний изученных бактерий на плотных питательных средах следует рассматривать как морфологическую особенность, представляющую собой внеклеточное образование, играющую важную роль в существовании популяций.

2.2. Морфология популяций бактерий в процессе их развития в жидких питательных и водных средах

Вопросы существования патогенных, потенциально-патогенных и сапрофитных бактерий в жидкой питательной среде и водных экосистемах требует детального исследования, так как нет единого мнения, касающегося морфологии, развития и существования их при различных условиях обитания.

В работе были изучены - Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Zoogloae ramigera.

Для изучения морфологии бактерий в жидкой среде (in vitro) с помощью сканирующей электронной микроскопии нами предложены специальные методические приемы, позволяющие без нарушения естественной архитектоники колоний бактерий, выявлять особенности существования и развития клеток в популяции.

Исследование морфологии популяций S.typhimurium (9-10-часовая культура на МПБ) - показало, что в жидкой питательной среде клетки S.typhimurium объединены межклеточным матриксом в группы, образуя микроколонии (рис.5). Полисахаридная природа матрикса установлена на уровне ультраструктуры клеток бактерий в реакции с рутением красным.

В микроколониях бактерии со всех сторон закрыты покровами, по своим морфологическим критериям они не отличались от колоний на плотных питательных средах. В жидких питательных средах встречаются и единичные клетки, обычно находящиеся на стадии деления.

Исследование популяций стафилококков в жидкой питательной среде (МПБ) выявило также ассоциативную связь клеток между собой. В микроколониях насчитывалось несколько десятков клеток, со всех сторон окруженных покровами.

Особый интерес представило исследование представителей сапрофитной микрофлоры, обитателей водных экосистем - бактерий рода 2оо§1оеа. Морфология этих микроорганизмов была изучена нами в связи с исследованием микробиоценозов активного ила в очистных сооружениях. Ведущая роль в функционировании этих микробиоценозов отводится флокулирующим бактериям. Нами из активного ила было выделены 26 штаммов Х-шт^гта.

Морфология клеток различных штаммов 2.гап^ега была однотипной, представлена грамотрицательными клетками в виде коротких палочек размером 0,5-1,5 х 1,5-3 мкм. Установлено, что в жидких питательных средах клетки имеют монополярный жгутик. Эти бактерии при любых условиях роста (жидкая или твёрдая питательные среды) имеют чётко дифференцируемую капсулу, хорошо выявляемую в световом микроскопе. Вокруг клеток выявлялся межклеточный матрикс, который мы наблюдали при выращивании г.гап^ега на покровных стёклах, помещённых в жидкую питательную среду.

Исследование популяций таких клеток в процессе роста выявило способность не только формировать массивный межклеточный матрикс, но и обильные покровы. Полисахаридная природа покровов была установлена нами в реакции, с центавлоном.

Изучение г.гап^ега в. жидкой питательной и водных средах выявило образование пленок на поверхности жидкости, которая уплотнялась по мере роста. На 5-7 сут массивная пленка постепенно оседала на дно пробирки. Установлены фазы формирования микрофлокул. Интенсивность биофлокуляций у выделенных штаммов различна; скорость оседания хлопьев свидетельствовала о высокой флокулирующей способности Z.ramigera.

Исследование популяций клеток Z.ramigera in vitro, а также из проб воды очистных сооружений, показало, что клетки плотно сгруппированы в виде длинных жгутов, представляющих собой колонии различной величины, с поверхностей закрытых массивными покровами. Колонии способны объединяться во флоки (рис.6). Установлено, что в условиях голодания - в очищенной воде, где недостаточно питательных веществ, процесс биофлокуляции усиливается образованием крупных флоков, формирующих на поверхности пленки. Образование пленки составляет одну из фаз биофлокуляции.

В заключении следует констатировать, что морфология популяций бактерий в процессе их естественного развития в жидких питательных средах имеет общие закономерности развития.

Рис.5. 10-часовая культура З.^рЫшилит в жидкой питательной среде (МПБ). Видно формирование микроколонии, с поверхности закрытой покровами. Сканограмма, х10000.

Рис. 6. Фрагмент флокулы 2оо§1оеа гапи§ега (проба воды из очистных сооружений). Клетки закрыты со всех сторон массивными покровами. Сканограмма, х 10000.

Установлено, что в колониях связь клеток осуществляется за счет продуцируемых ими экзопродуктов различной природы, морфологически определяемых как межклеточный матрикс, от степени развития которого зависит образование покровов в колониях.

Таким образом, колонии бактерий это ограниченная часть популяции, имеющая сложное строение, развитие и существование которой определяется условиями обитания,

2.3. Гетероморфизм бактерий в процессе естественного развития колоний на плотных питательных средах

Известно, что структура популяций бактерий динамична (Б.В.Громов, Г.В.Павленко, 1989). Эта динамичность определяется процессами диссоциации бактерий, сопровождающейся расщеплением однородной популяции на варианты (¡5, Л-формы), различающиеся по морфологическим, физиологическим и биохимическими свойствам.

Изучение морфологии колоний при естественном развитии их на плотных питательных средах показало, что у различных грамотрицательных и грамположительных бактерий скорость процессов диссоциации определяется многими факторами, в частности, длительностью хранения бактериальных культур, несбалансированностью состава и рН питательных сред, ускоряющих этот процесс. Гетероморфизм клеток является прямым отражением процессов диссоциации бактериальных популяций.

Исследованы грамотрицательные бактерии - S.typhimurium, P.rettgeri, P.vulgaris, K.pneumoniae, P.aeruginosa и грамположительные - S.aureus.

При исследовании грамотрицательных и грамположительных бактерий, в естественных условиях их культивирования на плотных питательных средах, через 24-48 ч в колониях выявлен гетероморфизм клеток. Следует отметить, что в этот период на поверхностях клеток в колониях покров отсутствовал.

При изучении колоний методами СЭМ в участках гетероморфизма обнаружены шаровидные, овальные крупные и мелкие клетки, нередко объединённые длинными тяжами, внутри которых заключены округлые элементы, имеющие тенденцию к развитию. В участках гетероморфизма выявлены клетки сферопластного и протопластного типа в 2-3 раза превышающих размер нормальных клеток; нитевидные структуры, мелкие клетки. На периферии колоний обнаружены нитевидные структуры диаметром 0,25-0,3 мкм. По морфологическим критериям они являлись элементами покровов. Внутри и на поверхностях нитевидных структур выявлялись мелкие клетки округлой формы размером 0,2-0,7 мкм, нередко располагавшиеся на субстрате и реверсировавшие в исходную форму, образуя новые микроколонии. Этот процесс закономерен для всех бактерий и не зависит от среды обитания. Мы полагаем, что нитевидные структуры обеспечивают дополнительную возможность сохранения вида в . условиях, неблагоприятных для существования бактерий.

В гетерогенных популяциях на примере клеток S.typhimurium нам удалось наблюдать гигантские тела (5-7 х 6-9 мкм) со складчатой поверхностью. Существует мнение, что гигантские тела представляют собой слившиеся сферопласты, объединённые общим чехлом, состоящим из фрагментов покровов и наружных мембран клеток (С.В.Прозоровский и др., 1981). В результате атипичного деления сферопластов, главным образом почкования, образуется большое количество мелких шаровидных клеток, которые «высыпаются» из гигантских тел.

Наряду с вышеописанными формами в процессе гетероморфизма наблюдались мелкие извитые палочковидные клетки размером 0,25-0,3 мкм, образующиеся из. шаровидных форм. По своей морфологической характеристике они рассматриваются как клетки-ревертанты (С.В.Прозоровский и др., 1981). Способность клеток к реверсии составляет характерную особенность гетероморфизма бактерий. Принципиально важно то, что гетероморфизм бактерий обнаружен нами в условиях

Рис. 7. Схема гетероморфного роста бактерий в процессе развития популяции: а - клетки, имеющие типичное строение, б - клетки с дефектной клеточной стенкой, в - почкующися сферопласты, г -нитевидные структуры, д - гигантские тела с выходом множества мелких форм, е - реверсирующие клетки. естественного развития популяций, а не при воздействии экстремальных факторов. Это даёт основание полагать, что гетероморфизм клеток присущ нормальному циклу развития бактериальной популяции, который начинается со стадии дефектности клеточной стенки с последующим образованием клеток сферопластного и протопластного типа различной величины и заканчивается образованием ревертантов (рис.

Гетероморфизм имеет общие закономерности морфологических проявлений у различных видов бактерий и может рассматриваться как один из этапов Ь-трансформации.

Ь-формы, являющиеся проявлением гетероморфизма клеток, было бы удачно называть "транзитные Ь-формы". Этот термин был предложен ещё в 1960 г. Клинебергер-Нобель. Наблюдаемая нами Ь-транеформация популяций бактерий в условиях естественного развития практически не изучена, она является ответной реакцией популяции бактерий на изменение условий окружающей среды, что способствует выживанию и сохранению вида.

Важно отметить, что нарушение экологии, связанное с применением дезинфектантов, гербицидов, инсектицидов, удобрений, широкое использование антибиотиков в животноводстве и медицине, воздействие техногенных факторов постоянно увеличивает вероятность возникновения гетероморфизма бактерий с проявлением Ь-трансформации' й образованием Ь-форм в окружающей среде.

В заключении можно предложить гипотезу, согласно которой явление спонтанной Ь-трансформации бактерий представляет собой естественную форму развития популяций, скорость и степень проявления которой определяются условиями среды обитания.

Рис. 8. Гетероморфизм бактерий в процессе развития популяции: а -почкующиеся клетки сферопластного типа, б - нитевидные структуры, в -элементарные тела - Ь-формы, г - гигантское тело, д - клетки-ревертанты. Сканограммы, х 8000.

2.4. Гетероморфизм популяций патогенных и потенциально-патогенных бактерий в жидких средах обитания

В настоящее время накоплены данные, свидетельствующие о способности многих патогенных грамотрицательных бактерий к длительной персистенции в водных экосистемах. При этом у бактерий наблюдалось значительное снижение метаболической активности и они не обнаруживались традиционными лабораторными • методами. Существование популяций бактерий в некультивируемом состоянии -малоизученное явление, а исследования популяций бактерий в водной среде с использованием методов электронной микроскопии практически отсутствуют.

Для объективной оценки поведения популяций бактерий в водной среде проведены исследования тёст-штаммов бактерий S.typhimurium и S.aureus in vitro. Культуры бактерий высевали в колбы, содержащие 500 мл стерильной родниковой воды, выдерживали при комнатной температуре и естественном освещении. Пробы отбирали через 1, 3 и 6 мес. Изучение образцов препаратов из опытных колб в СЭМ показало, что особенностью морфологии клеток был выраженный гетероморфизм, при этом основная часть популяции была представлена клетками сферопластного и протопластного типа различной величины. Выявлены нитевидные структуры, нередко объединенные в длинные и широкие тяжи, мелкие клетки шаровидной и овальной формы размером 0,3-0,7 мкм, по морфологическим критериям идентичные L-формам бактерий. Такие клетки обнаружены внутри и на поверхности нитевидных структур и > тяжей. Природа нитевидных структур и составляющих их тяжей мало изучена. Мы полагаем, что они являются остатками визированных клеток, объединенных спавшимися элементами покровов полисахаридной природы, представляющих собой чехлы, содержащие гетероморфные клетки различной величины.

На отдельных участках поверхностей нитевидных структур и тяжей, шиш Ян ликроко-'и.иии

Рис. 9. Культура Б^Ытипит (6 мес. хранения в стерильной родниковой воде). Видно формирование нитевидных структур в тяжи (а), на поверхности и внутри которых располагаются Ь-формы (б), клетки-ревертанты (в) и образование новых микроколоний (г). Сканограмма, хВООО. являющихся поддерживающим и питательным субстратом для L-форм, выявлены новые микроколонии (рис.9). Из L-форм формируются мелкие изогнутые клетки-ревертанты, способные в зависимости от условий существования к развитию в исходную форму.

Формирование новых микроколоний является закономерным явлением существовании различных видов бактерий в окружающей среде и служит дополнительной возможностью сохранения вида в условиях, неблагоприятных для развития популяций бактерий.

В производственных условиях из сооружений биологической очистки взяты пробы воды. Исследование популяций бактерий методами СЭМ позволило установить общие закономерности морфологии гетероморфных клеток со всеми фазами L-трансформации.

Для изучения способности клеток к реверсии были проведены микробиологические исследования культур, хранившихся в водной среде от I до 6 мес. Культуры высевали на обогащенные питательные среды и культивировали при оптимальном режиме. На 7 сут был обнаружен слабый рост. Методами СЭМ установлена реверсия L-трансформированных клеток в исходное состояние.

Полученные данные свидетельствуют о том, что после длительного существования бактерий в водной среде в условиях голодания реверсия клеток в исходное состояние может происходить при благоприятных условиях.

Одновременно исследовали возможность сохранения бактериями S.aureus патогенных свойств в условиях длительного пребывания в водной среде (3 мес). Для этого по модифицированной нами методике (р. 2.1) осуществляли количественную оценку гемолитической и ДНК-азной активности. Показано, что зоны гемолиза и просветления агара были в 1,52 раза меньше, чем в контроле. Так как известна корреляция гемолитической и ДНК-азной активности с патогенными свойствами стафилококков, можно полагать, что в условиях голодания при длительном обитании в водной среде бактерии частично теряют патогенные свойства. Однако, при благоприятных условиях существования клетки способны реверсировать в исходную форму, сохраняя свои патогенные свойства.

Полученные данные позволяют сделать заключение, что неблагоприятные для развития бактерий условия в водной среде, приводят к переходу клеток в атипичные формы, свойственные гетероморфизму с различными фазами Ь-трансформации.

2.5. Роль покровов в устойчивости колоний бактерий к воздействию абиотических факторов

Изучение роли покровов на поверхностях колоний у потенциально-патогенных и патогенных бактерий является актуальной проблемой в области экологии бактерий, обусловленной тесными взаимоотношениями их с окружающей средой.

Как было показано, покровы, не являясь обязательными структурными элементами клеток, могут быть удалены с поверхностей интенсивным встряхиванием.

Для выявления функционального значения покровов были использованы две группы клеток культуры ЗЛурЫтигшт: первая -осторожно смытые колонии с поверхности МПА; вторая - после интенсивного их встряхивания. На обе группы клеток воздействовали температурой +55°С и дезинфицирующими средствами (препарат "Белас" -0,05%, раствор едкого натра - 0,05% и раствор хлорамина - 0,01 %).

Исследование клеток сальмонелл в СЭМ после снятия с колоний покровов по нашей методике не выявило поврежденных клеток. При воздействии высокой температуры было установлено, что защищённые покровом бактерии более устойчивы к воздействию термального фактора. Различия в устойчивости этих бактерий были отмечены и при воздействии указанных дезинфицирующих средств.

При 15-минутной экспозиции количество выживших клеток сальмонелл, лишённых покровов, при воздействии препарата "Белас* было в десятки раз меньше, чем в исходной культуре. Подобная закономерность отмечалась и в случае воздействия хлорамина (рис. 10).

Установлена более выраженная устойчивость Р.уи^апБ и К.рпеитотае по сравнению с Е.соП к высокой температуре, перекиси водорода и гипохлориту натрия. Это связано с наличием у протея и клебсиелл массивных покровов в отличие от эшерихий. Рис. 10.

Устойчивость 8а]топс11а ТурЫтиИига (с покровами н без покровов) к воздействию дезинфицирующих средств , (экспозиция 15 минут)

10 ,

9,05% "БЕЛАС"

0,05% №ЮН

0,01% ХЛОРАМИН

Дезинфицирующие средства

Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что более объективно оценку дезинфицирующих и лекарственных препаратов можно получать при исследовании бактериальных колоний, а не отдельных клеток в суспензиях , где они лишены естественной защиты.

2.6. Адгезия бактерий и влияние на этот процесс абиотических факторов

Адгезия патогенных бактерий - это начальное и важнейшее звено в эпидемическом и эпизоотологическом процессах, поэтому прерывание адгезии, а, следовательно, и колонизации микроорганизмов, является радикальным способом предотвращения опасности распространения инфекционного очага. Как мы уже отмечали, некоторые патогенные бактерии не Только выживают вне организма, но способны размножаться и накапливаться в окружающей среде.

Нашими экспериментальными исследованиями с применением сканирующей электронной микроскопии, было установлено, что 8лурЫтигшт, Р.уи^апБ, К.рпеитошае, З.аигеиБ, Р.аепщтоза при благоприятных условиях активно адгезируются с последующей колонизацией на субстрате. В этой связи прерывание процессов адгезии патогенных и потенциально-патогенных бактерий к субстрату является основой для создания препаратов нового класса, способствующих предотвращению или уменьшению этого процесса.

Для изучения влияния некоторых абиотических факторов на адгезивную способность бактерий в окружающей среде нами была разработана методика, позволяющая количественно и качественно оценить этот процесс. В опытах использовали грамотрицательные бактерии РптёепЫае гей£еп. В качестве тест-объектов были выбраны участки стерильной резиновой трубки диаметром 0,5 см и шириной 1 см. Для определения динамики гибели бактерий при воздействии абиотических факторов использовали метод определения выживания бактерий методом серийных разведений, а также модифицированный нами ускоренный метод в каплях полужидкого агара (р.2.1). В качестве абиотических факторов использовали препарат «Новойод» и воздействие высокой температуры (50°С). Для изучения неспецифической адгезии стерильные участки резиновых трубочек помещали в МПБ, содержащий 2 млрд клеток в 1 мл. Инкубировали при 37°С в течение трех часов (оптимальное время адгезии). Далее трубочки извлекали из питательной среды, тщательно отмывали в физиологическом растворе с. помощью электровстряхивателя (10 с) и определяли в смыве количество микробных клеток. После высева на МПА через 18 ч подсчитывали колонии. Параллельно .определяли количество бактерий, неадгезированных к тест-объектам и оставшихся в питательной среде. Процессы адгезии клеток бактерий к тест-объектам контролировали методом СЭМ.

В задачи исследования входило определение адгезивной способности в зависимости от возраста бактерий. Так было установлено, что 18-ти часовые культуры Р.гей§еп обладали более высокой адгезивной активностью по сравнению с 24-х часовыми культурами.

Результаты опытов показали, что при воздействии на культуры бактерий препарата «Новойод», адгезивная активность бактерий падала значительно быстрее, чем наступала гибель клеток. Снижение адгезивных свойств бактерий под воздействием высокой температуры идет одновременно или несколько опережает процесс гибели клеток. Таким образом, полученные данные показывают, что обработка горячей водой объектов окружающей среды будет не только вызывать гибель части популяции патогенных и потенциально-патогенных бактерий, но и способствовать предотвращению процессов адгезии, а, следовательно, и колонизации как одного из возможных факторов возникновения инфекционного очага.

Известно, что холевая и дезоксихолевая кислоты обладают способностью уменьшать резистентность некоторых бактерий к антибиотикам (С.А.Климнюк,1984). Нами была экспериментально показана антиадгезивная активность этих кислот. Учитывая, что растворы медицинской консервированной желчи содержат в своем составе холевую и дезоксихолевую кислоты, было исследовано влияние этого препарата на адгезивные свойства бактерий. Установлено, что коэффициент адгезии после инкубации в течение двух часов у бактерий Р.гей§еп снижался в четыре раза. Параллельно проведено изучение морфологии колоний в СЭМ. Снижение адгезивной активности клеток морфологически проявлялось нарушением покровов и межклеточных связей в колониях, что обусловлено угнетением синтеза полисахаридов.

Полученные нами данные, основанные на изучении антиадгезивных свойств растворов желчи по отношению к патогенным и потенциально-патогенным грамотрицательным бактериям, позволили подобрать композиции препаратов «Инахол» для профилактики и лечения диарейных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных.

Антиадгезивную активность препаратов, содержащих поверхностно-активные вещества (ПАВ), следует учитывать в создании дезинфицирующих средств для снижения обсемененности патогенной и потенциально-патогенной микрофлорой ветеринарного и медицинского оборудования, а также различных объектов окружающей среды.

2.7. Роль процессов адгезии и колонизации в существовании популяций бактерий на объектах окружающей среды

Изучение морфологии бактериальных клеток, адгезированных к поверхностям объектов окружающей среды и их последующая колонизация, открывает перспективные возможности в разработке препаратов, предотвращающих эти процессы.

Объектами исследований служили патогенные бактерии - Salmonella typhimurium и потенциально-патогенные бактерии - Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa. Через 5-12 ч после нанесения на поверхность скорлупы куриного яйца, капустного листа, Частиц кормов, участков резиновой трубки, бактерии проявляли адгезивные свойства с последующей колонизацией.

На частицах корма выявлены как отдельные клетки, адгезированные к их поверхностям, так и микроколонии, закрытые покровами (рис.11). Между микроколониями на поверхности субстрата обнаруживались нитевидные структуры различной' величины, аналогичные структурам, выявляемым нами на питательных средах.

Рис. 11. Адгезия и колонизация бактерий на объектах окружающей среды - (а) клетки S.typhimurium на поверхности скорлупы куриного яйца и (б) — на частицах комбикорма, (в) - Р.vulgaris на капустном листе, (г) -S.aureus на резиновой трубке, (д) - S.aureus патогенный штамм на эритроцитах к.р.с. и (е) - непатогенный штамм. Сканограммы, х 10000.

Наши исследования показали, что на поверхности объектов окружающей среды изученные бактерии продуцируют внеклеточные вещества, выявляемые в виде покровов. Вначале экзопродукты выявлялись в виде матрикса вокруг адгезированных клеток, а на более поздних стадиях развития на поверхности клеток формировались мощные покровы.

Нами предложена методика исследования процессов адгезии бактерий на эритроцитах крупного рогатого скота. Показано, что клетки патогенных штаммов Б.аигеш адгезировались к поверхностям мембраны эритроцитов, в то время как непатогенные штаммы не обладали этим свойством.

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что образования покровов на поверхностях колоний патогенных и потенциально-патогенных бактерий отражают их способность адгезироваться на объектах окружающей среды.

2.8. Внутрипопуляционные антагонистические взаимоотношения бактерий

Одним из перспективных подходов к решению проблем популяционной стабильности в естественных микробиоценозах является использование антагонистов продуцентов биологически активных веществ (БАВ) - регуляторов естественных микробиоценозов. Для этой цели необходимо изучение внутрипопуляционных антагонистических взаимоотношений бактерий, в условиях, максимально приближённых к природным.

Существующие методы определения антагонистической активности дают лишь визуальные сведения и не позволяют получать количественную оценку гибели клеток тест-культур. Кроме того, видимая задержка роста необъективно свидетельствует об ингибирующем эффекте.

Изучение антагонистической активности бактерий продуцентов БАВ на тест-культуры патогенных и потенциально-патогенных бактерий проведено на популяционном уровне с применением методов компьютерной морфоденситометрии и сканирующей электронной микроскопии. Суть методики состоит в использовании мембранных фильтров, помещенных на поверхность плотной питательной среды. Каплю полужидкого агара, содержащую определенную концентрацию бактериальных клеток, наносили на мембранный фильтр, инкубировали при 37°С в течение 1-2 сут, после чего его извлекали вместе с выросшей культурой и на его место укладывали новый с последующим нанесением суспензии клеток тест-ыггамма в определенной концентрации. После инкубации контрольных и опытных образцов рост культур на поверхности мембранного фильтра в виде пятна различной величины и плотности регистрировали морфоденситометрическим методом и изучали морфологию популяции клеток в СЭМ.

Воздействие БАВ на тест-культуры вызывало в разной степени угнетение роста клеток. Для объективной количественной оценки этого действия применен метод, улавливающий по величине и оптической плотности выросшей культуры степень ингибирующего эффекта антагониста (И.Б.Павлова, И.М.Манохина, Т.Г.Путина и др., 1994).

В качестве продуцентов БАВ использовали культуру В.ИсЬешйэгпш и препарат «Колир», созданный на основе высокоактивного штамма Е.соН -продуцента микроцинов. Проведенные исследования показали, что действие БАВ, вырабатываемых В.ИсЬетйэгпш, вызывает снижение численности клеток в популяции Б-аигеив до 83%. Визуально это проявлялось значительным; уменьшением величины и плотности регистрируемого компьютером пятна в зоне роста культуры тест-штамма. Однако, при благоприятном режиме культивирования такой культуры наблюдали реверсию клеток стафилококка в пределах 70%.

Аналогичные эксперименты, проведенные с препаратом «Колир» показали, что численность клеток в популяциях некоторых энтеробактерий снижалась до 68%, а реверсия составляла лишь 17%.

Таким образом, предложенный нами метод изучения микробного антагонизма позволил впервые использовать компьютерную морфоденситометрию для количественной оценки ингибирующего эффекта при микробном антагонизме. Это расширяет познание о действии БАВ и показывает, что визуальное отсутствие роста бактерий ещё не свидетельствует о результатах бактерицидного действия, поскольку даёт возможность установить фактическое наличие этого роста в виде L-трансформации микроорганизмов с количественной оценкой её величины и стабильности.

Специфичность действия БАВ на определенные структуры бактериальных клеток в популяции позволяет осуществлять скрининг наиболее перспективных штаммов антагонистов.

Особый интерес представило изучение in vitro процессов внутрипопуляционного взаимодействия Z.ramigera с тест-штаммами патогенных бактерий. Разработана методика выращивания монослойных культур Z.ramigera на покровных стеклах, помещенных в жидкую питательную среду (CY). В работе использованы тест-штаммы патогенных бактерий - E.coli, S.typhimurium, S.aureus. Время контакта 1-3 ч. Изучение препаратов в СЭМ выявило адгезию клеток тест-штаммов бактерий к поверхности монослоя клеток Z.ramigera. Показано, что клетки имеют межклеточный матрикс в виде полупрозрачного покрова, в который погружены клетки патогенных бактерий (рис. 12).

Рис. 12. Монослойная культура Х.гатщега. Видна адгезия клеток стафилококка в различные сроки взаимодействия: (А) -1 час; (Б) - 3 часа. Сканограммы, х 25000, х 10000.

Экспериментально установлено, что в результате взаимодействия культуры г.гаш1§ега с тест-штаммами патогенных бактерий численность последних снижалась на 3-4 порядка. Показано, что часть популяции клеток тест-культур бактерий после такого взаимодействия находилась в стадии гетероморфизма с различными проявлениями Ь-трансформации.

В результате проведенных исследований установлено, что в процессе деконтаминации сточных вод активное участие принимают флокулирующие бактерии Z.тamigGтa, обладающие уникальной способностью продуцировать вязкий водонерастворимый матрикс полисахаридной природы, являющийся своеобразной «Ловушкой» для сторонних бактерий. Адгезия бактерий к поверхности матрикса нарушает нормальный процесс их деления. При этом часть популяции гибнет, а у другой инициируется атипичная форма деления почкованием с образованием клеток, свойственных Ь-трансформации.

Такой процесс взаимодействия флокулирующих бактерий со сторонними бактериями можно рассматривать как проявление последней стадии антагонизма - хищничества, свойственного всем другим видам микроорганизмов - обитателей водных экосистем.

В заключение можно сказать, что воздействие БАВ антагонистов вызывает у изученных патогенных и потенциально-патогенных бактерий закономерные изменения в популяции клеток в виде перехода их в состояние гетероморфизма с различной глубиной Ь-трансформации и образованием Ь-форм, реверсия которых определяется условиями их существования.

2.9. Структурно-функциональные изменения бактериальных клеток после воздействия дезинфицирующих средств

За последние 25-30 лет создано целое направление в современной микробиологии - цитология бактерий. Основой этих исследований явилось изучение ультраструктурной организации бактериальных клеток. Было показано, что бактерии имеют сложно устроенные поверхностные структуры, играющие важную роль в защите от неблагоприятных воздействий среды обитания (А.А.Авакян и др., 1972).

Начиная с 1973 г. во ВНИИВСГЭ было продолжено изучение ультраструктуры . потенциально-патогенных, патогенных и других бактерий. Данные об ультраструктурной организации изученных бактерий позволили перейти к следующему разделу современной биологии, изучающему структурно-функциональные изменения в отдельных органоидах бактериальной клетки при воздействии различных дезинфицирующих средств.

В основу исследований по дезинфекционной активности препаратов был положен метод изучения выживаемости бактерий (А.В.Куликовский, 1976-79), а также разработанная нами методика определения общего микробного числа методом серийных разведений в полужидком агаре с последующим высевом капли агара на мембранные фильтры.

Для изучения действия дезинфицирующих средств в качестве тест-штаммов использовали типичных представителей грамотрицательных бактерий E.coli и грамположительных S.aureus. Кроме того, нами было изучено воздействие препаратов на Mycobacterium bovis.

Из группы окислителей исследовали: перекись водорода, "Дезоксон-1", гипохлорит натрия.

Бактериологическими исследованиями установлено, что перекись водорода в концентрациях 0,08-0,01% вызывала гибель 99% клеток E.coli и S.aureus. Изучение структурно-функциональных изменений бактериальных клеток показало, что перекись водорода вызывает разрушение поверхностных структур: клеточной , стенки, цитоплазматической мембраны, инактивацию дыхательных ферментов, разрушение рибосом. При контакте перекиси водорода с клеткой выделяется активированный кислород, который, взаимодействуя с липидами и липопротеидами, индуцирует образование токсических перекисей, вызывающих окисление и разрушение структуры мембран и белков клетки.

В препарате "Дезоксон-1" (композиция надуксусной кислоты и перекись водорода) действующим началом является перекись водорода. Действие бактерицидных концентраций на клетки Е.соИ и Б.аигеш в дозе 0,005% вызывает увеличение клеток в объёме, что связано с нарушением проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Выявлено разрушение цитоплазмы и нуклеоида. При контакте бактериальной клетки с дезинфектантом выделяется активированный кислород, вызывающий окисление мембран и белков клетки, разрушению подвергаются дыхательные ферменты и ДНК клеток.

Гипохлорит 'натрия также относится к группе окислителей. Изучение ультраструктурных изменений в клетках Е.соН и Б.аигеиз при воздействии бактерицидных концентраций препарата показало, что повреждаются поверхностные структуры: клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана, разрушению подвергается нуклеоид и цитоплазма клеток.

Были изучены препараты глутаровый альдегид и «Дезинфектол», основой которого является формальдегид. Изучение бактерицидной активности глутарового альдегида показало его более высокую эффективность, низкие концентрации препарата (0,001%) вызывали гибель 99% клеток Е.соН и Б.аигеиз. Препараты этого класса оказывали фиксирующее действие на клетки благодаря высокой реакционной способности по отношению к белкам и ДНК без видимого изменения в ультраструктуре клеток. >

В последние годы ведутся активные исследования по изысканию новых антибактериальных препаратов, относящихся к группе катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ). Проведено структурно-функциональное изучение клеток и сферопластов Е.соН при воздействии катамина АБ. Изучение ультратонких срезов сферопластов Е.соН и целых клеток выявило нарушения в структуре цитоплазматической мембраны, а также рибосомального аппарата клеток. Установлено, что характер возникающих нарушений зависит от рН среды, времени контакта катамина АБ, низкие концентрации которого (0,0001-0,0002%) вызывают нарушение цитоплазматической мембраны Е.соН, в результате чего происходит утечка из клеток жизненно важных низкомолекулярных веществ.

Показана более высокая активность катамина АБ в отношении грамположительных бактерий. Исследование ультраструктуры клеток З.аигеш после действия бактерицидными концентрациями катамина АБ выявило утолщение клеточной стенки, нарушение проницаемости и структуры цитоплазматической мембраны, что приводило к выходу содержимого из клеток.

Бактерицидный эффект катамина АБ на клетки Е.соН связан с расслоением и нарушением целостности клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, что приводило к выходу содержимого из клеток. Разрушению подвергались рибосомы.

Изучены препараты «Глак» и «Средство для дезинфекции». Это высоко эффективные моюще-дезинфицирующие средства, представляющие собой композицию глутарового альдегида и катионного ПАВ (катамин АБ).

Изучены структурно-функциональные изменения клеток Е.соН, Б-аигеш и М.ЫлЛв после воздействия этими препаратами.

Выявлены нарушения поверхностных структур клеток, главным образом цитоплазматической мембраны, что обусловливает выход из клеток жизненно важных метаболитов. Разрушению подвергается цитоплазма и нуклеоид. Высокое дезинфицирующее действие препаратов обусловлено эффектом синергизма глутарового альдегида и катионного ПАВ. Композиции таких препаратов позволяют снизить концентрации составляющих их компонентов в 3-4 раза.

Таким образом, исследование структурно-функциональных изменений бактериальных клеток, базирующееся на данных бактерицидного эффекта, способствует целенаправленному созданию новых препаратов, а также научному обоснованию к их применению.

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование колоний различных видов бактерий с использованием сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, а также с применением разработанных методических подходов и методик, позволили теоретически обосновать закономерности их строения и существования в условиях естественного развития и при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды. Это явилось развитием нового направления в изучении бактерий на популядионном уровне.

Установлены общие закономерности развития и строения популяции различных видов бактерий, для которых характерно:

- существование в виде колоний или микроколоний как ограниченной части популяции со сложным строением, развитие которой определяется условиями среды обитания;

- в колониях и микроколониях бактерии существуют во взаимосвязи за счет межклеточного матрикса, от степени развития которого зависит образование покровов на их поверхностях;

- покровы в колониях и микроколониях являются морфологической особенностью и представляют собой внеклеточные образования. Их роль в развитии и существовании бактерий полифункциональна;

- для популяций патогенных и потенциально-патогенных бактерий закономерно проявление гетероморфизма с различной глубиной Ь-трансформации, образованием Ь-форм и реверсией клеток в исходное состояние как при естественных условиях развития, так и при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды;

- независимо от среды обитания бактерии способны формировать новые микроколонии в результате реверсии Ь-форм в исходное состояние, что обеспечивает дополнительную возможность сохранения вида в условиях, неблагоприятных для существования бактерий.

Практическим выходом с использованием полученных данных было создание препарата «Средство для дезинфекции», действие которого основано на эффекте синергизма глутарового альдегида с катионным ПАВ (защищено а.с.).

Разработаны препараты «Инахол» для профилактики и лечения диарейных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных (защищен двумя патентами). Действие препаратов основано на снижении численности энтеропатогенных бактерий за счет антиадгезивных свойств растворов медицинской желчи.

Важное значение имеют исследования сапрофитных бактерий, выделенных из сооружений биологической очистки сточных вод животноводческих комплексов.

В процессе работы были выделены и идентифицированы культуры г.га1ш§ега с различной биофлокулирующей активностью. Штамм 19-а Z.ramigera впервые депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН. Для научных и практических целей предложена методика выращивания клеток г.гап^ега в монослойной культуре на стеклах, помещенных в жидкую питательную среду. Методика утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ и может использоваться для отбора штаммов с высокой биофлокулирующей активностью.

Способность г.гап^ега снижать численность патогенных бактерий на 3-4 порядка установлена нами как в эксперименте, так и в период технологического цикла работы очистных сооружений. Полученные данные вошли в «Технологию формирования доминирующих микробных сообществ активного ила при аэробной биологической очистке сточных вод в условиях продленной аэрации», утвержденную Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ (1998).

Для, отбора перспективных штаммов бактерий антагонистов разработана методика, основанная на применении мембранных фильтров с различным диаметром пор, позволяющая производить оценку Ь-трансформации и способности Ь-форм к реверсии в исходное состояние. Анализ данных с использованием компьютерной морфоденситометрии позволяет дать количественно-качественную оценку ингибирующему эффекту БАВ на популяцию патогенных и потенциально-патогенных бактерий.

Указанные методики могут широко применяться для исследования колоний бактерий как в условиях их естественного развития, так и при воздействии физичеекими (озон, УФИ, радиация) и химическими факторами (дезинфицирующие, лекарственные и др. препараты).

Таким образом, представленная диссертационная работа определяет развитие теоретического направления в еще мало изученной области -экологии бактерий, что расширяет наше представление о поведении их в окружающей среде и способствует разработке новых подходов к практическому использованию полученных результатов.

IV. ВЫВОДЫ

1. Разработан новый подход к исследованию бактерий с использованием методик, сохраняющих естественную архитектонику популяций бактерий. Методами сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии установлены общие закономерности строения популяций различных видов бактерий в процессе их существования в условиях естественного развития и при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды.

2. Показано, что в колониях различных видов бактерий клетки находятся во взаимосвязи, осуществляемой за счет экзопродуктов различной природы, морфологическим проявлением которых является межклеточный матрикс. Степень развития матрикса определяет образование и морфологические особенности покровов на поверхности колоний.

3. Установлено, что грамотрицательные бактерии в процессе роста формируют на поверхности колоний покровы однотипного строения, являющиеся внеклеточным образованием. Исследованием ультратонких срезов единичных колоний в межклеточном пространстве выявлены фибриллярные структуры полисахаридаой природы, являющиеся элементами покровов.

Особенностью колоний грамположительных бактерий является наличие покровов на поверхности со специфическим строением для каждого вида.

4. Методом сканирующей и трансмиссионной микроскопии показано, что различные виды микобактерий: М.Ьоу1б, М.аушт, М.СоЛшШт на поверхностях колоний формируют массивные покровы, различающиеся по плотности, форме и строению. Специфичность липидной природы покровов микобактерий доказана обработкой катамином АБ (ПАВ), который вызывает частичное или полное удаление покровов с поверхностей клеток в колониях.

5. Обнаружено, что в жидких питательных средах бактерии развиваются и существуют главным образом в микроколониях, со всех сторон окруженных покровами, которые имеют общие закономерности строения с изученными на плотных питательных средах.

6. Показано, что покровы на поверхностях колоний и микроколоний выполняют полифункциональную роль: осуществляют межклеточные связи, процессы адгезии и колонизации, участвуют в защите бактерий от воздействия абиотических и биотических факторов окружающей среды.

7. Установлено, что гетероморфизм присущ естественному циклу развития бактериальной популяции. Он имеет общие закономерности морфологических проявлений у различных видов бактерий независимо от среды их обитания и может рассматриваться как один из этапов Ь-трансформации клеток в популяции. Цикл развития бактерий начинается гетероморфизмом с последующей Ь-трансформацйей и заканчивается реверсией клеток в исходное состояние. Ь-трансформация бактерий представляет естественную закономерную форму развития популяции, скорость и степень проявления которой определяются условиями среды обитания.

8. Впервые показано, что развитие популяции бактерий в водной среде в условиях длительного голодания, наряду с гибелью части популяции, сопровождается Ь-трансформациёй с образованием Ь-форм. Такие клетки обладают сниженной патогенностью и измененными биологическими свойствами. При благоприятных условиях они могут реверсировать в исходную форму и в определенной степени сохранять свой патогенный потенциал.

9. Впервые у изученных патогенных и потенциально-патогенных бактерий в процессе естественного роста выявлено участие элементов покрова в образовании нитевидных структур, внутри и на поверхности которых определяются Ь-формы, способные к реверсии с образованием новых микроколоний. Образование новых микроколоний обеспечивает дополнительную возможность сохранения вида в условиях, неблагоприятных для существования бактерий.

10. Показано, что патогенные и потенциально-патогенные бактерии при благоприятных условиях способны к адгезии с последующей колонизацией поверхностей различных объектов окружающей среды. Колонизация сопровождается образованием покровов на поверхностях колоний.

11. Показано, что сапрофитные бактерии Х.гат'щега осуществляют процессы естественного очищения сточных вод и пресноводных водоемов за счет уникальной способности продуцировать матрикс полисахаридной природы, служащий своеобразной «ловушкой» для патогенных и потенциально-патогенных бактерий. Экспериментально показано, что взаимодействие культуры Х.тат'щега. с другими бактериями снижает численность последних на 3-4 порядка.

12. Разработаны препараты «Инахол» для профилактики и лечения диарейных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. Действие препаратов основано на антиадгезивных свойствах растворов медицинской желчи, способных разрушать покровы и межклеточные связи в колониях энтеропатогенных бактерий.

13. Разработан препарат «Средство для дезинфекции», основанный на эффекте синергизма глутарового альдегида с катионным ПАВ. Методом ультраструктурного анализа показано, что действие глутарового альдегида усиливается катионным ПАВ, что позволило снизить концентрацию составляющих компонентов за счет эффекта синергизма в 3-4 раза.

14. Разработана методика, позволяющая прижизненно изучать архитектонику колоний в сканирующем электронном микроскопе, а также производить оценку спепени Ь-трансформации популяций и реверсии клеток в исходную форму при естественном развитии колоний и воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды. Основой метода служит использование двойных мембранных фильтров с различным диаметром пор, помещенных на поверхность плотной питательной среды.

15. Разработан метод количественно-качественной оценки действия бактерий антагонистов - продуцентов БАВ на патогенные и потенциально-патогенные бактерии, основанный на использовании компьютерной морфоденситометрии и СЭМ. Данный метод позволяет производить отбор перспективных штаммов бактерий -антагонистов.

V. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

- "Методические указания по ускоренному контролю качества дезинфекции воздуха животноводческих помещений и индикации микроорганизмов в аэрозоле" (утверждены ГУВ Госагропрома СССР 19.11.1987).

- "Технология формирования доминирующих микробных сообществ активного ила при аэробной биологической очистке сточных вод в условиях продлённой аэрации" (утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ, 1998).

- "Методические рекомендации по определению степени флокуляции микробиоценоза активного ила в аэротенках" (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 7.05.1999).

- "Методические рекомендации по подготовке препаратов для изучения степени адгезии микроорганизмов с клетками животных в световом и сканирующем электронном микроскопе", (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 16.01.1999).

- A.c. 713000 препарат для дезинфекции ульев и пчеловодческого инвентаря «Дезинфектол» (соавт. А.А.Поляков и др., СССР). Приоритет 12.07.1978.

- A.c. 944194 препарат "Средство для дезинфекции" (соавт. А.А.Поляков и др., СССР). Приоритет 13.03.1980.

- A.c. 303219. (соавт. В.СЛрных и др., СССР). Приоритет 10.09.1987.

A.c. 1673119 Препарат для лечения неспецифической бронхопневмонии "Бронхопневмозоль"(соавт. М.А.Симецкий и др., СССР). Приоритет 7.03.1989.

- Патент 1617701 "Способ лечения гастроэнтеритов молодняка сельскохозяйственных животных" (соавт. А.А.Куликовский и др., РФ). Приоритет 31.05.1989.

- Патент 1617702 "Способ профилактики гастроэнтеритов молодняка сельскохозяйственных животных" (соавт. А.А.Куликовский и др.,РФ). Приоритет 31.05.1989.

Материалы исследований использованы в руководстве к практическим занятиям по микробиологии для студентов МГУ; «Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных» служит учебным пособием на кафедрах микробиологии ветеринарных и медицинских вузов.

Депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН штамм 19-а сапрофитных бактерий активного ила Z.ramigera (регистрационный номер ВКМ В-2132Д).

За участие в работе по отдельным направлениям приношу благодарность сотрудникам лабораторий санитарной микробиологии, аэрозольных форм ветеринарных препаратов, производственной санитарии и охраны окружающей среды ВНИиТИБП.

Участие других соискателей отражено в списке опубликованных работ.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Авакян A.A., Павлова И.Б., Кац Л.Н., Высоцкий В.В. Исследование субмикроскопической структуры грамотрицательных бактерий // Тезисы доклада на Международной конференции по электронной микроскопии. - Прага. - 1967. - С.9.

2. Поляков A.A., Куликовский A.B., Павлова И.Б. Изучение тонкой структуры под действием дезинфицирующих средств // Ветеринария. -1969. - Xsl0, - С.28-35.

3. Поляков A.A., Авакян A.A., Куликовский A.B., Павлова И.Б. Современное представление о тонкой структуре бактериальной клетки // Труды ВНИИВС. - 1970, - № 37. - С. 15-22.

4. Авакян A.A., Кац Л.Н., Павлова И.Б. Атлас анатомии бактерий, патогенных для человека и животных. Монография // М.: Медицина, 1972,181 с.

5. Поляков A.A., Павлова И.Б., Шуваева О.Н., Кононенко Ю.В., Масленников Ю.А. Изучение действия надуксусной кислоты на ультраструктуру кишечной палочки и золотистого стафилококка // Труды ВНИИВС.-М.: 1974,- Т. 50. - С.97-103.

6. Павлова И.Б., Куликовский А.В. Изучение действия нового дезинфицирующего средства надуксусной кислоты на ультраструктуру микроорганизмов // Тезисы доклада на Всесоюзной научно-производственной конференции "Вет.-сан. мероприятия на животноводческих комплексах и хозяйствах промышленного типа". М.: 1977.-С.15-16.

7. Павлова И.Б., Куликовский А.В. Субмикроскопическое изучение бактерий и спор при воздействии надуксусной кислоты и некоторые аспекты механизма действия препарата // ЖМЭИ. - 1978.- № 1. - С. 37-41.

8. Павлова И.Б., Досанов К.Ш. Изучение кинетики гибели и ультраструктуры бактерий после воздействия препарата ЧАС П Тезисы докладаЛ В кн.:Труды XXI Всемирного ветеринарного конгресса. М.: 1979, - Т.З. - С.18.

9. Павлова И.Б., Досанов К.Ш.Ультраструктура бактерий при воздействии катионных поверхностно-активных веществ // Тезисы доклада на Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. Таллинн: 1979. - С.2.

10. Поляков А.А., Дудницкий И.А., Андрюнин Ю.И., Шуваева О.Н., Павлова И.Б., Куликовский А.В. Дезоксон-1 - препарат для дезинфекции животноводческих объектов // Ветеринария. - 1980. - № 1> С.15-19.

11. Поляков В.А., Павлова И.Б., Шуваева О.Н., Суакисян А.Н. Изучение действия препарата на основе глутаральдегида на ультраструктуру стафилококка // Труды ВНИИВС. -М.: 1980. - Т. - С.3-6.

12. Рудзит Э.А., Ермаченко В.А., Нещадим Г.Н., Куликова Д.А., Джемухадзе Г.К., Павлова И.Б., Зинченко Т.А., Тихонова Г.В., Милейковская Е.И., Шейко Т.В., Лукоянова М.А., Островский Д.Н. Сравнение антимикробных свойств катамина АБ и роккала и их действие на мембранные системы бактерий // Биохимия. - 1982. - № 5. -С. 847-853.'

13. Павлова И.Б., Шуваева О.Н. Ультраструктура бактериальной клетки после воздействия формальдегидсодержащего препарата // Труды ВНИИВС.- М.: 1982. - С. 64-68.

14. Чернявская М.А., Павлова И.Б. Изучение структурно-функциональных изменений в клетках кишечной палочки под воздействием катамина АБ и формальдегида // Тезисы докладов на Конференции по дезинфекции и стерилизации. - Эрфурт: 1983.-С.11.

15. Павлова И.Б., Чернявская М.А. Структурно-функциональное изучение клеток и сферопластов эшерихий при воздействии катионного ПАВ//ЖМЭИ. - 1983. - № 2. - С.62-65.

16. Самойленко И.И., Васильева Е.И., Павлова И.Б., Туманян М.А. Исследование механизмов бактерицидного действия перекиси водорода //ЖМЭИ. - 1983. - № 12. - С. 30-33.

17. Григорян А.Г., Павлова И.Б. Изучение структуры возбудителя аскосфероза пчел после воздействия дезинфицирующих средств // Доклады ВАСХНИЛ, - 1984. - 2. - С.35-37.

18. Павлова И.Б., Самойленко И.И. Исследование механизмов инактивации бактерий при воздействии катионного поверхностно-активного вещества // Антибиотики и медицинская биотехнология. - 1985. -№3,-С. 181-185.

19. Симецкий М.А., Чупахин В.И., Павлова И.Б. Препарат ГЛАК-Ц для одновременной дезинфекции и дезинсекции // Ветеринария.- 1986. -11.-С. 19-22.

20. Павлова И.Б., Гежес Л.В., Коган Б.П., Околелов В.В. Ультраструктура микробактерий после воздействия композиции ГА и ПАВ//Сборник трудовСиб.НИИ АН СССР.-1986.-С. 15-17.

21. Луганский С.Н., Павлова И.Б. Выживаемость возбудителя аскосфероза пчел в цветочной пыльце и перге // Ветеринария, 1988. - № 12. -С. 25-27.

22. Куликовский A.B., Павлова И.Б., Джентемирова K.M., Дроздова

Т.А. Экология некоторых малоизученных энтеропатогенных бактерий //Тезисы докладов на Международной конференции. - Брно: 1989. - №5. -С. 90-99.

23. Путина Т.Г., Павлова И. Б. Исследование поверхности колоний некоторых видов микобактерий в сканирующем электронном микроскопе // ЖМЭИ. - 1989. - № 5. - C.3-S.

24. Куликовский A.B., Павлова И.Б., Айвазян М.А., Дроздова Т.Д. Поведение микробной популяции во внешней среде //Вестник сельскохозяйственной науки. - 1990. - № 12. - С. 101-104.

25. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Джентемирова Е.М., Дроздова Т.Д. Экология бактерий в популяции //Вестник сельскохозяйственной науки. - 1990.-№ 2,-С.75-78.

26. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В., Джентемирова Е.М., Дроздова Т.Д. Электронно-микроскопическое исследование бактерий в колониях. Морфология колоний бактерий // ЖМЭИ. - 1990. - № 9. - С.15-20.

27. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В., Джентемирова Е.М., Дроздова Т.Д. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Гетероморфизм бактерий в процессе естественного развития популяции // ЖМЭИ. - 1990. - № 12.- С. 12-15.

28. Куликовский A.B., Павлова И.Б., Джентемирова Е.М., Айвазян М.А. Изучение поведения иерсиний и грибов Candida в популяции на объектах окружающей среды с помощью сканирующей электронной микроскопии // Тезисы докладов III Всесоюзной конференции по эпизоотии. -Новосибирск: 24-26 сентября 1991. - С.371-373.

29. Koulikovskii A.V., Pavlova I.B., Kasiyanenko A. I. Ecology of some foodborne pathogens in the environment // 3 rd World Congress Foodborne Infections and Intoxications. - Berlin, Germany, 1992. - p.462-466.

30. Куликовский- A.B., Павлова И.Б. Изменение адгезивной способности микроорганизмов // Ветеринария. - 1993. - № 7. - С.22 - 24.

31. Павлова И.Б., Манохина И.М., Путина Т.Г., Жукоцкий A.B., Коган Э.М. Применение компьютерной телевизионной морфоден-ситометрии в изучении микробного антагонизма // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. - № 7. - С.63-66.

32. Банникова Д.А., Павлова И.Б. Изучение в сканирующем электронном микроскопе морфологии популяций сальмонелл в водной среде // В сб.:"Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных". - Воронеж: 1997. - С. 50-52.

33. Павлова И.Б., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование патогенных бактерий на объектах окружающей среды //ЖМЭИ. - 1998. - №5. - С.13-17.

34. Ленченко Е.М., Куликовский A.B., Павлова И.Б. Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики // Монография. - М.: МГУБП, 1998. - 127 с.

35. Павлова И.Б., Банникова Д.А. Роль флокулирующих бактерий Zoogloea ramigera в снижении численности патогенных микроорганизмов в сточных водах (электронно-микроскопическое исследование) // Тезисы докладов. В сб. «Вода: экология и технология»,М., 1998. - С. 437.

36. Павлова И.Б., Ленченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование антагонизма бактерий // Ветеринария, 1998. - № 4. - С. 2228.

37. Денисова Е.А., Павлова И.Б., Светличкин В.В. Действие антибиотиков на популяции клеток. Е. coli и Staph, aureus // Тезисы докладов Всероссийской научно-исследовательской конференции, посвящённой 75-летию со дня рождения Н.Ф. Чуклова. 1998, Щёлково, С. 52-53. ,

38. Павлова И.Б. Электронная микроскопия колоний бактерий на объектах внешней среды // Тезисы докладов. В сб.: "Проблемы вет.санитарии, гигиены и экологии (дезинфекция, дезинсекция, дератизация)".-М.: 1999.-С. 163.

39. Кононенко А.Б., Бритова С.В., Павлова И.Б. Биологические особенности популяции патогенных энтеробактерий при воздействии биотических и абиотических факторов // В сб.: «Проблемы вет.санитарии, гигиены и экологии», М.: 1999. -С. 160-161.

40. Банникова Д. А., Павлова И.Б., Денисов A.A. Роль доминирующих микробных сообществ активного ила в очистке сточных вод // В сб.: «Проблемы вет.санитарии, гигиены и экологии», М.: 1999. -С. 126-127.

3«K.iar* Тир. /JC. Тип. изд-ва МАИ