Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Факторы выживания популяций сальмонелл в водной среде и их взаимоотношения с некоторыми гидробионтами

На правах рукописи

ЗУЕВ ВЯЧЕСЛАВ СЕРГЕЕВИЧ

ФАКТОРЫ ВЫЖИВАНИЯ ПОПУЛЯЦИЙ САЛЬМОНЕЛЛ В ВОДНОЙ СРЕДЕ И ИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ С НЕКОТОРЫМИ ГИДРОБИОНТАМИ (ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

16.00.06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гагаены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

доктор биологических наук, профессор Павлова Инна Борисовна (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

доктор ветеринарных наук Демидова Лидия Дмитриевна (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Дьяконов Лев Петрович (ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко)

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)

Защита состоится «_»_2004 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г.Москва, Звенигородское ш., д.5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.С. Майстренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ухудшение эпидемиологической обстановки в России по кишечным инфекциям в последние годы указывает на необходимость усиления контроля качества водных источников.

Эффективность санитарно-эпидемиологического контроля водных объектов должна базироваться не только на соблюдении существующих микробиологических критериев оценки качества воды, изложенных в документах санитарного законодательства, но и на фундаментальных исследованиях, способствующих совершенствованию индикации патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в водных экосистемах. Особенно это важно в свете концепции о возможности сапрофитического существования в окружающей среде микроорганизмов, патогенных для человека и животных. Данная концепция предполагает изучение поведения микроорганизмов на популяционном уровне, то есть в сообществах. Это является основополагающим подходом при изучении экологии бактерий во внешней среде (Павлова И.Б., 1999).

Экология бактерий является одним из фундаментальных разделов биологии, изучающих взаимодействие микроорганизмов с окружающей средой. Водные экосистемы по богатству и разнообразию микроорганизмов патогенных и потенциально-патогенных для человека и животных не уступают почвенным и наземным. Известно, что микрофлора озерной и прудовой воды представлена всеми основными родами энтеробактерий (Пушкарева В.И., Троицкая В.В., 1994)2, однако, наиболее устойчивыми из них являются сальмонеллы (Рахманин Ю.А. и др., 2002)3. Факторы, способствующие длительной персистенции сальмонелл в водных экосистемах мало изучены. По данным литературы известно, что выживаемость сальмонелл в воде сопровождается изменением их биологических свойств.

В этой связи актуальным является изучение факторов выживания популяций сальмонелл в водной среде и путей их циркуляции, связанных с различными гидробионтами.

Симбиотическое взаимодействие патогенных микроорганизмов с представителями биоценоза различных естественных экосистем позволяет им выживать в среде обитания в межэпидемические периоды (Литвин В.Ю. с соавт, 1997)4.

Павлова И.Б. Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде (электронно-микроскопическое исследование). Дисс. в виде научи, доклада на соиск. уч.ст.д б.н. - М., 1999; 2 Пушкарева В.И., Троицкая В.В. Спонтанная зараженность некоторых гидробионтов потенциально-патогенными бактериями// Патогенные бактерии в сообществах. - М., 1994.-С. 70-74; 9 Рахманин Ю.А. и др. Научное обоснование бактериологических критериев оценки качества воды поверхностных источников централизованного питьевого водоснабжения. // Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиене окружающей среды. - М.: НИИЭЧиГОС им. А.Н. Сысина.-2002.-С. 140-161;

4 Литвин В.Ю. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий - М ФАРМАРУС ПРИНТ, 1997;

РОС НАЦИОНАЛЬНА* ] БИБЛИОТЕКА {

Цель работы. Изучить факторы выживания популяций сальмонелл, способствующие их длительной персистенции в водных экосистемах.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методические подходы к исследованию существования популяции S.typhimurium в воде in vitro;

2. Разработать методические подходы к исследованию взаимоотношений популяции S.typhimurium в воде с некоторыми гидробионтами (водорослями, инфузориями, червями и дафниями) in vitro;

3. Изучить морфологические свойства популяции S.typhimurium из проб воды in vitro с использованием методов сканирующей электронной микроскопии при различных температурных режимах;

4. Провести исследование биохимических свойств S.typhimurium из проб воды in vitro при различных температурных режимах;

5. Провести сравнительный анализ биологических свойств музейной культуры S.typhimurium из проб воды in vitro и сальмонелл, выделенных из проб воды поверхностных водоемов;

6. Изучить морфологические свойства популяции S.typhimurium при их взаимоотношении с гидробионтами in vitro.

Научная новизна. Разработаны методические подходы к исследованию биологических свойств популяции S.typhimurium в воде как изолированно, так и -при взаимодействии с водорослями, инфузориями, червями, дафниями с применением методов сканирующей электронной микроскопии и биохимической идентификации в микротестсистеме.

Экспериментальными исследованиями показано, что основным фактором выживания популяций сальмонелл в водной среде является популяционная изменчивость, обеспечивающая, им жизнеспособность и устойчивость к воздействию абиотических и биотических факторов в условиях их сапрофитического существования в водной среде.

Популяционная изменчивость сальмонелл в водной среде независимо от влияния абиотических факторов обеспечивает им персистенцию как в микроколониях, закрытых покровами, так и в виде клеток сферопластного типа и L-форм, объединенных общими чехлами, что способствует защите клеток от воздействия абиотических факторов среды обитания.

Установлена корреляция между морфологическими изменениями клеток сальмонелл и изменением их биохимических свойств по ряду ферментов.

Другим фактором выживания популяций сальмонелл в водной среде является их способность к симбиотическим взаимоотношениям с одноклеточными водорослями, инфузориями, червями и дафниями, о чем свидетельствовали процессы адгезии и колонизации бактерий к поверхностям этих гидробионтов. Показана способность клеток сальмонелл к размножению на хитиновом покрове дафний при низких температурах, что указывает на возможность длительной персистенции сальмонелл на поверхностях низших ракообразных.

Практическая значимость работы. Разработана методика подготовки препаратов для сканирующей электронной микроскопии, позволяющая изучать популяции бактерий при их взаимоотношениях с гидробионтами.

На основании результатов исследований разработаны и утверждены «Методические рекомендации по изучению морфологических и ферментативных свойств популяций сальмонелл, выделенных из воды», утвержденные РАСХН 06.04.2004. Данная методика предназначена для совершенствования методов идентификации сальмонелл при выделении их из проб воды различных водных источников.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 23-25 сентября, 2002);

II Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2003);

Заседании лаборатории инфекционных и паразитарных болезней научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды РАМН им. А.Н. Сысина (НИИЭЧиГОС РАМН).

Публикации. Результаты исследований отражены в 6 научных работах.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы.

Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, содержит таблицу и 39 рисунков, включающих схемы, фотографии и сканограммы. Список литературы включает 150 работ отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования. Экспериментальная работа по теме диссертации проводилась в 2001-2004 гг. в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ. Работа является частью темы в программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ на 2001-2005 гг., задание 05, этап 05.03.

В опытах использовали штаммы Salmonella typhimurium №1951, Salmonella dublin №2187, полученные из коллекции лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ, а также культуру сальмонелл, выделенную из проб р. Ока в весенний период года.

Для проведения экспериментальных исследований по моделированию существования S.typhimurium в воде in vitro использовали автоклавированную водопроводную воду, соответствующую критериям санитарного законодательства по контролю качества питьевой воды централизованного водоснабжения5, а также гигиеническим требованиям к охране поверхностных вод6. Экспериментальные исследования проводили по схеме, представленной на рис.1.

S Санитарное законодательство. Санитарные правила и нормы. СанПин 2.1.4.559-96;

Санитарное законодательство. Санитарные правила и нормы. СанПин 2.1.S.980-00;

Выделение культуры сальмонелл проводили из 7 проб воды р.Ока с использованием методов накопления культуры в средах обогащения с последующим пересевом их на плотные селективные среды согласно «Методическим указаниям по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов» .

Для получения колоний сальмонелл в S-форме осуществляли пересев культуры до 7-8 раз с жидких обогатительных сред (селенитовый бульон и магниевая среда) на селективную среду висмут-сульфит агар (ВСА). Экспериментальные исследования проводили по схеме, представленной на рис.2.

С целью изучения морфологических особенностей взаимоотношений популяций S.typhimurium с водорослями, инфузориями, червями и дафниями в воде in vitro, использовали аксеничные культуры гидробионтов, полученные из лабораторий ВНИИВСГЭ, МГУ и НИИ рыбхоза и океанографии. Экспериментальные исследования проводили по схеме, представленной на рис.3.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Для изучения морфологических особенностей популяции сальмонелл в воде проводили исследования с использованием методов сканирующей электронной микроскопии, дающие возможность изучать культуру, не нарушая естественной архитектоники популяции. С этой целью исследуемую культуру сальмонелл в

7 Методические указания по санитарно-микробиологическому анализу волы поверхностных водоемов М: Минздрав СССР, 1981;

воде в виде капли наносили на мембранные фильтры «Владипор» №№2-4, фиксировали парами 25%-го водного раствора глутарового альдегида, обезвоживали парами пропиленоксида и готовили препараты для исследований в сканирующем электронном микроскопе. Участки мембранных фильтров, предназначенных для исследований, монтировали на электролитические медные пластинки-подложки и напыляли ионами платины и палладия на установке «Hitachi E-102». Электронно-микроскопическое исследование проводили на микроскопе «Hitachi 800» со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении от 1000 до 15000, сопровождая изучение выборочной фотодокументацией с последующей компьютерной обработкой результатов.

Для изучения морфологических свойств сальмонелл, выделенных из проб поверхностного водоема, культуру высевали на мембранные фильтры «Владипор» №№ 2-4, помещенные на поверхность плотной питательной среды ВСА в чашки Петри. Посевы культивировали в течение 18 часов при температуре 37°С, выросшие колонии фиксировали парами 25%-го водного раствора глутарового альдегида и обезвоживали парами пропиленоксида, после чего готовили препараты для исследования в СЭМ по описанной ранее методике.

Для изучения межпопуляционных взаимоотношений сальмонелл и водорослей Chlorella vulgaris методом СЭМ монослойную культуру хлорелл, выращенную на покровных стеклах, фиксировали 4%-м глутаровым альдегидом на фосфатном буфере рН 6,8-7,0 с последующим обезвоживанием в возрастающих концентрациях спирта (50°,70°,96°Д00°). Участки стекла монтировали на пластинки-подложки и готовили препараты для СЭМ.

Для изучения морфологических особенностей взаимоотношений популяций сальмонелл с инфузориями, червями и дафниями опытные и контрольные образцы препаратов фиксировали раствором 4%-го глутарового альдегида на фосфатном буфере и обезвоживали в восходящих концентрациях спирта (50°,700,96°,100С). Гидробионтов наносили на поверхность мембранных фильтров и готовили препараты для исследований в СЭМ.

Биохимические свойства сальмонелл определяли ускоренным методом с использованием микротестсистемы для биохимической идентификации сальмонелл МТС-сальм (НПО «Питательные среды»).

Для определения биохимических свойств S.typhimurium после каждого срока экс9 позиции (1 неделя, 2 и 6 месяцев) взвесь клеток в воде в концентрации Ш'КОЕ/мл вносили дозаторной пипеткой (UNIPIPETE 100) по 0,1 мл в каждую ячейку контейнера МТС-сальм, включающего набор из семи тестов по утилизации глюкозы, инозита, арабинозы, рамнозы, ксилозы, цитрата натрия и обнаружению сероводорода.

Для определения биохимических свойств культур сальмонелл, выделенных из исследуемых про9б воды, готовили взвесь клеток с мясо-пептонного агара в концентрации К^КОЕ/мл на физиологическом растворе. Взвесь клеток объемом по 0,1 мл вносили в каждую ячейку контейнера.

Для создания анаэробных условий ячейку для обнаружения сероводорода заполняли доверху стерильным вазелиновым маслом. Контейнер закрывали и выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С в течение (20±2)ч. По окончании экспозиции производили визуальный учет результатов в соответствии с цветовым указателем, приложенным к инструкции.

Изучение культуральчо-морфологических. тинкториспьных и серологических свойств сальмонелл. Культурально-морфологические и тинкториальные свойства определяли путем высева сальмонелл на ВСА с последующей микроскопией мазков, окрашенных по Граму.

Серологические свойства изучали путем проведения реакции агглютинации с помощью агглютинирующих сальмонеллезных сывороток, содержащих агглютинины к О- и Н-антигенам сальмонелл. Реакцию учитывали согласно инструкции.

ДНК-гибридизация. С целью идентификации сальмонелл, выделенных из проб воды поверхностного водоема, проводили ДНК-диагностику культуры путем определения уровня гомологии в ДНК методом оптической реассоциации по Де Лею8 (гибридизация ДНК).

В качестве тест-культуры использовали сальмонеллы, выделенные из проб воды поверхностного водоема; в качестве референтных штаммов - музейные штаммы S.typhimurium и S.dublin. Перед реакцией проводили выделение и очистку ДНК, а также определение её нуклеотидного состава. После реакции гибридизации производили математический расчет сходства в полинуклеотидных последовательностях ДНК референтных штаммов и тест-культуры сальмонелл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение биологических свойств популяции музейного штамма Salmonella tvphimurium в воде in vitro.

С целью изучения биологических свойств популяции музейного штамма S.typhimurium в воде исследование проводили параллельно в нескольких направлениях согласно схеме, представленной на рис. 1.

Изучение морфологических свойств популяции клеток сальмонелл в пробах воды при температуре 26°С показало, что через 1 неделю исследования формировались микроколонии сальмонелл из единичных клеток, объединенных общим матриксом и со всех сторон закрытых покровами. Наряду с микроколониями выявлены гетероморфные клетки шаровидной формы сферопластного типа (рис. 4).

Через 2 месяца в популяции наблюдали гетероморфизм в виде уплощенных клеток с неровными краями, лишенных покровов, что соответствовало 1-му этапу L-трансформации - формированию клеток сферопластного типа с дефектными клеточными стенками, объединенных общими чехлами (показано стрелками) (рис. 5).

Через 6 месяцев (срок наблюдения) вся популяция клеток сальмонелл находилась на стадии L-трансформации. Наблюдались клетки сферопластного типа округлой или овальной формы, а также L-формы, объединенные общими чехлами (рис. 6).

* DeLey J, Cattoir II, Reynaerts Л The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur.J Biochcm, 1970 -12 -P.I33-H2;

Рнс. 6. Популяция Salmonella typhimurium в воде. Проба воды, температура 26°С, 6 месяцев. СЭМ, ув.х 10000.

Мы полагаем, что наличие чехлов в виде тяжей, объединяющих сферопласты и Ь-формы в популяции, свидетельствует о жизнеспособности сальмонелл и защищает клетки от воздействия неблагоприятных факторов.

Изучение морфологических свойств популяции клеток сальмонелл в водной среде при температуре 10° показало, что в отличие от температуры 26° через 1 неделю сальмонеллы находились на стадии Ь-транс формации (рис. 7 А). В этой связи следует отметить, что явления Ь-транс формации подобного типа были выявлены и в более поздние сроки эксперимента - 2 и 6 месяцев (рис. 7 Б, В). Эти изменения носили однотипный характер. Выявлены округлые или овальные клетки сферопластного типа, превышающие размер нормальных клеток в 2-3 раза, нередко сливающиеся между собой (рис. 7 А, показано стрелками) и объединенные чехлами в виде тяжей (рис. 7 Б, В, показано стрелками)

Рис. 7. Популяция Salmonella typhimurium в воде. Проба воды, температура 10°С, Л - 1 неделя, Б - 2 месяца, В - 6 месяцев. СЭМ, ув.х А - 10000, Б - 3000, В - 10000.

Параллельно электронно-микроскопическому исследованию популяции клеток сальмонелл в водной среде было проведено исследование их биохимических свойств с использованием микротестсистемы для биохимической идентификации сальмонелл.

Было отмечено, что изменение биохимических свойств сальмонелл в воде при температуре 26°С начиналось со 2-го месяца эксперимента и проявлялось отсутствием ферментативной активности сальмонелл в отношении тестов на утилизацию рамнозы и цитрата натрия. В дальнейшем, с увеличением сроков пребывания сальмонелл в воде, угнетение их биохимических свойств нарастало и через 6 месяцев, наряду с угнетением ферментативной активности в отношении рамнозы и цитрата натрия, отмечалось отсутствие реакции на утилизацию инозита и выделение сероводорода.

Аналогично данному исследованию проведено изучение биохимической активности сальмонелл в воде при температуре 10°.

Через 1 неделю эксперимента отмечали угнетение ферментативной активности сальмонелл в воде в отношении тех же субстратов (рамнозы и цитрата натрия), что и при температуре 26°. На более поздних сроках пребывания сальмонелл в воде (2 и 6 месяцев) угнетение ферментативной активности нарастало и, помимо рамнозы и цитрата натрия, отмечали отрицательную реакцию в тесте на выделение сероводорода.

Следует отметить, что на протяжении всего эксперимента сальмонеллы сохраняли способность утилизировать глюкозу, арабинозу и ксилозу, что указывает на высокую стабильность данной ферментативной активности у сальмонелл в процессе их выживания в воде (табл. 1).

Таблица 1

Изучение биохимических свойств S.typhimurium в воде

>чСи«НМ1М'М<*М* т*еты Срма \ '•МП*р*Ту|Г4 \ UOIKJ.

в

1 неделя,*1 г»'с * J . • .+ ' I1" V + t"

2 месяца. 26'С 7 + ! '+ - i . .+ * • J с 1 Г+"-'

9 месяцев, 26*С- + , _ ft: - ; С* * J A > * 'J -.■>'

1 неделя. life + + + - + - +

2 месяца. to*C + + + - + - -

6 месяцев. 10> С + + + - + - -

+ реакция положительная; — реакция отрицательная.

С целью определения способности L-форм сальмонелл к процессу реверсии на протяжении всего эксперимента проводился высев культуры сальмонелл на ВСА с последующим определением серологических и тинкториальных свойств после подращивания.

Отмечено, что на ранних этапах исследования рост культуры сальмонелл на ВСА наблюдали уже к 18 часам аналогично высеву контрольной культуры сальмонелл. Однако, длительное обитание сальмонелл в воде приводило к замедленному росту культуры. Так, к 24 часам наблюдали рост мелких одиночных колоний зеленоватого цвета, который приобретал типичный вид лишь к 4-5 суткам. Серологические и тннкториальные свойства сальмонелл, выросших на питательной среде, были типичными, что свидетельствовало о полной реверсии клеток в исходное состояние с восстановлением антигенных свойств.

Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что в условиях голодания, при различных температурах, а также длительности пребывания в воде, популяции сальмонелл выживают как в микроколониях, так и в виде гетероморфных клеток с различной степенью L-трансформации, причем, степень проявления гетероморфизма в популяции зависит от глубины действия неблагоприятных факторов среды обитания.

Установлена корреляция между морфологическими изменениями клеток сальмонелл и изменением их биохимических свойств по ряду ферментов, участвующих в утилизации таких субстратов как инозит, рамноза, цитрат натрия и цистеин (реакция на выделение сероводорода).

Особенности биологических свойств культуры сальмонелл, выделенной из проб поверхностных вод р. Ока

Культура сальмонелл была выделена из проб поверхностных вод р. Ока, взятых у водозаборников в весенний период года (апрель). Накопление культуры сальмонелл проводили путем высева проб воды на жидкие среды обогащения (магниевая среда и селенитовый бульон) с последующим пересевом их на плотную селективную среду ВСА. Для получения колоний сальмонелл в S-форме осуществляли пересев культуры до 7-8 раз с жидких обогатительных сред на селектнвную среду. Принадлежность выделенной культуры к бактериям рода Salmonella определяли методом ДНК-гибридизация.

При изучении морфологии выделенной из воды культуры сальмонелл в мазках, окрашенных по Граму, было установлено, что клетки имели вид мелких грамотрицательных палочек с закругленными концами, а также наблюдались удлиненные, укороченные клетки и коккоподобные формы, что является признаком гетероморфизма.

Изучение серологических свойств выделенной культуры с использованием сывороток, содержащих агглютинины к О- и Н- антигенам сальмонелл позволило отнести её к бактериям рода Salmonella группы В.

Исследование культуры сальмонелл, выросших на питательной среде, с использованием методов сканирующей электронной микроскопии показало, что

значительная часть популяции представлена мелкими извитыми клетками -ревертантами, которые еще полностью не восстановили клеточную стенку. Однако, наряду с ними часть популяции сальмонелл находилась под покровами, что свидетельствовало о переходе их в S-форму (рис. 8, показано стрелками).

По данным литературы известно, что процесс реверсии бактериальных клеток из нестабильных L-форм замедлен, так как клеточная стенка синтезируется de novo (Прозоровский СВ. с соавт., 1981)9.

Рис. 8. Край колонии сальмонелл, выделенных из пробы воды поверхностного водоема. СЭМ, ув.х 10000.

Изучение биохимических свойств выделенных из проб воды сальмонелл показало, что они не утилизировали инозит, рамнозу и цистеин, при этом, способность утилизировать глюкозу, арабинозу и ксилозу была стабильной аналогично сальмонеллам, обитающим в воде в экспериментальных условиях.

Таким образом, изменения ферментативной активности у культуры сальмонелл, выделенной из проб воды поверхностного водоема, имели сходства с изменениями ферментативной активности у музейной культуры сальмонелл в эксперименте.

* Прозоровский С.В, Кац ЛИ, Каган Г.Я. L-формы бактерий (механизм образования, стр)|ст)ра, роль в патологии)/АМН СССР.-М.: Медицина, 1981,

Изучение межпотчячионных взаимоотношений сальионеп с разтчными

В научной литературе последних лет встречаются немногочисленные сведения о том, что поддержание численности патогенных бактерий в воде может осуществляться в результате взаимодействия их с представителями биоценоза водных экосистем.

В этой связи, несомненный интерес представляло моделирование природных условий сосуществования популяций сальмонелл с некоторыми наиболее распространенными гидробионтами пресноводных водоемов, такими как водоросли, инфузории, черви и дафнии с последующим изучением их взаимоотношений при использовании методов СЭМ.

В эксперименте использовали одноклеточные микроводоросли Chlorella vulgaris. Культуру хлорелл выращивали на покровных стеклах в виде монослоя по методике, разработанной в лаборатории санитарной микробиологии.

С помощью СЭМ были изучены контрольные препараты клеток хлорелл в моиослое. Показано, что микроводоросли объединены слизистыми чехлами.

Рис. 9. Взаимодействие сальмонелл с хлореллами (22-26°С). Видна адгезия бактерий к поверхности микроводорослей (А). Колонизация сальмонеллами поверхностей монослойной культуры хлорелл (Б). СЭМ, ув.х Л-10000, Б-8000.

При исследовании взаимодействия хлорелл с сальмонеллами при температуре 22-26°С, уже через 3 часа отмечена адгезия единичных клеток к поверхностям хлорелл (рис 9 А). Через 6 часов клетки сальмонелл интенсивно размножались и колонизировали их (рис.9 Б). При этом, клетки сальмонелл были закрыты покровами, что характерно для нормального развития популяции бактерии.

Известно, что грамотрицательные бактерии, как и одноклеточные водоросли, имеют общие по составу экзополисахариды. Процесс адгезии идет по типу лиганд-рецепторного взаимодействия.

Адгезия и колонизация клеток сальмонелл к поверхностям водорослей, а также сохранность клеток хлорелл, указывали на их симбиотические взаимоотношения и возможность накопления популяций сальмонелл в водной среде в летний период.

Другим объектом исследования были свободноживущие простейшие -инфузории, которые являются обязательными компонентами водных экосистем. В экспериментах использовали культуру Те^аИутепа ругИвгтк штамм ^И.

Изучение морфологии популяций сальмонелл при взаимодействии их с инфузориями выявило адгезию и начало колонизации нефагоцитированных клеток сальмонелл к поверхностям инфузорий уже через сутки их совместного культивирования (рис. 10 А, Б). Показано начало образования микроколоний сальмонелл, (рис. 10 Б, показано стрелками).

Рис. 10. Взаимодействие популяции клеток сальмонелл с инфузориями. Популяция клеток сальмонелл, адгезированных к поверхности тела инфузории (А). Колонизация сальмонеллами поверхности тела инфузории (Б). СЭМ, ув.х А - 10000, Б - 7000.

Другим объектом исследования явились представителями бентоса водоемов -черви. Для экспериментальных исследований нами были использованы кольчатые черви трубочник ТиЬИёх ШЬИех

Исследование контрольных препаратов червей методом СЭМ показало, что поверхность червя была складчатой и состояла из отдельных мышечных волокон, покрытых слизью.

Через сутки после взаимодействия с сальмонеллами в препаратах был выявлен интенсивный процесс адгезии клеток сальмонелл к поверхностям тела червя по типу лигаид-рецепторного взаимодействия (рис. 11 А).

На 2-4-е сутки выявлена колонизация, сопровождающаяся увеличением численности клеток сальмонелл (рис. 11 Б).

Рис. 11. Фрагмент поверхности тела червя ТЛиЫГех. Адгезия клеток сальмонелл к поверхности тела червя (А). Колонизация сальмонеллами поверхности тела червя (Б). СЭМ,ув.х 10000.

Наибольший интерес представило изучение взаимоотношений популяций сальмонелл с низшими ракообразными - дафниями. В литературе имеются отдельные сведения, указывающие на способность рачков поддерживать численность таких патогенных микроорганизмов, как холерный вибрион (Huq Л. et.al., 198410; Михайлова А.Е. с соавт., 2000м).

Дафнии, наряду с простейшими, составляют основу зоопланктона и являются обитателями пресноводных водоемов. Тело дафний заключено в прозрачную хитиновую раковину. Полисахарид хитин является природным полимером, который составляет основу наружного скелета ракообразных.

Для морфологического анализа контрольных препаратов аксеничной культуры Daphnia magna проводили исследование хитинового покрова. Изучение взаимодействия сальмонелл с дафниями методом СЭМ показало, что сальмонеллы способны адгезироваться к хитиновой поверхности ракообразных как при температуре 26°С, так и при температуре 10°С. При этом, температура влияла на процессы адаптации сальмонелл, что отражалось на морфологии их клеток.

Так, при температуре 26°С выявлена адгезия клеток сальмонелл к поверхности чешуек. Видны единичные и делящиеся клетки сальмонелл, имеющие типичную форму и величину, что свидетельствует о специфическом процессе адгезии клеток по типу лиганд-рецепторного взаимодействия (рис. 12).

Рис. 12. Адгезия клеток Salmonella typhimurium к поверхности чешуек дафний (26°С). СЭМ, ув.х А-5000, Б-15000.

10 Huq A. etal. Influence of water temperature, salinity and pll on survival and growth of toxigenic Vibrio cholerae serovar 01 associated with live copepods in laboratory microcosms. // Appl.Environ.Microbiol.-1984.-V.48.-N2.-P. 420-424;

" Михайлова A.E., Хайтович А.Б. Факторы сохранения холерных вибрионов в водоемах. // ЖМЭИ.-2000.-№6.-С. 99-104;

При температуре 10°С была видна адгезия клеток сальмонелл, имеющих удлиненную форму, что свидетельствовало о замедлении скорости разделения клеток на фоне их роста, в результате чего наблюдалось наличие У-образных клеток, характерных для начального этапа гетероморфного роста, описанных в монографиях Пешкова М А , (1955)12 и Прозоровского СВ. с соавт., (1981)13 как фаза сбалансированного роста (рис. 13).

Рис. 13. Адгезия клеток Salmonella typhimurium к поверхности чешуек дафний (10°С). Видны удлиненные, неразделившиеся клетки сальмонелл. СЭМ, ув х А-5000, Б-15000.

11 Пешков МЛ Цитопопм бактерий М-Л Нзд-во АН СССР, 1955,

Прозоровский СВ, Как ЛИ, Каган Г Я L-формы бактсрнЛ (механизм образования, структура,

рольвнатологни)/ЛМ11СССР-М Медицина, 1981

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментальных исследований было показано, что основным фактором выживания популяций сальмонелл в водной среде является популяционная изменчивость, обеспечивающая им жизнеспособность и устойчивость к воздействию абиотических и биотических факторов в условиях их сапрофитического существования при изолированном обитании в воде и при взаимодействии с некоторыми гидробионтами водных экосистем.

Популяционная изменчивость сальмонелл в водной среде независимо от влияния абиотических факторов обеспечивает длительную персистенцию популяций как в микроколониях, закрытых покровами, так и в виде клеток сферопластного типа и L-форм, объединенных общими чехлами, что способствует защите популяции клеток от воздействия абиотических факторов среды обитания.

Установлена корреляция между морфологическими изменениями клеток сальмонелл и изменением их биохимических свойств по ряду ферментов, ответственных за утилизацию инозита, рамнозы, цитрата натрия и цистеина. Снижение ферментативной активности замедляет процессы метаболизма, что способствует сохранению жизнеспособности клеток в условиях голодания.

Сальмонеллы способны не только выживать в водной среде изолированно, но и проявлять симбиотические взаимоотношения с одноклеточными водорослями, инфузориями, червями и дафниями, о чем свидетельствовали процессы адгезии и колонизации бактерий к поверхностям этих гидробионтов. Показана способность сальмонелл к размножению клеток на хитиновом покрове дафний при низких температурах, что указывает на возможность длительной персистенции сальмонелл на поверхностях низших ракообразных и поддержание их численности в водной среде в межэпидемические периоды.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что основным фактором выживания популяций сальмонелл в водной среде является популяционная изменчивость, обеспечивающая им жизнеспособность и устойчивость к воздействию абиотических и биотических факторов в водной среде.

2. Методом сканирующей электронной микроскопии выявлено, что популяции сальмонелл при обитании в воде выживают как в микроколониях, закрытых покровами, так и в виде гетероморфных клеток с различной степенью L-трансформации.

3. Установлено, что сальмонеллы в воде на стадии L-трансформации представлены клетками сферопластного типа различной величины и мелкими клетками - L-формами, объединенными в популяции чехлами, выполняющими защитную роль от воздействия неблагоприятных факторов.

4. Установлена корреляция между морфологическими изменениями клеток сальмонелл и изменением их биохимических свойств по ряду ферментов, участвующих в утилизации таких субстратов, как инозит, рамноза, цитрат натрия и цистеин.

5. Изучение биохимических свойств популяции сальмонелл в воде как в эксперименте, так и у выделенных из проб поверхностного водоема показало, что ферментативная активность в отношении глюкозы, арабинозы и ксилозы оставалось стабильно положительной, что свидетельствовало о важной роли этих ферментов в жизненном цикле популяций сальмонелл в водной среде.

6. Показаны механизмы взаимоотношений сальмонелл с одноклеточными микроводорослями. Выявлен процесс адгезии и колонизация клеток сальмонелл к поверхностям водорослей при температуре 22-26°С, что указывает на их симбиотические взаимоотношения и возможность выживания, а также накопления популяций сальмонелл в водной среде в летний период.

7. Установлено, что сальмонеллы способны к симбиотическому существованию с инфузориями, дафниями и водными червями, о чем свидетельствуют процессы адгезии и колонизации бактерий на поверхностях гидробионтов.

8. Выявлена адгезия и размножение гетероморфных клеток сальмонелл к поверхностям хитинового покрова дафний при температуре 10°С, что указывает на возможность длительной персистенции сальмонелл на поверхностных структурах низших ракообразных.

9. На основании экспериментальных исследований разработаны «Методические рекомендации по изучению морфологических и ферментативных свойств популяций сальмонелл, выделенных из воды».

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Для микробиологических лабораторий научно-исследовательских учреждений РАСХН и РАМН, центров Госэпиднадзора, преподавателей и студентов ветеринарных и медицинских ВУЗов могут быть рекомендованы разработанные нами «Методические рекомендации по изучению морфологических и ферментативных свойств популяций сальмонелл, выделенных из воды», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 6 апреля 2004 г.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зуев B.C. Факторы выживания популяций сальмонелл в водной среде (электронно-микроскопическое исследование) // II Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2003: Материалы конференции. - М.: МГУПБ,

2003.-С. 148-150;

2. Зуев B.C. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия микроводорослей с сальмонеллами // Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», Воронеж, 2002: Материалы конференции. - Воронеж, 2002. - С. 274275;

3. Зуев B.C. Выживание сальмонелл в водной среде при взаимодействии с дафниями // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб.научн.трудов ВНИИВСГЭ.- М.-2003.-Т.115. - С.79-85;

4. Павлова И.Б., Зуев B.C. Стратегия адаптации популяции Salmonella typhimurium в воде (сканирующая электронная микроскопия). // ЖМЭИ.-№5.-

2004.-С. 33-36;

5. Зуев B.C. Сапрофитическое существование популяций патогенных бактерий в среде обитания // Ветеринарная патология.-Т. 1.-М.: Ветеринарный консультант, 2004;

6. Павлова И.Б., Зуев B.C. Факторы выживания популяций Salmonella typhimurium в воде (сканирующая электронная микроскопия) // Ветеринарная патология.-Т.1.-М.: Ветеринарный консультант, 2004.

ВНИИВСГЭ, 2004, г.Москва. Звенигородское шоссе, 5 Заказ $9// _. Тираж д ^ экз.

¿.6418

Актуальность проблемы. Ухудшение эпидемиологической обстановки в России по кишечным инфекциям в последние годы указывает на необходимость усиления контроля качества водных источников. # Эффективность санитарно-эпидемиологического контроля водных объектов должна базироваться не только на соблюдении существующих микробиологических критериев оценки качества воды, изложенных в документах санитарного законодательства, но и на фундаментальных исследованиях, способствующих совершенствованию индикации патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в водных экосистемах. Особенно это важно в свете новой концепции о возможности сапрофитического существования в окружающей среде микроорганизмов, патогенных для человека и животных.

Данная концепция построена на изучении поведения микроорганизмов на ^ популяционном уровне, то есть в сообществах. Это является основополагающим подходом при изучении экологии бактерий как в организме человека и животных, так и во внешней среде.

Экология бактерий является одним из фундаментальных разделов биологии, изучающих взаимодействие микроорганизмов с окружающей средой. Водные экосистемы по богатству и разнообразию микроорганизмов патогенных и потенциально-патогенных для человека и животных не уступают почвенным и наземным. Так, по данным литературы известно, что микрофлора озерной и прудовой воды представлена всеми основными родами энтеробактерий [67], однако, наиболее устойчивыми из них являются сальмонеллы [70].

Факторы, способствующие длительной персистенции сальмонелл в водных экосистемах сложны, изменчивы и мало изучены. По данным литературы известно, что выживаемость сальмонелл в воде сопровождается изменением их биологических свойств.

В этой связи актуальным является изучение факторов выживания популяций сальмонелл в среде обитания. Помимо этого, важным является изучение возможных путей для сохранения и выживания сальмонелл в водной среде, благодаря их взаимодействию с различными гидробионтами, которое проявляется не только в виде модели «хищник-жертва», а имеют сложную симбиотическую природу. По данным литературы известно, что именно симбиотическое взаимодействие патогенных микроорганизмов с представителями биоценоза различных естественных экосистем позволяет им выживать в среде обитания в межэпидемические периоды [42].

Цель работы. Изучить факторы выживания популяций сальмонелл, способствующие их длительной персистенции в водных экосистемах.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методические подходы к исследованию существования популяции S.typhimurium в воде in vitro;

2. Разработать методические подходы к исследованию взаимоотношений популяции S.typhimurium в воде с некоторыми гидробионтами (водорослями, инфузориями, червями и дафниями) in vitro;

3. Изучить морфологические свойства популяции S.typhimurium из проб воды in vitro с использованием методов сканирующей электронной микроскопии при различных температурных режимах;

4. Провести исследование биохимических свойств S.typhimurium из проб воды in vitro при различных температурных режимах;

5. Провести сравнительный анализ биологических свойств музейной культуры S.typhimurium из проб воды in vitro и сальмонелл, выделенных из воды поверхностных водоемов;

6. Изучить морфологические свойства популяции S.typhimurium при их взаимоотношении с гидробионтами in vitro.

Научная новизна. Разработаны методические подходы к исследованию биологических свойств популяции 8.1урЫтигшт в воде как изолировано, так и при взаимодействии с водорослями, инфузориями, червями, дафниями с применением методов сканирующей электронной микроскопии и биохимической идентификации в микротестсистеме.

Экспериментальными исследованиями показано, что основным фактором выживания популяций сальмонелл в водной среде является их популяционная изменчивость, обеспечивающая им жизнеспособность и устойчивость к воздействию абиотических и биотических факторов в условиях их сапрофитического существования в водной среде.

Популяционная изменчивость сальмонелл в водной среде независимо от влияния абиотических факторов обеспечивает персистенцию в популяциях как в микроколониях, закрытых покровами, так и в виде клеток сферопластного типа и Ь-форм, объединенных общими чехлами, что способствует защите клеток от воздействия абиотических факторов среды обитания.

Установлена корреляция между морфологическими изменениями клеток сальмонелл и изменением их биохимических свойств по ряду ферментов.

Другим фактором выживания популяций сальмонелл в водной среде является их способность к симбиотическим взаимоотношениям с одноклеточными водорослями, инфузориями, червями и дафниями, о чем свидетельствовали процессы адгезии и колонизации бактерий к поверхностям гидробионтов. Показана способность клеток сальмонелл к размножению на хитиновом покрове дафний при низких температурах, что указывает на возможность длительной персистенции сальмонелл на поверхностях низших ракообразных.

Практическая значимость работы. Разработана методика подготовки препаратов для сканирующей электронной микроскопии, позволяющая изучать популяции бактерий при их взаимоотношениях с гидробионтами.

На основании результатов исследований разработаны и утверждены «Методические рекомендации по изучению морфологических и ферментативных свойств популяций сальмонелл, выделенных из воды», утвержденные РАСХН 06.04.2004. Данная методика предназначена для совершенствования методов идентификации сальмонелл при выделении их из проб различных водных источников.

Исследования по теме данной диссертационной работы были проведены в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ. За помощь в работе приношу глубокую благодарность всем сотрудникам лаборатории.

По характеру работы мы были связаны с сотрудниками лаборатории санитарной микробиологии и паразитологии НИИЭЧиГОС им. А.Н.Сысина РАМН, а также лаборатории микробных сообществ Института микробиологии РАН. За помощь в работе приношу глубокую благодарность кандидату биологических наук Артемовой Т.З., кандидату биологических наук Ивановой JI.B., а также кандидату биологических наук Лысенко A.M.

Приношу сердечную благодарность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Павловой Инне Борисовне за помощь и внимательное руководство к нашей работе.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1.

САПРОФИТИЧЕСКОЕ СУЩЕСТВОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В РАЗЛИЧНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

Процесс существования патогенных бактерий в естественных экосистемах в настоящее время мало изучен. На самом деле автономное обитание в почве или воде многих патогенных бактерий и грибов, вызывающих инфекционные болезни человека и животных, закономерные и многообразные связи с почвенными и водными организмами делают их полноправными сочленами естественных экосистем - главным образом, почвенных и водных. Данная сапрофитическая фаза существования патогенных бактерий (сапронозы) осуществляется благодаря одним и тем же биологическим законам, но менее изучена, чем антропонозы и зоонозы.

Одним из первых идею «внечеловеческого» существования возбудителей инфекционных заболеваний высказал Д.К. Заболотный: в 1899 году он писал, что «различные породы грызунов, по всей вероятности, представляют в природе ту среду, на которой сохраняются различные бактерии» [29]. Как итог обобщения накопленных фактов E.H. Павловский [56] сформулировал учение о природной очаговости болезней человека. Поначалу, учение E.H. Павловского охватывало трансмиссивные инфекции с наземными паразитарными системами замкнутого типа, представленными обязательной триадой "возбудитель-переносчик-носитель". В дальнейшем, развитие учения привело к пониманию того, что "патобиоценоз" может включать как два компонента паразитарной системы, обеспечивающие циркуляцию возбудителя (теплокровные носители и членистоногие переносчики), так и лишь один компонент - только теплокровных животных [57, 58].

Новый этап развития учения о природной очаговости болезней исторически связан с работой Терских В.И. [81] о сапронозах, природными резервуарами возбудителей которых служат субстраты внешней среды. Бурное развитие исследований по экологии патогенных микроорганизмов в окружающей среде в 70-90-е годы прошлого столетия и до наших дней укрепило учение о сапронозах, одновременно соединив его с концепцией природной очаговости болезней.

В настоящее время имеются работы отечественных и зарубежных исследователей, изучающих способность некоторых патогенных бактерий выживать в окружающей среде в составе почвенных и водных экосистем, в растениях и на различных субстратах, способствующих сохранению и, нередко, размножению патогенных микроорганизмов [3, 13, 42, 54, 66, 80 и многих других]. Однако, стратегия адаптации возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных в среде обитания остается недостаточно изученной.

В этой связи, значительный интерес представляет концепция адаптивной саморегуляции бактериальных популяций за счет их гетерогенности и способности переходить в Ь-формы. Кроме того, особый интерес представляет вопрос изучения биоценотических взаимоотношений патогенных бактерий с гидробионтами водных, а также представителями биоценоза почвенных экосистем, играющих, по-видимому, важную роль в выживании бактерий в условиях окружающей среды.

7. Заключение 129