Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Роль Zoogloea ramlgera в биоценозе активного ила

На правах рукописи

БАРКОВ АРТЁМ ьтШй'Л-,

РОЛЬ '¿оое1оеа галИдега В БИОЦЕНОЗЕ АКТИВНОГО ИЛ,'

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микологи* и иммунология

А В Т о Р Е С Е Р А " Диссертации иа соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Москва-199;-

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и вкологии

Научный руководитель: старший научный сотрудник, кандидат

медицинских наук И.Б.Павлова

Научный консультант: доктор биологичерких наук А.А.Денисов

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук В.Г.Тюрин

кандидат биологических неук

И.В.Бэтвинко

Ведущая организация: Московская Государственная

Академия прикладной биотехнологии

Защита состоится" 2f " „1995 г. в_чао.

на заседании диссертационного Учёного Совета БНИИВСГЭ по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5. .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВСГЭ

Автореферат рвзослан " " SO/täp-P 1995 г. Учёный секретарь

>

диссертационного Совета

кандидат биологических наук Л.П.Пименова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Очистка и обеззараживание сточных вод агропромышленного сектора - проблема, стоящая на стыке биотехнологии и ветеринарной санитарии. Развитие этого направления идет по пути использования экологически безопасных технологий на основе естественных природных процессов. При этом очистные сооружения рассматриваются не как технологические конструкции, а как антропогенные экосистемы (Громов Б.В.,1989; Синицин А.П.,1994).

Особенность сточных вод животноводческих ферм, мясокомбинатов, боен заключается в том, что они контаминированы опасными для здоровья человека и животных агентами: патогенными бактериями (Lehmann D.L.,Wallis P.M.,1982.), вирусами (Metcalf Т.6.,1976), микроскопическими грибами (Bertoldl M.D. ,1981), патогенными Protozoa, яйцами гельминтов (Hannan J. ,1981). Проблема деконтамииа-ции этих стоков является актуальной как в санитарном, так и в экологическом аспектах.

Разрабатываются, внедряются и усовершенствуются способы де-контаминадии сточных вод на основе использования биоценозов не только естественно сформировавшихся, но и искусственно созданных из селекционированных штаммов и культур ( Тимофеева С.С., 1984; Доливо-Добровольский Л.Б.,1986).

Одним из основных методов очистки и деконтаминации сточных вод является использование микробиоценозов активного ила аэротен-ков. Ведущая роль в функционировании этих биоценозов отводится флокулируюдим бактериям родов Alcalignes, Pseudomonas, Zoogio-еа(Ротмистров М.Н. ,1978). Наиболее часто иэ активного ила выделяют бактерии рода Zoogloea (Crabtree К., J.Fratvur 1974; Tezuka Y.А.,1973). Изучение закономерностей функционирования этого элемента биоценоза активного ила ведётся давно и достаточно-успешно. Оснс ное направление этих исследований - изучение влияния бакте-

рий рода Zoogloea на технологические свойства активного ила, на улучшение химических и биохимических показателей очистки сточных вод (Денисов A.A.,1989;Adams A.D.,1978). Изучение влияния этих бактерий на формирование санитарно-бактериологических свойств сточных вод в процессе их очистки в аэротенках - актуальная задача, решение которой даёт подход к созданию экологически безопасных способов деконтаминации агропромышленных стоков.

Цель и задачи исследования.Целью настоящей работы явилось изучение роли Zoogloea ramigeга в биоценозе активного ила.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1.Изучить структуру и основные закономерности функционирования активного ила.

2.Выделить из активного ила зооглейные бактерии и идентифицировать их.

3.Изучить морфологические и культуральные свойства Zoogloea ramigera на популяционном уровне.

4.Изучить антагонистическую активность Zoogloea ramigera в отношении патогенной микрофлоры на межпопуляционном уровне.

5.Произвести оценку воды и активного ила в аэротенке на различных этапах технологического цикла по санитарно-бакте-риологическим показателям.

Научная новизна. Впервые в отечественной ветеринарной науке проведены исследования по влиянию бактерии Zoogloea ramigera на процесс снижения количества бактерий при очистке сточных вод. Выделено 11 штаммов Zoogloea ramigera. Методом сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии изучены особенности существования популяции этих бактерий в различных условиях.Описаны 4 основных этапа в процессе формирования флокул.Предложена оригиналь-

- ь -

ная методика изучения взаимодействия иммобилизованных на поверхности стекла клеток гоой1оеа гатдега с бактериальными клетками различных тест-штаммов. Впервые" описан переход чроти популяции бактерий к гетероморфному росту как следствие их взаимодействия с 2оог1оеа г шдега.

Практическая ценность.На основании полученных экспериментальных данных подтверждены сведения зарубежных и отечественных ученых о важной роли 2оог1оеа- гагг^ега в биоценозе активного ила. Полученные в ходе исследования сведения о процессе биофлоку-ляции представляют интерес для решения практических задач при разработке технологических режимов работы аэротенков. Адаптированная методика позволит достаточно легко выделять гоов1оеа гат1-кега в условиях промышленной лаборатории. Разработанные и утверждённые "Критерии оценки перспективных штаммов микробов-антагонистов при аэробном способе биологической очистки сточных вод" служат для отбора штаммов с высокой интенсивностью флокуляции с целью их использования при инициации рабочего цикла во вновь построенных и при технологических срывах в функционирующих аэро-тенках. Разработанная оригинальная методика на основе иммобилизации клеток гоог1оеа гаш!кега на поверхности стекла позволяет изучать процесс взаимодействия популяций различных микроорганизмов одновременно методом световой и сканирующей электронной микроскопии.

»

Апробация подученных результатов. По материалам диссертации сделаны сообщения:

1.На международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов (Воронеж, 1995 г.).

2.На межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИ ве-

теринарной санитарии, гигиены и экологии (Москва, 1995 г.). •

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.

Структура U объём диссертации. Диссертация включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.Диссертация изложена на 120 страницах,иллюстрирована 3 таблицами,9 графиками, 42 микрофотографиями и электроннограммами. Список литературы включает 238 источников литературы, в том числе 116 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования.Экспериментальная работа по диссертации проводилась в рамках темы 8.6.91.95 лабораторий санитарной микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (BHJWBC-ГЭ). Образцы лиофилизированного активного ила, а также возможность отбирать пробы сточных вод ц активного ила из экспериментальных аэротенков были предоставлены заведующим лабораторией производственной санитарии и охраны окружающей среды Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИиТИБП) д.б.н. А.А.Денисовым. В ходе работы из 15 проб выделили 21 штамм эооглейных бактерий,11 из них идентифицировали как Zoogloea ramigera. В качестве тест-штаммов в работе использовали: Вас. Ucheniformis из коллекции штаммов ИЭМ им.Гама-леи. Staph.aureus 209P,E.coli К-12 - штаммы из коллекции ВНИИВС-ГЭ.Е.соП К-83 - штамм предоставил д.в.н.Л.С.Каврук .

- ъ -

Выделение гоо(?1оеа гаш1<?ега.Ддя выделения бактерий рода 2о-од1оеа использовали среду накопления, состоящую из двух фаз: твёрдой и жидкой.Твёрдая фаза представляла собой плотную среду, приготовленную на основе минерально-солевого раствора.В качестве источника питания она содержала 2.4 г/л глюкозы. Инокулят вносили в жидкую фазу - минерально-солевой раствор. Культивировали 18-24 часа при температуре 28°С (11п2 Р. Р. ,1974).

Сформировавшуюся поверхностную плёнку переносили в 10 мл стерильного фосфатного буфера и суспензировали, используя тач-миксер. Полученную суспензию рассеивающим штрихом высевали на плотную питательную среду на основе гидролизата казеина и дрожжевого автолизата - Саэиопе УеаэЬ-агар (СУ- агар). После 48 часов культивирования при 28°С отбирали характерные для 2оог1оеа тальвега колонии (Кп2 ЕЮпбего N.0. .1967).

Изучение культуральных и морфологических свойств 7_оосг1оеа ' гат1%ега.Характерные культуральные свойства 2оод1оеа гат1цега выявляли путём посевов на твёрдую среду (СУ-агар)и в жидкую питательную среду (СУ-бульон) аналогичного состава. Морфолопгческке свойства- изучали методами обычной и фазовоконтрастной световой, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии. Для исследования морфологических особенностей 2оод1оеа гаш!еега на популя-ционном уровне микроколонии выращивали на трнком слое агаровой среды. Для этого на подогретое предметное стекло нглосилн несколько капель расплавленного СУ-агара и равномерно распределяли по всей его поверхности.После застывания избыток среды по краям стекла удаляли.Посев из суточной бульонной культуры производили остриём препаровальной иглы.Культивировали 24 часа во влажной камере при температуре 28°С. Изучали методами обычной и фазовоконт-

- б -

растной световой микроскопии (Павлова И.Б..Тарабукина Н.П.,1983). Параллельно изучали особенности существования зооглейных микроорганизмов в активном иле аэротенков и культурах из лиофилизирован-ного активного ила. Лиофилизированный активный ил инокулировали в жидкую питательную среду,изучали суточную культуру.

Часть отобранных из аэротенков проб фиксировали глутадювым альдегидом, исследовали методами обычной и фазовоконтрастной световой, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии. Работа осуществлялась на электронном микроскопе "Hitachi-800" со сканирующей приставкой "Hitachi 8010" (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-30 тысяч.

Изучение биохимических свойств Zoogioea ramlgera. Цитохромок-сидазную активность культур определяли по стандартной методике с использованием реактива из альфа-нафтола и оксалата диметил-п-фе-нилендиамина (Герхардт Ф.,1983). Ферментативные свойства по отношению к углеводам определяли путём посева в среды на основе 0Y-бульона с добавлением углеводов (арабинозы, галактозы, глюкозы, рамнозы, мальтозы, лактозы, сахарозы, сорбита) в концентрации 1% и фенолового красного в количестве 0,012г/л (Unz R.F.,Dondero N. С.,1967).Способность продуцировать уреазу определяли по стандартной методике посевом на скошенный агар Кристенсена с мочевиной. Тест на сероводород проводили по методике А.Б.Черноморди-ка(1965).Гидролитическую способность по отношению к желатине определяли путём посева уколом в мясо-пептонную желатину, (с добавлением гидролизага казеина и дрожжевого автолизата).Для выявления способности использовать цитрат в качестве единственного источника углерода производили посев на скошенный нитратный агар Симмон-са(Герхардт Ф.,1983) Способность Zoogloea ramigeia продуцировать

полисахариды выявляли фенол-серным методом (Dubois M.,1956). Кислую природу биополимера подтверждали реакцией с центавлоном (Кочетков К.К.,1907).

Выявление у Zoogloea ranigera способности продуцировать биологически активные вещества. В работе по выявлению у Zoogloea га-migera способности продуцировать биологически активные веш,естг,а, угнетающие рост тест-штаммов патогенных и непатогенных бактерий, применяли два метода.

Первый бил основан на стандартной методике подсева тест-штаммов перпендикулярно к линии роста испытуемого штамма, при этом использовали питательную среду и режим культивирований, соответствующие бактериям Zoogloea ranigera.

Второй метод, использованный в исследовании, был основан на оригинальной методике с культивированием бактерий на поверхности мембранных фильтров, предложенной И.Б.Павловой с соавтора!«! (19'J4 г.). Аналогичными методами, выявляли способность продуцировать биологически активные вещества у чистых культур бактерий, выделенных нами из активного ила.

Иммобилизация Zoogloea ramigéra на носителе.Проводили иммобилизацию клеток Zoogloea ranigera на поверхности покровных стёкол, погружённых, в питательную сред> (CY-бульон) .Для моделирования взаимодействия Zoogloea ramigera с патогенными бактериями стёкла с наросшей культурой погружали на 1 час во взвесь бактериальных клеток Staph.aureus 209 Р, E.coli К-12, E.coli К-88. После 3-кратного отмывания стёкол стерильным буферным раствором фиксировали глутаровым альдегидом, обезвоживали в спиртах с возрастающей концентрацией; 70°, 96°, .100°. Препараты пучали метода'«' световом и ск-'шируюцсй электронной микроскопии.

Выявление антагонистических свойств бактерий Zoogloea ramigera. Для моделирования антагонистического взаимодействия бактерий Zoogloea ramigera с патогенными бактериями использовали оригинальную методику их совместного культивирования в условиях, имитирующих работу аэротенка. Через 24 и 48 часов культивирования определяли концентрацию тест-культур в общей пробе (непосредственно после прекращения аэрации); в осадке и над осадочной жидкости (после отстаивания в течение 1 часа). При моделировании взаимодействия консорциума активного ила с патогенными микроорганизмами применяли аналогичную методику.

Изучение функционирования аэротенка в периодическом полунепрерывном режиме.Отбирали пробы сточных вод свиноводческого комплекса Щелковского района Московской области до загрузки в азро-тенк и после 48-часового цикла очистки активным илом в Экспериментальном аэротенке лаборатории производственной санитарии и охраны окружающей среды ВКИиТИБП. Через 2 часа пробы доставляли в лабораторию санитарноймикробиологии ВНИИВСГЗ и проводили их са-нитарно-бактериологический анализ по следующим показателям:

- общее микробное число;

- количество бактерий группы кишечных палочек;

- наличие энтеропатогенных бактерий.

Исследование проводили в соответствии с "Инструкцией по лабораторному контролю очистных сооружений на животноводческих комплексах Мин.сель.хоз-а СССР от 17.11.80."

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Структура и функционирование активного ила.Отправной точкой исследования было изучений активного ила экспериментальных аэро-тенков, действующих в периодическом"полунепрерывном режиме. Преж-

де чем приступить к исследованию его многокомпонентного, сложного биоценоза, изучали культуры, полученные из лиофилизированного активного ила.Лиофилыю высушенный активный ил используют д. инициации рабочего цикла во вновь построенных аэротенках, следовательно, он содержит необходимый минимум компонентов микробиоценоза.

Бульонная культура бактерий лисфилизированного активного ила состояла из двух основных компонентов:

-первый,составляющий большую часть, представлял собой палочковидные, грамотрицательные, обладающие капсулой, не имеющие спор, монотрихиальные бактерии размером 0,5 - 1,0 х 1,5- 3,0 мкм;

-второй,составляющий меньшую часть, был представлен крупными - 0,8 х 2,4 - 3.0 х 10,0 мкм грамотрицательными подвижными бактериями, имеющими капсулу.

В мазках, окрашенных по Граму, бактерии зтих двух групп заметно отличались друг от друга. Короткие, толстые,часто более интенсивно окрашенные по полюсам клетки бактерий первой группы имели явную тенденцию к образованию конгломератов.В таких скоплениях контакт между бактериальными клетками был неплотным, иногда между клетками наблюдалась едва заметная розоватая аморфная масса.Фазо-во-контрастная микроскопия показала, что скопления этих бактерий окружены полупрозрачным студенистым матриксом, что позволило нам отнести эти микроорганизмы к группе зооглейных бактерий.Отдельные клетки этих бактерий были свободны от студенистого матрикса и обладали подвижностью.Интересно отметить, что движение зооглейных бактерий было более интенсивным и продолжительным в препарате "раздавленной капли" по периферии капли или вокруг воздушных пузырьков, оставшихся между предметным и покровным стёклами.

Бактерии второй группы лучше воспринимали фуксин и в мазках, окрашенных по Граму, выделялись своим интенсивно-красным цветом на фоне розовых зооглейных бактерий.Столь же очевидными были различия по форме бактериальных клеток. Крупные палочковидные клетки бактерий второй группы образовывали длинные цепочки, отдельные клетки были подвижны. Совокупность морфологических признаков позволила отнести эти нитчатые бактерии к роду ЭрЬаегоШиБ.

Часто наблюдали взаимодействие популяций зооглейных и нитчатых бактерий: бактерии рода БрИавгоШиз, соединённые в длинные, взаимопересекающиеся цепочки, покрытые тонкими чехлами, образовывали подобие каркасов, вокруг которых зооглейные бактерии формировали скопления клеток, заключённых в студенистые матриксы.

По мере роста указанных бактерий жидкая питательная среда теряла свою прозрачность, в ней появлялись хлопья,на'её поверхности образовывалась мощная бугристая плёнка. На 2-5 сутки культивирования хлопья, достигающие 1-2мм в диаметре, оседали,формируя мощный осадок, похожий на активный ил в аэротенках.

Основываясь на данных, об основных компонентах лиофилизиро-ванного активного ила, приступили к исследованию проб активного ила непосредственно из аэротенков.С этой целью исследовали аэро-тенк N 13,очищающий сточные вопи свиноводческого комплекса.Макроскопически активный ил в исследуемом аэротенке представлял собой темно-коричневые хлопья размером до Змм в диаметре.При аэрации аэротенка или при встряхивании сосуда с отобранным материалом флокулы активного ила равномерно заполняют весь объём воды.

В состоянии покоя флокулы постепенно оседают,при атом граница раздела между отдельными флокулами продолжает оставаться заметной достаточно долгое время, вплоть до окончательного формиро-

вания плотного, визуально однородного осадка. Макроскопическая картина была аналогична наблюдаемой при длительном культивировании жидкой питательной среды, инокулированной лиофилипированным активным илом,однако флокулы были более плотными и интенсивно окрашенными. !а микроскопическом уровне различия заключались в том, что флокулы в культурах, полученных из лиофилизировапшго активного ила, были образованы только микроорганизмами,а в структуре естественных флокул сирого активного ила встречается множество посторонних включений:' минеральных частичек, остатков растительной ткани и т.д.

Другим очевидным отличием сырого активного ила от лиофили-зированного является наличие простейших. В сиром иле Protozoa многочисленны и разнообразны. Больше всего в активном иле представителей отряда раковинных корненожек (Testacea).При изучении образцов активного ила при малом увеличении (X 70) в поле зрения светового микроскопа видно до десятка раковинных корненожек. Чаще всего это различные виды рода Euglypha, отличающиеся размерами и формой кремниевых пластинок раковины. Много в изучав мом активном иле и представителей класса Infusoria. Исследование фиксированных глутаровым альдегидом препаратов активного ила методами световой и электронной микроскопии показало, что большая часть Protozoa находится в тесном контакте с флокулами.

Фазово-контрастная микроскопия витальных препаратов активно»

го ила позволила установить, что простейшие не включены в структуру флокул, а находятся в свободном состоянии,концентрируясь на их поверхности, и активно поглошдют биомассу флокул.Но наиболее нагляден был процесс поедания активного ила коловратками:их крупные (по сравнению с Protozoa) размеры позволяют наблюдать, как

они поглощают эооглейные бактерии вместе с окружающим их студенистым матриксом. Поскольку Protozoa и коловратки являются эука-риотическими организмами, их подробное изучение не входило в круг поставленных задач.

Таким образом, было обнаружено три основных элемента в структуре консорциума активного ила исследуемого аэротенка: аоог-лейные бактерии, нитчатые бактерии и различные микроскопические эукариотические организмы.При этом флокулирующие эооглейные бактерии составляли подавляющее большинство, что позволило отвести им ведущую функциональную роль в биоценозе активного ила. По совокупности морфологических признаков флокулирующие бактерии предположительно отнесли к роду Zoogloea.

Выделение и идентификация бактерий рода Zoogloea. Основным материалом, из которого выделяли бактерии рода Zoogloea, был "сырой" и лиофилизированный активный ил из исследуемого аэротенка. Кроме того, эти бактерии выделяли из плёнок'обрастания камней проточного биофильтра, доочищающего воду на выходе из исследуемого аэротенка.

После инокуляции двухфазной среды накопления уже через 18-20 часов культивирования зооглейных бактерий образуется поверхностная плёнка ,

При пересеве суспензии поверхностной плёнки на CY-arap колонии. характерные для бактерий рода Zoogloea, формировались достаточно медленно,становясь видимыми невооруженным глазом не ранее чем через 48 часов.

Всего для работы был отобран 21 штамм.Все они по морфологическим и культуральным свойствам соответствовали бактериям рода Zoogloea.Тест с диметил-п-фенилендиамином позволил установить ци-

тохромоксидаэную активность только у 12-ти ив них.

Результаты тестов по определению биохимических свойств этих штаммов показали значительные расхождения между ними. Явное несовпадение характеристик штамма 131 с даннг ш,приведёнными в "Определителе бактерий Берги" (1974) не позволило отнести его к бактериям рода Zoogloea.

Таким образом, в процессе идентификации были отобраны для дальнейших исследований 11 штаммов бактерий, принадлежащих к единственному виду их рода - Zoogloea ramigéra.

Морфологические свойства Zoogloea ramigera.Морфология бактериальных клеток у различных штаммов 7<">ogloea ramigera была сходной. Они представлены короткими толстыми грамотрицательными палочками. Концы бактериальных клеток были закруглёнными,иногда - тупыми, редко - коническими. Множество подвижных клеток наблюдали как в молодых бульонных культурах, так и в суспензии из колоний с плотной среды.

Электронномикроскопические исследования позволили установить наличие у бактерий монотрихиальных жгутиков,которые были очень хрупкими.Часто наблюдали повреждённые жгутики, лежащие рядом с бактериальными клетками.

Метод световой микроскопии позволил наблюдать у Zoogloea ramigera выраженные капсулы. Они были видны как в мазках с тушью из бульонных культур, так и в окрашенных фуксином препаратах из колоний на CY-агаре.

При наращивании Zoogloea ramigera на стекле слой иммобилизованных клеток становился заметным невооружённым глазом на 2-е сутки культивирования. Электронномикроскопические исследования позволили установить , что на начальных сроках культивирования на

поверхности стекла прикреплялись единичные молодые клетки 2оог1о-еа гат!еега. Они имели форму коротких толстых палочек,близкую к сферической.По мере роста (2-й сутки)в культуре начинали преобладать делящиеся бактерии.их количество увеличилось,клетки приобретали удлинённую форму.

. Вокруг клеток наблюдали капсулу, обычно окружённую плотным полупрозрачным чехлом. В дальнейшем такие клетки склеивались, образуя единый матрикс в виде гонкого покрова, который на 3 сутки утолщался и под ним были видны лишь контуры клеток гоог1оеа гаш1-дега. Полученные данные о полисахаридной природе матрикса согласу ютя с данными литературы о способности гоод1оеа гаш!дега продуцировать нерастворимые в воде экзополисахариды, плотно связанные с бактериальными клетками, обладающие устойчивостью к воздействию различных биогенных и абиогенных факторов.

Культуральные свойства 2ооа1оеа ramlgera.Ha плотной среде бактерии 2оод1оеа гаш1вега формировали плоские, бесцветные, полупрозрачные колонии с ровными краями. По мере старения центральная часть колоний уплотнялась.становясь непрозрачной, бактериаль ные клетки в ней (по данным микроскопии)были плотно упакованы и располагались близко друг к другу.В периферической части колоний клетки лежали более рыхло, погружённые в межклеточный студенистый матрикс.Края колоний с возрастом становились более изрезанными.В старых культурах часто наблюдали плотные .непрозрачные тяжи, ради-аньно расходящиеся от центра колоний. Диаметр колоний не превшая 2-3 мы.Они, как правило, имели очень плотную консистенцию и отделялись бактериологической петлёй от поверхности среды целиком, практически не деформируясь.Иногда в старых культурах некоторые колонии были менее плотными,разрастались до 5мм и проявляли

тенденцию к сливному росту. У них был характерный для гоо^оеа га-пигега изрезанный край, они имели аморфную, полупрозрачную.окантовку. При пересеве таких колоний на свежий СУ-агар наблюдали рост обычных колоний, описанных выше .

Культуральные особенности гоог1оеа гат1(?ега в жидкой среде были типичными для бактерий этого вида. В пробирках при культивировании без активного перемешивания среды образовывалась поверхностная плёнка .которая утолщалась и уплотнялась по мере роста. На начальных этапах культивирования нередко наблюдалось "кружевное" строение поверхностной плёнки,у 5-7 суточных культур онз становилась массивной, один из краев отрывался от стекла и о-.а свободно свисала вдоль стенки пробирки. От плёнки,вплоть до ю-мента её отрыва, отсоединялись мелкие - 0.2-1мм в диаметр» -хлопья,оседающие на дно в виде более или менее плотного осадка. На стенках пробирок со старыми культурами была заметна плёнка обрастания.

Культивирование гоое1оеа гаш1гега во флаконах с дополнительной аэрацией при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке приводило к интенсивному флокулообразованию:крупные, плотные фло-кулы практически ничем не отличались по внешнему виду от активного ила из аэротенков.Интенсивность флокуляции варьировала у различных штаммов.При исследовании бульонных культур с помощью фазсг-во-контрастной микроскопии наблюдали как аморфные, так и ветвящиеся зооглейиые колонии.

Наблюдение за ростом выделенных штаммов эооглейных бактерий в жидкой питательной среде позволило изучить процесс флокуляции, состоящий из следующих фаз:

1.Бурное размножение эооглейных бактерий,заполнение всего

- 4<э

объёма питательной среды подвижными,свободно плавающими бактериальными клетками, что макроскопически проявляется сильным помутнением среды.

2.Образование микрофлокул; при этом можно наблюдать на поверхности флокул древовидные выросты, характерные для бактерий рода гоов1оеа.

3. Объединение микрофлокул в ыакрофлокулы; свободно плавающими остаются единичные бактериальные клетки, макроскопически наблюдается образование хлопьез и частичное просветление среды.

. 4.Осаждение флокул (свободно плавающие бактериальные клетки практически не выявляются), выпадение осадка и полное просветление среды.

Интенсивность флокуляции у разных штаммов была различной. Если первые две фазы заканчивались у всех штатов через 13-24 часа после инокуляции,то наступление третьей и четвёртой происходило на 2-е - 4-е сутки.Выделенные штамма 2оое1оеа гат1дега условно разделили на две группы: штаммы, начинающие.флокулировать к концу первых суток культивирования, и штаммы, флокулирующие позже этого срока. Критерием флокуляции служил уровень раздела фаз после отстаивания культур в течение часа.

Изучение влияния гоое!оеа гаш!кега на снижение численности сторонних бактерий при очистке сточных вод активным илом.Сле"ую-щим разделом исследований было выявление ведущего механизма, обеспечивающего снижение численности бактерий (в том числе и патогенных) в сточной воде при её очистке активным илом.

Результаты экспериментов по выявлению способности гоог1оеа гаш^ега продуцировать антибиотикоподобные вещества, как одного из возможных механизмов антагонистической активности э дали ожи-

даемого положительного результата. Полученные данные можно объяснить тем, что в естественных условиях Zoogloea ramigera обитает в водной среде, поэтому использование плотных питательных сред не является оптимальным для её существования.

Накопленные в ходе исследований сведения указывали на то, что механизм, обеспечивающий снижение количества бактерий в ходе очистки сточных вод, связан с процессами биофлокуляции.Известно, что на поверхности студенистого матрикса Zoogloea ramigera происходит интенсивная адсорбция ионов растворённых веществ и адгезия мелкодисперсных биогенных и абиогенных частиц (Громов Б.В. .1989) . Логично было предположить, что и клетки сторонних патогенных и непатогенных бактерий включаются в этот процесс.

Для подтверждения этого предположения была разработана методика иммобилизации зооглейных клеток на поверхности стекла.

В ходе эксперимента испольвовали два штамма Zoogloea ramigera: штамм 196 - с высокой интенсивностью флокулообразования и штамм 201 - с низкой интенсивностью флокулообразования.

Изучение препаратов иммобилизованных на стекле клеток Zoogloea ramigera с помощью сканирующей электронной микроскопии позволило наблюдать адгезию стафилококков к поверхности зооглейных бактерий. Эта способность была более выражена у штамма19б.При одном и том же инструментальном увеличении мы наблюдали примерно на порядок больше стафилококков, адгезированных к поверхности клеток этого, штамма, чем штамма 201. Если количественное различие адгезии у двух, штаммов Zoogloea ramigera было очевидным, то качественных отличий обнаружить не удалось. Изучение препаратов методом сканирующей электронной микроскопии при большом инструментальном увеличении позволило наблюдать тесный контакт между бактериальными

клетками Staph, aureus и Zoogloea ramigera. Стафилококки как. бы погружались в зооглейный матрикс и были вдавлены в поверхность клеток Zoogloea ramigera.

Аналогичную картину наблюдали при взаимодействии монослоя Zoogloea ramigera и эшерихий.Использовали два штамма E.coll: патогенный штамм К-12 и патогенный штамм с адгезивным антигеном К-88. Разницы в процессе взаимодействия бактерий различных штаммов отмечено не было.

Клетки тест-штаммов имели нормальную,свойственную для бакте-

t

рий их вида форму.Это явление мы склонны объяснять непродолжительным временем контакта Zoogloea ramigera и клеток тест-штаммов. Результаты предыдущих исследований лаборатории, подтверждаемые данными литературы, показывают, что процесс адгезии развивается в течение 1-3 часов.В опытах время контакта бактериальных популяций составляло 1 час.

Для дальнейшего изучения выявленного феномеьа провели модельные эксперименты, приблизив их к реальным производственны)»! условиям, дополнительной аэрации и ограниченному' поступлению тщательного субстрата.

Совместное культивирование в жидкой питательной среде выделенных штаммов Zoogloea ramigera 196 ,201 и тест-штаммов Staph.aureus и E.coll проводили в течение 48 часов, что cootp^tc-твовало продолжительности технологического цикла работы аэротен-ка.

На первом этапе отбирали пробы для определения концентрации тест-шт&ммов сразу после прекращения перемешивания среды. Результаты эксперимента показали некоторое снижение количества E.ooli и Staph.aureus ß опытах с обеими штаммами Zoogloea ram' ira, однако

значительного уменьшения концентрации тест-штаммов не происходило.

'Следующим этапом было определение kohl нтрации бактериальных клеток тест-шгаммов в осадке и в надосадочной культуральной жид- кости. Было' установлено, что после раздела фаз происходит значительное снижение их количества в надосадочной культуральной жидкости за счёт их концентрации в осадке. Эта тенденция также была более выражена в опытах с активно флокулирующим штаммом Zoogloea ramigera 196 (Рис.),2).

Исследование осадка методом чанирующей электронной микроскопии позволило установить, что часть бактериальных клеток E.coli приобретали сферическую форму.Атипичные сферические клетки эшерихий имели гладкую поверхность; их размеры варьировали в пределах от 0.5 до 2 мкм. Стафилококки сохраняли присущую им форму, однако диаметр клеток был неодинаковым.Поверхность бактериальных клеток была бугристой. На поверхности зооглейного матрикса были видны скопления мелких клеточных форм стафилококков диаметром 0.2-0.5 мкм.Переход части стафилококков и эшерихий в гетероморф-ный рост при взаимодействии с популяцией Zoogloea ramigera можно объяснить биологической приспособляемостью патогенных и непатогенных бактерий к неблагоприятным условиям их существования,в данном случае - адгезии на студенистом матриксе.

Заключительным этапом работы было исследование проб воды и активного ила по санитарно-бактериологическим показателям. За 48 часов технологического цикла работы аэротенка происходило снижение общего микробного числа с 1х107К0Е/мл до 1х103К0Е/мл. Бактерии группы кишечных палочек в исходной сточной воде были выявлены в разведении 10~5, а в очищенной воде - в разведении Ю-2.

- 2Q -

Рис Л. Количество E.coll в над осадочной культуоальной жидкости (1) и осадке (2) через 48 часов взаимодействия с fc.ramlgera 190, 201

lg-KOE/мл

196 • 201

Рис.2.Количество Staph.aureus в надосадочной культуральной жидкости (1)и осадке (2) через 48 часов взаимодействия с Z.ramigera 196, 201 Примечание: 196-штамм с высокой биофлокулирующей способностью, 201-штамм с низкой биофлокулирующей способностью

В активном иле, оставшемся в аэротенке после слиза еоды в конце технологического цикла, эти показатели составляли 1хЮ6К0Е/кл и 1СГ3 соответственно. - В исхо юй сточной коде из 30 культур зтерихий 1-2 культур били отнесены к энтеропатогенным 15 культур к серогруппе 09,2 )сультуры - к серогруппе 0115 и по одной культуре - к серогруппам 04,020,0119,026,041). В очищенной воде из 30 культур зшерихйй 1 культура была отнесена к энтеропатогенным зшерихиям серогруппы 01. Сальмонелл в стоках обнаружено не было. Напученные результаты подтверждают данные модельных экспериментов о непосредственном влиянии пргчесса биофлокудяции на снижение количества бактерий (в том числе и патогенных)в сточных водах. Повышение интенсивности флокуляции приводит к увеличению связываемых с флокулами и осаждаемых бактерий.

Таким образом, для Zoogloea ramigera показано, что одной из форм микробного антагонизма может являться способность к биосинтезу высоковязкого студенистого межклеточного матрикса- "ловуш-ки"для сторонних бактерий.

С Ы В О Д Ы

1. Установлено, что биоценоз активного ила азротенка, функционирующего в периодическом полунепрерывном режиме, состоит из трёх основных структурно-функциональных компонентов: флокулирую-щих бактерий, нитчатых бактерий,микроскопических одноклеточных и многоклеточных эукариотических организмов.При этом ведущая роль принадлежит флокулирующим эооглейным бактериям.

2. Выделенные из активного ила флокулируюшие бактерии были идентифицированы и отнесены к виду Zoogloea ramigera. Методические поиёмы, подобранные для этих целей, легко воспроизводимы, не тре-

буют сложного оборудования и дорогостоящих реактивов.

3. Впервые методами световой и электронной микроскопии изучена морфология Zoogloea ramigera на клеточном и популяционном уровнях в жидкой и на плотной питательных средах.

4.Изучение совокупности культуральных и морфологических свойств Zoogloea ramigera при различных сроках культивирования в жидкой питательной среде позволило определить 4 основные фазы процесса биофлокуляции.

5.Показано различие в интенсивности процесса флокулообраэо-

I

вания у разных штаммов Zoogloea ramigera. Критерием оценки флоку-лирущих свойств штамма служит установление границы уровня раздела фаз между осадком и надосадочной культуральной жидкостью после отстаивания суточной культуры Zoogloea ramigera. По этому критерию они подразделяются на штаммы с высокой и низкой биофлокулиру-юмей способностью.

6. Впервые изучена способность Zoogloea ramigera адгезировать на поверхности полисах аридного матрикса клетки патогенных и непатогенных бактерий.Разработанная для изучения этого процесса методика позволяет вести исследования методом световой и электронной сканирующей микроскопии.

7.Лабораторные и производственные испытания позволили установить, что одним из механизмов антагонистической активности Zoogloea ramigera является включение клеток сторонних бактерий в структуру формирующихся флокул и их осаждение в процессе биофдо-куляции.Часть бактерий, включённых в структуру флокул, переходит в гетероморфный рост.

8.Выявлена способность интенсивно фяокулирующих штаммов Zoogloea ramigera более эффективно осаждать клетки бактерий, снижая их численность в очищаемой воде.Результаты исследования поз-

воляютрекомендовать дляповышения эффективности очистки сточных вод в аэротенках использование штаммов 2оог1оеа гат1кега с высокой биофлокулирующей способностью, в частности, штамма 196.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДИССЕРТАЦИИ

1.Барков А.В.Экологические аспекты антагонизма бактериальных популяций./Гигиена, ветсанитария и экология животноводства.Материалы Всероссийской научно-производственной конференции.-Чебоксары.-1994 г.-С.33-34.

2.Барков А. В.Процесс флокуляции активного ила и механизмы деконтаминации в аэротенках./Проблемы ветеринарной санитарии и экологии.Сборник научных трудов.-Том 97.-1995.-С.115-120.

3.Барков А.В.Межвидовая конкуренция в микробиоценозе активного ила аэротенков./Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования.Тевисы докладов международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов.-Воронеж.-1995.-С. 150-151.

ВНИИ8СГЭ, 1995 г.,Москва, Звенигородское «..5, зак. тира* 80 зкз.