Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств

Цыганова, Светлана Вячеславовна

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Цыганова, Светлана Вячеславовна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств

На правах рукописи

ЦЫГАНОВА СВЕТЛАНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

1 и \т *

Санкт-Петербург 2009 г.

003469907

Работа выполнена в отделе микробиологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства

Научный руководитель -

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Борисенкова Адель Наумовна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Калишин Николай Михайлович

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, Шумилов Константин Васильевич

Ведущая организация - ФГОУ ВПО «Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита состоится «04» июня 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул.Черниговская, д. 5, тел. (812) 388-36-31.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины».

Автореферат разослан «04» мая 2009г. Учёный секретарь —*"" *

днссертациойного совета Л.М.Белова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди болезней, общих для человека и животных, бактериальные болезни занимают ведущее место. Наличие их в хозяйстве негативно сказывается не только на эпизоотической ситуации, но и на экономике предприятия (Борисенкова А.Н., 2007). Наибольшая роль отводится сальмонеллезам. В течение последних почти трёх десятилетий доминирующим серовариантом, вызывающим заболевание людей и циркулирующим в птицехозяйствах, является S.enteritidis. В настоящее время промышленное птицеводство является ведущим производителем высококачественной диетической продукции. Поэтому контроль эпизоотической ситуации птицехозяйств в отношении сальмонеллёза является основой стратегии по уменьшению рисков, связанных с пищевыми продуктами.

Установлено, что основной составляющей заболевания людей являются контаминированные патогенной микрофлорой пищевые продукты — 91%. Факторами передачи в 60% являются употребление заболевшими яиц, в 22% — мяса птицы, в 9% — прочих продуктов (Пережогин А.Н., 2007). При проведении микробиологического мониторинга в птицехозяйствах различного технологического направления установлено, что процент выделения S.enteritidis из патологического материала и помёта зависит от эпизоотической ситуации в каждом конкретном хозяйстве. Он составляет от 4,3% до 42,2%, Escherichia coli -до 72,9%, Pseudomonas aeruginosae - до 7,4%, Staphylococcus и Streptococcus до 6,5% (Борисенкова А.Н., Рождественская Т.Н., Новикова О.Б, 2007).

Статистический мониторинг и анализ данных ветеринарных отчетов выявил возрастание числа неблагополучных пунктов по сальмонеллезу в РФ: от 60-ти в 1991 г. до 170-ти в 2001г.

Для профилактики сальмонеллеза в промышленном птицеводстве разработана система контроля, включающая в себя 9 основных этапов, в т.ч. контроль с применением эффективных антибактериальных препаратов, сульфаниламидов и нитрофуранов (Борисенкова А.Н., 2001, 2004). Однако длительное применение их ведёт на начальном этапе к снижению чувствительности возбудителей к лекарственным средствам, следствием чего может быть увеличение лечебных доз в 1,5-2,0, а иногда и в 3,0 раза (Малахеева Л.И., 2007), а в конечном итоге к селекции резистентных возбудителей. Значительное негативное действие обусловлено применением в ветеринарии антибиотиков медицинского назначения, поэтому во многих странах вводятся ограничения на применение антибиотиков в ветеринарии.

В связи с этим в ветеринарной практике всё большее применение находят экологически безопасные препараты. В частности, бактериофаги. Применение их в комплексе ветеринарно-санитарных мероприятий даёт высокий терапевтический эффект.

За последние годы в ветеринарной практике с целью диагностики

(Гаврилов В.А., Васильев Г.Г., Литусов Н.В. и др., 2004), лечения (Натидзе М., Ригвава С., Толкликишвили Т., 2004; Леонтьева И.А., 2004;Розовенко Л.Н., 2005) и профилактики болезней стали широко применяться бактериофаги (Barrow and Soothill, 1997).

Levin и Bull (1996) и Broxmayer Lawrence (2004), опубликовали обзоры работ по применению фаготерапии у животных, выполненных в Великобритании и США. В связи с вышеперечисленным мы решили провести исследования по выделению и применению бактериофагов в птицеводстве.

Цель работы. Целью настоящих исследований явилось выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц, изучение их биологических свойств и применение против сальмонеллёза и стафилококкоза птиц.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

- освоить методику выделения, выделить бактериофаги из внутренних органов птицы и сточных вод и предложить оптимальную питательную среду для получения максимального количества бактериальной массы культур-кормилок;

- определить фазу логарифмического роста чувствительных к бактериофагам культур-кормилок Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus для максимального выделения бактериофагов;

- провести электронную микроскопию полученного бактериофага против Salmonella enteritidis и изучить его биологические свойства;

- изучить безвредность и эффективность выделенных бактериофагов в

экспериментальных и производственных (на ограниченном поголовье)

условиях.

разработать методические рекомендации по выделению

бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц.

Научная новизна.

Впервые выделены бактериофаги из внутренних органов гусей против Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus и из сточных вод гусеводческого хозяйства против Pseudomonas aeruginosa.

Впервые в сравнительном аспекте была определена фаза логарифмического роста Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus при культивировании на агаре из панциря криля (АПК), агаре из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонном агаре (МПА) и модифицированных нами средах: кровяном агаре Левинталя (МПАкр), среде Блаурокка (АПБ) и агаре на основе мяса курицы (КА).

Установлены сроки наступления фаз логарифмического роста и выхода бактериальной массы для этих культур в зависимости от питательности среды.

Предложена методика качественного определения чувствительности исследуемых культур к бактериофагам методом дисков.

Изучена эффективность выделенных бактериофагов в отношении Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus методом выпаивания цыплятам разного возраста в экспериментальных условиях.

Показана эффективность применения выделенного нами бактериофага «1ВР-1» против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях;

- Получен патент на изобретение № 2342429 «штамм бактериофага bacteriophagum salmonella IBP-1, обладающий лизирующей активностью по отношению к S. enteritidis».

Практическая значимость. Разработанные «Методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц» утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, академиком A.M. Смирновым 10.03.2009 г. и качественный метод дисков для оценки литической активности бактериофагов могут быть использованы в работе врачами-бактериологами лабораторий.

Предложенная нами питательная среда для получения бактериальной массы культур - кормилок в процессе изготовления бактериофага может быть использована в лабораторных условиях;

Предложенный нами бактериофаг против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц «1ВР-1» можно рекомендовать как эффективную альтернативу антибиотикам.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Методика выделения бактериофага из внутренних органов птицы и сточных вод.

- Определение фазы логарифмического роста чувствительных к фагам культур - кормилок Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus при культивировании на агаре из панциря криля (АПК), агаре из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонном агаре (МПА) и модифицированных нами средах: кровяном агаре Левинталя (МПАкр), среде Блаурокка (АПБ) и агаре на основе мяса курицы (КА).

- Бактериофаг «1ВР-1» против Salmonella enteritidis инфекции птиц.

- Качественный метод дисков для оценки литической активности бактериофагов.

- Методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований заслушаны на заседаниях Методических Советов отделов микробиологии и паразитологии ГПУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2004-2007 гг.); Учёных Советов ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2004-2007 гг.); на конференции-школе молодых ученых и аспирантов Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии (Санкт-Петербург -Пушкин, 2005г); на XIX Международной научно-практической конференции

«Новые фармакологические средства в ветеринарии» СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2007г.); на научно-практической конференции «Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы», посвященной памяти академика Россельхозакадемии Р.Н.Коровина (5-6 июня 2007 г., ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована 27 рисунками, из них: 10 фотографий, 7 таблиц, 10 графиков. Список использованной литературы включает 219 источников, в том числе 56 работ иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований.

Исследования проводили с 2004 по 2007 год в отделе микробиологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства (ГНУ ВНИВИП) в соответствии с программой НИР, номер государственной регистрации 08.07.08. Исследования проводили в 10-ти птицехозяйствах различного технологического направления.

В лабораторных опытах было использовано 146 цыплят, в том числе 60 цыплят суточного возраста, 32 цыпленка 25-30-ти дневного возраста, 40 цыплят в возрасте 60 дней, 14 цыплят 105-дневного возраста и 103 куриных эмбриона 9-ти дневного срока инкубации.

В процессе выделения и изучения биологических свойств бактериофагов были использованы 157 культур, выделенных из патологического материала 10-ти птицефабрик различного технологического направления. Из них: Salmonella enteritidis - 35, Escherichia coli - 99, Staphylococcus aureus - 23.

Для выделения бактериофагов методом обогащения в качестве источников выделения были использованы внутренние органы гусей и сточные воды одного из птицехозяйств.

Получение бактериофага методом обогащения сводилось к тому, что в жидкую питательную среду вносили исследуемый материал и одновременно молодую (не старше 18-24 часов роста) культуру соответствующего микроорганизма.

Среду помещали в термостат при температуре 30-35°С. Каждые 30 минут проводили наблюдения за исследуемыми пробирками под контролем среды, в которую добавлена только культура микроба без исследуемого материала.

При наличии фага в исследуемых пробирках, после появления роста наступало в разной степени выраженное просветление; в пробирке же, в которую добавлена только одна культура, был обычный усиливающийся рост микроба. Независимо от того, наступало просветление или нет, смесь культуры с исследуемым материалом фильтровали через фильтр Зейтца. Полученный фильтрат снова вносили в жидкую питательную среду вместе с молодой культурой микроорганизма для повторного наблюдения в тех же условиях.

Для опыта по определению фазы логарифмического роста культур Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus в трех повторностях были использованы следующие среды:

агар из панциря криля (АПК), агар из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонный агар (МПА) и модифицированные нами среды: кровяной агар Левинталя (МПАкр), среда Блаурокка (АПБ) и агар на основе мяса курицы (КА). Определение концентрации живых микроорганизмов на плотных питательных средах определяли по Ашмарину (1962).

Биологические свойства выделенного бактериофага оценивали по морфологии колоний, активности, литическому спектру действия.

Определение чувствительности культур и спектра литнческой активности к выделенному бактериофагу определяли по Отто и методом дисков.

Морфология выделенного фага и размеры фаговых частиц были изучены под электронным микроскопом. Препараты для электронно-микроскопического исследования готовили по стандартной методике (Doan F.W., Anderson N., "Electron Microscopy in Diagnostic Virology", Cambridge, 1987). Лизат бактерий предварительно осветляли центрифугированием при 5000 об/мин, 20 мин, затем производили осаждение вирусных частиц путем высокоскоростного центрифугирования надосадка при 120000 g, 1 час на центрифуге Beckman L8 (США). Осадок ресуспендировали в дистиллированной воде и контрастировали 1,5% раствором натриевой соли фосфовольфрамовой кислоты (рН 6,7).

Исследование препаратов производили на просвечивающем электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония) при увеличении 10 000 -50 000.

Стерильность бактериофагов определяли по общепринятой методике.

Безвредность бактериофагов определяли на модели суточных цыплят и куриных эмбрионах.

Эффективность полученного бактериофага изучали на цыплятах в экспериментальных и на ограниченном поголовье кур в производственных условиях.

Достоверность различия результатов контроля и опыта определяли по Ашмарину (1962г.).

Для проведения опыта в ГНУ ВНИВИП разработали «Временное наставление по применению бактериофага «1ВР-1» против сальмоиелла-энтеритидис инфекции птиц», утвержденные директором ГНУ ВНИВИП

Джавадовым Э.Д. от 10.09.2007 г. и программу комиссионного лабораторного испытания бактериофага от 01.10.2005 г. Для проведения испытания эффективности бактериофага в производственных условиях на ограниченном поголовье было подобрано хозяйство, где в мясе куры ФГУ «Ленинградской межобластной ветлабораторией» была выделена сальмонелла (протокол лабораторных испытаний образца продукта № 939 (2) от 02.11.06 г.).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Выделение бактериофагов.

Методом обогащения исследовали 16 проб из внутренних органов павших гусей и 30 проб сточных вод гусеводческого хозяйства Ленинградской области. Всего было выделено три бактериофага: против Salm, enteritidis, Staph, aureus и Pseudomonas aeruginosa.

По общепринятой методике из внутренних органов павших гусей (сердце, легкие, почки) были выделены два бактериофага: против S. enteritidis и против S. aureus. Из сточных вод выделили бактериофаг против Ps. aeruginosa.

•

Для получения чистых колоний фагов клонировали морфологически однотипные негативные колонии 8 раз и высевали по методу Грациа из 10-ти кратных разведений фаголизата суспензии.

Для усиления вирулентности бактериофагов, проверки чувствительности культур были использованы культуры микроорганизмов, выделенные из внутренних органов, эмбрионов и проб куриного помета из птицефабрик различного технологического направления и вивария ГНУ ВНИВИП. Всего было использовано 157 проб. Из них выделено культур E.coli - 99; S. enteritidis - 35; S. aureus - 23;

2.2.2. Определение фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus на различных плотных питательных средах.

Для максимального получения фаговых частиц при воздействии бактериофага на фагочувствительную культуру необходимо, чтобы она находилась в фазе логарифмического (экспоненциального) роста. В этой фазе значительное количество клеток микроорганизма вовлечено в клеточное деление, сами клетки слабо вакуолизированы и очень подвержены всякого рода химическим, физическим и биологическим влияниям. Поскольку бактериофаг является вирусом для клетки, то для заражения клетки этим вирусом мы и выбирали наиболее подходящий момент в развитии фагочувствительной клетки.

Для определения фазы логарифмического роста использовали восемнадцатичасовую культуру, выращенную в жидкой среде. Культуру вносили через определенные интервалы времени на агар из панциря криля (АПК), агар из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонный агар

(МПА) и модифицированные нами среды: кровяной агар Левинталя (МПАкр), среда Блаурокка (АПБ) и агар на основе мяса курицы (КА). Проводили также оценку ростовых свойств плотных питательных сред при оптимальных для каждой культуры условиях по количеству сформировавшихся КОЕ/см3 среды.

Обработку результатов проводили по Ашмарину (1962). На основании результатов были построены графики, где по оси абсцисс отметили время роста культуры в бульоне, откуда через каждые 2 часа в течение 21 часа отбирали материал для посева на агаризованные среды, а по оси ординат -десятичный логарифм роста.

Фаза логарифмического роста для Salmonella enteritidis при концентрации культуры в начале опыта 13 333 333 КОЕ/см3 к 4-му часу наступала на всех средах, но больший выход бактериальной массы дала на АПБ (8,23 lg), затем в порядке убывания: АГК и АПК (7,54 lg), МПА (7,23 lg), КА и МПАкр (6,45 lg). Наибольший выход бактериальной массы при такой плотности засева культуры получили к 4-му часу на АПБ (8,23 lg), к 9-му - на МПАкр (8,75 lg).

Фаза логарифмического роста для Salmonella enteritidis при концентрации культуры в начале опыта 3 ООО ООО КОЕ/см3 быстрее всего наступала на КА -с 0 по 1-й час рост достигал 3,87 lg, выход бактериальной массы к 18-му часу - 4.05 lg; на АГК и МПА с 1 по 2-й (2,88 lg). Выход бактериальной массы к 18-му часу составлял 3,99 lg на этих средах. Остальные среды давали более низкие показатели.

Анализируя данные можно сказать, что на предложенной нами среде из куриного мяса фаза логарифмического роста наступала быстрее (и длилась до 6-го часа), чем на всех остальных средах и выход бактериальной массы к 6-му часу был больше, чем на контрольных средах АГК и МПА.

Логарифмический рост культуры Staphylococcus aureus к 4-му часу наблюдался на всех средах, наибольшее накопление бактериальной массы было на АПБ (8,23 lg), затем в порядке убывания: МПА (8,05 lg), АГК (7,55 lg), АПК (7,23 lg), КА (6,92 lg). Выход бактериальной массы к 18-му часу наибольший на КА - 7,95 lg и затем в порядке убывания: МПА (7,77 lg), АПК (7,51 lg) и АГК (6,75 lg).

Фаза логарифмического роста культуры Escherichia coli к 4-му часу также наблюдалась на всех средах, но больший выход бактериальной массы был на КА и МПА с одинаковыми значениями 8,53 lg, меньший рост наблюдался при культивировании на АГК, АПК, АПБ и МПАкр также с одинаковыми значениями 8,23 lg. Выход бактериальной массы составил к 18-му часу на средах МПА (8,64 lg), АГК (8,62 lg) и КА - 8,5 lg. Разница между значениями составляла 0,02-0,14 lg (рис. №1,2).

2.2.3. Биологические свойства выделенных бактериофагов.

Биологические свойства изучали у сальмонеллезного и стафилококкового бактериофагов.

Штамм сальмонеллезного бактериофага «IBP-1» образует прозрачные зоны лизиса диаметром 1,5-2,0 мм с небольшим (около 1 мм) ореолом частичного просветления на газоне чувствительных культур S.enteritidis. Центр колоний прозрачный, край чёткий, вторичный рост отсутствует.

Выделенный бактериофаг против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц, обозначенный нами как «IBP-1», не инактивируется антисыворотками, полученными к другим серовариантам Salmonella spp. из коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (10 различных серовариантов). Константа инактивации фага гомологичной антисывороткой (К) составляет 85 мин.

При определении активности бактериофага «IBP-1» титр по Аппельману составил 10^, по Грациа (БОЕ/см3) - 1,7-2x109 .

Бактериофаг IBP-1 сохраняет литические свойства при хранении его при температуре +4°С - +6°С в пептонной воде в течение 1 года. Периодичность пересевов 1 год. Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 4550 мин, урожайность - 75-80 частиц на одну клетку.

Штамм сальмонеллезного бактериофага Bacteriophagum salmonella enteritidis IBP-1 и культура S. enteritidis SVZ-5, используемая для поддержания его жизнеспособности, депонированы в коллекции бактериологической лаборатории №3 испытательного центра ГОУ ВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова кафедры эпидемиологии под номером 0048.

Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 40 мин при 55°С. Пределы допустимых значений pH, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 5-11. Устойчив к хлороформу.

Штамм выделенного стафилококкового бактериофага образует прозрачные зоны лизиса диаметром 4,5-5,0 мм с небольшим (около 2 мм) ореолом частичного просветления на газоне чувствительных культур. Центр колоний прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция S. enteritidis из 150 штаммов ГНУ ВНИВИП. Фаг обладает способностью лизировать 76% культур штамма S. enteritidis. Диапазон специфичности: лизирует S. enteritidis, не лизирует Ps.aeruginosa, E.coli и штаммы других представителей нормальной микрофлоры.

Бактериофаг IBP-1 сохраняет литические свойства при хранении его при температуре +4°С - +6°С в пептонной воде в течение 1 года. Периодичность пересевов 1 год. Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 45-50 мин, урожайность - 75-80 частиц на одну клетку.

Рис. № 2 9

Рост staph, aureus на плотных средах.

§ 6

S 4

£ з

I ^ ®

ч:

Е 1

Я Ф SET

J \ ИРИР» 1 Bha •

::Ш N/ ■Hp ' I

I »»:, . .. g

f " . Шит. • . Ж11 ИДИ ■МММ» ШШЩШМШШШШ ЩШШшШШВШШШШтЯ

ЯНВкУ V ; -i щ шшяшт . - ■■ЩВрВ —■ ....... „-..

liibsiä " ии Я1Ш J... ......1 -"г:

3 I 4 1 1 е 8 12 I 15 18 21

• криль

кура

МП А

Ж—МП Акр —•—печет

Полученные нами данные были подтверждены в бактериологической лаборатории № 3 испытательного центра ГОУ ВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова кафедры эпидемиологии.

Проверка спектра литической активности проводилась несколькими способами. Первый метод, предложенный нами, - качественный метод определения литической способности - метод дисков.

Для опыта брали чашки Петри с питательным агаром, засеянные чувствительными к бактериофагам культурами S. enteritidis и S. aureus, E.coli, Ps. aeruginosae и диски собственного изготовления, пропитанные бактериофагами собственного и промышленного производства. В опыте использовали бактериофаги производственного изготовления: гшофаг (бактериофаг против S. aureus, E.coli, Ps. aeruginosae) и полифаг (бактериофаг против S. aureus, E.coli). Бактериофаги собственного изготовления: бактериофаг против S. enteritidis, S. aureus и Ps. aeruginosae в титре Ю 9. Данные представлены в таблице №1.

Таблица № 1.

Определение литической способности бактериофагов методом _дисков____________

№№ Культура Зона задержки роста бактериофагами, мм

Salm-фаг Coli-фаг Staph-фаг Ps- фаг Пиофаг (Уфа) Полифаг (BMA) Физ. раствор

1. Salm, enteritidis 15 - - - - - -

2. E.coli - - - - - - -

3. Staph, aureus - - 15 - - 13 -

4. Ps. aeruginosae - - - 10 15 07 -

5. Контроль среды - - - - - - -

Из таблицы видно, что выделенные бактериофаги не уступают по литической активности производственным. Зоны задержки лизиса на разных культурах от 10 мм. у псевдомонозного бактериофага, до 15 мм. у сальмо - и стафилофагов. Коли-бактериофаг не оказал литического действия, поэтому от дальнейшей работы с ним мы отказались.

Второй способ (по Отго) - путем нанесения капель бактериофагов на чувствительные культуры S. enteritidis, E.coli, S. aureus и Ps. aeruginosa, посеянные "газоном" на мясопептонном питательном агаре. Из таблицы представленных данных видно, что спектр литической активности бактериофага «IBP-1» по Огго распространяется только на S. enteritidis, а спектр литической активности Staph.-фага ограничивается лизисом S. aureus.

2.2.4. Электронная микроскопия выделенного бактериофага «1ВР-1» против сальмонелла - энтеритидис инфекции птиц.

Электронно-микроскопическим исследованием было установлено, что бактериофаг «1ВР-1» имеет головку гексагональной формы размером 80x80 нм., длина хвостового отростка в сокращённом состоянии составляет 104,24 им, в растянутом - 120,25 нм. Выделенный бактериофаг относится к семейству Myoviridae (F.A.Murphy et all, 1995), по классификации А.С.Тихоненко к V морфологической группе «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению» (фото 1).

Фото 1. Выделенный бактериофаг, виден хвостовой отросток фага «1ВР-1» в сокращенном состоянии.

2.2.5.Изучение сальмонеллезного и стафилококкового бактериофагов в экспериментальных условиях.

Эффективность сальмонеллезного и стафилококкового бактериофагов проверяли в экспериментальных условиях на 115 цыплятах, в том числе 62 цыплятах суточного возраста, 32 цыплятах 25-30-ти дневного возраста, 21 цыпленке в возрасте 60 дней и на 103 куриных эмбрионах 9-ти дневного срока инкубации. Были проведены комиссионные лабораторные испытания бактериофага против сальмонелла-энтеритидис инфекции кур «1ВР-1», изготовленного в отделе микробиологии ГНУ ВНИВИП на базе вивария ГНУ ВНИВИП.

Контроль бактериофага на безвредность, был проведён на цыплятах и эмбрионах. При определении безвредности на эмбрионах бактериофаги вводили в ХАП (хориоаллантоисную полость) в дозе 0,5см3. Доза превышала лечебную в 5 раз. Срок наблюдения 7 суток (таблица № 2).

Таблица № 2

Контроль бактериофага па безвредность

на модели 9-ти дневных эмбрионов

№ п/п Название группы Время наблюдений, дни Всего эмбрионов, U1T. Пало выжило

1 2 3 4 5 6 7

1 Бактериофаг «1ВР-1» 5 - 5

2 Стафилококковый бактериофаг 5 5

3 Чистый контроль - - - - - - - 2 - 2

4 Контроль введения 2 - 2

Суточным цыплятам бактериофаги вводили в дозе 2,0 см3 один раз в день в течение пяти дней. Доза превышала лечебную в 7 раз. Срок наблюдения 10 суток (таблица № 3).

Таблица № 3

Контроль бактериофага на безвредность на модели суточных цыплят

№п/п Название группы Время наблюдений, дни Всего пало выжило

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 Бактериофаг «1ВР-1» 10 0 10

2 Стафилококковый бактериофаг 10 0 10

3 Чистый контроль 5 0 5

В течение всего срока наблюдения эмбрионы и цыплята были живы. При патологоанатомическом вскрытии (через 7 суток после окончании опыта) макроскопических изменений не установлено.

Изучение активности выделенных бактериофагов проводили методом выпаивания суточным и 60-ти дневным цыплятам. Для заражения использовали 18-24-часовые бульонные культуры. Исследуемую культуру вводили в дозе 300 млн. микробных тел суточным и 1 млрд. 60-ти дневным цыплятам per os.

Культурой заражали по 5-10 цыплят. За заражёнными цыплятами наблюдали 10 суток. По окончании опыта птица была убита, вскрыта и сделаны высевы на питательные среды.

Первый опыт по контролю бактериофага на активность проводили на 33-х клинически здоровых цыплятах суточного возраста яичной породы. Проверка достоверности различия результатов опыта и контроля проводилась по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф. 1990). Цыплят разделили на 5 групп:

1 группа (4 гол.) заражены S. enteritidis в дозе 300 млн. микробных тел

per os.

2 группа - опыт (10 гол.) заражены S. enteritidis в дозе 300 млн. микробных тел per os, через 1 час после заражения был выпоен бактериофаг в лечебной дозе 2,0 мл 1 раз в день в течение 5 дней.

3 группа (4 гол.) заражены S. aureus в дозе 300 млн. микробных тел per

os.

4 группа - опыт (10 гол.) заражены S.aureus в дозе 300 млн. микробных тел per os, через 1 час после заражения был выпоен бактериофаг в лечебной дозе 2,0 мл 1 раз в день в течение 5 дней. Уровень достоверности (значимости) р<0,01;

5 группа - чистый контроль (5 гол.) - ничем не заражены. Определение достоверности этого опыта определяли так: Контроль и, = 4, х, = 4; опыт п2 = 10, х2 = О

р = 0.001, 2р = 2.58 (из таблицы); \7.\)гр, при р = 0.01,

уровень значимости /><0.01. Доверительная вероятность Р = 0.99.

Второй опыт по контролю бактериофага на активность проводили на 21-м клинически здоровом цыпленке 60-ти дневного возраста яичной породы.

п. = 4,и, = 10, W, = =- = \ Ж = ^-Ж= — = 0

Z -

1-0

-1 75

Цыплят разделили на 5 групп:

1 группа (3 гол.) - заражены S. enteritidis в дозе 1 млрд. суточной культуры per os;

2 группа - опыт (6 гол.) - заражены S. enteritidis в дозе 1 млрд. суточной культуры per os, через 1 час после заражения был выпоен бактериофаг в лечебной дозе 2,0 мл однократно.

3 группа (3 гол.) - заражены S. aureus в дозе 1 млрд. суточной культуры per os;

4 группа - опыт (6 гол.) - заражены S. aureus в дозе 1 млрд. суточной культуры per os, через 1 час после заражения был выпоен бактериофаг в лечебной дозе 2,0 мл однократно. Уровень достоверности />(0.01;

5 группа - чистый контроль (3 гол.) - ничем не заражены Определение достоверности:

Контроль я, =3,i, = 3, опыт п2 = 6,х2 = 0;

и, = 3,х, =3,W, =1; п2 = 6,x2=0,W2 =0; = —= 0.333;

3 + 6

z= , =-L-=3.oo;

Л п о.ззз

0.333*0.667*

•(14)

3.00)2.58, поэтому /><0.001; 7> = 0.99.

Третий опыт по контролю бактериофага на активность проводили на 29-ти клинически здоровых цыплятах суточного возраста яичной породы. Цыплят разделили на 5 групп:

1 группа (3 гол.) - заражены S. enteritidis в дозе 300 млн. микробных тел per os;

2 группа - опыт (10 гол.)- заражены S. enteritidis в дозе 300 млн. микробных тел per os, через 1 час после заражения был выпоен бактериофаг в лечебной дозе 0,3 мл 1 раз в день в течение первых 3-х дней, затем 2 дня перерыв и еще 2 дня выпаивали бактериофаг в такой же дозе.

3 группа (3 гол.) - заражены S. aureus в дозе 0,3 мл суточной культуры per os;

4 группа - опыт (10 гол.)- заражены S. aureus в дозе 300 млн. микробных тел per os, через 1 час после заражения был выпоен бактериофаг в лечебной дозе 0,3 мл 1 раз в день в течение первых 3-х дней, затем 2 дня перерыв и еще 2 дня задавали бактериофаг в такой же дозе.

5 группа - чистый контроль (3 гол.) - ничем не заражены. Определение достоверности:

Контроль и, =3,*, =3; опыт ;

3 0 3+0 3

П. =3,Х. =- = 1; п2=\0,х =0ж =— = 0; р — ————— = = 0.231;

' 1 1 3 10 ' 3 + 10 13

2 = 1-0 = —!— = 3.61; 3.61)2.58; поэтому п(0.01,Р = 0.99;

Т\ П 0.277 3 И '

, 0.231*0769* - + —

V I3

Сводные данные экспериментов представлены в таблице № 4.

Таблица № 4.

Вы жил ~3

Результат всех опытов был идентичен: культуры заражающего штамма были выделены от всех контрольных (заражённых, но не получавших бактериофаг) цыплят. Из групп цыплят, получавших бактериофаг, культура заражающего штамма ни в одном случае не выделена (р<0,01). При убое, через 7 суток после окончании опыта, макроскопических изменений во внутренних органах цыплят опытных групп не установлено, в то время как у цыплят контрольной группы (заражённых, но не получавших бактериофаг), отмечали серозный перикардит, гепатит, катарально-геморрагический дуоденит.

Таким образом сальмонеллезный «1ВР-1» и стафилококковый бактериофаги стерильны, безвредны и обладают лечебным эффектом в отношении сальмонелла-энтеритидис инфекции кур и стафилококкоза. Эффективность применения бактериофага «1ВР-1» была подтверждена при проведении лабораторного комиссионного испытания. Акт испытания от 25.10.06г. прилагается к диссертации,

Результаты опытов по определению активности бактериофагов

№ гр.

Название группы

Время наблюдений, дни

Всего цыплят, гол

Пало

Контроль.Заражены S. enteritidis,

Опыт. Заражены S. enteritidis + бактериофаг

Контроль. Заражены S. aureus

Опыт. Заражены S. aureus + бактериофаг

Чистый контроль

2.2.6. Изучение активности бактериофага «IBP-1» против сальмонелла- энтеритидис инфекции птиц в производственных

условиях.

В производственных условиях бактериофаг испытан на 14920 курах-несушках в возрасте 345 дней.

Птицефабрика, на которой проводились испытания, специализируется на производстве яйца кросса «Хайсекс коричневый». Общее поголовье цеха промышленной несушки составляет 408620 голов. Валовой сбор яйца за 2006 год составил 141 438 970 шт. яиц. Птицефабрика ежегодно продает живую птицу. В 2006 году было продано: кур-несушек в количестве 79415 гол. на сумму 31051472 руб., подрощенного молодняка в количестве 79395 гол на сумму 31049745 руб., мяса кур в количестве 412060 кг. на сумму12505084 руб., меланжа - 387635,15 кг. на сумму 8964043,7 руб., яйца - 135 420 266 шт. на сумму 251 636 340,7 руб. Хозяйство комплектуется собственным суточным молодняком. Птицефабрика работает по режиму закрытого предприятия.

В соответствии с «Программой проведения производственных испытаний на ограниченном поголовье» до начала опыта на птицефабрике было проведено бактериологическое исследование патологического материала павшей птицы. В трёх турах бактериологических исследований патологического материала в данном хозяйстве от 8 из 35 трупов кур 180346-дневного возраста были выделены 10 культур Salmonella enteritidis из печени, желчи и яичных фолликулов.

В соответствии с «Временным наставлением по применению бактериофага «IBP-1», утверждённым директором ГНУ ВНИВИП Э.Д. Джавадовым 10.10.2007 г., был применен бактериофаг «IBP-1» на курах из птичника № 23 - 06п. на 1 батарее (7460 голов).

В опыте использовали контрольную и опытную группы по 7460 голов в каждой (по 1 батарее). Бактериофаг применяли по следующей схеме: один раз в неделю методом группового выпаивания по одной дозе на голову, три недели подряд.

Эффективность применения бактериофага «IBP-1» оценивали по анализу динамики падежа, продуктивности и бактериологическому исследованию.

При анализе падежа установлено, что в опытной группе он составил 242 головы, в контрольной группе 263 головы за 20 дней. Это на 21 голову или на 7,98%, меньше, чем в контрольной.

После применения бактериофага при бактериологическом исследовании культура Salmonella enteritidis в опытной группе из 50 проб не выделена ни в одной, в то время как в контрольной группе из 12 проб Salmonella enteritidis выделена в двух пробах. Коэффициент достоверности Р<0,01.

Полученные нами результаты подтверждены исследованиями, параллельно проведенными в Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова.

В дальнейшем поголовье кур контрольной группы было подвергнуто медикаментозному лечению для стабилизации ситуации по Salmonella enteritidis-ипфекции птиц на сумму 36 300 рублей за период 197 дней, в то время как на поголовье птиц опытной группы дополнительных препаратов за этот период не было использовано. Экономический эффект проведенных мероприятий за 197 дней представлен в таблице № 5. Доминирующими признаками в контрольной группе являлись перитониты, асциты, клоациты

Таблица № 5.

Экономический эффект проведенных мероприятий на птичнике Л» 23-06Пза 197 дней

наименование Ед. изм. Батарея Батарея разница

№1 №2 Абсолют. Относит.

(контроль) (опыт)

Затраты на Руб. 36 300 5 500 -30 800 -85%

ветеринарию

Поголовье Гол. 7 460 7 460

Возраст птицы Дн. 345 345

на начало

периода

Продуктивность % 79% 79%

птицы

Падеж птицы Гол. 1 337 1 210 -127

Количество Дн. 197 197

дней контроля

Кормодни Дни 1 206 219 1 231 260 25 042 2,1%

Валовой сбор Шт. 956 532 976 390 19 858 2,1%

Себестоимость Руб./Ю 0,38 0,06 -0,32 -8,5%

яйца по вет. шт.

затратам

В результате проведенного опыта, выявлены следующие положительные аспекты относительно эффективности использования нового препарата:

1. Снижение затрат на проведение лечения бактериофагом на 30 800 руб. или на 85%.

2. В результате использования бактериофага, снижается падеж на 9,5 % за 197 дней, что в конечном итоге положительно влияет на увеличение валового производства яйца. В данном случае, дополнительный валовой сбор яйца по сравнению с контрольной группой составил 19 858 шт.

3. Вышеуказанные данные в конечном итоге положительно повлияли на изменение себестоимости производства яйца. В данном случае, себестоимость яйца снижается на 0,32 руб./шт., что является

положительным аспектом в производственно-хозяйственной деятельности предприятия.

4. Увеличение сохранности птицы на 127 голов дало дополнительный доход от продажи птицы (куры-несушки) в размере 6 356 руб. (127 голхцена реализации).

4.ВЫВОДЫ

1. Отработана методика выделения и получены два бактериофага из внутренних органов гусей против Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus и один бактериофаг против Pseudomonas aeruginosa из сточных вод гусеводческого хозяйства. ,

2. Предложена питательная среда на основе куриного мяса для культивирования Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus и Escherichia coli, которая дает больший выход бактериальной массы чем, на традиционных средах: агаре из гидролизата кильки (АГК) и мясопептонном агаре (МПА).

Фаза логарифмического роста наступает быстрее и длится до 6-го часа для S. enteritidis, с 0 до 1-го часа для Е. coli и с 6 по 9-й час для S. aureus при культивировании на курином агаре.

3. Изучены биологические свойства бактериофагов. Установлена специфичность бактериофага «1ВР-1» в отношении культур Salmonella enteritidis. Изучены его литические свойства.

Титр по Аппельману составляет 10^, по Грациа -1, 7-2x10^. Фаг обладает способностью лизировать 92% культур Salmonella enteritidis. Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.

4. Методом электронной микроскопии установлено, что фаг «1ВР-1» имеет головку гексагональной формы размером 80x80 нм, длина хвостового отростка в сокращённом состоянии составляет 104,24 нм, в растянутом -120,25 нм. Выделенный бактериофаг относится к семейству Myoviridae.

5. Предложен качественный метод определения чувствительности культур к бактериофагам - метод дисков. Зоны задержки роста культур выделенными бактериофагами составляли от 12 до 15 мм., что соответствует титру 109- 1012 по Аппельману.

6. Экспериментально установлена эффективность применения сальмонеллёзного и стафилококкового бактериофагов. Сальмонеллёзный «1ВР-1» и стафилококковый бактериофаги стерильны, безвредны и обладают лечебным эффектом в отношении сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц и стафилококкоза.

7. В производственных условиях бактериофаг испытан на птицефабрике по производству яйца, неблагополучной по сальмонелла-энтеритидис инфекции.

В результате бактериологического исследования в контрольной группе были выделены культуры S. enteritidis из печени и яичных фолликул, а в опытной группе не выделены. Падёж за 16 дней в опытной группе был на 8% меньше, чем в контрольной.

8. Экономический эффект от применения бактериофага «1ВР-1» против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц за 197 дней выразился в увеличении валового сбора яйца на 19 858 шт. (2,1%), снижению затрат на ветеринарные нужды на 30 800 рублей, снижению себестоимости яйца на

0.32.руб/10 шт (8,5%).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны «Методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, академиком A.M. Смирновым 10.03.2009 г. могут быть использованы в работе врачами-бактериологами лабораторий.

2. Предложенная питательная среда на основе куриного мяса дает максимальный выход бактериальной массы Salmonella enteritidis, Escherichia coti и Staphylococcus aureus и может использоваться в лабораторных условиях.

3. Предложенный нами качественный метод определения чувствительности культур к бактериофагу методом дисков удобен в применении и может быть использован для работы в лабораториях.

4. Полученный нами препарат на основе бактериофага «1ВР-1» может быть использован против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях как альтернатива антибактериальным препаратам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Цыганова С.В. Характеристика бактериофагов, выделенных против возбудителей бактериальных болезней птиц. / С.В. Цыганова // Формирование конкурентоспособности молодых ученых: материалы конференции-школы молодых ученых и аспирантов Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии, Санкт-Петербург -Пушкин (26 октября 2005г.) С. 79.

2. Цыганова С.В. Выделение стафилококкового бактериофага и его применение в птицеводстве / С.В. Цыганова // Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы: материалы научно-практической конференции, посвященной памяти академика Россельхозакадемии Р.Н.Коровина (5-6 июня 2007 г., ВНИВИП), 2007. - С.240-244.

3. Цыганова С.В. Особенности лаг-фазы E.coli на плотных питательных средах / С.В. Цыганова // Новые фармакологические средства в ветеринарии: материалы XIX Международной науч. - практ. конф. / СПГАВМ. - СПб., 2007. - С.98.

4. Борисенкова А.Н. Бактериофаг против сальмонеллёза птиц, вызываемого S.enteritidis / А.Н. Борисенкова, С.В. Цыганова, О.Б. Новикова // Животноводство. - 2008. - №5. - С.13-14.

5. Борисенкова А.Н. Методы специфической и неспецифической защиты от сальмонеллеза птиц /А. Н. Борисенкова, Т. Н. Рождественская, О.Б. Новикова, C.B. Цыганова, М.Н. Байбарак, Ю.И. Бабиков // V Международный ветеринарный конгресс по птицеводству (21-24 апреля 2009 г., Москва). - М. 2009. - С. 140-145.

6. Штамм бактериофага bacteriophagum salmonella IBP-1, обладающий литической активностью по отношению к S.entcritidis: пат.2342429 Рос. Федерация: МПК C12N 7/00 / авторы Цыганова C.B., Гончаров А.Е., Новикова О.Б., Борисенкова А.Н.; заявитель и патентообладатель Цыганова C.B. - №2007118802; заявл. 21.05.2007; опубл. 27.12.2008 Бюл.№36.

Подписано в печать «4» мая 2009 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз.'Заказ №

Типография «САН Принт» 190005. г. Санкт-Петербург. 1-ая Красноармейская д: 24/21

Оглавление диссертации Цыганова, Светлана Вячеславовна :: 2009 :: Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

1 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактериальные болезни птиц на современном этапе промышленного птицеводства

1 t 1 1 'I

1.2. Сальмонёлла-энтеритидис инфекция птиц. Биология возбудителя, эпидемиологические, эпизоотологические и экологические аспекты. Клинические, патологоанатомические изменения, лечение и профилактика

1.3. Биологические свойства бактериофагов

1.4. Применение бактериофагов для лечения бактериальных болезней в ветеринарии и сравнительная характеристика влияния бактериофагов и антибиотиков на организм животных 3 8 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1.1. Методика приготовления питательных сред для определения фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus

2.1.2. Методика выделения бактериофагов из внутренних органов птицы и сточных вод

2.1.3. Методика определения фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus

2.1.4. Методика определения концентрации живых микроорганизмов путём высева на плотные питательные среды

2.1.5. Методика определения титра бактериофага по Аппельману и по Грациа

2.1.6. Методика определения чувствительности культур к выделенному бактериофагу и спектра литической активности фагов по Отто

2.1.7. Методика электронной микроскопии выделенного бактериофага

2.1.8. Методика определения стерильности бактериофага

2.1.9. Методика определения безвредности бактериофага на модели суточных цыплят и куриных эмбрионов

2.1.10. Методика определения активности бактериофага в лабораторных условиях на модели суточных и 60-ти дневных цыплят

2.1.11. Методика определения достоверности различий результатов опыта и контроля 53 2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Выделение бактериофагов

2.2.2. Определение фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus и Escherichia coli на различных плотных питательных средах

2.2.2.1. Определение фазы логарифмического роста Salmonella enteritidis

2.2.2.2. Определение фазы логарифмического роста Staphylococcus aureus

2.2.2.3. Определение фазы логарифмического роста Escherichia coli

2.2.3. Биологические свойства и выделенных бактериофагов.

2.2.4. Электронная микроскопия выделенного бактериофага «1ВР-1» против Salmonella enteritidis

2.2.5. Изучение активности сальмонеллёзного и стафилококкового бактериофагов в экспериментальных условиях

2.2.6. Изучение активности бактериофага «1ВР-1» против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Цыганова, Светлана Вячеславовна, автореферат

Актуальность темы: Интенсивное развитие птицеводства - одной из крупнейших отраслей сельского хозяйства, сдерживается широким распространением инфекционных заболеваний (Косякова Г.П., Дуценко H.H., Маенкова С.И., 2007г). Среди болезней, общих для человека и животных, бактериальные болезни занимают ведущее место. Наличие их в хозяйстве негативно сказывается не только на эпизоотической ситуации, но и на экономике предприятия (Борисенкова А.Н., 2007). Наибольшая роль отводится сальмонеллёзам. В течение последних почти трёх десятилетий доминирующим серовариантом, вызывающим заболевание людей и циркулирующим в птицехозяйствах, является Salmonella enteritidis.

По сложности эпизоотологии, эпидемиологии и трудностям борьбы сальмонеллёз не имеет себе равных среди зоонозов (Новикова О.Б., 2007г). Сальмонеллы — эпидемиологически опасные микроорганизмы, способные вызывать крупные вспышки инфекции среди людей. Резкий и значительный подъём заболеваемости сальмонеллёзом в разных странах в 80-90-х годах прошлого столетия был оценен экспертами ВОЗ как «пандемия». Этиологическая структура возбудителей, выделенных от заболевших, свидетельствует о преобладании сальмонеллы энтеритидис — 90% (А.Н. Пережогин, 2007).

Статистический мониторинг и анализ данных ветеринарных отчетов выявили возрастание числа неблагополучных по сальмонеллезу пунктов в РФ: от 60-ти в 1991 г. до 170-ти в 2001 г. Летальность от сальмонеллёза в пересчете на общее поголовье заболевших кур в РФ составила: 23,6 % в 1998 г.; 13,7 % в 1999г.; 25 % в 2000г; 23,3 % в 2001году. Летальность среди цыплят до 30-ти дневного возраста превысила 40 % (Пименов Н.В., 2003). В 1990 году распространение Salmonella enteritidis по миру воспринималось как пандемия (D. Rodrique, R. Tauxe, В. Rowe,1990).

Для профилактики сальмонеллёза в промышленном птицеводстве разработана система контроля (Борисенкова А.Н., 2001, 2004), включающая в себя 9 основных этапов, в т.ч. контроль с применением эффективных антибактериальных препаратов, сульфаниламидов и нитрофуранов.

Существенным недостатком антибиотикотерапии является снижение иммунных сил организма птиц, негативное влияние на качество продукции, быстрое привыкание патогенных микроорганизмов к лекарственным препаратам. Применение антибиотиков, нитрофуранов и фторхинолонов привело к селекции резистентных возбудителей инфекционных болезней животных(Соок Mark Е., 2001 г). Появление антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов привело к неэффективности лечения бактериальных болезней у животных, к увеличению заболеваемости и смертности и, как следствие, к продолжительному бактерионосительству. Антибиотикорезистентность появляется у многих видов возбудителей, таких как Escherichia coli, Salmonella enteritidis (Piddock L.„ 2002; Забровская A.B., Кафтырева JI.A., Борисенкова A.H. и др.,2007; Белов Л. П., Сорокин O.A. 2007).

В связи с ограничениями, вводимыми на применение антибиотических препаратов (Джавадов Э.Д., 2007) еще более актуальным является вопрос о включении бактериофагов в противоэпизоотические мероприятия в промышленном птицеводстве.

В связи с этим в ветеринарной практике все более широкое применение находят экологически безопасные методы лечения, которые в комплексе с другими лечебными мероприятиями часто дают более высокий терапевтический эффект. К последним относят и бактериофаготерапию (Косякова Г.П., Дуценко H.H., Маенкова С.И., 2007г).

За последние годы в ветеринарной практике с целью диагностики (Гаврилов В.А., Васильев Г.Г., Литусов Н.В. и др., 2004), лечения (Натидзе М., Ригвава С., Толкликишвили Т.,2004; Леонтьева И.А., 2004;Розовенко Л.Н., 2005) и профилактики болезней стали широко применяться бактериофаги (Barrow and Soothill, 1997).

Levin и Bull (1996) и Broxmayer Lawrence (2004), опубликовали обзоры работ по применению фаготерапии у животных, выполненных в Великобритании и США.

Бактериофаги строго специфичны и воздействуют только на те микроорганизмы, которые вызвали инфекционное заболевание, не приводя к дисбактериозу, как это происходит при применении антибиотиков, нитрофуранов и фторхинолонов (Кереселидзе М., Габисония Т., Лоладзе М., Мелашвили Г., Дидебулидзе К., Макадзе И., 2006).

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

- изучить безвредность и эффективность выделенных бактериофагов в экспериментальных и производственных (на ограниченном поголовье) условиях. разработать методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц.

Научная новизна. Впервые выделены бактериофаги из внутренних органов гусей против Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus и из сточных вод гусеводческого хозяйства против Pseudomonas aeruginosa.

Показана эффективность применения выделенного нами бактериофага «1ВР-1» против-сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях;

Получен патент на штамм бактериофага «1ВР-1» против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц.

Практическая значимость. Разработанные «Методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц» и качественный метод дисков для оценки литической активности бактериофагов могут быть использованы в работе врачами-бактериологами лабораторий.

Предложенная нами питательная среда для получения бактериальной массы культур-кормилок в процессе изготовления бактериофага может быть приготовлена и использована в лабораторных условиях птицехозяйств;

Основные положения, выносимые на защиту:

- методика выделения бактериофага из внутренних органов птицы и сточных вод;

- определение фазы логарифмического роста чувствительных к фагам культур-кормилок Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus при культивировании на агаре из панциря криля (АПК), агаре из гидролизата каспийской кильки (АГК), мясопептонном агаре (МПА) и модифицированных нами средах: кровяном агаре Левинталя (МПАкр), среде Блаурокка (АПБ) и агаре на основе мяса курицы (КА);

- бактериофаг «1ВР-1» против Salmonella enteritidis инфекции птиц;

- качественный метод дисков для оценки литической активности бактериофагов;

- методические рекомендации по выделению бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований заслушаны на заседаниях Методических Советов отделов микробиологии и паразитологии ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2004-2007 гг.); Учёных Советов ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2004-2007 гг.); на конференции-школе молодых ученых и аспирантов Северо-Западного научно-методического центра Россельхозакадемии (Санкт-Петербург — Пушкин, 2005 г.); на XIX Международной научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии» СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2007г.); на научно-практической конференции «Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы», посвященной памяти академика

Росссельхозакадемии Р.Н.Коровина (5-6 июня 2007 г., ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы.

Заключение диссертационного исследования на тему "Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств"

4.ВЫВОДЫ

1. Отработана методика выделения и выделены два бактериофага из внутренних органов гусей против Salmonella enteritidis и Staphylococcus aureus и один бактериофаг против Pseudomonas aeruginosa из сточных вод гусеводческого хозяйства.

2. Предложена питательная среда на основе куриного мяса для культивирования Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus и Escherichia coli, которая дает больший выход бактериальной массы, чем на традиционных средах: агаре из гидролизата кильки (АГК) и мясопептонном агаре (МПА).

Фаза логарифмического роста наступает быстрее (и длится до 6-го часа для S. enteritidis, с 0 до 1-го часа для Е. coli и с 6 по 9-й час для S. aureus) при культивировании на курином агаре.

3. Изучены биологические свойства бактериофагов. Установлена специфичность бактериофага «IBP-1» в отношении культур Salmonella enteritidis. Изучены их литические свойства.

Титр по Аппельману составляет 10^, по Грациа - 1,7- 2x109. Фаг обладает способностью лизировать 92% культур Salmonella enteritidis. Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.

4. Методом электронной микроскопии установлено, что фаг «IBP-1» имеет головку гексагональной формы размером 80x80 нм, длина хвостового отростка в сокращённом состоянии составляет 104,24 нм, в растянутом — 120,25 нм. Выделенный бактериофаг относится к семейству Myoviridae (F.A.Murphy et all, 1995).

6. Экспериментально установлена эффективность применения сальмонеллёзного и стафилококкового бактериофагов. Сальмонеллёзный «IBP-1» и стафилококковый бактериофаги стерильны, безвредны и обладают лечебным эффектом в отношении сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц и стафилококкоза.

7. В производственных условиях бактериофаг испытан на птицефабрике по производству яйца,, неблагополучной по сальмонелла-энтеритидис инфекции.

В результате бактериологического исследования контрольной группе были выделены культуры Salmonella enteritidis из печени и яичных фолликул, а в опытной группе не выделены. Падёж за 16 дней в опытной группе был на 8% меньше, чем в контрольной.

8. Экономический эффект от применения бактериофага «IBP-1» против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц за 197 дней выразился в увеличении валового сбора яйца на 19 858 шт. (2,1%), снижению затрат на ветеринарные нужды на 30 800 рублей, снижению себестоимости яйца на 0,32 руб./10 шт. (8,5%).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанные «Методические рекомендации по выделению бактериофагов из сточных вод и внутренних органов птицы» могут быть использованы в работе врачами-бактериологами лабораторий.

2. Предложенная питательная среда на основе куриного мяса дает максимальный выход бактериальной массы Salmonella enteritidis, Escherichia coli и Staphylococcus aureus и может использоваться в лабораторных условиях.

3. Предложенный нами качественный метод определения чувствительности культур к бактериофагу методом дисков удобен в применении и может быть использован в бактериологических лабораториях.

4. Полученный нами препарат на основе бактериофага «IBP-1» может быть использован против сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Цыганова, Светлана Вячеславовна

1. Адаме М. Бактериофаги. / Адаме М. Москва: изд-во иностранной литературы, 1961.- 320 с.

2. Акайзин Е.О. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза / Е.О. Акайзин, С.Е. Воскун, Л.А. Панова, С.Г.Смирнов // Микробиология. 1990. - Т.59. - С.283-288.

3. Арканова А.В. Сравнительный бактериальный анализ мясного фарша при добавлении фагов / А.В. Арканова // Материалы междунар. Науч. конф. «Живые системы и биологическая безопасность населения». — М., 2002. С.150-151.

4. Асланов Б.И. Обоснование применения бактериофага для борьбы с синегнойной инфекцией в травматологическом стационаре: автореф. на соиск. учен. степ, к.м.н. / Асланов Б.И. — СПб., 2001. — 20с.

5. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / Ашмарин И.П., Воробьев А.А. М.: Медгиз, 1962. — 179 с.

6. Багманов М.А., Терентьева Н.Ю. Групповая профилактическая терапия болезней телят в раннем постнатальном возрасте // Вестн. РАСХН. — 2003. №4. - С.70-71.

7. Багманов М.А. Профилактика осложнений родов и послеродовых заболеваний коров // Вестн. РАСХН. 2005. - № 6. - С.69-70.

8. Бактериофаги /Бойцов А.Г., Порин A.A., Ластовка О.Н. и др.; под ред. Проф.В.П.Иванова.-С-Петербург: Санкт-Петербургская медицинская академия, 2006.- 99с.

9. И.Балакшина В.В. Динамика взаимодействия вирулентных бактериофагов Pseudomonas aeruginosa с бактериями хозяина / В.В. Балакшина, Л.А.Кулаков, A.M. Боронин // Микробиология. — 1987. -т.56, вып.2 С.39-41.

10. Бой Кикимото Баширу Бависе Профилактика токсикоинфекции сальмонеллезной этиологии тушек птицы с использованием бактериофагов: автореф. дисс. . к. вет. наук / Бой Кикимото Баширу Бависе-М., 2001.-19с.

11. Бойцов А.Г. Санитарная микробиология / Бойцов А.Г. Л.: ЛСГМИ, 1988.-71 с.

12. Борисенкова А. Н. Профилактика бактериальных болезней у цыплят раннего возраста / А.Н. Борисенкова // РацВетИнформ. — 2002.-№ 6. -С.12-13.

13. Борисенкова А. Н. Определение эффективности «Энрофлона» (фирма ВИК) в отношении болезней — возбудителей заболеваний птицы /А.Н. Борисенкова, Т.Н.Рождественская, О.Б.Новикова, Е.Н.Елисеева // Ветеринария. 2002. - № 6. - С. 15-16.

14. Борисенкова А. Н. Рекомендации по диагностике и профилактике псевдомоноза птиц/ А.Н. Борисенкова // Рекомендации по профилактике и лечению бактериальных болезней птиц, архив ветеринарных наук: сб. статей Санкт-Петербург-Ломоносов, 2002. - С. 30-40.

15. Борисенкова А. Н. Респираторный микоплазмоз птиц, особенности эпизоотологии, профилактики / А.Н. Борисенкова // РацВетИнформ. — 2003. № 2. - С.15-16.

16. Борисенкова А. Н. Спектр микрофлоры, выделяемой от птиц, в хозяйствах различного технологического направления/ А.Н.Борисенкова, Р.Н. Коровин, О.Б.Новикова, В.А. Чавгун, К.А. Головещенко // РацВетИнформ. 2003 г. - № 10. - С. 3-6.

17. Борисенкова А. Н. Результаты испытания тилозина отечественного производства в отношении микроорганизмов, выделенных от птиц / А.Н.Борисенкова, О.Б.Новикова, Е.Н.Елисеева // Ветеринария. 2003. №10.-С. 34-36.

18. Борисенкова А. Н. О выделении Salmonella enteritidis от птиц / А.Н.Борисенкова, О.Б. Новикова, В.А. Чавгун // Материалы 3-го Международного конгресса по птицеводству. — Москва, 2005 С.35-38.

19. Борисенкова А. Н. Бактериофаг против сальмонеллеза птиц А.Н.Борисенкова, С.В. Цыганова, О.Б.Новикова // Животноводство. -2008.-№5. С.13-14.

20. Бульканова Е.А Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Klebsiella, конструирование на их основе биопрепарата: автореф.дис. на соис. учен. степ, к.б.н. / Бульканова Е.А.-Саратов, 2006 21 с.

21. Варфоломеев С. Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов / Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. -М.: Высшая школа, 1990. — 235 с.

22. Васильев Д.А. Биологические свойства фагов Yersinia enterocolitica / Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Померанцев Д.А. и др. // Ветеринария. 2003. №1. - С.25-28.

23. Воробьев А.Л. Литический спектр поливалентного бруцеллезного R-фага / А.Л. Воробьев, С.Е. Алтынбаева // Современные проблемы эпизоотологии: институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего востока. — Новосибирск, 2004. — С.53-56.

24. Воробьев А.Л. Султанов А.А., Тен И.Б. Бактериофаги и вирулентность бруцелл. //Ветеринария.- 2005.-№ 10. С. 27-29.

25. Габисония Т. Бактериофаговые препараты / Т. Габисония, Л. Чанишвили, И. Чиракадзе, Д. Моглокелидзе, Н. Чахунашвили, М. Надирадзе, т. Каландаришвили и др. // Известия АН Грузии сер. А2003. № 1-2.-С.7-11.

26. Ганина В.И. Влияние бактериофагов на формирование органолептических свойств молочных продуктов / В.И. Ганина // Перераб. молока. 2003. - №7. - С.7-8.

27. Ганина В.И. Мобильный мониторинг бактериофагов молочнокислых бактерий в современных условиях / В.И. Ганина, Л.А. Борисова, Л.В. Калинина, И.Р. Волкова // Технологии живых систем / Моск. Гос. уе.-т прикладной биотехнологии. Москва, 2004. — С.44-47.

28. Ганина В.И. Фаговый фон на предприятиях, вырабатывающих кисломолочные продукты / В.И. Ганина, И.Р. Волкова // Переработка молока. 2005. - №7. -С. 10.

29. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии: учеб. пособие / Ганюшкин В.Я. Ульяновск: Ульяновский СХИ, 1988. - 84 с.

30. Гласкович A.A., Киржаев Ф.С. Бактерионосительство при сальмонеллезе гусей // Ветеринария. 1983. - № 4. - С.31-32.

31. Гордеева И.В. Эпизоотологический и микробиологический скрининг болезней репродуктивных органов коров в условиях Среднего Поволжья (микробиоценозы и их коррекция): автореф. дис. . к.вет.н. / Гордеева И.В. Нижний Новгород, 2005. — 19с.

32. Дарсавелидзе М.А. Характеристика донорспецифических РНК-содержащих бактериофагов Escherichia coli / М.А. Дарсавелидзе, Т.Г. Чанишвили // Микробиология. 2005. - №2. - С. 86-88.

33. Есепенок В. А. Диагностика стафилококковых инфекции сельскохозяйственных животных: методическое пособие / Есепенок В.А., Кириллов А.К., Конопаткин А.А., Литвинов О.Б. — Москва:

34. Министерство сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации. Российская академия менеджмента и агробизнеса, 1997. — 35 с.

35. Ефимов A.B. Структурная организация хвостового чехла бактериофагов Т4 и фКZ: автореф. дисс. . к.ф.-м.н. / Ефимов A.B. — М., 2002.-23с.

36. Золотухин С.Н. Изучение чувствительности Escherichia coli 0157 к колифагам / С.Н. Золотухин, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев, Л.С. Каврук // Вестн. Ульян. Гос. с.-х. акад. Сер. «Ветеринария. Зоотехния». -2001. №4. - С.59-62.

37. Калимуллина Р.Т., Байгузина Ф.А. Комбинированный бактериофаг и миксоферон для лечения острых желудочно-кишечных заболеваний у телят // Науч. тр. Баш НПВЛ / Башкир, науч.-произв. вет. лаборатория. -Уфа, 2002. -С.78-79.

38. Камалутдинов Ф.Ю. Профилактика и лечение диареи новорожденных телят поливалентным бактериофагом: автореферат дис. .канд. вет. наук / Камалутдинов Ф.Ю. — Москва, 1992. — 16 с.

39. Качмазов Г.С. Сальмонеллез кур в птицехозяйствах промышленного типа, обусловленный Salmonella enteritidis: автореф. дис. . канд. мед. наук. - Л.: ЛВИ, 1990. - 17 с.

40. Кереселидзе М. Характеристика новых клонов бактериофагов против E.coli / Габисония Т., Макадзе И., Чанишвили Л., Чахунашвили Н., Маглакелидзе Д., Дидебулидзе К., Мелашвили Г. // Птицеводство.-2005. № 12.- С. 39-45.

41. Кереселидзе М. Лечебный эффект бактериофага против сальмонеллеза / Габисония Т., Лоладзе М., Мелашвили Г., Дидебулидзе К., Макадзе И. // Птицеводство.- 2006. № 2. - С.49.

42. Киржаев Ф.С. , Соловьян Н.А, Персов A.C. Иммунопрофилактика при сальмонеллезе гусей // Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями с.-х. птиц: Сб. науч. тр./ ВНИТИП, ВНИВИП. -Л., 1988. С.67-72.

43. Коритняк Б.М. Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов Yersinia enterocolitica и разработка на их основе технологии идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза: автореферат дис. . канд. биол. наук / Коритняк Б.М. — Саратов, 2005.-15с.

44. Костюченко В.А. Структура аппарата инфицирования бактериофага Т4: автореферат дис. . канд. биол. наук /Костюченко В.А. М., 2004. -18 с.

45. Кузьмин В.А., Ещенко И.Д. Защитные свойства сальмофагов против сальмонеллеза — enteritidis в птицеводстве // Состояние и проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии в животноводстве / Чуваш, гос. с.-х. акад. Чебоксары, 2004. - С.425-428.

46. Лакин Г.Ф.Биометрия: Учеб.пособие.-М. Высшая школа, 1990. 352 с.

47. Леонтьева И.А. Бактериофаги при гнильцовых заболеваниях // Пчеловодство. 2004. - №7. - С.28-29.

48. Липатова O.A., Липатов А.М. Экономическая эффективность иммуномодуляторов при профилактике желудочно-кишечного заболевания молодняка КРС // Вестн. Ульян, гос. с.-х. акад. сер. «Ветеринария». 2002. - №8. - С.88-90.

49. Ляпустина Л.В. Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии производства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза: автореф. дисс. . д.м.н. / Ляпустина Л.В. Ставрополь, 2004.-41 с.

50. Макарова Т.Н. Использование бактериофагов в ветеринарии / Т.Н. Макарова // Вет. и мед. аспекты зооантропонозов. — Покров, 2003. — ч.2. С.633-637.

51. Росссельхозакадемии Р.Н.Коровина (5-6 июня 2007 г., ВНИВИП), 2007. С.261-268.

52. Миллер Дж. X. Эксперименты в молекулярной генетике. / Миллер Дж. X. М., Мир, 1976. - 240с.

53. Мохаммад H.H. Основы получения стафилококкового бактериофага для лечения мастита коров: автореф. дис. . канд. вет. наук / Мохаммад H.H. Москва, 1988. - 18 с.

54. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов E.Coli О 157 и их применение в диагностике: автореф. дис. . канд. биол. наук / Молофеева Н.И. Саратов, 2004. — 32 с.

55. Мугатаров И.Н. Комплексное лечение больных острой гнойной хирургической инфекцией мягких тканей с включением озонированных растворов бактериофагов и повязок сорбционных из углеродистой ткани: автореф. . к.м.н. / Мугатаров И.Н.- Пермь, 2001. -23 с.

56. Мухитов А.З. Бактериофаги микроорганизма Pasteurella multocida (выделение, изучение биологических свойств) и технология ихпрактического применения: автореф. дис. . канд. биол. наук / Мухитов А.З. — Ульяновск, 2001. — 20 с.

57. Наумов М.М. Экологический подход к профилактике колибактериоза телят и санации животноводческих помещений // Актуал. пробл. болезней молодняка в соврем, условиях. Воронеж, 2002. — С.444-447.

58. Нефедова Н.В. Биологические методы снижения бактериальной контаминации фарша для колбасных изделий / Н.В. Нефедова, И.Г. Серегин // Мясн. индустрия. 2003. - №10. - С.48-51.

59. Нияз Н.М. Принципы создания стафилококкового бактериофага для лечения маститом коров / Нияз Н.М. // Вопросы ветеринарнойбиологии: сб. научных трудов / Московская ветеринарная академия. -М., 1988. С.23-32.

60. Омурзакова К.С. Экология и биологические свойства сальмонелл: Автореф. дис. канд. биол. наук. Алма-Ата, 1990. - 22 с.

61. Пережогин А.Н. О неотложных мерах по усилению контроля за проведением мер по профилактике сальмонеллёза / А.Н. Пережогин // Конкурент. 2007. - №6. - С.35.

62. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Перт С.Дж. М.: Мир, 1978.- 223 с.

63. Перспективы и проблемы изучения морских вирусов — бактериофагов / O.A. Степанова // Экология моря. — 2000. вып.50. -С.37-38.

64. Пименов Н.В. Эффективность бивалентного сальмофага против сальмонелла энтеритидис и пуллороза-тифа кур: автореф. дис. . канд. биол. наук / Пименов Н.В / Москва, 2003. — 20 с.

65. Пожарникова E.H. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Enterobacter и конструирование на их основе биопрепарата: автореф. дис. . к.б.н. / Пожарникова E.H. Саратов, 2006 - 21 с.

66. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: автореф. дис. . к.б.н. / Пульчеровская Л.П., Саратов, 2004 - 20 с.

67. Радченко В.A. S.enteritidis- инфекция у кур (эпизоотология, патогенез, меры профилактики): автореф. дисс. .канд. вет. наук. / Радченко В.А. -Санкт-Петербург, 1993. 20 с.

68. Рожнова С.Ш. Роль биологической изменчивости микроорганизмов в эволюции эпидемического процесса сальмонелл езов / С.Ш.Рожнова, В.А.Килессо, О.А.Христюхина, Н.К.Соловьева // Современный . этап эволюции эпидемического процесса. М., 1989. - С.44-51.

69. Розовенко Л.Н. Эпизоотологический надзор при паразитозах кур (бактериофаго- и пробиотикотерапия на примере спонтанного эймериоза): автореф. дис. . канд. вет. наук / Розовенко Л.Н. — Н.Новгород, 2005.-21 с.

70. Романенко В.Ф. Сальмонеллез // Инфекционные желудочно-кишечные болезни свиней. М.: Колос, 1984. - С.94-111.

71. Романова Л.В. ПЦР-генотипирование ДНК-содержащих бактериофагов холерных вибрионов / Романова Л.В., Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д.ДСачкина Г.В., Переседова Е.С., Мишанькин Б.Н. // Биотехнология.- 2003. -№ 2. — С. 16-23.

72. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / М.: Медицина, 1978. 374с.

73. Рыжков В.Л. Таксономия вирусов бактерий / В.Л. Рыжков // Ветеринария. 1990. - N12. - С.З6.f

74. Сетдеков P.A. и др. Фаготерапия и фагопрофилактика колиэнтеротоксемии (отечной болезни) поросят / P.A. Сетдиков, М.А. Сафин, И.Н. Хайруллин // Вет врач. 2002. - №2. - С.61-62.

75. Сетдеков P.A. Эпизоотология и лечебно-профилактические меры при отечной болезни (колиэнтеротоксемия) поросят в Нижегородской области: автореф. дис.канд. вет. наук / Сетдеков P.A. Казань, 2003. — 18 с.

76. Сергевнин В.И. Антибиотикорезистентность и биохимические свойства S.typhimurium и S.enteritidis, выделенных из разных источников / В.И.Сергевнин, Э.А.Печушина, Н.Д.Поздеева и др. // Журн. микробиол., эпидем. и иммунобиол. 1993. - № 3. - С.583-584.

77. Светличный В.А. Характеристики ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus / В.А. Светличный, Г.И. Эль-Регистан, А.К. Романова, В.И. Дуда // Микробиология. 1983. - Т.52. - № 1. - С.33-38.

78. Сивожелезов К.Г. Комплексное лечение гнойно-воспалительных заболеваний пальцев и кисти: автореф. дисс. . к.м.н. / Сивожелезов К.Г. Самара, 2005. 30с.

79. Сидоренко C.B. Инфекционный процесс как "диалог" между хозяином и паразитом. -КМАХ, 2001, том 3, - № 4 - С.28-40.

80. Система контроля бактериальных болезней / А.Н. Борисенкова // Птицеводство. 2004.- №8. - С. 13-17.

81. Сихарулидзе H.H. Биологическая характеристика стафилококков при стафилококковой инфекции птиц и борьба с ней в Грузии: автореф. дис. .канд. биол. наук / Сихарулидзе H.H. Тбилиси, 1990-24 с.

82. Смирнова Г.В. Биологические свойства сальмонелл панама, циркулировавших в 80-е годы в Ленинградской и Владимирской областях / Г.В.Смирнова, Л.А.Кафтырева, Т.А.Николаева и др. // Острые кишечные инфекции. Л., 1990.- № 13. - С.65-67.

83. Смирнова Н.И. Возбудитель сальмонеллеза // Ветеринарная микробиология и иммунология / Н.А.Радчук, Г.В.Дунаев, Н.М.Колычев и др. М.: Агропромиздат, 1991. - С.209-216.

84. Соколов A.B. Этиопатогенез и лечебно-профилактические средства при стафилококкозе птиц: автореф. дис. .канд. вет. наук / Соколов A.B. — Ленинград, 1989. 21 с.

85. Солодовников Б.В. Совершенствование биотехнологии производства сибиреязвенного диагностического бактериофага: автореф. дисс. . к.б.н. / Солодовников Б.В. — Ставрополь, 2002. — 20 с.

86. Стегний Б.Т. Изучение эффективности применения питательных сред с добавлением сыворотки крови сельскохозяйственных животных для накопления бактерийной массы микоплазм / Б.Т. Стегний, В.В.

87. Степанова O.A. Методические подходы к изучению процесса взаимодействия бактерий и вирусов / В.Г. Шайда // Экология моря. — 1999.-вып. 48.-С. 96-99.

88. Таблицы химического состава и питательной ценности пищевых продуктов: под ред.Ф.У. Будогяна М.: Медгиз, 1961. —412с.

89. Тараканов Б.В. Феномен бактериофагии в рубце жвачных / Тараканов Б.В.-Москва: Научный мир, 2006.-181с.

90. Тутов И.К. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов / Тутов И.К., Ситьков В.И. Ставрополь. - 1997.- 121 с.

91. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем / Уголев A.M. Л.: Наука, 1987. - 186с.

92. Урсов И.Г. Амбулаторная терапия больных туберкулезом легких. Бактерицидный метод / И.Г. Урсов, В.А. Красков, ТБ.А. Боровинская pi др.: Сиб. Отделение РАМН и др. Новосибирск: Изд-во института теплофизики, 2001. - 122с.

93. Уфимов A.B.Структурная организация хвостового чехла бактериофагов Т4 и фК2: автореф. дис. . канд. биол. наук / Уфимов A.B. -М., 2002.-23 с.

94. Феоктистова H.A. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Ptoteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения: автореф. дис. . к.б.н. / Феоктистова H.A. Саратов, 2006 - 21 с.

95. Хайруллин И.Н. Роль микрофлоры хирургического отделения в развитии послеоперационных осложнений хирургических ран и их коррекция с помощью бактериофагов: автореф. . к.м.н. / Хайруллин И.Н.- Казань, 2003. 19с.

96. Химический состав пищевых продуктов: под ред. И.М. Скурихина, и М.Н. Волгарева. М.: ВО Агропромиздат, 1987. - книга 2. -416с.

97. Хохлов A.C. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы / Хохлов A.C. М.: Наука, 1988. -215с.

98. Цыганова С.В. Особенности лаг-фазы E.coli на плотных питательных средах / С.В. Цыганова // Новые фармакологические средства в ветеринарии: материалы ХЕК Международной науч. практ. конф. / СПГАВМ. - СПб., 2007. - С.98.

99. Шапиро Дж. А. Бактерии как многоклеточные организмы / Дж. А. Шапиро // В мире науки. 1988. - № 8. - С.46-54.

100. Шестаков А.А. Фаги P. aeruginosa / Шестаков А.А., Афонин Э.А., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы / Ульян, гос. с.-х. акад. — Ульяновск, 2005. ч. 4-5. - С.227-229.

101. Ackermann H.-W. Frequency of morphological phage descriptions in 1995 / H.-W. Ackermann // Arch. Virol. 1996. - N 141, P. 209-218.

102. Ackermann Hans-Wolfgang Viruses of Prokaryotes / Ackermann Hans-Wolfgang, Michael DuBow I: General Properties of Bacteriophages, ch. 7. Practical Applications of Bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, Florida, 1987.-P.315-319.

103. Ackermann Hans-Wolfgang Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000 / Ackermann Hans-Wolfgang // Arch. Viril. -2001.-146, № 5-P.843-857.

104. Aizenman E. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by 3',5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death / E. Aizenman, H. Engelberg-Kulka, G. Glaser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996. V.93. - P.6059-6063.

105. Anderson T. The role of tryptophane in the adsorption of two bacterial viruses on their host E.Coli. J. Cell. Comp. Physiol., 1945. - v. 25. - P.17-25.

106. Arbid M. Toxicological and biological studies on Japanes quails fed graded levels of furazolidone / M. Arbid, M. el-Habbak, M. Hanafy // Acta Vet. Hung, 1990. - V.38. - № 4. - P.271-273.

107. Barrow P., Experimental infection of egg-laying hens with Salmonella enteritidis phage type 4 / P. Barrow, M. Lovell // Avian Pathol. 1991 -V.20. - № 2. - P.335-348.

108. Barrow, P. A. Bacteriophage Therapy and Prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of the potential / Barrow, P. A., J. S. Soothill // Trends Microbiol. 1997. - №5. - P. 268-271

109. Bergh O. High abundance of viruses found in aquatic environments / O. Bergh, K. Borsheim, G. Bratbak et al // Nature. 1989. - 340. n. 6233. -P. 467-468.

110. Boujaafar N. Salmonella / N.Boujaafar, G.Zambardi, F.Renaud, J.Freney // Lyon Pharm. 1991. - V.42. - № 4. - P.327-337.

111. Broxmayer Lawrence. Bacteriophages: Antibacterials with a future? // Med. hypotheses. 2004. - 62, - № 6. - P. 889-893.

112. Cook Mark E. Discovering alternatives to antibiotics. Where do we go from here? / E. Cook Mark // World Poultry. 2001. - 17. - № 3. - P. 17-20.

113. Cox N. Salmonella Methodology update // Poultry Sei. 1988. - V.67. - № 6. - P.921-927.

114. Davis Brigit M. CTX prophages in classical biotype Vibrio cholerae: Funcional phage genes but dysfunctionale phage genomes. / M. Davis Brigit, E. Mayer Kathiyn, Boyd E. Fidelma, K.Waldor Matthew // J. Bacteriol. 2000. - 182. - № 24 - P. 6992-6998.

115. Desgrandchamps D. Salmonellen Gastroenteritis: Ursachen, Folgen, therapeutische Perspektiven / D. Desgrandchamps, M. Altwegg // Schweiz. Med. Wochenschr. - 1990. - Nov.24. - V.120. - № 47. - P. 1751-1754.

116. Fehlhaber K. Zur lebensmittelhygienischen Sedeutung der Salmonellen-Okologie und Risiken / K. Fehlhaber // Z.-Gesamte-Hyg. -1989. Nov. - V.35. - № 11. - P.660-662.

117. Fokine A. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4 / Fokine A., Chipman P., Leiman P., Vesyanzhinov Y., Rao V., Rossman M. //Proc. Natl. Acad. Sei VSA, - 2004. - Vol. 101 - P. 6003-8.

118. Gast R. Production of Salmonella enteritidis contaminated eggs by experimentally infected hens / R. Gast, C. Beard // Avian. Dis. - 1990a. -Apr.-Jun. - V.34. - № 2. - P.438-446.

119. Greenwald E. coli 0157:H7 Infection / Greenwald, David and Lawrence Brandt / Hospital Practice, April 15, 1997. -P.123-140.

120. Guibs P. Food poisoning current concerns: pap how safe our food? / P. Guibs // Proc. 11th. Brit. Nut. Found. Annu. Conf. - London, 1989 // BNF Nutr. Bull. - 1989. - V.14. - Suppl. № 1. - P.92-102.

121. Hara S. Abundance of bacterial phage in the ocean / S. Hara, I. Koike // 5thInt. Symp. Microb. Ecol., Kyoto, Aug.27 Sept.l, 1989: Abstr. - S.J. -1990. —P.161.

122. Hara S., Terauchi K., Koike I. Abundance of viruses in marine waters: Assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy / S. Hara, K. Terauchi, I. Koike // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - 57, n 9 -P.2731-2734.

123. Heider G. Epizootisch-epidemischs aspekte bei Salmonellen-Infektketten in der Geflugelproduktion / G. Heider // Z.-Gesamte-Hyg. -1989. Nov. - V.35. -№.11.- S.643-645.

124. Hoszowsky A. Evaluation of Salmonella isolation methods from animal faeces / A. Hoszowsky // Bui. Vet. Inst. Pulway. 1989. - V.32-33. -№90. -P. 1-11.

125. Kaprelyants A.S. Do bacteria need to communicate with each other for growth? / A.S. Kaprelyants, D.B. Kell // Trends Microbiol. 1996. V.4. P.237-241.

126. Kell D.G. Pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria / D.G. Kell, A.S.Kaprelyants, A. Grafen // Tree. 1995. - V.10. - P.126-129.

127. Lahellec C. Influence of resident Salmonella on contamination of broiler flocks / C. Lahellec, P. Colin, G. Bennejean // Poultry Sci. 1986. -V.65. - № 11. - P.2024-2039.

128. Lawrence Broxmeyer Bacteriophages: antibacterials with a future? / Lawrence Broxmeyer //Med. Hypotheses. 2004. - № 6. - P. 889-893.

129. Leiman P. Structure and location of gene product 8 in the bacteriophage T4 baseplate / P. Leiman, M. Shneider, V. Kostychenko, P.Chipman, V. Mesyanzhinov, M. Rossmann // Mol. Biol. 2003. - Vol. 328. —P.281-283.

130. Levin, Bruce Phage Therapy Revisited: The Population Biology of a Bacterial Infection and its Treatment with Bacteriophage and Antibiotics / Levin, Bruce and J. J. Bull // The American Naturalist. 1996. - 147. -P.881-898.

131. Linares J.A. Staphylococcus aureus pneumonia in turkey poults with gross lesions resembling aspergilosis / J.A. Linares, W. L. Wigle // Avian Dis. 2001. - Vol. 45. - № 4. - P. 1068-1072.

132. Lipkin R. Bacterial chatter. How patterns reveal clues about bacteria's chemical communication / R. Lipkin // Sci. News. 1995. - V.147. - P. 136141.

133. Machado N. Pesquisa de bacterias do cenero Salmonellaem ingredientes e racoes utilizadas na alimentaca de aves / N. Machado, J. Zopata, M. Vasconcellos//Cienc. agon. 1987. - V.18. - № 1. - P. 111-115.

134. Maciak T., Kubinski T., Mazurek J. Wystepowanie paleczek Salmonella w paszach komponentach paszowych i myczkach pochodzenia zwierzecego // Med. Vet. 1990. - V.46. - № 9. - P.333-335.

135. Meyer H. Major study into the role of marine viruses / H. Meyer // Mar. Pol lut. Bull. 2002. - № 8. - P. 724.

136. Meyer H. Die Verhatung und Bekamfung der Salmonellosen bei Rind und Schwein / H.Meyer, F.Gold, D.Jentsch et al. // Z. Gesamte Hyg. und Grenzgeb. - 1989. - V.35. - № 11. - P.650-653.

137. Meyer H. Preventing salmonella infection through vaccination / H. Meyer // Poultry Int. 1994. - March. - P. 58.

138. Milletic B. Reusteration par la catalase chez une bactérie lysogéne irradiée. Production de bactériophage / B. Milletic // Compt. r. Acad. Sci. — 1954.-t. 238, P.1541-1542.

139. Morris G. Microbiology of Eggs / G. Morris / Report from the 5 th European Symposium on the Quality of eggs products // Poultry Int. 1994. - March. - P. 44-48.

140. Morris G. Salmonella enteritidis and eggs: assessment of risk / G. Morris // Poultry Sci. 1989. - V.68. Suppl. - P. 100.

141. Mulder R. Probiotics as attach against salmonella contamination / R. Mulder // Misset. Poultry. 1991. - № 2. - P. 122-129.

142. Piddock Laura J. Fluoroquinolone resistance in Salmonella serovars isolated from humans and food animals / J. Piddock Laura // V. FEMS Microbiol. Rew. 2002. - 26, - №1, - P. 3-16.

143. Pomeroy B. Studies on feasibility of producing salmonella-free turkeys / B.Pomeroy, K.Nagaraja, L.Ausherman, I.Peterson, K.Friendshuh // Avian Dis. 1989.-V.33. -P. 1-7.

144. Pohl P. Epidemiological study of Salmonella enteritidis strains of animal origin in Belgium / P.Pohl, P.Lintermans, M.Marin et al. // Epidemiol. Infect. 1991. - Feb. - V. 106. - № 1. - P. 11-16.

145. Proctor L.M. Bacteriophage-infected bacteria in the sea / L.M. Proctor, J.A. Fuhrman // 5th Int.Symp. Microb.Ecol., Kyoto, Aug.27-Sept. 1., 1989: Abstr. -S.L. 1990. -P. 161.

146. Proctor L.M. Viral mortality of marine bacteria and cyanobacteria / L.M. Proctor, J.A. Fuhrman // Nature. 1990. - 343, n 6253. - P. 60-62.

147. Quintin W.F. Experimental bacteriophage protection against Staphylococcus aureus abscesses in a rabbit model / W.F. Quintin, C. Kerrigan , J. Soothill // Antimicrob. Fgents and Chemother. 2005. - № 3 -P. 1220-1221.

148. Roberts T. Microbial pathogen in raw pork, chicken, and beef: benefit estimates for control using irradiation / T. Roberts // Am.J. Agric. Econ. -1985.-№67.-P.957-965.

149. Robson Wolfgang, Mirold Susanne, Hardt Wolf-Dietrich, Tschape Helmut //Berlin.und munch tierarztl. Wochenschr. — 2002.-115, № 9-10. p. 355-359.

150. Rodrique D.International increase in Salmonella enteritidis: a new pandemic? / D. Rodrique, R. Tauxe, B. Rowe // Epidemiiol. Infect. 1990. -Aug.-№ 105(1).-P.21-27.

151. Rampling A. Nitrofurantoin resistance in isolated of Salmonella enteritidis phage type 4 / A. Rampling, R. Upson, D. Brown // J. Antimicrob. Chemother. 1990. - Feb. - V.25. - № 2. - P.285-290.

152. Salmela J. Continuous emphasis on salmonella control / J. Salmela // Poultry Int. 1994! - May. - V.33. - № 5. - P.14-16.

153. Shapiro J.A. The significances of bacterial colony patterns / J.A. Shapiro // BioEssays. 1995. - V. 17. - N 7. - P. 597-607.

154. Summers, William C. On the Origins of the Science in Arrowsmith: Paul de Kruif, Felix d'Herelle and Phage / Summers, William C. // Journal of the History of Medicine and Allied Sciences. 1991. -46. -P.315-332.

155. Sinko S. Salmonella findings in feeds in Slovakia during 1971-1984 / S. Sinko, P. Magic // Folia vet. 1988. - V.32. - № 2. - P.53-67.

156. Steinbach G. Die Dynamik der Erregerzahl bei der experimentell ausgelosten Salmonellose des Kalbes / G.Steinbach, H.Koch, H.Meyer et al. // Arch. Exp. Veternarmed. 1990. - V.44. - № l. - P.93-101.

157. Stuart S. A microscopic look at microorganisms, part 1 / S. Stuart // Water Technol. 1987. - V.10. - № 5. - P.37-39.

158. Waterbury J.B. Viruses of marine bacteria / J.B. Waterbury // Oceanus. 1992. - 35, n 3. - P. 107 - 108.

159. Wray C. The epidemiology of salmonella infection of calves: the role old dealers / C.Wray, N.Todd, L.Melaren et al. // Epidemiol, and Infec. -1990. V. 105. - № 2. - P.295-305.

160. Vielitz E. Salmonella control programmes worldwide / E. Vielitz // Poultry Int. 1994. - March. - P. 32-38.

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств

Оглавление диссертации Цыганова, Светлана Вячеславовна :: 2009 :: Санкт-Петербург

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Цыганова, Светлана Вячеславовна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств"

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Цыганова, Светлана Вячеславовна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций