Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

оА-МШ

На правах рукописи

ПОМЕРАНЦЕВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, Эпизоотологии.. ( . ■ * ' микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ульяновск - 2000

Рабата выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, элизоотоло-' г>ш >| ветеринар!ю-саиитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич.

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник ВНИИЗЖ Русалеев Владимир Сергеевич.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ульяновского государственного Университета ; .. ф Генинг Татьяна Петровна

.... кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ВГНКИ ; . - Обухов Игорь Леонидович \

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследоватеДьский институт ветеринарной вирусологии н микробиологии РАСХН.

Зашита состоится « /6 » 2000 года в часов на заседании

диссертационного совета К 120.82.03 при; Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Адрес: г, Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке УГСХА.

Автореферат разослан «» (ЛлЛКР 2000г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент Козин А.И.

Общая характеристика работы. Актуальность темы. За последние 50 лет отмечено рас»трети; кручу микроорганизмов, которые обуславливают кишечниезаболеианйя. Наряду с известными, хорошо изученными болезнями сельскохозяйственных животных, появляются «новые» болезни, этнологический з'ент которых не изучали. К числу таких болезней относится кишечный иерсиииоз людей ii животных, возбудителем которого является бактерия Yersinia enterocolitica.

Первые сведения Ог возбудителе кишечного иерсиниоза получены в CUJA, где с 1923 по 1957 год было выявлено от людей около 15 штаммов бактерий, но в то время они были отнесены к атипичным вариантам псевдЬтуберкулёзного микроба и не рассматривались как причина заболевания. В дальнейшем кишечный иереиниоз как инфекционная болезнь людей появился в Западной Европе — Франции, Бельгии, Голландии, Германии, Швейцарии в I960 году и первоначально была названа Pasteurella X. Позднее она появилась в Швеции, Финляндии, Венгрии. " — " •

В данное время в Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде,* Австралии иерсиниоз занимает третье место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллё-за п кампилобактериоза<1.ВоскетиЫ. 1995).

В России ирошиоз занимает второе место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза, в 1993 году зарегистрировано 3876 случаев иерсиниоза или 2,6 на 100 тысяч населения (Черкасский Б J1., Подунова Л.Г., Акулова Н.К., 1995). , Опасность иеренниоза усугубляется чрезвычайной распространённостью возбудителя Yersinia enterocolitica в природе. Как отмечают (Ленченко Е.М., Куликовский А.П., Павлова И.Б., 1998; Собакин A.C., Зыкин Л.Ф., 1998; Покровский В.И.,1986; Ющенко Г.В., 1984) бактерии Yersinia enterocolitica выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков и насекомых. Кроме того, Yersinia enterocolitica обнаружены в воде, почве, сточных водах, продуктах животного происхождения.

Изучение распространения иерсиниоза среди животных затруднено, так как эта болезнь в РФ не подлежит обязательному учёту как самостоятельная нозологическая единица. До сих пор не разработана система мероприятий по диагностике, профилактике и лечению животных, больных кишечным иерсиниозом. Фаготипирование, как один из методов диагностики бактерий не изучался.

Пели и задачи исследования. Целью работы являлась разработка ускоренного метода выделения и идентификации бактерии вида Yersinia enterocolitica. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Провести сравнительную оценку существующих методов выделения и идентификации бактерий Yersinia enterocolitica.

2) Разработать и предложить схему и методы бактериологического выделения и идентификации Yersinia emcrocolitica.

3) Выделить бактериофаги Yersinia enterocolitica,

4) Изучить основные биологические свойства фагов Yersinia enterocolitica.

5) Исследовать фапупутрпт»»« ^цргрий Y.enterocolitica для

целей идентификации.

ЦЗ-П'НЛЯЫ-ГАЯ НАУЧ !ЛП ,6Д! ОТЕКА академии lí. Д. *i^...крязейа

Ино иэ Ш^^ф

Научная повит». Усовершснсгвотшна ^рабоганиая методическая схема бактериологического выделения и идентификации Y .enterocol itica. Впервые в ветеринаркой практике выделены бактериофаги Y.enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного нерсиниоза. Изучены основные биологические свойства выделенных бактериофагов Y.enterocot itica... Доказана возможность использования бактериофагов Y.enterocol itica для идентификации возбудителя кишечного иерсинноза.

Практическая значимость работы. Для врачей бактериологов предложены методические указания по ускоренному выделению и-идентификации бактерий-Y.eriterocolitica, позволяющие в более короткие сроки поставить диагноз на заболевание кишечным иеренниозом.

Доказана возможность использования бактериофагов Y.enterocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного нерсиниоза. Основные положения выдвигаемые на защиту: *" ' '

Схема бактериологического выделения и идентификации Y.enterocolitica. ' Схема выделения бактериофагов Y.enterocolitica. ' ' ' ' ' **'*■

Биологические свойства выделенных бактериофагов Y.enterocolitica .Доказательство возможности использования бактериофагов для идентификации возбудителя кишечного нерсиниоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях учёного совета факультета'ветеринарной медицины УГСХА (1998-1999), на научно-практический конференциях в Ульяновской ГСХА (1997-1999), семинарах проводимыми Ульяновским "областным управлением ветеринарии (1997-1999), на межкафедрзльном' заседании профессорско-преподавательского состава Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (2000).

Материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях. Объём и структура, работы. Материалы диссертации наложены на.134" страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы н методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы содержащий I82 отечественных и зарубежных источника. Диссертация имеет 17 таблиц и 6 фото^ (рафий. ! '-' ~

Собственные исследования.

' Материалы и методы.

Работа выполнялась в период с 1996 - 2000 г. на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии н ке vepi mnpi to-caiштарной экспертизы Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии.

Для бактериологического исследования в работе были использованы 24 игтамма бактерий Y.enterocolitica, По антигенному строению штаммы . Y.enterocolitica распределились следующим образом: серо вар 0:3 — 4 штамма: 0:5 - 2 штамма; 0:5,27 - 3 штамма; 0:4,32 - 6 штаммов; 0:6,3О - 2 штамма; 0:6,31 — 2 штамма; 0:8 - 2 штамма; 0:9-3 штамма. Помимо этого, при определении специфичности бактериофагов использовались 62 штамма других видов бактерий - представители родов: Proteus, Citrobacter,'Escherichia, Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas.

Методы:

1) Мере ni ni oí сельскохозяйственных животных (диагностика и профилактика). // Методические рекомендации ВАСХНИЛ М,, 1989г.

2) Эпидемиология, лабораторная диагностика иеренниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий // Инструкция МЗ СССР от 30.10.1990г.

3) Методические указания «по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энте-робакгериями» утверждёнными ГУВМСХиП СССР 12.П.1991г.

4) Методические' ' указания «по выявлению Y.enterocolitica и Y.pseudotuberculosis в пищевых продуктах животного происхождения» ут-

• верждёнными ДВ МСХиП РФ 23.09.1998г.

Исследования- фагов проводили общепринятыми методами Грация (1936), М. Л дам с (1961), И.М. Габрилович (1973).

Объектами исследования являлись музейные штаммы бактерий и фаги Y.enterocolitica, выделенные нами из сточных вод животноводческих хозяйств Ульяновской области.

Питательные среды и реактивы. Для выделения и исследования биологических свойств бактериофагов Y.enterocolitica использовали мясо-пептонный бульон (рН 7,4 - 7,6); 1,5% и 0,7% мясо-пептонный агар (рН 7,4 -7,6). При работе с бактериями использовали: в качестве сред накопления ФБР, СФБР; агары Экдо, Серова, БТС, МПА; МПБ, для определения биохимических свойств цветной ряд Гисса. Все посевы инкубировались при температуре 26°С в течении 24-48 часов, а при работе с бактериофагами в течении 18-20 часов. Оборудование: термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, лупа бинокулярная МБС-9, ультратермостаты УТ-15У4.2; вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия), бактериальные фильтры L-3 свечи Шамберлана, центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 см3, флаконы ёмкостью 50, 100 см1, стёкла покровные, стёкла предметные, чашки Петри, пробирки, стандарты мутности на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток. Статистическая обработка результатов исследований. Цифровые данные подвергали статистической обработке средних величин и их ошибок. Достоверность определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера.

Результаты исследований. Сравнительная оценка не пользуемых методик. С целью использования в наших исследованиях оптимального метода выделения и идентификации бактерий Y.enterocolitica мы провели сравнительное изучение различных схем. В результате проведённых опытов выявили ряд принадлежащих им недостатков. Методические указания «по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» не позволяют точно типироеать иер-синии, так как предлагаемые для этого тесты не являются для бактерий

Y.enierocoütica основными, отсутствует этап обо гашения, не предлагаются специальные дифференциально-диагностические среды,.

Используя методические указания «по выявлению Y.enterocotítica и Y.pseudotubereulosis в пищевых продуктах животного происхождения», мы установил», что предлагаемую схему можно с определённым, успехом использовать, только при работе с чистыми культурами бактерий. Рекомендуемые }8

биохимических тестов требуют значительного времени и средств, что задерживает получение результатов исследования < В инструкции МЗ и методических рекомендациях ВЛСХНИЛ используется мало эффективная среда накопления и для определения биохимических свойств предлагается большой и сложный набор тестов, в результате сроки выделения и идентификации занимают не менее 2-3-х недель. Всё это обусловило необходимость заняться исследованиями по разработке оптимальной схемм выделения Y.enterocolitica. ; ■. 1 * ;

Создание оптимальной схемы выделения бактерий Ycrsinia enterocolitica.

При первичной обработке любого исследуемого материала,. в качестве приёма увеличивающего процент высеваемости бактерий вида Y, enterocolitica мы предложили изменить состав среды накопления солевого фосфатно-буферного раствора добавив ОуI % раствора генциан виолета. Это позволило ин-гнбнровать сопутствующую грамлоложчггельную и часть грамотрицательной микрофлоры/ г

Эффективность сконструированной среды накопления для бактерий вида Y.enterocoUtica была проверена в серии из 26 опытов на референс штаммах Высевы ¿о, сред накопления проводили через 48 часов инкубации при 4вС в условия ¿'холодильника. Посевы инкубировались в течении 24 — 48 часов при 26"С. Результаты этих опытов^тображены в таблице I.

..... i ... Таблица№1

Среды накопления' Кол-во выросших колоний

СФЕР 28 ± 1,0 ■ •

СФБР с генцианвиолетом . 26 ± 1,2 >

Из табличных данных видно, что добавление водного раствора генциан-виолета существенно не отражается на размножении нерсиннй.

Для определения эффективности среды накопления с добавлением генциан виолета проводили исследование сточных еод животноводческих хозяйств, дополшггельио контамииированных штаммами У.ешегосоН^са. Таблица 2.

.. . * ■ Таблица№2

Сравнительная оценка сред накопления щ»и исследовании сточных вод

Спелы накопления Выросло Y.enierocoütica Других бактерий

СФБР • Ю,8±0,б ' 51,0 ± 1,3 .

СФВР с генинан виолетом 11.3 ±0,7 36 ± 1,1

Дли определения оптимального времени выдержи воин я пробирок со средой накопления с посевами в холодильнике при 4вС мы произподили высевы на плотную дифференциально-диагностическую среду Серова через каждые 12 чаема в течении 5-ти суток. В результате-исследовання мы определили, что наиболее оптимальным является выдерживание при 4°С в течении 48 часов, дальнейшее выдерживание хотя и положительно сказывается на ингибировании сопутствующей микрофлоры, но увеличивает сроки исследования, являясь следовательно не целесообразным, так как значительная часть микрофлоры ингибм-руется в первые двое суток.:

Выло проведено сравнение наиболее часто употребляемых сред рекомендуемых для.выделения бактерий У^етегосоНпса: агара Эндо, агар Серова, агар с бромтимоловым-синим (БТС).

Была изучена селективность сравниваемых сред при высеве на них фильтрата сточных вод животноводческих хозяйств дополнительно коотаминирован-ных суточными культурами иерсиний.В результате проведенных исследований мы определили, что выделить бактерии У.етегосоШка из сточных вод можно только при помощи агара Серова. Агар Эндо * полностью зарастал бактериями находящимися в сточных водах. Агар с бромтимоловым-синим (БТС) тоже зарастал, причём цвет среды из травянисто-зелёного менялся'на жёлтый и обнаружить колонии голубого цвета уже не представлялось возможным:'

Важно отметить что на агаре Серова бактерии У.етегосо1Шса удаётся об-нэружить благодаря тому, что на данной среде у них своеобразная, отличительная от других бактерий морфология колоний. Они образовывали колонии тёмно-красного цвета, с матовой суховатой: поверхностью и чуть сосцевидно-выпуклым центром, диаметр колоний составлял 2,0-5,0 мм. Колонии других видов кишечных бактерий образовывали большие, более 5,0 мм в диаметре, блестящие и яркие колонии. • У

Биохимическая идентификация. На основании известных биохимических свойств бактерий этого &ида мы сконструировали оптимальную схему идентификации кишечного иерсиниоза до вида. За основу межродовой идентификации, внутри семейства энтеробактернй были взяты следующие тесты: расщепление мочевины, ферментация без образования газа глюкозы, ферментация арабиноэы и инозита.. ■ >-• '

Изучение морфологических н биохимических свойств ' :

положительная уреазиая активность

* Citrobacter. Salmonella, Enterobacter Uafnia.

—^исключаем роды Proteus и Serratia.

исключаем Escherichia, Edwardsieila,

ферментация а га би козы

> исключаем род ЮеЬккНя-

ВИЛ

►Yersinia enterocolittea.

Внутриродовую идентификацию проводили по следующим тестам: ферментация сахарозы, целлобиозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, рафинозы, мелибиозы и подвижность при 25°С.

Внутри видовую ... дифференциацию> выделенных: культур Y.enterocoiitica делали с целью ткпирования биоваров и проводили по следующим тестам: салицин, индол, ксилоза, трегалоза. -

Таким образом, предложенная схема дала нам возможность вести целенаправленное исследование на обнаружение возбудителя кишечного перс и-ниоза в любом материале, значительно сокращая объём и время работы. Это позволило наработать необходимо» количество штаммов Y.enterocotjtrca для проведения дальнейших исследований по бактериофагам. . ■ ; ■ :

Методика выделения бяктернофягови сеяекиця клонов фагов. - ' ' Первым этапом нашей , работы была попытка выделить бактериофаги Y.emerocoiitica из имеющихся. у нас штаммов бактерий Y.emerocoiitica. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаг», выделен» иые из таких культур, обладайт более выраженной специфичностью Mollaret (1967); B.Nilehnu P.Nicolle (1969); Т.Ч.Жугова (1985).

Выделить лизогенные бактериофаги из имеющихся у нас культур Y.emerocoiitica мы пробовали различными методами. Выявление лизогенных культур проводили путём перекрестного испытания на чашках с 1,5% питательным агаром методом а газовых сло£в A.Gracia (1936), И.М.Габрилович (1973). Все изучавшиеся штаммы исследовались как индикаторные и как «лизогенные», .

В первой серии опытов, .исследуемые культуры изучались по методике И.М.Габриловича(1973). ■ ^ , ..ч

Во второй серии опытов использовали методику используемую И.В. Д6~ марадским (1971).

В третьей серии опытов применяли общепринятую методику для выделения бактериофагов гнтероб^тггеркя использованную В.Я. Гам юш к иным (1988) и С.Н. Золо^-хиным (1994)1

Провсая эти исследования в 42 опытах с I [8 пробами, нам не удалось выделить бактериофаги Y.entenScolitica из имеющихся у нас штаммов бактерий Y.enterocolitis, ;\>> \ ■>.......< -ч,.

Таким образом, не обнаружив явления лизо гении у имеющихся штаммов бактерий, мы решили выделить ■ бактериофаги Y.enterocoiitica из объектов внешней среды.. Для этого мы бра/)н сточные воды в свиноводческих хозяйствах н молочко-товарных фермах; в различных хозяйствах Ульяновской области. В колбу содержащую МПБ вносили фильтрат сточных вод и все имеющиеся у нас штаммы бактерий Y.emerocotitica. Колбу инкубировали 10 суток

ПоложитеЛшая ферментация сахарозы,,, целлобиозы, сорбита отрицательная

рамнозы,'мелибиозы, рафинозы.

при 26°С. После этого, содержимое колбы центрифугировали при 2000 g в течении 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали методом агаровых слоев по A.Gracia (1936). . , , ■.*..--

Наличие негативны х^колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага. При этом отмечалось следующее;, а) полный лизис индикаторной культуры; б) слившиеся негативные колонии; в) единичные негативные колонии. В случае положительного результата негативные колоиии или участок лизиса отвивали в мясо-пе?ггонный бульон с индикаторной культурой. Для получения чистой линии фага проводили до пяти пассажей из изолированных негативных колоний.

Селекцию бактериофагов и повышение' их литической активности проводили с помощью пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной Dulbeio и Vogt (1954) и использованной И.М.Габриловичем (1972), С.Н.Золотухиным (1994).

В результате проведённых опытов нами были выделены и изолированы 6 штаммов бактериофагов Yersinia enterocolitica..

Характеристика фа roa Yersinia enterocolitica.. Изучение биологических свойств фагов проводили в соответствии с современными схемами классификации бактериофагов M.Adams -(1961); D.Bradley (1965); А.С.Тлхоненко (1968); ,,;Т.Г.Чинашвили (1968); Н.-W-Ackermann (1969); И.М.Габршювнч (1973); D.Reanney и Н.-W.Ackermann .(1982)'... „ ' .■■■'•■■ '

Наследовались следующие свойства фагов Yersinia enterocolitica:, а).морфология негативных колоний; , '

''.б)литическаяактивность;- ' ■

' в) спектр литической активности; :

г) специфичность действия; , , ; . и

д) температурная устойчивость; . ■

е) устойчивость к хлороформу; . >

ж) взаимодействие с микробной клеткой^- ¡.

... а) Морфология негативных колоний. Морфология негативных колоний изучалась при посевах фагов метолом агаровых слоев по Грация на питательном агаре. Учёт производился через Í8-20 часов инкубации при температуре :. 2б°С. Отмечались.величина негативной;колонии, её форма, степень прозрачности. наличие вторичного роста, характер краёв колонии, наличие и величина зоны неполного лизиса. . . .. . • - ••• •'•

Негативные колонии, образуемые изученными бактериофагами разделены на три типа. Колонии типа «а», у 3 фагов, они образуют мелкие, круглые, прозрачные негативные колонии, с чёткими краями от t ,3 до 2,0 мм в диаметре. У двух бактериофагов Y.emerocolitica отмечались негативные колонии типа «в» величиной 2,0-3,0 мм в диаметре, прозрачные с ясным центром и хорошо

иыраженной зоной неполного лизиса. Один бактериофаг образовывал крупные, круглые прозрачные с чёткими крал мл негативные колонии, от 4,0 до 5,0 мм в диаметре -тип «с».

б) Литическая активность бактериофагов Y. enierocolítica. Культуры бак-тери й У, enieroco t i tica на которых мы определяли литнческую активное ть бактериофагов выращивали на стандартном мясо-псптонном бульоне и использовали их в логарифмической фазе роста.

Логическую активность селекционированных бактериофагов проводили по методу Аппельмана и Грация Д.М.Гольдфарб (1961). , ■ Данные о лиги чес кой активности селекционированных бактериофагов - Yersinia enierocolítica представлены в таблиц« 3 - 4

; ' -ТаблицаЛаЗ

Литическая актианость бактериофагов Y.enterocolitica:'_

№ Фаги Литическая ахтн в иость

по Грация- по Аппельману

1. YE/CB-42* 3 10* 8 10«

2. УЕ/СВ-5 7 10' & 10s

. 3.. . YE/CB-6' ' 4,2 (0* 2,6 106'

4. УЕ/КР-3 2,4 10й 3.» 105

.5. • YE/KP-3 5.2 10* 8,2 105

6. , YE/KP-9 • 6,4 Ю6 4,1 10*

sí'J'í У ' - - i

-! - - Из табличных- данных видно, что литическая активность селекционированных фагов находится в диапазоне от 3 106 до 4,2 10* по Грация и от 4,1 104 до 2,6 106 по Аппельману. Наибольшей литическон активностью, по отношению к-изучаемым культурам обладает фаг УЕ/СВ^!

в) Спектр литнческой активности бактериофагов 'У.егйегосЫШса. Для изучения спектра литяческой активности шести селекционированных фагов (УЕ/СВ-5, УЕ/СВ-42, УЕ/СВ-б, УЕЛСР-З, УЕ/КР-8, УЕ/КР-9) мы использовали 24 штаммаУ.еп1егосо1Шса следующих серологических групп; 0:3; 0:4^32; 0:5; 0:5,27; 0:6,30; 0:6,31; 0:8; 0:9 - сюда входят музейные^ референс и эпизоотические штаммы бактерий. Для характеристик спектра действия фагов определяли долю штаммов от числа изученных, чувствительных к фагу {индекс спектра действия) и круг хозяев - группу штаммов, чувствительных к данному фагу. Результаты опыта показали, что изученные фаги характеризуются различным спектрам литнческой активности. Нужно отметить, что бактериофагов,' лизи-ругащнк только один штамм, обнаружено км было. Наиболее широким' спектром литического действия но отношению к изучаемым культурам обладает штамм фага УЕ/СВ-42. Из 24 штаммов У.еглегосоНцса он лизировал |1и обладает сравнительно высоким спектром действия 0,46. Три штамма бактерий, относящиеся к серологической группе 0:4*32 оказалтеь фагорезистентнымы. Всего из 24 штаммов У.стиегосоК^са лизировались фагами 21 штамм, то есть 87,5%. Результаты опыта отображены в таблице 4.

' Таблица№4

Диапачо« лнтической актнвиост» иерсинмозных фагов nt> отношению к штаммам бактерий Y.enterocolitica.

Г* » Кол-во , Из них J] тируемые. Индекс %лизи-

j Jfe , Фагн испытан. чуествПТ. Серовары.. . Спектра руемых

j штаммов к фагу . ■■ ,■(!'.'•. ■Действия-' штаммов

f 0:4,32; . ' ' "

! YE/CB-42 24 ■ 11 0:6,30; 0,46 - 145.8

1 0:631; 0:9

12- YE/CB-5 -24 5 • 0:5; 0:5,27 0,2 20,8

1 3. YE/CB-6 . ' " 24 . 4 ■ , 0:63<Н 0:631 0,17 16,7

: 4.' YE/KP-3 .24- 7 0;3; 0:630 03 19Х

i 5. YE/KP-8 24 .2. ;. -f- 0:8 0,08 S3

YE/KP-9 24- з •. • 0:9 - 0,12 12,5

г) Специфичность действии бактериофагов Y.enterocolitica. Определение видовой специфичности 6-тн. изучаемых бактериофагов .Y.cnterocolitica (YE/CB-5, YE/CB-42, YE/CB-6, YE/KP-3. YE/KP-8,. YE/KP-9) проводили на агаровых средах путём накалывания фага,на газон культуры. В результате изучения специфичности шести бактериофагов Y.enterocölitica (YE/CH-5, YE/CB-42. YE/CB-6, YE/KP-3, YE/KP-8, YE/KP-9) по отношению к представителям родов Proteus vulgaris б штаммов, Citrobacter б,штаммов, tschcrichia coli 14 штаммов, Morgan ei la morgan» 12штамж>й, Klebssiell^'pheunioinac Уштаммоя. Salmonella 8 штаммов, Staphylococcus pyogenes 3 штамма, Pseudomonas aeruginosa 8 штаммов - установлено," что :ни"одйа из испытуемых культур других видов бактерий данными фагами не лизйровалась. На основании полученных результатов можно сделать вывод; о том что селеКцИОН ирован н ые фаги я вляются -специфичными и не активней представителям другихродов бактерий^

д)* Темлературная устойчивбсть1 бактери^аговУ.еМегосо(тса. Изучение термочуш^ительноста селеишонированнык бактериофзгов проводили в питательном бульоне М^Адомс (1961); и!м.Габрияович (1973).

С целью определения оптимальных условий приготовления фаговых суспснзпп проведено изучение тер мочу ест внгел ьности всех шести бактериофагов Y.enterocolitica (YE/CB-5; YE/CB-42, YE/CB-6, YE/KP-3, YE/KP-S, YE/KP-9) в сравнении« с • iy вствительногстью индикаторных штаммов бактерий Y.entcrocolitica; При прогревании в течении 30 минут при температуре 40°С наблюдалась' 100% выживаемость фагов и бактерий, выдержлвание при температуре 65"С при той же экспозиции приводило практически к полной гибели фагов и бактерий. В дальнейшем с целью определения критериев разграничения бактериофагов была определена термочувствитслькость всех изученных фагов при- температуре 55°С и 60"С в течении 30 минут. Между шестью ■ испытанными бактериофагами существенных различий в чувствительности к

температуре не имеется. Все испытанные бактериофаги У.смегосоНиса (УЕ/СВ-5, УЕ/СВ-42, УЕ/СВ-б, УЕ/КР-З, УЕ/КР-8. УЕ/КР-9) являются высоко чувствительными к воздействию температуры. Наибольшей чувствительностью к температуре 55°С обладает бактериофаг УЕ/КР-З (К=0,12 мин-1), а наименьшей УЕ/СВ-5 (К=0,029 мин-1). К температуре 6СГС наибольшей чувствительностью обладают бактериофаги УЕ/КР-8 и УЕ/КР-9 <К=0,18 мин -I и 0,22 мин-1), а наименьшей УЕ/СВ-5и УЕ/СВ-б (К=*0,11 мин-1 и 0,14 мин-1). У всех бактериофагов инакгнвацня наблюдалась в основном в первые 12 минут, а в последующие 18 минут инактивировался незначительный процент фагов. Результаты этих исследований приводятся в таблице 5.

Таблица№5

Инактивация при 55°С Инактивация при 60°С

№ Фаги % выживае- % выживае-

- у. мости фага К, мин*1 ■ мости фага К, мин'1

- (Х±м) - (Х±м) '

1. УЕ/СВ-42 13,9 ±0,82 0,065 1,9 ±0,02 0,13

2 УЕ/СВ-5: ■ 41,6 ±5,9 0,029 4,3 ± 0,9 • 0,11

3. УЕ/СВ-6 ■ 12,6 ±1,07 0,068 ' 1,4 ±0,26 0,14

.-.А, . УЕ/КР-З' " 1!,2±0,012* 0,12 0,29 ± 0,02 0,17

;5. -УЕ/КР-8 "10,9 + 3,86 - 0,073' 0,21 ±0,02 0,18

Ь, УЕ/КР-9 ' ;!"Й;0± 1.6 ■ 0,065 0,24 ±0,01 0,22 ,

' '"" Результаты исследований позволяют сделать следующие выводы: а) ис-1 "Следованные бактериофаги "'У.егкёгосоМюа .являются термолабильными, по "'скорости инактивации они мало отличаются между собой; б) несмотря на почти полнуюинактивацию индикаторных штаммов метод прогревания фаголиза-' !та ¿ля устранения из него бактерии - хозяина неприменим.

' е) Устойчивость бактериофагов У-еп(егосоНиса к воздействию хлороформом. Определение чувствительности бактериофагов и бактерий к хлороформу проводили путём обработки фаговой суспензии или бульонной культуры, содержащей в 1 мл около 10т частиц фага или бактерий, хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Затем, определяли процент активного фага в сравнении с контрольной пробой, не подвергавшейся воздействию хлороформа и вычисляли константу скорости инактивации.

Обработка бактерий У.епКгосоПЦса из индикаторных штаммов: ЕВ-0:5.27; М-0:3, П11-0:9 в течении 15 минут хлороформом приводила к их полной гибели. Бактериофаги оказались менее чувствительными к воздействию хлороформа н их выживаемость составляла: фага УЕ/СВ-5 20,5 ± 4,1% (К=0,13 мин'); фага УЕ/СВ-6 22,4 ±2,8% (К=0,14 мин1); фагаУЕ/СВ-42 28Д ± 11,4% (К=0.12 мин1); фага УЕ/КР-З 25,6 ± 3,5% (К=0,13 мин'1); фага УЕ/КР-8 40,8 ± 7,6% {К=0,09 мин"1); фага УЕ/КР-9 53,7 ± 5,9% (К=0,06 мин1).

Воздействие хлороформом, на бактерии испытуемых штаммов в течеиин 10 минут при постоянном встряхивании, выявило что их выживаемость со-

г ставляет 0, ] + 0,006% и таким образом происходит практически полная их гибель. Тем не менее, значительная инактивация бактериофагов указывала на невозможность использования хлоро<|юрмз для приготовления фагавых суспензий. . ■■■■::

Обработка селекционированных бактериофагов У.еп1егосо1Шса хлороформом выявила различную их чувствительность к этому агенту. Результаты этих исследований представлены в таблице 6 ■ '

Табпица№6

Устойчивость бактериофагов Y.enterocolitica к

воздействию хлороформом.__

и ' Обработка 15 мииут Обработка i 0 минут1

N2: Фаги; % выживае- % выживае- *

мости фага . (Х±м) К, мин*' мости фага ' (Х±м) КГ, мин'1 ' *

1. 2. 5. 6. YE/CB-42 YE/CB-5 YE/CB-6 YE/KP-3 YE/KP-8 YE/KP-9 28,2 ±11,4 20.5 ±4,] , ,;22,4 ±2,8 25.6 ± 33 40,8 ± 7,6, 53.7 ±5,9 0,12 , , 0,13 ..0,14, , 0,(3 0,09 0,06 38.5 ± 5,6 25,7 ±3,6 26,1 ±3,6 40,9 ± 7,9 70,1 ±8.8 64.6 ± 2.7 0,09 : 0,13 ] 0,13 1 0,09 0,034 0,04

Таким образом; проведя данное исследование, мы разделили селекционированные фаги Y.enterocoliliea на 2 группы. В первую группу вошли фаги YE/KP-8 и YE/KP-9 их выживаемость при обработке хлороформом в,течении 10 микут составила более 50%. Во вторую группу мы отнесли остальные 4 фага, так как их выживаемость была менее 50%.

ж) Взаимодействие бактериофагов Y.enterocolitica с микробной клеткой. Взаимодействие бактериофагов с микробной клеткой включает в себя различные фазы: а) адсорбция фага на клетке; б) фаза латентного периода; в) выход фага или его урожай. Так же мы проводили исследование по определению свободного литического фермента индуцируемого в клетке бактериофагами Yersinia enterocolitica.

Фазы взаимодействия бактериофагов Y.enterocolitica с микробной клеткой. Фазы взаимодействия бактериофагов с бактериальными клетками Y.enterocolitica определяли по суммарному количеству неадсорбированного н вновь образовавшегося фага, описанной М. Адамсом (1961) и использованной И.М.Габриловичем (197?); Т.Ч.Жуговой{1985),

Изученные бактериофаги различаются между собой по скорости адсорбции, продолжительности латентного периода и среднему урожаю. Минимальное значение константы скорости адсорбции (0,23 10 мл/мин) у фага YE/CB-42 более, чем в 20 раз меньше максимального (4,75 10 ~,имл/мин) у фага YE/KP-8. Все бактериофаги характеризуются сравнительно невысоким процентом адсорбции. У двух из всех изученных бактериофагов адсорбция составляла свыше 70%, причём максимальный процент адсорбированного фага YE/KP-8

был 77,5%. Средний процент адсорбции 58,0%. Продолжительность латснтно-.. го лериода варьирует от 10 до 65 минут. Результаты данных исследований отображены в таблице 7. ■ '

Таблица№7

Фазы взаимодействия < Ьагов Y.enterocoüüca с микробной клеткой.

Фаги средний % адсорбированного фага Константы ско^-рости адсорб-* ■ . цип 10ио мл/мин Латентный период,' мин ■' Средний урожай на Клетку

1. 2. 34. ' 5. 6. YE/CB-42 YE/CB-5 YE/CB-6 YE/KP-3 YE/KP-8 YE/KP-9 53,6.. 65,672,4 47,8 77,5 на 0,0(8 2,1 ±0.9 0,27 ±0,15 3,36 ±0,48 4,75 ±1,08 0,88 ± 0,2 50-55 10-15 60-65 10-15 15-20 20-2 S 3.1-4,0 4.2-5,7 4,1-5,9 ' 4,2-4,6 5,1-5,6 2,9-43

Таким образом, можно сделать вывод, что показатели одиночного цикла развития не могут быть использованы при 'дифференциации бактериофагов Уегзииаегиегосо1шса. . ' *'

Исследование свободного литического фермента . бактериофагов У, етегосоИНеа. Лигнческий фермент, образующийся в бактериальной клетке, проявляется на платной'питательной среде в виде ореолов вокруг негативных колоний, обработанных хлороформом. Отмечено, что характер ореолов имеет таксономическое значение для ряда, бактериофагов И.М.Габрилович- (1970). Т.Ч.Жугова (1985). . .. . ■

Определение свободного литического фермента мы проводили по методике описанной ДМ.Голъдфарбом ■ и В.А.Зуевым (1963) и использованной Т.Ч.Жуговой (1985). Бактериофаг титровали методом агаровых сло€в. В каждом опыте измеряли по 10 негативных колоний бактериофага до и после обра* ботки хлороформом. Для количественной оценки логической активности определяли разность между диаметром ореола, образовавшимся после хлороформирования и диаметром бляшки, определяемым до нзелаивания хлороформа (величина е ). Результаты данных исследований отображены в таблице 8.

.... . Таблица№8

Ореолообразование вокруг негативных колоний фагов У.сгНегосо1шса

Кг фаги Средний диаметр, мм , е мм

Негативных колоний Ореолов

1. YE/CB-42 . *• 1,7. 3,5 1,8

2. . YE/CB-5

3. YE/CB-6 2.0 1- ■ ■ . 4,0 2,0

4.' YE/KP-3 : 2.5 5,0 ' 2,5

5. YE/KP-8 »J ■ . ; .

6. YE/fCP-9 -4,5 7,0. 2.5

Образование ореолов вокруг негативны* колоний отмечено у четырёх фагов. По характеру проявления литичесхот фермента они однотипные и образуют вокруг негативных колоний ореолы средних размеров, величина е в пределах от 1,8 до 2,5 мм. Какой-либо связи между способностью образования литического фермента н типом негативной колонии (а, в, с) не отмечено^

; У бактериофагов УЕ/СВ-5 и УЕ/КР-З образования ореолов вокруг негативных колоний ие отмечено. ' *

По признаку образования свободного литического фермента фагн У.емегосо1Шса распределены нам» в 2 группы. В первую вошли 2 фага, у которых не отмечалось образования ореолов вокруг негативных колоний. Во вторую мы отнесли остальные четыре фага, по характеру проявления свободного логического фермента они однотипны и образуют вокруг негативных колоний ореолы средних размеров, величина е находится в пределах 1,8—2,5мм.*"

Для выяснения роли бактериального хозяина и вируса в определении функции ореолообраэования были изучены комбинации включающие различных хозяев и один и тот же бактериофаг и наоборот, одинакового хозяина и различные бактериофаги. Исследованные бактериофаги обладали различной величиной лнтичеекой активности прн использовании одного и того же хозяина. Таблица 9,

■ . . Тзблица№9

Проявление литического фермента (величена е) бактериофагов

:» Фаги Штаммы бактерий " ■-

0:4,32 0:6,30 0:6,31 0:5 | 0:3 0:8 0:9

УЕ/СВ-42 1,8 и- 1,5 ., ■ < — ■ - — ■ ■. ■ - 1.8 !

! 2.' УЕ/СВ-5 ■ ... ' - 1 " ■ -. 1

| 3. УЕ/СВ-б - 2,0 2Х ' - ' 1 ■ - -

1 4- УЕЛСР-3 - 1,8 - - - 2,5 - -

1 5. УЕ/КР-8 ' ■ ■ - ! - -

1 6. УЕ/КР-9 - - - - 1 - - 2.5 !

Таким образом( можно сделать заключение, что признак образования свободного литического фермента определяется геном фага, но бактерия хозяин влияет на интенсивность ореолообразования на плотной среде.

И результате изучения основных свойств селекционированнами бактериофагов У.еп1егосо!и1са установлений, что они являются высоко специфичными в отношении к бактериям У.еШегосоКгка, не отличаются между, собой по термочувствительности, параметрам взаимодействия с чувств ительны- -ми микроб н ыми-клеткам и. Различаются между собой по морфологии н^атив-ных колоний, логической активности, спектру л итического действия, чувствительности к хлороформу и способности образовывать свободный литический фермент. ■'*■ ■■■'*' ■

В результате проведённых исследований показана возможность использования селекционированных и изученных нами фагов с целью тшшровалня

бактерий Y.enlcrocolitica, результаты исследований дали возможность предложить предварительную схему фаготипирования культур Y.enlerocolШса.

ВЫВОДЫ.

I. Предложен на схема ускоренного выделения и идентификации бактерий Yersinia cnterocolitica позволяющая вести целенаправленное, исследование на обнаружение возбудителя кишечного иерсиниоза в любом материале и значительно сокращающая объём и время работы до 5-ти -6-ти дней.

2. Из объектов вн£Ц1ней среды выделены и селекцнонированны б бактерио-' фагов Yersinia enterocoiitica. :

3. Селекционированные .бактериофаги Yersinia enterocoiitica обладают следящими биологическими свойствами:

- образуют негативные колонии 3 типов;

- являются термолабильными я не различаются между собой по чувствительности к температуре;

'- чувствительны к хлороформу;

- характеризуются , медленной адсорбцией на чувствительных клетках, константы скорости адсорбции их составляют 0,23-4,75 10'"* мл/мин. Латентный период равен 10-65 минут. А средний урожай на одну клетку 4,5 инфекционных центров;

- обладают выраженной специфичностью они лизируют лишь штаммы данного вида н не проявляют активности против культур других родов семейства Энтеробактерий; ^

- являются литически активными, их активность составляет по Грация от 2,4 10* до 4Д i 0"* по Аппелеьману от 4,1 10й до 2,6 I О"6.

4. На основании изученных основных биологических свойств предложен набор специфических бактериофагов доказывающий возможность идентификации бактерий Yersinia enterocoiitica,

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для врачей бактериологов предложены методические указания по ускоренному выделению и идентификации бактерий Y.enterocoiitica, позволяющие в более короткие сроки поставить диагноз на заболевание кишечным иереи-

ННОЗОМ. ■ . 1 ..,1 I-:

Доказана возможность использования бактериофагов Y.enlcrocolitica для целей идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Померанцев Д.А., Васильев Д.А. Yersinia enterocoiitica как возможный этиологический агент при желудочно-кишечных заболеваниях сельскохозяйственных животных. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитариой экспертизы. Вып 3. Ульяновск, 1998. с. 103-N7.

IT

2. Васильев Д.Л., Померанцев Л-Л. Схема бактериологического выделения и идентификации Yersinia enterocolitica. // Методы частной бактериологии. Ульяновск, 1999. с. 147-152.

3. Нафеев А.А., Никишина Н.М., Померанцев Д.А., Васильев Д.Л. Некоторые вопросы лабораторной диагностики и распространения иерсиниозов в Ульяновской области. Н Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 16-19.

4. Померанцев Д.А., Васильев Д.А., Золотухин С.Н. Разработка ускоренной схемы выделения и идентификации бактерий вида Yersinia enterocolitica. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 19-21.

5. Померанцев Д,А., Васильев ДА;, Золотухин С.Н. Биологические свойства бактериофагов Yersinia enterocolitica выделенных из объектов внешней среды. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиолога и, эпизоотологии и ветеринар-но-саннтарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000, с. 21-23.

6. Кожаева Д.К., Померанцев Д.А. Разработка оптимальной схемы выделения Y.enterocolitica из мясопродуктов. И Сб. науч. работ. Вопросы микробиоло-гни, эпизоотологии н ветеринзрно-саннтарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск, 2000. с. 23-25.

7. Кожаева Д.К., Померанцев Д.А., Коритняк Б.А. Определение пороговых показателей термической инактивации бактерий {..monocytogenes и Y.enterocolitica.. // Сб. науч. работ. Вопросы микробиологии, эпизоотологии н ветсринарно-саннтарной экспертизы. Вып 4. Ульяновск. 2000. с. 32.