Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства бактериофагов к Salmonella typhimurium и их применение в борьбе с сальмонеллезом голубей

На правах рукописи

UUJ448923 /

ЧИРКОВА Ирина Владимировна

Биологические свойства бактериофагов к Salmonella typhimurium и их применение в борьбе с салыионеллезом голубей

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 0ИТ 2ßQ8

Москва 2008

003448923

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ).

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Пименов Николай Васильевич.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Бессарабов Борис Филиппович; кандидат ветеринарных наук Капустин Андрей Владимирович

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ГНУ ВИЭВ).

Защита диссертации состоится «еШ> г. в «/¡/»¿2£>

часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан «с%3 » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Т.Н. Грязнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Становится все более распространенным разведение голубей. Среди бактериальных инфекций голубей сальмонеллез занимает одно из ведущих мест (Гусев В.В., 2005). Основной серовариант, вызывающий эпизоотический процесс на голубятнях относится к серогруппе В - Salmonella typhimurium (Geor-giades G.K., 2002 г). Кроме того, S. typhimurium - основной возбудитель сальмонел-леза уток, гусей (80-90%) (Осидзе Д.Ф, 1987), и один из основных сероваров, вызывающих пищевые токсикоинфекции человека (Гусев В.В, 2005).

Борьба с сальмонеллезом голубей актуальна для обеспечения санитарного благополучия и профилактики пищевых токсикоинфекции человека, для лечения и профилактики сальмонеллеза клубных голубей, для профилактики сальмонеллеза в промышленном птицеводстве и животноводстве

Применение специфических и литически высокоактивных бактериофагов для борьбы с сальмонеллезом голубей позволит санировать птицу от сальмонеллоноси-тельства, обеспечить защиту от заболевания с первых дней жизни, предотвратить поствакцинальные осложнения и повысить сохранность поголовья, ограничив применение антибиотиков

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов к S. typhimurium, а также создание и определение эффективности применения фагового препарата для борьбы с сальмонеллезом голубей.

Для осуществления данной цели были поставлены задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезу голубей в Московском регионе.

2. Выделить и селекционировать высокоактивные бактериофаги к Salmonella typhimurium.

3. Изучить морфологию, литическую активность, специфичность и спектр логического действия селекционированных фагов тифимуриум.

4. Создать фаговый препарат, изучить его профилактическую и лечебную эффективность для голубей в лабораторных условиях.

5. Изучить эффективность применения экспериментальных серий препарата в неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях и вольерах.

Научная новизна. Изучена эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей

в г. Москве и Подмосковье. Выделены бактериофаги к S. typhimurium, селекционированы наиболее активные из них и изучены их биологические свойства. Создан биологический препарат Бактериофаг тифимуриум, предназначенный для лечения и профилактики сальмонеллеза голубей, изучена его профилактическая и лечебная эффективность в лабораторных и практических условиях. Терапевтическая эффективность препарата составила 100%.

Практическая ценность работы. Рекомендован для внедрения в биологическую промышленность и ветеринарную практику Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей с установленной эффективностью.

Разработаны и внедрены «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей».

Бактериофаги к Salmonella typhimurium депонированы в ФГУ ВГНКИ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Открытой Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 24-26.04.2007); на Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых вузов МСХ РФ (г. Воронеж и г. Москва, 2007); X Всероссийской медико-биол. конференции «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 20-21.04.2007), на Всероссийском конкурсе «Развитие АПК РФ» (Москва, 27-29 05.2008), межкафедральных заседаниях ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 6 научных статей и методические рекомендации, одобренные Департаментом ветеринарии Минсель-хоза РФ от 11.04 2008 № 25-25/16.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов исследований, рекомендаций по использованию научных выводов, приложений. Список использованной литературы включает 185 источников, из них 43 - зарубежных авторов. Работа содержит 18 таблиц и 15 рисунков.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в Москве и Московской области.

2. Биологические свойства выделенных и селекционированных бактериофагов к S.typhimunum.

3. Протективные и лечебные свойства препарата Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в 2005-2008 г. в основном объеме на базе кафедры клинической диагностики и болезней молодняка ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Белые мыши массой 14-16 г - 320 голов, голуби различных пород, фазаны, лебеди, утки и другая птица - 1245 голов, штаммы и изоляты S. typhimurium, S. enteri-tidis, S. gallmarum-puUonim, S. dubiin, S. newlands и другие культуры микроорганизмов, питательные среды, О-; О- и Н- агглютинирующие сальмонеллезные сыворотки, электронный микроскоп JEoL-100 S, ДНК-амплификатор «Терцик», центрифуги, автоматические пипетки-дозаторы, бактериальные фильтры, водяная баня, термостат, микроскопы, лабораторная посуда и другие.

Бактериологическое исследование проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов животных и человека», утвержденным Департаментом ветеринарии РФ и Госкомсанзпиднадзором Минздрава РФ 18 06.96

Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) проводили на базе ФГУ ВГНКИ, используя тест-системы НИИ эпидемиологии.

Выделение изолятов бактериофагов сальмонелл проводили из фекальных вод голубятен, используя метод обогащения, описанный Адамсом (1961). Изучение биологических и морфологических свойств фагов проводили методами, описанными А С. Тихоненко (1968), В .Я Ганюшкиным (1988), А.П. Пономаревым (2002) Статистическую обработку полученных цифровых данных проводили по H.A. Плохинскому в соответствии с методами, описанными в работах П.И. Ашмарина и A.A. Воробьева.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей

По результатам исследования патологического материала за 2004-2007 гг. в ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория» число S typhimurium среди случаев выделения сальмонелл других серовариантов от птиц в 2004 г. составило 6,2%, 2005 г. - 38,0%, 2006 г - 7,1%, в 2007 г. - 6,6%. От голубей в ФГУ ЦНМВЛ выделение S typhimurium отмечали в период 2003-2007 гг. в среднем в

85,19% случаев.

При исследовании нами патологического материала от диких и синантропных птиц, декоративных голубей г. Москвы, Подмосковья за период 2004-2008 гг. положительные результаты на сальмонеллез отмечены в 97 из 123 анализов - 78,9%. БЛурЫтипит была выделена нами в 96%, Б. егиегШсШ - в 1,6% случаях, в остальных случаях - другие виды сальмонелл.

Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов к БЛурЫтипит

По методу обогащения Адамса нами были исследованы пробы пометных вод и фекалий голубей, выделены 10 бактериофагов к Б. 1урЫтигшт, из которых три: №5 ТЗ, № 8 МЁ, № 9 ММ - с наиболее высокой степенью литической активности.

Литическая активность фагов к эталонному штамму Б^рЫтипит М-2ф ЬДЕП, составила: по методу Аппельмана Ю'10, 10'8 и Ю"10; по Грациа 3,6х 108 БОЕ/см3, 1,0*Ю7БОЕ/см3, 1,4x108 БОЕ/см3 соответственно.

Для получения чистых колоний фагов морфологически однотипные негативные колонии клонировали 7 раз и из 10-кратных разведений фаголизата суспензии высевали по методу Грациа Бактериофаги №5 ТЗ, №9 ММ формировали на бактериальном газоне круглые, прозрачные с ровными краями колонии диаметром 1,5-2,5 мм, № 8 МЁ - крупные, прозрачные колонии диаметром 2,5-3,5 мм со вторичным ростом индикаторной культуры.

Исследованный спектр литической активности и диапазон специфичности фагов с музейными и полевыми культурами микроорганизмов представлен в таблице 1.

1. Диапазон специфичности бактериофагов №5 ТЗ, №8 МЁ, №9 ММ

MiffipooprarocMbi Бактериофаги

513 8ME 9MM

S typhimuriura 29/32 28/32 26/32

S gallinarum-pullorum 5/7 6/7 6/7

S enteritidis 8/10 9/10 8/10

S. dublin 3/4 4/4 3/4

S newlands 1/3 2/3 2/3

Escherichia coli 0/7 0/7 0/7

Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 013

Yersinia pseudotuberculosis 0/2 ОД 0/2

Proteus vulgaris 0/2 0/2 0/2

Proteus mirabilis 0/3 0/3 0/3

Pasteurella multocida 0/2 0/2 0/2

Bordetella bronchiseptica 0/2 0/2 0/2

Listeria monocytogenes 0/2 0/2 0/2

Примечание в числителе - количество лизирусмых культур бактерий; в знаменателе - количество всех тестируемых штаммов

Как видно из таблицы 1, селекционированные фаги показали широкий спектр литического действия: Phagum S. typhimurium №5 ТЗ лизировал 29 из 32, Ph. S. ty-phimurium №8 МЁ - 28 из 32, Ph. S. typhimurium №9 MM - 26 из 32 изолятов S. typhimurium, кроме того, лизировали S. enteritidis (из 10 штаммов - 80-90%), S. gallina-гит-риПогит (из 7 - 75-100%), S. dublin (из 4 - 85-100%), S. newlands (из 3 - 3367%), но не лизировали бактерии других родов семейства Enterobacteriaceae и других семейств, что подтверждает специфичность их действия.

Изучение морфологии отобранных бактериофагов проводили при помощи электронно-микроскопических исследований на электронном микроскопе JEoL-100 S при ускоряющем напряжении 80 кВ с использованием метода негативного контрастирования с 2%-ным водным раствором уранил-ацетата в ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН при инструментальном увеличении в 53018 раз и фотографическом в 25-80 раз. Получены электронные фотографии фагов (рис. 1).

а б в

Рис.]. Бактериофаги Phagum S. typhimurium (а - №5 ТЗ, 6 - JYs8 МЁ, в - №9 ММ)

По A.C. Тихоненко (1968) все три бактериофага были отнесены к IV классификационной группе. Это фаги с длинным, несокращающимся отростком с периодической исчерченностью и изометрическими головками, содержащими внутри двутя-жевую ДНК, входят в семейство Siphoviridae, относятся к морфотипу В1. Основные размеры структурных элементов вирионов фагов Ph. S. typhimurium 5 ТЗ, 8 МЁ, 9 ММ представлены в таблице 2.

2. Размеры структурных элементов вирионов фагов, нм

Изолят бакте- Диаметр Диаметр Ширина хво- Морфотип

риофага головки, хвостового стового фага

нм отростка, нм отростка, нм

№ 5 ТЗ 50 225 11 В1

№¡8 МЁ 64 120 11 В1

№9 ММ 37 117 10 В1

Как видно из таблицы 2, выделенные бактериофаги имеют сходную морфологию, размер головки от 50 до 100 нм. Фаг № 9ММ имеет диаметр головки 37 нм, но по остальным морфологическим свойствам сходен с бактериофагами № 5 ТЗ и №8МЁ.

Изготовление препарата Бактериофаг тифнмуриум

Три высокоактивных бактериофага были депонированы в ФГУ ВГНКИ как Pha-gum Salmonella typhi muri um №5 ТЗ - ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №8 МЁ -ДЕП, Phagum Salmonella typhimurium №9 MM - ДЕП. На их основе приготовлен препарат для профилактики и лечения сальмонеллеза голубей с содержанием 108 фаговых частиц в 1 см3, консервированный 0,01% раствором хинозола (рис. 2).

Культивирование бактериофагов с использованием молодых (6-часовых) культур Б. 1урЫпшгшт М-2ф I в МПБ в колбах объемом 50 литров

Очистка биопрепарата от биомассы сатьмонелл и компонентов питательной среды

Центрифугирование ■ ► Фильтрация

Приготовление концентрированной суспензии бактериофагов

Расфасовка, упаковка, маркировка, контроль препарата Бактериофаг тифнмуриум

Консервирование хипозолом

Р и с 2. Схема изготовления препарата Бактериофаг тифнмуриум

Готовый препарат - Бактериофаг тифнмуриум против сальмонелллеза голубей проверяли на стерильность высевом на МПА и в МПБ, а также на активность, для чего белым мышам массой 14-16 г (10 голов) подкожно вводили Б. 1урЫтипшп М-2ф I в дозе 10 тыс. мкр. кл. (5ЬО50) и, спустя 20 минут, - препарат в дозе 0,5 см3. Контрольной группе лабораторных мышей вводили только культуру сальмонеллы в указанных дозах. Наблюдали 14 дней - в опытной группе сохранность составила 100%, тогда как в контрольной группе все 10 мышей пали, из их паренхиматозных органов была выделена в. 1урЫтипит.

Таким образом, было установлено, что изготовленный препарат Бактериофаг тифнмуриум активен и безопасен для белых мышей.

Экспериментальная инфекция сальмонсллеза голубей

Экспериментальную инфекцию сальмонсллеза голубей вызывали путем орального заражения невакцинированных голубей породы синий 3-месячного возраста. Всего было использовано 4 группы по 4 голубя на каждый тестируемый штамм Б. гурЫшипиш М-5в 1, М-2ф 1, Д-1в I из коллекции кафедры. Наблюдение за птицей вели в течение 14 дней после инфицирования, учитывали количество заболевших и павших.

Больная птица хохлилась, отмечали повышение температуры до 43,0-43,5°С, слабость, угнетение, одышку, анорексию, атаксию, диарею с содержанием слизи и желчи, в некоторых случаях - ринит и др. Гибель отмечали преимущественно на 510 сутки после инфицирования. При вскрытии наблюдали катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, незначительное увеличение селезенки, некротические узелки на печени.

Значения 1Л)50 составили для Б. 1урЫтипит М-5в I = 2,025 млн мкр. кл.; Б. 1урЫтипит М-2ф г = 2,8856 млн мкр. кл.; в. 1урЫтипит Д-1в I = 3,135 млн мкр. кл.

Определение эффективности бакгериофагового препарата в остром лабораторном опыте при сальмонеллезе голубей

Для определения профилактического действия Бактериофага тифимуриум голубям первой опытной группы (10 голубей 3-месячного возраста породы синий) орально вводили препарат из расчета 0,5 см3 индивидуально автоматической пипеткой-дозатором. Через 12 часов проводили заражение голубей смесью штаммов Б. 1урЫтипит М-5в I, Б. ГурЫтипит М-2ф I, 8.1урЫтилит Д-1в I по 0,7 мл, в концентрации 5 млн мкр. кл. в 1 мл, т.е. общая инфицирующая доза составила 10,5 млн мкр. кл. (4 11550).

Голубям второй опытной группы бактериофаг выпаивали согласно разработанному временному наставлению. Необходимое для обработки поголовья птиц количество доз препарата добавляли в питьевую, предварительно кипяченую и охлажденную до 20-30°С воду, из расчета 10-20 мл на голубя на одно выпаивание. За три часа до выпойки Бактериофага тифимуриум голубей выдерживали без поения. Заражение птиц проводили через 12 часов аналогично первой группе. Птиц контрольной группы

инфицировали смесью штаммов в тех же дозах, но обработку бактериофагом не проводили.

Наблюдение вели 15 дней, после чего проводили убой и бактериологическое исследование трупов павших и убитых голубей. В результате проведенных лабораторных испытаний отмечены профилактические свойства 90-100% при 10% сохранности в контрольной группе (табл. 3).

3. Профилактическая эффективность применения Бактериофага тифимуриум

Группа Количество голубей, голов Заболело, голов Пало, голов Летальность, % Выделение Б. 1урЫтипшп от голубей

голов %

1-опытная 10 0 0 0 0 0

2-опытная 10 1 1 10 1 10

Контрольная 10 9 9 90 10 100

Примечание: Р<0,05

Определение терапевтического действия Бактериофага тифимуриум проводили на 30 голубях породы синий 3-месячного возраста. Были созданы три группы: две опытные (по 10 голубей) и контрольная (10 голубей), которых кормили и содержали по принципу аналогов. Голубей всех групп инфицировали смесью: Б. (урЫтипиш М-5в 1, в. 1урЫтипит М-2ф ^ Б. 1урЫтипит Д-1в I аналогично предыдущему опыту, затем через 12 часов голубям первой опытной группы орально вводили бактериофаг из расчета 0,5 см3 препарата индивидуально. Голубям второй опытной группы бактериофаг выпаивали через 12 часов после инфицирования, добавляя его в питьевую воду. Голубей контрольной группы Бактериофагом тифимуриум не обрабатывали. Наблюдение вели 14 дней, после чего проводили убой и бактериологическое исследование трупов (табл. 4).

4. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум в лабораторных условиях

Группа Количество голубей, голов Заболело, голов Пало, голов Летальность, % Выделение в. (урЫшигшт от голубей

голов %

1-опытная 10 0 0 0 0 0

2-опытная 10 0 0 0 0 0

Контрольная 10 7 7 70 10 100

Примечание: Р<0,05

Из представленных в табл. 4 данных видно, что Бактериофаг тифимуриум обладает выраженными лечебными свойствами. У голубей, которым был выпоен бактериофаг, не было клинических проявлений сальмонеллеза. Через 14 дней при убое и бактериологическом исследовании в опытных группах сальмонелл не выделяли.

Таким образом, Бактериофаг тифимуриум обладает выраженной литической активностью против сальмонелл in vivo. Профилактическая эффективность препарата составила 90-100%, а терапевтическая - 100% при заражении голубей вирулентными штаммами S. typhimurium в лабораторных условиях.

Определение терапевтической эффективности препарата Бактериофаг тифимуриум в производственных условиях

Производственные испытания терапевтической эффективности Бактериофага тифимуриум были проведены на пяти голубятнях, расположенных в различных районах г. Москвы и Московской области.

Болезнь сопровождалась характерными клиническими признаками, острым, под-острым и хроническим течением. Диагноз был подтвержден бактериологическими исследованиями и методом молекулярной диагностики в ПЦР.

Обработку голубей Бактериофагом тифимуриум проводили трижды с интервалом 48 часов в дозе 0,5 см3 на голубя групповым методом с питьевой водой в разведении 1:20.

На третьи сутки после начала фаготерапии состояние большинства заболевшей птицы улучшилось, появилась активность, восстановился аппетит, консистенция и цвет помета нормализовались, прекратились новые случаи заболевания и гибель птицы. При контрольных исследованиях положительных результатов на сальмонел-лез не отмечали. За период наблюдения (6 месяцев) рецидивов сальмонеллеза на голубятнях не регистрировали.

5. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум в условиях голубятен

Местоположение голубятни Марьино, г. Москва Кузьминки, г. Москва г. Подольск, Моск. обл. г.Домодедово, Моск. обл Бирюлево, г. Москва

1 2 3 4 5 6

Количество голубей, голов 162 76 295 150 75

Заболаевемость, % 69,1 13,6 15,2 58,0 14,7

Летальность, % 20,5 20,0 2,2 89,6 36,4

1 2 3 4 5 6

Падеж с начала лечения, гол 0 0 0 0 0

Бактериологический

анализ через 14 сут. сальмонелл не выделили

(смывы из клоаки)

ПЦР через 30 суток:

- количество проб 20 20 20 20 20

- получено положительных 0 0 0 0 0

результатов

По результатам проведенных опытов показано, что при лечении сальмонеллеза в условиях голубятен Бактериофаг тифимуриум обладает 100% терапевтической эффективностью (табл. 5).

Экономическая эффективность полученных результатов лечения

Предотвращенный ущерб при лечении сальмонеллеза в среднем на 100 голубей составляет (при коэффициенте легальности 0,3; средней стоимости 1 голубя - 500 руб. и 90%-ной эффективности терапии) 10000 руб.

Один рубль вложенных средств позволяет получить экономический эффект в размере 16,67 руб. при условии, что цена одной дозы препарата составляет 2 рубля.

Изучение лечебного действия бактериофагового препарата в опыте иа других видах птиц

Терапевтическая эффективность препарата была исследована в передвижном частном зоопарке «Ташир» и в зоопитомнике ФГУ «Московский зоологический парк».

В частном передвижном зоопарке «Ташир» в ноябре 2005 г. наблюдали заболеваемость уток, фазанов и других птиц сальмонеллезом, при этом у взрослой птицы отмечали матовое оперение, взъерошенный вид, апатию, периодически жидкий помет с зелеными прожилками, отставание в росте, повышение температуры тела, понижение аппетита.

Из 28 фазанов разных пород клиническую картину заболевания наблюдали у 6 (21%). 2 фазана 3-месячного возраста пали. При вскрытии павшей птицы обнаруживали катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, слизь на поверхности кишечника, мелкие кровоизлияния, очажки некроза в печени, на селезенке и другие изменения. Б. 1урЫтипит выделяли в смывах из клоаки у всех

фазанов. У 9 уток породы кряква отмечалась острая инфекция с развивитием угнетения, анорексии, повышения температуры до 43,5-44,0°С, диареи. 5 уток из 9 пали. Утки положительно реагировали в ПЦР на сальмонеллез, из клоаки выделена сальмонелла.

Выпойку Бактериофага тифимуриум проводили групповым способом (1"20 с водой) всей птице зоопарка из расчета: перепелам - по 0,5 см3 препарата, фазанам, уткам - по 1 см3, селезням, павлинам - по 3 см3, гусям, лебедям - по 5 см3 трижды с интервалом 12 часов, четвертую и пятую выпойки - через 48 часов

На третьи сутки после начала фаготерапии состояние заболевших улучшилось, восстановился аппетит, оформился помет, температура к 5-6 дню лечения нормализовалась. Гибель птицы больше не отмечали, при бактериологическом анализе смывов из клоаки у фазанов и уток, проведенном через 14 суток, бактерий рода Salmonella не выделяли. ПЦР через месяц после начала фаготерапии не дала положительных результатов

В зоопитомнике Московского зоопарка наблюдали случаи заболевания голубей, уток, гусей и других птиц. В вольерах содержались 65 голубей, 30 гусей, 42 утки, 22 лебедя, 4 фазана, 1 павлин.

Клинически заболевание отмечали у 12 голубей (18,5%) породы гривуны, свердловские и др. в возрасте от 2 мес. до 2 лет. Заболевание характеризовалось типичными для сальмонеллеза клиническими признаками, у трех голубей отмечали неспособность к полету, опухание локтевых и коленных суставов. 8 голубей в возрасте ог 2 до 8 мес. пали (смертность составила 12%) У уток отмечали схожие признаки, наиболее выраженные у утят 2-х месяцев. Пали 3 утенка из 8. У 1 золотистого фазана отмечали развитие угнетения, понижение аппетита, жидкий помет. У гусей, содержавшихся в соседнем вольере, и у лебедей не отмечали клинических признаков заболеваний, однако из помета выделяли S. typhimurium.

Выпойку препарата проводили орально всей птице зоопарка Лечение Бактериофагом тифимуриум показало высокую эффективность, выздоровление птиц к 4-6 суткам, отсутствие сальмонеллоносительства по результатам контрольных исследований на 10 день после начала лечения.

Таким образом, терапевтическая эффективность препарата Бактериофаг тифимуриум на птицах частного зоопарка «Ташир» и зоопитомника ФГУ «Московский зоологический парк» составила 100%.

Исследование возможности возникновения резистентности сальмонелл к

бактериофагам

Инфицирование голубей Б. 1урЫтипит М-5в I орально в дозе 4 млн мкр. кл с однократной выпойкой РЬ. Б. 1урЫтипит №9 ММ в дозе 0,5 см3 через 2 часа четырехкратно с интервалом 10 месяцев показало отсутствие возникновения фагорезистентности у сальмонеллы. Клинических признаков сальмонеллеза отмечено не было, в то время как у голубей контрольной группы без обработки фагом на второй день после заражения наблюдались признаки, характерные для сальмонеллеза: диарея с примесью слизи, вялость, взъерошенность, отказ от корма и гибель на 5-10 сутки.

Каждые 2 месяца проводили опыт, где на три чашки Петри высевали штаммы Б. 1урЫтипит Д-1в М-2ф 1, М-5в I. Чашки делили натри сектора, в которые вносили по капле фагов: РЪ. Б. гурЫтипит №5 ТЗ - ДЕП, №8 МЁ - ДЕП, №9 ММ - ДЕП. Через сутки инкубирования проводили учет реакции по образованию зоны негативного роста, после чего культуры сальмонелл с каждого сектора агара вблизи границы с зоной негативного роста фага высевали в полужидкий агар и после инкубации помещали на хранение при температуре 4°С. По истечению двух месяцев проводили аналогичный опыт - на отдельные чашки высевали штаммы сальмонелл, хранившиеся в полужидком агаре и восстановленные при 8-12-часовом росте на МПБ. На каждую чашку Петри с высеянным штаммом сальмонелл капали те же фаги, что и в предыдущий раз. Данный опыт повторяли 8 раз с интервалом 60 суток. Активность фагов на изоляты сальмонелл оставалась неизменной — на каждый посев в течение 30 месяцев возникали очаги лизиса культуры бактерий примерно одинаковые по размеру. Изменений в структуре колоний и биологических свойствах Б. 1урЫтигшт за время проведений опытов выявлено не было

Таким образом, при проведении опытов по возможности возникновения резистентности сальмонелл к фагам появления фагоустойчивых изолятов сальмонелл выявлено не было.

Выделение и селекция резервных бактериофагов для препарата Бактериофаг тифимуриум

На длительную перспективу применения препарата нами были продолжены выделение, селекция и изучение биологических свойств бактериофагов к Б. 1урЫ-типит. По методу обогащения выделили дополнительно 29 бактериофагов, из них

13 - с активностью от 10"8 до Ю"10 и 2 - с активностью 10'5 до 10"7 (табл. 6)

6. Свойства резервных фагов

Название фага Морфология негативных колоний Литичсская активность по методу

форма цвет диаметр, мм Аппель-мана Грациа, БОЕ/см3

11 ФЧ круглые прозрачные 5,0-8,0 Ю10 3,2хЮ!

12Ф,Т круглые прозрачные 0,5-1,0 10" 1,7x10"

13 ВГ круглые прозрачные 2,0-3,0 10'ш 2,5x10"

14 ПП круглые прозрачные 2,0-3,0 кг" 3,0x10"

15 СС круглые прозрачные 2,5-3,0 10"1и 4,0хЮ1и

16 ФЗ круглые прозрачные 2,0-3,0 10" 5,0x10'

17Ф,М круглые прозрачные 1,0-2,5 10: 1,7* Ю4

18 ГО круглые прозрачные 5,0-6,0 Ю-9 2,7хЮ7

19 БЕ круглые прозрачные 1,0-2,0 10"5 1,7хЮ4

20 Н2Ж крупные, круглые полупрозрачные, с вторичным ростом 2,5-5,0 10"8 5,5хЮ7

21 БИ круглые прозрачные 7,0-9,0 10" 1,2x10'

22 ПР круглые прозрачные 2,5-3,0 10° 5,6x10"

23 ТУ круглые прозрачные 1,5-2,5 10*1и 1,2x10'

24 Ф2В круглые прозрачные 1,5-2,5 10 s 6,8x10'

25 ПО круглые прозрачные 1,0-2,0 10 й 3,1хЮ5

Изучением специфичности и спектра литического действия наиболее высокоактивных фагов был отмечен лизис Э. 1урЫтипит (из 20 музейных и полевых культур -более 90-100%), 8 ёиЬПп (из 4 культур - 85-100%), 8. стспПсПз (из 15 - 80-90%), Б. £аШпагиш-ри11огиш (из 7 - 75-100%), Б. newlands (из 3 - 20-60%) и отсутствие литического действия на штаммы других энтеробактерий.

Структуры вирионов наиболее литически высокоактивных резервных бактериофагов характеризовали по электронно-фотографическим изображениям (табл. 7).

7. Размеры структурных элементов вириона, нм

Изолят бактериофага Диаметр головки, нм Длина хвостового отростка, нм Ширина хвостового отростка, нм Морфотип фага

11 ФЧ 53 230 5 В1

13 ВГ 68 133 3 В1

14 ПП 60 280 6 В1

15 СС 62 237 5 В1

16 ФЗ 50 150 5 В1

18 ГО 63 233 5 В1

Данные исследования позволили фаги РЬ. 8. (урЫтигшт 11 ФЧ, 13 ВГ, 14 ПП, 15 СС, 16 ФЗ, 18 ГО отнести к IV классификационной группе по АС. Тихоненко, семейству 81рЬоуМае и паспортизировать.

выводы

1. Сальмонеллез - широко распространенное бактериальное заболевание голубей. Серовариант Salmonella typhimurium является основным возбудителем сальмо-неллеза голубей (96%).

2. Выделенные нами бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ, Ph.

S. typhimurium №8 ME и Ph. S. typhimurium №9 MM являются высокоактивными (ак-

10 8 10 8 тивность по методу Аппельмана составила 10"", 10° и 10" , по Грациа - 3,6x10

БОЕ/см3; 1,0х107 БОЕ/см3; 1,4х108 БОЕ/см3 соответственно), специфичными и обладают широким спектром литического действия по отношению к возбудителям саль-монеллеза голубей

3. Фаги Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, №8 МЁ, №9 ММ по строению относятся к IV группе по А.С.Тихоненко, семейству Siphoviridae и морфотипу В1.

4. Бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ - ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЁ - ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 MM - ДЕП депонированны в ФГУ ВГНКИ. На их основе изготовлен препарат Бактериофаг тифимуриум для профилактики и лечения сальмонеллеза голубей. Препарат безвреден и высокоактивен в подкожном тесте на белых мышах.

5. В лабораторных условиях протективная эффективность препарата Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей составила 90-100%, терапевтическая эффективность - 100% при гибели в контрольных группах 70-100% инфицированных голубей.

6. Бактериофаг тифимуриум эффективен в условиях голубятен. На 5 неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях г. Москвы и Московской области лечение Бактериофагом тифимуриум позволило ликвидировать инфекционный процесс и сальмонеллоносительство: контрольные исследования на 14-е сутки после применения препарата бактериологическими методами и на 30-е сутки в ПЦР - отрицательны

7. Экономическая эффективность лечения сальмонеллеза у голубей Бактериофагом тифимуриум составила 16,67 руб. на 1 руб. затрат.

8. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум была отмечена на птицах различных видов зоопитомника ФГУ «Московский зоологический парк» (голуби, утки, фазаны) и вольеров передвижного зоопарка «Ташир» (утки, фазаны) и составила 100%.

9. Применение фагов, включенных в препарат Бактериофаг тифимуриум, в течение 30 месяцев не вызывает потери или снижения фагочувствителыюсти у сальмонелл в опытах на питательных средах и на голубях.

10. Дополнительно выделены и селекционированы 15 резервных фагов с активностью 10"5-10''° и широким спектром литического действия в отношении S. typhimurium, а также S. dubün, S. enteritidis, S gallinarum-pullorum, S. nevvlands. Электронная микроскопия Ph. S. typhimurium 11 ФЧ, 13 ВГ, 14 ПП, 15 CC, 16 ФЗ, 18 ГО из числа резервных позволила отнести их к IV классификационной группе по методике А С. Тихоненко, семейству Siphovindae и морфотипу В1.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научные данные, полученные в ходе работы, использованы для составления «Рекомендаций по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренных Департаментом ветеринарии МСХ РФ (№ 25-25/162 от 11.04.2008)

Результаты, полученные при изучении эффективности Бактериофага тифимуриум, внедрены в ветеринарную практику голубятен и зоопарков России. Материалы научных исследований используются в учебном процессе в ФГУ ВПО МГАВМиБ.

Выделенные бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ - ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЁ - ДЕП, Ph S. typhimurium №9 MM - ДЕП депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных.

Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы по заявленному патенту на препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Изученные особенности сальмонеллеза голубей при экспериментальном инфицировании, эффективность применения Бактериофага тифимуриум рекомендуется учитывать при планировании противоэпизоотических мероприятий при сальмонел-лезе голубей.

Препарат Бактериофаг тифимуриум рекомендован специалистам и владельцам голубятен для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пименов Н.В. Биологические свойства бактериофагов Salmonella typhimurium и их терапевтическая эффективность против сальмонеллеза голубей /Н.В.Пименов, И.В. Чиркова //Молодежь и наука XXI века: Сб. науч. тр - Ульяновск. УГСХА, 2007.-С. 336-340.

2. Пименов Н.В. Фаговыделение, терапия и профилактика сальмонеллеза голубей /Н.В Пименов, И.В. Чиркова//Ветеринария. -2007. -№10. -С. 24-27.

3. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей /Н.В. Пименов, А.Н Куриленко, И.В. Чиркова, С.С. Яковлев. - М: МСХ РФ. -Изд. «МегАрт». - 2008 - 43 с.

4. Чиркова И.В. Биологические свойства бактериофагов против сальмонелл ти-фимуриум и их использование в борьбе с сальмонеллезом птиц /И.В. Чиркова, Н В. Пименов //Ветеринария и кормление. - 2008. -№3 - С. 32-33.

5. Чиркова И В. Применение бактериофагов для лечения сальмонеллеза голубей с целью снижения заболеваемости сальмонеллезом человека /И В Чиркова //Фундаментальная наука и клиническая медицина: Человек и его здоровье: Сб. науч. тр -СПб, 2007.-С. 510-511.

6. Чиркова И.В. Специфическая профилактика сальмонеллеза голубей /И.В Чиркова //Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб тр. мол. уч. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2006. - Вып.З. - С. 117-122.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать Об 09.08. Тираж 100 экз. Усл. п.л 1 Печать авторефератов (495) 730-47-74,778-45-60

Актуальность темы. В последнее время в нашей стране и зарубе-жом широкое распространение получило голубеводство.

Однако, голуби также как домашняя птица, подвержены инфекционным заболеваниям, одним из которых является сальмонеллез. Среди бактериальных инфекций голубей сальмонеллез занимает одно из ведущих мест

42, 118, 127). Гибель голубей от этой инфекции может достигать 20-25%, а молодняка - до 80%. Заболевание наносит значительный ущерб, заключающийся помимо потерь от гибели птицы в отставании в росте и развитии переболевшей птицы, снижении оплодотворяемости голубок, недополучении приплода, потери спортивных и служебных качеств голубей. При этом больные и переболевшие птицы являются возможным источником инфицирования сельскохозяйственной птицы, животных и человека (42).

По данным Департамента ветеринарии Минсельхоза РФ сальмонеллез широко распространен среди голубей практически во всех регионах страны. Особую опасность заболевание представляет в густонаселенных городах, где много мест концентрации пищевых и бытовых отходов, большая численность диких синантропных птиц (86). Синантропная птица (голуби, воробьи, вороны и другие) концентрируется вблизи мест сбора мусора, торговли продуктами питания, водоисточников, зернохранилищ, возле животноводческих и птицеводческих комплексов. При этом птица, больная сальмонеллезом, становится источником возбудителя для животных и человека. После переболевания угрозу представляет сальмонеллоно-сительство, птица распространяет возбудителя через определенные биологические связи, в том числе посредством пищевых цепей (44, 82).

По данным ВОЗ, заболеваемость людей сальмонеллезом за последнее десятилетие возросла шестикратно, а в странах СНГ — в 7 раз. Причины заболевания многие исследователи связывают с загрязнением продуктов питания животного происхождения патогенными микроорганизмами

16, 43, 82, 99, 165, 176). Причем, по данным Центра контроля болезней в США, изделия из домашней птицы продолжают быть одним из самых важных источников вспышек сальмонеллеза у людей (177).

Основной серовариант, вызывающий эпизоотический процесс на голубятнях относится к серогруппе В - 8.1урЫтипит (90%). Кроме того, от голубей выделяли: Б. ег^егШсНБ, Б. 1шс1а1;, 8. Ье1ёе1Ьег§, 8. §аШпагит и другие. Необходимо отметить, что 8. егйегМсКз (44-46%), 8. §а11тагшп-риПогит (41-43%), 8. 1урЫшипит (8-10%) являются основными возбудителями сальмонеллеза кур; 8.1урЫтипит — сальмонеллеза уток, гусей (8090%); 8. егйегШсНз, 8.1урЬш1игшш — основные сероварианты, вызывающие пищевые токсикоинфекции человека (8,42, 58, 69, 71, 94, 113, 116,152).

Таким образом, борьба с сальмонеллезом голубей актуальна с нескольких сторон:

- во-первых, для обеспечения санитарного благополучия и профилактики пищевых токсикоинфекций человека, особенно в условиях густонаселенных местностей с большой концентрацией пищевых и бытовых отходов и скоплением синантропных птиц;

- во-вторых, для лечения и профилактики сальмонеллеза у клубных голубей: декоративных, спортивных, служебных, разведение которых становится все более популярным и дорогостоящим;

- в-третьих, для профилактики сальмонеллеза в промышленном птицеводстве и животноводстве, где синантропные птицы могут быть источником возбудителя и разносчиком инфекции для гусей, уток, кур и молодняка сельскохозяйственных животных, пушных зверей.

В основе мероприятий по борьбе с сальмонеллезом уделяется большое внимание разработке и применению химиотерапевтических препаратов. Сложность борьбы с сальмонеллезом определяется быстрым ростом резистентности сальмонелл к антибиотикам и другим химиотерапевтиче-ским препаратам. Бесконтрольное применение антибактериальных средств способствует усугублению ситуации и селекции антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов (43, 44, 60, 103, 119, 128, 177).

Отмечается, что за последние годы произошел серьезный дрейф штаммов в сторону развития у них множественной резистентности к антибиотикам, не активны многие антибактериальные препараты последних поколений, никогда не использовавшиеся в голубеводстве и ветеринарии в целом. По данным Гебеша В.В. (2000 г.) большинство свежевыделенных, особенно госпитальных штаммов сальмонелл полирезистентны к 810 хи-миотерапевтическим препаратам различных групп. По данным Гусева В.В. (2003 г.), в ряде голубятен обнаруживали даже 100% устойчивость бактерий ко всем применяемым антибиотикам (34, 42, 44, 60, 103, 128, 160).

При контакте с дикими и домашними животными, человеком, в особенности с детьми, а также с пищевыми продуктами и открытыми водоемами возникает вероятность распространения не только самой инфекции, но и устойчивых к антибиотикам штаммов на другие восприимчивые организмы и на другие территории. В связи с этим лечение сальмонеллеза становится сложной задачей, а проблема борьбы с сальмонеллезом — еще более актуальной. Остро стоит вопрос совершенствования методов профилактики и лечения сальмонеллеза и переориентирования подходов к его искоренению от применения только химиотерапевтических средств (44, 103, 119, 145, 183).

Одним из перспективных и безопасных препаратов против сальмонеллеза является бактериофаг.

Отмечена эффективность применения подобных препаратов в промышленном птицеводстве. Сальмофаги энтеритидис и пуллорум обладают как профилактическими, так и лечебными свойствами против сальмонеллеза кур. Использование бивалентного сальмофага против сальмонелллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур позволяет:

- обеспечить защиту от заболевания сальмонеллезом с первых дней жизни, чего нельзя достигнуть использованием вакцин;

- исключает поствакцинальные осложнения;

- снимает проблему инфекции, обычно имеющую место при вакцинации по инфицированному фону;

- санирует птиц-бактерионосителей, чего невозможно достичь применением антибиотиков (116).

Применение специфических и литически высокоактивных бактериофагов для борьбы с сальмонеллезом голубей позволит санировать птицу от сальмонеллоносительства, обеспечить защиту от заболевания с первых дней жизни, предотвратить поствакцинальные осложнения и повысить сохранность поголовья.

Безопасность метода использования фагов (в т.ч. для молодняка с первых дней жизни), удобство применения, лечебный и профилактический эффект, высокая экономическая эффективность, возможность решения проблемы сальмонеллоносительства являются перспективным компонентом комплексной системы профилактики сальмонеллезной инфекции (70). В общем контексте многие исследователи и специалисты отводят бактериофагам важную роль в борьбе с сальмонеллезной инфекцией (32, 45, 72, 78, 93,102, 136, 167).

Применение биопрепарата, функциональная основа которого — бактериофаг, с лечебно-профилактической целью при сальмонеллезах у птицы весьма перспективно. Поэтому исследования, посвященные выделению и изучению бактериофагов к Salmonella typhimurium, являющимся основным серовариантом, вызывающим сальмонеллез синантропных птиц и домашних голубей, а также создание бактериофагового препарата для профилактики и лечения сальмонеллеза голубей актуальны для ветеринарии и голубеводства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлось выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов к Salmonella typhimurium, а также создание и определение эффективности применения фагового препарата для борьбы с сальмонелле-зом голубей.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезу голубей в Московском регионе.

2. Выделить и селекционировать высокоактивные бактериофаги к Salmonella typhimurium.

3. Изучить морфологию, литическую активность, специфичность, спектр литического действия селекционированных фагов тифимуриум.

4. Создать фаговый препарат, изучить его протективную и лечебную эффективность для голубей в лабораторных условиях.

5. Изучить эффективность применения экспериментальных серий препарата в неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях и вольерах.

Научная новизна.

1. Изучена эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в г. Москве и Подмосковье.

2. Выделены бактериофаги к Salmonella typhimurium, селекционированы наиболее активные из них и изучены их биологические свойства.

3. Создан биологический препарат Бактериофаг тифимуриум, предназначенный для лечения и профилактики сальмонеллеза голубей, изучена его протективная и лечебная эффективность в лабораторных и практических условиях.

Практическая ценность работы. Рекомендован для внедрения в биологическую промышленность и ветеринарную практику Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей с установленной профилактической и лечебной эффективностью.

Разработаны и внедрены «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей» для ветеринарных специалистов, лабораторий, институтов, владельцев голубятен.

Выделенные бактериофаги к Salmonella typhimurium депонированы в ФГУВГНКИ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Открытой Всероссийской научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI века» во ФГОУ ВПО УГСХА (г. Ульяновск, 2426.04.2007); на Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых ВУЗов МСХ РФ (г. Воронеж и г. Москва, 2007); X Всероссийской Медико-биологической конференции «Человек и его здоровье» (г. Санкт-Петербург, 20-21.04.2007), на Всероссийском конкурсе «Развитие АПК РФ» (Москва, 27-29.05.2008), межкафедральных заседаниях ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 6 научных статей и выпущены методические рекомендации, одобренные Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ от 11.04.2008 № 25-25/16.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу голубей в г. Москве, Московской области.

2. Биологические свойства выделенных и селекционированных бактериофагов к S. typhimurium.

3. Протективные и лечебные свойства препарата Бактериофаг тифи-муриум против сальмонеллеза голубей.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, сведений о практическом использовании результатов иссле

4. ВЫВОДЫ

1. Сальмонеллез - широко распространенное бактериальное заболевание голубей. Серовариант Salmonella typhimurium является основным возбудителем сальмонеллеза голубей (96%).

2. Выделенные нами бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЁ и Ph. S. typhimurium №9 MM являются высокоактивными (активность по методу Аппельмана составила Ю"10, 10"8 и 10" , по Грациа - 3,6* 108 БОЕ/см3; 1,0x107 БОЕ/см3; 1,4x108 БОЕ/см3 соответственно), специфичными и обладают широким спектром литического действия по отношению к возбудителям сальмонеллеза голубей.

3. Фаги Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, №8 МЁ, №9 ММ по строению относятся к IV классификационной группе по A.C. Тихоненко, семейству Siphoviridae и морфотипу В1.

4. Бактериофаги Ph. Salmonella typhimurium №5 ТЗ — ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЁ — ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 MM - ДЕП депони-рованны в ФГУ ВГНКИ. На их основе изготовлен препарат Бактериофаг тифимуриум для профилактики и лечения сальмонеллеза голубей. Препарат безвреден и высокоактивен в подкожном тесте на белых мышах.

5. В лабораторных условиях протективная эффективность препарата Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей составила 90100%, терапевтическая эффективность — 100% при гибели в контрольных группах 70-100% инфицированных голубей.

6. Бактериофаг тифимуриум эффективен в условиях голубятен. На 5 неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях г. Москвы и Московской i области лечение Бактериофагом тифимуриум позволило ликвидировать эпизоотический процесс и сальмонеллоносительство: контрольные исследования на 14-е сутки после применения препарата бактериологическими методами и на 30-е сутки в ПЦР — отрицательны.

7. Экономическая эффективность лечения сальмонеллеза у голубей Бактериофагом тифимуриум составляет 16,67 руб. на 1 руб. затрат.

8. Терапевтическая эффективность Бактериофага тифимуриум была отмечена на птицах различных видов Зоопитомника ФГУ «Московский зоологический парк» (голуби, утки, фазаны) и вольеров передвижного зоопарка «Ташир» (утки, фазаны) и составила 100%.

9. Применение фагов, включенных в препарат Бактериофаг тифимуриум, в течение 30 месяцев не вызывает потери или снижения фагочувст-вительности у сальмонелл в опытах на питательных средах и на голубях.

10. Дополнительно выделены и селекционированы 15 резервных фагов с активностью 10"5-Ю"10 и широким спектром литического действия в отношении различных изолятов S. typhimurium, а также S. dublin, S. enteritidis, S. gallinarum-pullorum, S. newlands. Электронная микроскопия Ph. S. typhimurium 11 ФЧ, 13 ВГ, 14 ПП, 15 CC, 16 ФЗ, 18 ГО, из числа резервных позволила отнести их к IV классификационной группе по методике A.C. Тихоненко, семейству Siphoviridae и морфотипу В1.

5. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Научные данные, полученные в ходе работы, использованы для составления «Рекомендаций по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренных Департаментом ветеринарии МСХ РФ (№ 25-25/162 от 11.04.2008) (приложение, стр. 16).

Результаты, полученные при изучении эффективности Бактериофага тифимуриум, внедрены в ветеринарную практику голубятен и зоопарков России. Материалы научных исследований используются в учебном процессе в ФГУ ВПО МГАВМиБ.

Выделенные бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ - ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЁ - ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 MM -ДЕП депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных.

Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы по заявленному патенту на препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

Изученные особенности сальмонеллеза голубей при экспериментальном инфицировании, эффективность применения Бактериофага тифимуриум рекомендуется учитывать ветспециалистам при планировании противоэпизоотических мероприятий при сальмонеллезе голубей.

Препарат Бактериофаг тифимуриум рекомендован специалистам и владельцам голубятен для профилактики и лечения сальмонеллеза птиц.