Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Влияние токсигенных анаэробов на биологические свойства эшерихии и стафилококков

ЗСЕС0ЕЗН1Д ОРДЕНА ЛЕНИНА

научно-исследовательский институт

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им.Я.Р.КОВАЛЕНКО ВСЕСОЮЗНО« ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУЛОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АШЕ!Ш СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имен« В.И.ЛЕША (ВАСШЛ)

На правах рукописи

НАЧКЕБИЯ ДХЕШ ВАРЛАИОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ТОКСИГЕННЫХ АНАЭРОБОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ

СВОЙСТВА ЭШЕРИШ И СТАФИЛОКОККОВ 16.00.03 - мтеринарми кякробиоаогия, мруоо-хогия. эпиэоотояогня, микояогия я иммунология

автореферат диссертации на соискание учепой степей* доктора ветеринарных йаук

Москва - 1991 р.

Работа выполнена в ГруаV -ком ордена "Знак Почата" аоотвхническо-ветерннардем учебно-исследовательском института.

Официальные оппоненты:

1. Кириллов Л.З. - доктор ветеринарных наук, профессор (г.Москва, ЗГНКИ).

2. Сидоров М.А. - доктор ветеринарных наук, профессор (г.Москва, МИПБ).

■3. Лклодед В.Г. - доктор медицинских наук, профессор ( НИЛБАВ КЗ СССР).

Ведущее учреждение - Всесоюзный каучно-исследоватвдьсккЯ Институт ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Защита диссертации состоится " // "¿//<5?991г. в 14*® часов на заседания специажмированного совета Д 030.28.01 по эааите диссертации на соискапие ученой степени доктора наук при Всесоваиом ордена Ленина научно-иссжедовательском Институте экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко (109472« Москва, Куэьминвн, ВИЭВ). С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан " 1991 г>

Учений секретарь совета канд.вет.паук Ф.Г.Теревков

Г«»!-;.'-: ■. t -f -

t ' "

Ut-::.-. : : ;

------ ' ' I'. ОШ.Я ХАР^КТЕШСТИКА РАБСГШ

I.I. Актуальность теш. Значительный экономический ущерб животноводству накосят болезни молодняка : колибактерпоз„ анаэробные инфекции, стафшюкоккозн п стрептококкозн.

Условнопатогвнные микробы* которые прп экстенсивном способа ведения пивотноводства не првдставля.111 особой опасности, при интенсивной системе содержания глвотных резко усилило сзса вирулентное гь .

В крупных ягвотноводчасклд комплексах циркулируют множество вирулентных серогрупп кишечной палочки, патогенность которых нельзя объяснить одним только понижением резистентности гатвот-ных или пассированием через' восприимчивый организм. Если учесть, что в желудочно-кишечном тракте еивогнътс наряду с кишечной палочкой присутствуют анаэробные микроорганизмы, то при определенных условиях биоценоза мокну шта, по-видимому, может происходить обмен генетическим материалом и передача патогенных свойств.

Токсигенностъ анаэробных бактерий обусловлена плазмидной ДНК / Rood J. et al , 1978; Donald 1. et al , I984j Charles H.-

et al г 1984/, которая локализована в клетке автономно (не исключено интегрирование с хромосомой). Она ж мокет переноситься os анаэробов к е.coli к стафилококкам. Кисечная палочка, имея селективные преимущества размножения в квлудочно-кишвчяом тракте, вызывав? соотвотсгвуЕзло заболевания у человека и яивотпых«,

Несмотря ка то, что биологические свойства анаэробных микроорганизмов, езертгятй п стафилококков хороио изучены, механяэ-ш возникновения коляпкЬакцяй недостаточно вскрыты, отсутствуй? данные о возмогшем влпяняп гоксягенных анаэробов на патогенные

- 2 -

и другие свойства coli и стафилококков.

Изучение этих вопросов позволят раскрыть механизм развития эшерихиозов, разработать средства профилактика и лечения коли-бакгвриоза новорожденных ашвстных, выяснить внехромосомнуг и хромосомную наследственность клостридиЯ, эшерихиЯ и стафилококков.

1.2. Цель и задачи работы. Целью исследования является изучение возможности передачи различных биологических свойств - па-тогенноста, гомолипгческой активности, антигенылс,детерминант, ферментативной способности, резистентности к антибиотикам о? УОКСИГвНШХ клострщщй / Cl.perfringens, Cl.eepticum, Cl.oedema-tlene, Cl.chauvcei / к эшерихпям и стафилококкам. В соответствии с этим на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Остановить возможность передачи патогенных, гемолитических, антигенных, ферментативных свойств, устойчивости к антибиотика?: с помощью конъшвции и трансформации от токсигенных :июстридий к эшерихиям и стафилококкам.

2. Установить возможность передачи гемолитических, ферментативных свойств, устойчивости к антибиотикам о? патогенных анаэробов к этеряхиям и стафилококкам при совместном заморашЕва-кии.

3. Изучить иымуногвнные свойства рекомбннантов E.coli ц о галоши о; штаммов токсигонких хлостридий и кх протективкув активность г оттпз эшарихиозов.

1.3. } ручная новиана результатов. Изучается возможность переноса рааагних свойств о? гохсигвшшх анаэробных гакроорга-¡133юв к »шоряхияы в стафилококкам.

Обнаружена передача патогенных свойств, гетдикгческоЛ активности, антигенных двтергеваш1, ферментативных свойств в ус-

■ойчивости к антибиотикам от вирулентных клостридий к эшерахиям : стафилококкам; при этом патогенные свойства преимупественно :вреносятся конъюгацией - трансформация для этой цели менее ригодна, но во реализуется передача гемолитических и фврмвнга-изных свойств, а также резистентность к антибиотикам. Эти приз-акя передаются, в частности, при совместном замораживании клос-рщшй с эшерихяямя я клостридий с ста(£илокояками.

Доказана возможность получения гибридных штатов с полезши саойстзаг.я в результате скрещивания токсигенных анаэробов этврюсгоая, передачи при этом антигенных свойств, характерных тя клостридий, что позволило изготовить вакинн, обладающие .муногешшки свойствами против клостридиозов и эшорихиозов, а 1кло лочабныо гидершлмушшо скворогкя.

Разработана методика скрощлвашя анаэробных мнкрооргянпз->в с эиерихияш и стафплокоюеат в 'Тязиологячоском растворе ■ci . Разработана гакзо методика солекцлскипоояншг рокомбя-нтов E.coli из организга павзих mhmoíí, шкгтпровашпяг смэсьп :остридяй с оперютямя. Впервые доказана возмоглость ксиользо-нля вакцины против коллбактеряоза новорожденных ллвотшгх, из-товленной из вирулентны;: эталонны:: я га жоп гугоотркдип. Обнару-на антигенная связь мезцу токсигоштагг а на гроба и этврютя-, гокспгошп-ггя атзробаг-л п сгайклококкак:. топсптзнншст агаэ-

бЭШ Я СГр0П7О1СОК-!'.Э?-Г-Л

1.4....Практическая. значимость работы,. Предлагается работа зволлт болоо углубленно .попит;. вот осе згполопи: заерихяозоа тознцкЗ внохромосоглой п хромосомной юслзлствотюсук гззду зэробшяг r;!:pooprarnî3r'f.":t гчзвряхиямч и о^йьтококкзга» с CSO ВОПРОС!! генной ШГСОПОрЯК с ЦОЛЬП ПОЛУЧЗНЗЯ ЯТЗ'.СЮЭ ГГ.ПфО-здшзмов с П0Л03Ш1.Я ссойсгхогл;, усоворгокствопать прочла."-

г яку к лечение новорожденных животных при колибактерлозе.

Результаты исследованиЗ коренный обрезом изменяет вдевшиеся до сих пор представления о вирулентности в.coli и стафилококков и дают совершенно новое направление исследованиям в области инфекционной патология и генетики этих микроорганизмов.

•Теоретические обобщения, основанные на экспериментальных дашлд, позволили изготовить вакцины ■ сыворотки для профилактики и лечения эшерихиозов.

1.6. Публикация. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

1.7. Объем работы. Диссертация изложена на 367 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 таблицами, 26 фотографиям!. Список цигарозанноЗ литературы включает 349 источников, в том числе, 209 отечественных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Возможность передата свойства токсинообразования, гемолитической активности, антигенных свойств, ферментативной активности, резистентности к антибиотикам и др. изучили на модели токсигенных анаэробов, эшерихии и стафилококков. При этой нап-равляицими были штаммы клостридий.

. Для экспериментального доказательства существования спонтанного переноса различных свойств от патогенных клостридий к эшерихияы с стафилококкам использовали как эталонные шгамш указанных микроорганизмов, так и культуры, выделенные из объектов анезшей среды и организма животных.

В опытах по переносу Hiy и Ent факторов, антигенных свойств итаоды доноров (клостридий), как правило, были токся-гегошш, ишуногенныш, а культуры реципиентов полностью лезю-

ни этих свойств, не имеют общих антигенов с донорами. Штамю* доноров к реципиентов отличались также по чувствительности к различным антибиотикам. В качестве питательной среды использовали Китт-Тароцци, бульон Хоттингере, МПБ, МЛН, глюкозокровяной агар, агар Эндо. Конъюгацию между анаэробам!, эшерихнями и стафилококками проводили по Ваганабе /1961/, Бвааппап /1969/, Дж.Миллер /1976/; идентификацию бактерий, синтезирующих гемолизин, осуществляли по Госбел, Ройер, Покора н др. /1974/; идентификацию бактерий, синтезирующих экзотоксин, - заражением белых мышей культурами рекомбинантов в брюшную полость.

Ввиду того, что не разработана стандартная методика скрещивания токсигенных анаэробов с аэробныш видами бактерий, в зависимости от цела эксперимента, внесены соответствующие изменения в них, в частности, в одном случав конъюгация осуществлена в 0,15 К растворе н»сх , в другом - ва полноценной среде о последующим заражением и отбором рекомбинантов в организме павших подопытных животных с целью лучшего селекционирования клопов с сообщенным свойством токсинообразования.

Достоверность передачи токсигенных свойств пта и.ем реципиентов контролировала ншунологически. Для этой цели использовали диагностические сыворотка С1.регГг1п£епа , изготовлен-ныв Адма-Атинсхим бпокомбннатоы, и гаперяшушше кроличьи сыворотки, получаемые наш. Ставила реакции нейтрализации п агглютинации. В РН антитоксические сыворотки, гомологичные типу доноряого штаьса, нейтрализовали культуры рекомбинантов о? соответствующих россов. В пробирочной РА положительный результат получала о гомологачнзлз типу донора сыворотками.

Спонтанную транодукцпэ исключала добавлением к культурам реципиентов Зяльтрзтов культур допоров, а трансфор*зцел - до-

(Заеданием к смеси клеток донора и реципиента ДКК-азы.

Перед л остановкой опытов у всех исштувшх. штаммов научали морфологические, биохимические, гемолитические, вирулентные и антигенные свойства, отношв'ше к отдельшпл антибиотикам, ауксо-трофность.

.Трансформацию изучали по мотка резистентности к стрептомицину и передаче Н1у -'{актора. Пред-даритель но определяли чувствительность к антибиотикам методом серийных раззэдений и методом диффузии в агар с применением дисков, содержащих антибиотики, согласно методическая указаниям, утвержденным ГУВ МСХ СССР /1972/.

Для получения стрептомицинорезистентных вариантов пользо- , вались методиками Д.Г.Кудлай /1950/, Сцибальского и Бризона /1952/, матодо;л реплик /Д.Ледерберг, Э.Леберберг, 1952/.

Изолирование ДНК из бактериальных клеток проводили по методике Мармура /1961/.

Опыты по трансфоршции ставили в соответствии методикам, описанным Эвери с сотр. /1944/ и Марыур /1961/.

Проводили сравнительное изучение иммуногенных свойств культур реципиентов, доноров, трансконъюгантов и трансформантов. Вакцины для иммунизации готовили по общепринятой методике, проверяли их на стерильность, безвредность и активность. Формол-вакцюи животным вводила подкожно двукратно, с интервалом в 12 дней первой и второй инъекцией. Степень напряженности им-

мунитета у вакцинированных животных проверяли чороз 21-22 дня поело окончания иммунизации. Контрольное зараконло проводили различите дозами культуры. Активность сыворотки крови ншуни-зярованннх животных проверяли методой нейтрализация культуры чврэз 21-22 дня после окончания ишушгзацил. Ультра с грукгуру

КЛ9Т0К клоогрютй изучали ПО HJter, , Kellenberger И Др. А958/, Kellenberger /I960/, Mc.Quillen /1965/ и др. По разработанной наш методике готовили препарате для обнаружения конъюгирующихся клеток.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Передача гемолитических, патогенных, антигенных и ферментативных свойств от Cl.perfringene к E.eoli

В качестве доноров использовали гоксигенные. штаммы ci.per-frlngena типов: А28, А49, B2I6, В( ЬД-I), C2I9, Д2П, Д213, Д218, Д47, резистентные к стрептомицину, неомицииу, мономицииу, полишксину, налидихсовой кислоте, чувствительные к пенициллину и тетрациклину, обладающие хорошо выраженными гемолитическими свойствами, характеризующиеся отсутствием роста на пластинчатых средах в аэробных условиях.

Реципиентами служили авируленгные штаммы E.eoli KI2 ? , MI, OUI, 0119 - резистентные к пенициллину и чувствительные к стрептомицину, тетрациклину, полимяксину, неомицину, мономицину, налидиксовой кислоте; не обладающие способностью гемолизировать эритроцит^ разных видов животных (кролика, овцу, лошади).

Каяушй штамм донора скрещивали отдельно со штаммами реципиентов. Отбор рекомбинангов вели по обнаружению на глюкозокро-вяном агаре колоний с зоной гемолиза (передача фактора- Н1у ). Исходили из того, что одновременно с гемолитическим свойством переносится фактор токсигенности.

Рвкомбинангы, полученные от каждой скрещиваемой пары, были изучены по свойствам, характерным роципиентным итачтам, а далее ■га приобретение вирулентных свойств - путем заражения болых мы-

шей внутрибрюшнно бульонными культурами рекомбикантов 24-часо-

q

вого роста в объеме 0,5 мл с концентрацией микробных тел 4.10 на мл. Еивотные, зараженные культурами рекоыбинантов, погибали в течение 48-72 часов; контрольные животные,■зараженные исходным! культурами реципиентов, оставались живы.

.Все штаммы доноров ci.perfringene передавали Н1у -фактор культурам е.соИ. *, Ent -фактор не сообщался только от штамма Cl.perfringene Д47, который заведомо Сил авирулентным и, следовательно, служил в качестве контроля, удостоверяющим отсутствие переноса токсигенных свойств от атоксигенных доноров. Результаты опытов представлены в таблице I.

Количество рокомбинангоа с фактором- Н1у было выше, чем с фактором - Ent , что касается переноса антигенных детерминант, го оно несколько выше по сравнению с сообщением фактора-Ent , но ниже, чем передача способности синтеза гемолизина.

Достоверность передачи патогенных свойств шгамшм е.coli KI2, Щ, OUI, 0119 контролировали иммунологически - ставили реакции нейтрализации и агглютинация.

Для этой цели использовали моновалентные иммунные сыворотки, полученные гикериммунпзацией кроликов штаммами ci.perfrln-gene типоа: А28, B2I6, C2I9, Д2П и антитоксические сыворотки Cl.perfringeno , изготовленные Алма-Атинским биокомблнатом и Томски) ЕИИ вакцин и сывороток.

Рсак то найтрализа1даи ставили в соответствии с методическим указанием лавного управления ветеринарии МСХ СССР от 30.01.1979 г.

ХЪпернммунные сыворотки Cl.perfringene » полученные К гомологичным типу донора штаммам, защищали белых мы-ей, контрольные животные габли в течение 48-72 час. Те же сыворогся

таблица I

Результат скрещивания между штаммами С1.реггг1пвепз и Е.соИ

1 Количест- Частота Количеств Частота Количаст Частота

1 во реком- образова- во реко-;образова во реком образова-

1 0 1 С к р в щ и в а е м ы в бинантов ния ре- мбинантсвния ре- бинантов ния ре-

пары м н к р о 6 о в с приобр& комбинан- с приоб-;комбинан с приоб- комбинан-

генным гов регенным тов ретенным тов

фактором фактором антиген-

Н1у на Вп» на ным

; 1 I мл I мл свойст-

! ( вом

|1 С1»регГг1пв®пз А28Х г.со11К12 18 ЭЛСГ3 12 6 лег8 14 ' 7.10Г8

; 2 И [ А49Х —"— К 8.КГ8 14 7 ЛОГ8 10 5.ПГ8

: 3 И В216Х -"- 22 1Д.10Г7 18 9.ПГ8 20 1.10-7

и -" В( Д-1)Х—"- 22 1.1 ЛОГ7 18 " 9 Л О-8 13 Э.10"8

5 " . I. С219Х -"- 16 вЛСГ8 10 5 ЛОГ8 14 7.10-8

6 -"_ ■ Д2Ш -"- 15 7.5.ПГ8 7 • 3,5.Ю-8 14 7 ЛСГ8

! 7 Д213Х -"- 14 7.1СГ8 7 3.5.1СГ8 12 5.10-8

! ! 8 1» Д218Х -И— 12 б.ш*8 8 4.10-8 10 5 .ИГ8

; э 1 -"- Д47Х -"- 15 7,5.10® - - - -

- 10 -

агглютинировали, убитые нагреванием антигены рекомбинантоэ .в.coli в разведениях 1:200 - 1:400. Отмечалась и перекрестная агглютинация, но в более низких тиграх - 1:50 - 1:100. Это объяс 1шется тем, что между типами ci.perfringens имеются антигенные сшзи.

. С жишш антигенами титр агглютининов был значительно ниже - 1:40 - 1:50. Однако, если сравнить их с антигенами исходных штаммов реципиентов, то разница бэсьш значительная - они либо на агглютинировались с теми г;е сыворотками, либо реагировали в очень низких разведениях -1:5.

При изучении ферментативных свойств культур доноров, реци-лиентов и их рекомбинантов, было замечено, что отдельные культуры рекомбинантов по сравнению с исходными п гамма ми реципиентов е.coli KI2, MI, 0119, OUI сбраживали инозит, рафинозу, ман-нозу, т.е. те углеводы, которые ферментировались исходными куль-тураш доноров - ci.perfringèna тапои А28, B2I6, C2I9, Д2II.

Таким образом, штаммам реципиентов е.coli от штаммов доноров Cl.perfrinscns сообщались токсигешюсгь, гомолигцчос-кая активность к антпгогаюсть к способность фор;.:знхацгш отдельных са:сароь - инозита, рафнкозц s luhhosu.

3.2. Породача гбьолтичоских, аатогсгашх, ашл-генных п форматативных свойств от

' - Cl.eepticua К E.coli

В ка iCTBe доноров использовались штам.*и ci.eep-noura А2, А59, AlbC. AII3, обладайте токсигошшмя к гииг.. ;л'юсши Б^'.стьама; роцнпконташ служили те ко штаммы E.coli.

Рекомбикэнти, отобранные по прлэнглсу гемолитической актшз-iiccvii, изучались по основный свойствам рецкпаот'оя, затем по

• - II -

переданным ям другим свойствам: патогенности, антигенным детерминантам, ферментативной активности.

Культуры рекомбинантов, одновременно приобретшие гемолитическую активность я вирулентные свойства, убивали белых мышей в течение 48-72 ч. Не все рекомбинанты с приобретенным Н1у -фактором оказывалась вирулентными, некоторая часть из этих культур на вызывала гибель подопытных жизотных. Следовательно, эти два признака клеткам е.coli передаются независимо друг от друга. Ч;астота образования рекомбинантов с фактором- Ent ниже нежели о гемолитическим. Результаты опытов представлены, в таблице 2.

Культуры рекомбинантов о приобретенной вирулентностью проявляли агглютинабельность в ишунной сыворотке ci.septieum А59, полученной наш от гипериммунизированных кроликов. Для этого готовили ОН-антигены, тщательно отобранные по отсутствию самоагглютинации.

Антигены рекомбинантов и соответсгвуших реципиентов исследовали в живой культуре и убитой нагреванием. Культуры реко»-бинантов (убитые нагреванием) агглютанировались довольно в высоких тиграх (1:300 - 1:450) в иммунной сыворотке к ci.septieum А59, тогда как в той ке сыворотке культуры реципиентов реагировали в разведениях на превышающих 1:5. В нормальной кроличьей сыворотке агглютинация отсутствовала как у рекомбинантов, гак и у реципиентов, что подтверждает одновременный перенос фактора патогенности и антигенных свойств от ci.septieum к е.coli.

С'тавыт.я антигенами в РА наибольшее разведение сыворотки отмечено в пределах 1:200 - 1:300, что несколько превышает таковую с Cl.perfringens . Объяснить это можно тем, что для получения гипериммунной сыворотки к ci.septieum А59 использовали ОН-антиген.

Таблица 2

Передача фактора Н1у и фактора Ent от

Cl.Bepticum к E.coli

С к й а

р а ¡ц и в а е р ы м и к р

ы е б о

I. С1.

! 2*

3.

4.

> 1 к и о.

с ts >>о

1С 2

а о о £

o*s е а,о

§ь к S к о

КЗ CS ST

§sS

mag

ЧяЕ

000 И("К

1 ©

со 2 « он

septlcum А2 X Е.coli KI2 12

А59х II

А103х 14

ЛПЗх , 12

I

о «

ш

о.

о п

сз

£ о

Е

о к

о &

г

!К со о,

■ с ы о

' О <D

Е

m о о

f- C«

§23

к о

Я)

о

к о

. jj 5 ® я я

0 5 о

СО t< «

1 ш ^

со а fd ОН

о «

ш О.

н

3

о m

о

6.10"

10

5.5.1СГ® ' 8 7.10-8: II

6 лог

,-8

I 5'

; 4. 5,5. 4.5,

ю о

Еч

S о

,-в

1СГ8

Ю"3;

ICT8!

Гипериммунная сыворотка к Cl.eepticua А59 нейтрализовала

культуры ракомбинантов, та so культуры, но без добавления сыворотки, убивали белых мышей, что свидетельствует о специфичности имму1шой сыворотки против ci.oepticum А59 к культурам рекомби-

нантов, полученным скрещиванием штатов Cl.eeptlcum с шгаы-шщ к. со П.

Pökouoi- анты, полученные скрещиванием пар Cl.eepticua ц

2.coli приобретали способность ферментировать отдельшо ве-цеетьа, ображьзание которых было свойственно штамшм донора

( Cl.oepticuo ). Так например, культуры реципиентов е.coli

по сбраываювда киозат, салицин, ловулезу и но ргпшгкавщио жола-

9

тин, после скрещивания с штаммами Cl.septicua становились активными к ним,

3.3. Передача гемолитических, патогенных, антигенных и ферментативных свойств от ci. chauvoei И Cl.oedematiens К E.coll

В качестве доноров использовячи штаммы CI.chauvoei BI, BIG, и 311; Cl.oedematiene А7Э.

Реципиенгаш служили те же штаммы Б.coli , что и в предыдущих опытах - KI2, Í.H, Olli, 0119. Бактерии скрещивали по описанному методу. Рекомбинантов отбирали с глюкозокроаяного • агара по признаку гемолиза вокруг колоний.

Перенос вирулентных свойств проворяли вкутрибрюшинным заражением белых мыпаЯ культурами рекомбинантов, которые были селекционированы по приобретении фактора- Н1у . 7 зараженных животных срок гибели наступал на 3-4 сутки и был удлинен на 1-1,5 сутки по сравнении с рекомбинантами, полученными от скрещивания С Cl.perfringenв ИЛИ Cl.septicum.

Далее проверяли агглютинабелъность рекомбинантов в гиперИММУННОЙ сыворотке CI.chauvoei И Cl.oedematiens.

РА ставили с живыми и убитыми нагреванием культурами. В гипериммунной сыворотке против Ol.chauvoei 31 соответствующие рекомбинанты (убитые) агглютинировались в титрах от 1:300 до 1:400. Агглютинабелъность рекомбинантов в гипериммунной сыворотке против Cl.oedematiens А79 выражалась в титрах от 1:350 до 1:450.

С живыми антигенам:! рекомбинантов сыворотки против С1. chauvoei DI ¡I Cl.oedematienB A79 также реагировали

положительно. Титр агглютининов в сыворотке против 01. cha -

- 14 -

uvoei В среднем равен 1:280, против Cl.oedematiene

1:320. В контроле исходные культуры реципиентов агглютинировались в разведении не вызе 1:5.

Пшершлмунные сыворотки против Cl.chauvoel и Cl.oedematiene нейтрализовали гомологичные культуры рекомбинангов.

Штамш ci.chauvoei сообщали реципиентам E.coli способность ферментации левулезы. От cl.oedematiene А 79 свойство сбракивания глицерина передавалась птаммам в. coli KI2 и Щ.

Таким образом, ревдшшнтщш штампам E.coli KI2, ЬЦ, Olli, 0119 ОТ Ci.chauvoei И Cl.oedematiene сообщаются гемолитические, патогенные, антигенные и ферментативные свойства.

3.4. Передача гемолитических и патогенных свойств от клостридлй к стафилококкам

В качестве доноров использовали штаммы Cl.perfringene А28, B2I6, Д2П; Cl.eepticum А59; Cl.oedemoUeno А 79; Ci.chauvoei 31 - чувствительные к пенициллину, обладающие гсыолитцчаскиш свойствами.

Реципиентами служили 46 штаммов белого стафилококка, выделенных из воздуха кивотноводческих помещений, не гемолитических, апатогешшх, не продуцирующих на МГЬ\ золотистого и желтого пигментов, р.зистекгшх к пенициллину.

Все штг -ни доноров передавали Hly -фактор. Из 46 штаммов стафалококко. испытанных в качестве реципиентоа, способными нос принимать политическую активность оказалось 14.

Культуры рекомбннантои с приобретенным Uly -фактором проверяли на возможность одновременного сообщения и аирулентшх свойств. Для этого культурами рекомбинаитоо 24 ч рост?. на 'ДБ

заражали белых мнэей ж.м. 18-20 г, впутрябрпаинко л подкожно в

гч

дозах: 0,3-0,5 - 0,8-1,0 мл с концентрацией 2-10 и.т/т. 7ка-ззшше дозы при подкожном заражения не вызывали гибель животных, а при внутрибрюсиином мили погибали от дозы 0,8 и 1,0 мл в- течение 3-4-5 суток. Отмеченная вирулентность была свойственна всем рекомбинантам с сообщенным Hly -фактором, т.е. одновременно передавалась как гемолитическая активность, гак и впрулен-' тносгь, значительно уступавшая исходным культурам доноров.

Частота встречаомосги рекокбинантов по Hly -фактору была

о

в среднем 5«IC-0.

3.5. Передача устойчивости к стрептомицину ОТ Cl.ehauvoei К В.coli

Saundera /1?78/ показал возк-о-шость передачи п -Доктора от облнгатных анаэробов, относящихся к группе Bacteroidee ( fr agi lia ). Зги трансмнсспзныэ R -факторы обдигатных анаэробов могут попасть и з клетки патогенных бактерий ( Salmonella, Shigella ).

Нами изучена возможность поратичи устойчивости к стрептомицину от облпгатного анаэробного микроорганизма ci.cheuvoei к Е. coli.

3 качество донора использовали атамм Cl.chnuvoei BI -резистентный к стрептомицину и чузствителыый к пенициллину.

Реципиентом слу-лл и:та:.:.! е.coli KI2, резистентный к пенициллину, чувстакте.чь!з;й к стрептомицину, лишенный способности гомолпзировать эритроциты барана.

Передачу устойчивости к строптомтаину о? ci.chauvooi BI к Е.coli KI2 проводили с помоги конъюгации по методу Вятпна-бо ( T.Watanabe , T.Pukacnva ,, IS6I), ПО МОТОЯЗГКО, рог-рабо-

- IS -

танной лабораторией шкробиологки К;ЭВ /1978/.

Для отбора ракоыбиьантов в качестве селективных сред использовали пластинчатый глокозокроьяной агар и агар Эндо, содер-ващие 40 ед/мл стрептомицина и 5 ед/мл пенициллина.

Выход трансконъсгантов составлял в средне!/. 9-Ю-8.

.На селективной гдюкозокроэяном агара некоторые колонии ре-комбинатов имели зону гемолиза. В среднем, в пересчете на I мл конъюгационной смеси было^Э колоний. Зыход трапсконъюгантов составил 4,5-IO"8.

Таким образом, от донора Cl.chauvoei BI реципиенту В.coli KI2 передаотся резистзнтность к стрептомицину и гемолитическая активность. |

3.6. Определение степени устойчивости к стрептомицину у в.coli передаваемой от Cl.perfrin-genB , Cl.eepticum И Cl.chauvoei

В качьсгзе доноров использовали CI .peri'ringene B2I6, CUaepticura А59, Cl.chauvoei BI, устойчивые к более чем 150 ВД/мл концентрации стрептомицина на пластинчатой среде, не культивируемое в аэробных условиях, облздаыоие вцракенными ток-свгйнш|.щ свойствами и гемолитической активностью.

Реципиентами служили штамш Б. ее Ii KI2 и "Л; чувствительные стрептомицину, ашрулонпше, на гемолитические, культивируете в азр^бшл и анаэробных условиях.

Дчн l'.ji >тя б[.ьли три уровня концв'прыщи стрептомицина Нй A'Hi.T.o'-DKpcnuoKw агаре по Цейсслеру - 10, 20 я 50 ЕГ . Се--си!.1 ■•:!■■ i к c.peib крг»1в укаэаничх кокцонтраций стрептлтциьп со ■ ? КД/г.ч пспчщняяинз (доноры ч.у»> тв.ич лт цу к ченицилда-

- 17 -

Конъгацию проводили по методике, описанной в предыдущих опытах. Рост рекомбинантов отмечался в с^едо с концентрациями стрептомицина 10 и 20 НД/мл как в аэробных, так я анаэробных условиях, с концентрацией стрептомицина 50 ЕДЛ'Л рост рекомби-нантов не обнаруживался.

Параллельно конъгационной смеси,после 36 ч инкубирования, заражали белых мышей с целью выяснения передачи факторов Ent , Hly и уровня устойчивости к стрептогяцяну. К этому времени (за 36 ч) анаэробы из среды элиминировались, за исключением тех, которые были а парз с клетками реципиента. Болые .мыши, зараженные конъюгационной смесью, погибали в 70-80-9055 случаев, а зараженные культурами доноров погибали все, культурами реципиентов - оставались живы.

Культуры рекомбинантов с переданной вирулентностью хранились при температуре +3°С в течение года на следующее питательных средах: ШБ, МППБ и полужидкий агар (всего 82 штамма). Хранившиеся культуры пересевали один раз в месяц, через год проверяли сохраняемость переда того вирулентного свойства на белых мышах. Из 82 культур рекомбинантов на ШБ сохранили токсигвн-ность 32, на МШШ - 46, на полужидком агаре - 62.'

Лучшей средой для сохранения вирулентных культур рекомбинантов является полужидкий агар. Он стабилизирует клеточную оболочку и предохраняет от повреждения, доводя до шнимуш элиминацию плвзмид, обусловливающих продуцирование экзотоксина.

- ie -

3.7. Передача шфулентялс овеять с? тсхсхгокпих анаэробов к эщаркхи.п.: их ассовакном uut ащиветн::

Известно, что в ассоциациях одни ?.яг:<роорга.чизмов усаливают, другие - снижают вирулентность симбионтов. Подобное действий отмечено между килечной палочкой и cl.perfringene . Поэтому ставилась задача - проворить влияние самих клостридяй га патогешше свойства эшерихий при ассоциированном их вы;а:язашш.

Для решения этого вопроса в качестве доноров испо.тьзовали штаммы cl.perfringene А28, А4Э, B2I6, В( ьД-I), С21Э, Д213, Д218; Cl.aepticuin А2, А59, AI03, AII3; Ci.chauvoei BI, BII; C1.oedematieue к7Э. В качества реципиентов взяли E.coli KI2 И E.coli MI.

Ассоциирований выращенной смесью, культурами доноров и реципиентов, заражали белых шаей с целью выделения из организма пашшх мгшей селекционированных рекомбинангов по вирулентным свойствам.

Белые мыши, зараженные смесью клостри.щаЯ с эшерихияш, по-гнбали на 2-3 сутки. Контрольные животные, инфицированные куль-i'jpai® рацигалзнтоа и доноров с МПБ, оставались живы. Контрольна киши'ые, зарин «энные культурами допоров с МИЛЕ, погибали в гечиинм I2-1G-I8-24-46 ч (в зависимости от нпда донора).

Пядичс 1 -ji.iiriЯ, йаракенйых вз ommm щоб, вскрывали и дела-у:а ььоьиы hj ••■роил сердца на 1.ПБ, ыау Эвдо, МПА, глюкоэокровя-iiou агар, Но и ^эпнче ракоыбинь.чти были п.аингнчны с рсполт-зован-ниы ь.coli KI2 и Ы1, шпГюточ, нриоуло ре-

чи!'- •(•.', с.пар.1Нялй и ракомбишотг, вдобавок она приобретали

ü.'iV"! eiü: 5 И, ■* ;■■■)!', "ilTV,4bii;;.V? ¡1 !'Л )!£<■-!'.( ГЬ .

—19 -

Далее у полученных рекомбинантов проверяли возможность одновременного переноса антигенных свойств. Для этого заведомо получали гапериммунные кроличьи сыворотки против донорных штаммов, которые использовали для постановки реакции агглютинации с имеющимися рекомбинантами. Положительная РА одновременно позволяла контролировать и перенос Ent -фектора. Гипериммукше сыворотки соответствующих декоров агглютинировали клетки рекомбинантов в пробирочной РА в разведениях 1:200, 1:250, 1:300. Исходные культуры реципиентов агглютинировались до разведения сывороток 1:5.

Было замечено, что при последовательных пересевах на МПБ рекомбинантов с факторами Ent и Hly (интервалом 2-3 дня с последующим высевом на глюкозокровяной агар), Hly -фактор часто элиминировался, но сохранялся фактор- Ent , зараженные белые мыши гибли в течете 4&-72 ч. Следовательно, эти два приз!шка передаются независимо друг от друга и элиминация фактора- туне влияет на вирулентные свойства рекомбинантов, Ent -фактор сохраняется.

Из -культур рекомбинантов и исходных реципиентных штаммов E.coli KI2, Ж готовили аназакцяны для гипериммунлзацяи кроликов.

Сыворотки, полученные гиперишунизацией кроликов анавакци-нами рекомбинантов е.сои , агглютинировали антигены соответствующих донорных штатов, а также антигены исходных штаммов реципиентов. Предельный титр положительной РА токсигенного анаэроба с сыворотками рекомбинантов был 1:300 - 1:400. Контрольные сыворотки, полученные иммунизацией кроликов антигенами исходных реципиентных культур ( E.coli KI2, !Я), не агглютинировали культуры доноров. Эти сыворотки агглютинировали гомологич-

- 2С

ныв антигены в разведениях 1:20 - 1:50. Перекос фактора вирулентности сопровождается также сообщением антигенных свойств.

3.8. Антигенные связи между зшерихиями и клос тридиями

Постоянное контактирование различных видов дакроорганизмов в желудочно-кишечном тракте человека я животных, а также в объектах внешней среды, обусловливает их взаимодействие, которое выражается в приобретении ила утрате ими некоторых биологических свойств. j

I

Наблюдающиеся в природе антигенные чвязи ыевду различными ищами и родами микроорганизмов - не просто случайное совпадение, а результат их взаимодействия, когда происходит перенос различных детерминант, в том числе и антигенных, от доноров одного вида или рода к реципиентам другого вида или рода.

Доказательством таких феноменов явилось исследование 216 штаммов в.coli , выделенных от больных и павшие колибакгерио-зом новорожденных животных, принадлежащих к серогруппам: 0125, 09, 0101, 0119, 0128, 0124, 044, Olli, 026, 08, которые были идентифицированы по морфологическим, тшгкториалышы, культураль-иыи, биохимическим, вирулентным, гемолитичоским свойствам, резистентности к антибиотикам. Из 216 культур 134 убивали белых мыший,

Для обнарувения антигенной связи ыевду вирулентными эпизо-отлескиш штампами в.coli с токсигенныш анаэробами готовили атшшш из культур Cl.perfringece ' типов А28, B2I6, C2I9, Д2П; Ol.aepticuiB А59; Cl.chauvoei BI; Cl.oedeoatiene А7Э.

Иш 1'>1!10|.'Л!£.!ут!ЗИ])0йа.'Ш КрОЛНКОВ.

Tj'ij. аггл л'ниннов против Cl.perfringeno айнов Л28, B2I6,

C2I9, Д2П соответственно составлял - 1:3200, 1:3800, 1:1800, I:2COO; Ci.eepticun А59 - 1:2600; Cl.oedemstiene А79 - 1:800, Cl.ehauvoei BI - 1:800. Затем эти сыворотки испытали с эпизоотическими штаммами в.coli . Антигены эпизоотических штаммов в.соli готовили в двух вариантах - живой и гретой.

1ивые антигены эпизоотических штаммов в,coli агглютинировались сывороткой ci.perfringens , А, В, С, Д в разведении 1:20, 1:40, 1:50 - 88; Cl.eepticun 1:20, 1:40 - 16; Cl.oede-B*ti»ne 1:20-3; Cl.ehauvoei 1:20 - 9.

С гретыми антигенами положительная реакция была получена с разведением сывороток: ci.perfringene типов А, В, С, Д -1:20, 1:50, 1:100, 1:200, 1:250, у 98 штаммов; ci.eepticum -1:20, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200 - у 14; ci.oedemmtiene - 1:20, 1:50, 1:100 - у 8; Cl.ch.uroei - 1:20, 1:50, 1:100 - у 14.

Испытали также типоспециЗические диагностические сыворотки ci.perfringene типов А, В, С, Д, Е, изготовленные Алма-пАганским биокомбинатом и Томским НИИ вакцин и сывороток.

С хивыш антигенами положительную РА получали в разведении сывороток, содержащей в I мл 20 АЕ у 52 штаммов; убитые нагреванием 82 штамма агглютинировались при содержании а I юг сыворотки 5 АЕ. Контроль с нормальной кроличьей сывороткой в раз- . ведении 1:10 и физиологическим раствором НаС1 был отрицательным.

Результаты РА свидетельствуют об антигенной связи между различными серогруппами эпизоотических штаммов е.со11 и клостридилщ.

. - 22 -

3.9. Антагонистическое действие x.coll в отношение анаэробных бактерий

Антагонистическое действие микроорганизмов связано с выработкой ими антибяотикоподобных веществ - бактериоцннов. Известии бактериоцины, продуцируеше кишечной палочкой (колицкны), сх. perfrlngana (велхицины), Cl.botulinum (ботицины), холерным виброоном (вибриоцикы), возбудителей чуш (пестицины) и др.

Для изучения этого вопроса использовали культуры к.coli в анаэробов, выделенные из фэцас стельных и отелившихся коров.

Готовили парные пробы 10-1фагного разбавления материала (100 иг) в MIIIIH. Одну часть пробирок с содержимым црогревали на водяной бане при Ь0°С в течение 20 мин, другую часть оставляли без термического воздействия. В чашках, где высевалась гретая до 60°С суспензия, кульгинируе:ая в условиях анаэробиоза, выросли колонии неоднородной формы с зоной гемолиза. При изучении основных биологических свойств они были отнесены к ci.perfrin-gene , Cl.eepticum , ci.oedematiens < Выделенные штамш клостридай были патогенны для белых мышей; при подкожном заражении убивали подоштных животных в течение 16-36 ч. Штаммы ci.perfringene относились к типу А (по результатам нейтрализации.

В чьшиах с посевами негретой суспензии выросли колонии однородной формы; некоторые из них имели зону гемолиза и бшш нирульнпш для белых шшей. При микроскопии шзков из колоний с гемолизом а без гемолиза обнаруживали грамэтрацахельные, ко-puiiüce, довольно толстые палочки, расположенные одикчно и по-iiapuo. ¡in среде Эндо от образовывали колонии красного цвета с исХ'к^чвикам Слиской. Изучение других свойств позволило отнео-

то их к яиду е.сои.

В гретой суспензии вдашли спорогеншс формы, а эшэрихпл и другая иеспорообразуюцая м-крофлорз погиоли. Поэтому на пластинчатой среде выросли колонии разных видов хлостридпй. Тя>/!, где суопензня не подвергалась термическому погдайотвию, e.coü подавил рост спорогенчых анаэробов.

Подавление роста гокспгоишл: анаэробов куль-гурами е.coli провер;ш1 Также на эталонных птамчэх клостридий: ci.porfringeno А28, B2I6, Д213; Cl.cepticvra Л2. АЮЗ, Л59; CUchnuvooi BI я BIS; в качестве антагонистов использовали штамм! е.coli, выделенные) из фэцес.

В чашки Потри с глккозокровлкым агаром, по диаметру газона соллп по одному и гашу б.coli. после 24 инкубация, по линии роста культуры, перпендикулярно к ной наносил;: кулътурн указанна анаэробов и инкубировали п анаэробных условиях 24-АВ ч. Около линии роста е.coli отсутствовал рост ттагмон клостри-днй. Так, например, у c1.porfrin.5enn типа A2Ü зона задергал роста составила 15 ш, B2I6 - I? и.1, Д213 - 13 ил: у Cl.chnuvoei BI отсутствовал рост га расстоянии 24 к:»;, 316 - 22 мл, Г Cl.Qopticun Л103 - 16 и, А59 - па 10 леи, А2 - НА 21 мм.

Таким образом, на пластинчатой сродо к.coli полявляог . рост клосгридий п топ сяучао, оси! они буду? вдеоош на определенное вромя ранъшз, достаточное для роста гатточной палочки и шдоления им в сроду ктзгопистичоского вдаютт. который, диффундируя в шмтодш/fi агар,- яогзпляот poor amopoCon. Подобное наблюдается п и гадкой пптргольиой сродо. Если в еаоглЛ f.'ißlß одновременно вност:: ;ntor?::vrr- суточных культур анэоробоа п эш&-рихиЯ, го в.поршо трп часа oui представителя рязглю-аотся уд о-

влбтворительно ( Е.coli интенсивнее), но по црошосгвии 6-12-Ib-24-Зб ч рост анаэробов полностью подавляется, н они постепенно элиминируются из смешанной культуральной среды. Если к активно метущей на ЛППЕ культуре е. coli добавить инокуляиг анаэробов (также с 1/ЛЗБ) в логарифмической фозе роста, го размножение клоотридай полностью подавляется, а затем и постепзкно элиминируется.

4.1. Трансформация азирулентных вариантов клостридий в сторону вирулентности с помощью ДНК выделенных от исходных родительских штаммов токенген-

]

ных анаэробов

В опыт были взяты шгаыш ci.perfringene А28, B2I6,

Д211, G2I9; ci.eepticum А59, AI03, AII3. Ослабление или полную потерю вирулентности осуществляли путем многократных пассажей на питательных средах со стрептомицином /В.Д.Тимаков, Гольд-фарб, 1958/ и действием-низких температур.

Сравнивали вирулентность культур непрерывно и многократно пассированных со стрептомицином с устойчивыми культурами, полученными уу таге ниш действием высокой концентрации антибиотика. Оказалось, что вцсокоустойчивые варианты ся.рerfringenы а Cl.eepticuta , цолучешшо мутагоншпл действием антибиотика с пластинчатой среды, ио вирулентности ае отличались от исходных культур, "ледоватально, ajcoras устойчивость к антибиотикам у ооигри.1Ш на сопровождается ослаблением вирулентное га; поторя этого сьоВ.-;г^ цроясгодаг при многократном нассирог.:(|.,-н па пп-'.■а1'!пишх сродах со ступенчато возрастании« коипектрацаяка •iiiTii-iacii'iiKa.

Вова о ста<1цявКо8 утраты вирулентности :;ооит»ля щ»и коабя-

шгровакном воздействии низкой температуры и сгропгомпщна. Для этой цели штаглмы С1.регГг1пеопз !1 (П.серПсит замораживали при -70°С в течение 20 мин, после оггаивакил культуры высовалп на глюкозохровяной агар с концентрацией сгрелгсмзщнга 600 ЕД/м. Выросшие колонии били плоским!, морялнистыма, зорохова тот с изрезанннш краями, ко с хорошо выгаданным гомоли'зом. Культуры из таких колоний не убивали зараженных белых

Представляло интерес испытание на белых мысах иимуногегашх свойств авирулентннх вариантов С1.регГг1пеепо и С1.вер1;1сшп, полученных с помощью комбинированного действия низкой температуры и стрептомицина.

Для имтг/низащет использовали авирулантные :киеыэ культуры С1.регГППйело А28, В216, Д211, С21Э; С1. оярисит АЮЗ, А113 18-час роста на МППБ. Контрольных мышей вакцинировали фор-молвакциной, приготовленной из исходных одноимотзых атаммов. Вакцинацию проводили двукратно, с интервалом 7 дной кездг первой и второй инъекцией. На 21-й день проводили контрольное заражение исходным! вирулентными культурами. Все белые мши /84/, привитые живой авярулонпюй культурой, пал;! в течение 72-56120-144 ч. Из 84 белых гыгаей, привитых форколвакцпной, пали 6. Все контрольные (нопривитые) белые ив (30! пади в тэчэниа 18-24 ч. Срок гибели белых ш2вйс привитых твой а вирулентной культурой, удллнянлоя Д1П 144 ч. тогда гак контрольные болне глгаи ггогибли в течение ч. Это догсазысаот, что в индуююи икгуни-гота у анаэробов основную рол-;, игрзо? экзотоксин, но смоете с токсином участвует г, антшшшя слнториэлыш: кяотиа.

Получонк"-' ->ч"рулоитшо варианта перечисленных штаммов попользовали л /лчвоузо реципиентов в огшта:: по трзнсформах'ш. Трансформирующую ДЧК выделяли из походных иарулонияе: культу;.

,.:азинных штампов ио методике ¡¿армура /1361/. Клетки ллзпрошлц помощью лмиоидма 4 дсдецалсуль4ата арл 3?°С. Дапротеинизацою лпэирошшюЛ культуры проводили сшсьа ¿лорофорш и изоалилово-го спирта в соотноаенаи 24:1; дщ осакдала двумя объемами охлак-данного этанола ц растворяли в жидкости следу щаго состава: 0,15Ы МеС1 , 0,015.'.! цитрат Ка , а такад в физиологической растворе КиС1.

Спесь клагок рецаииента с ДНК донора инкубировала в точо-наб 4 ч при 0°С, за том выдергивали 20 шн при 37°С н после этого весь объем смеси переносили в с во кий оуаъон Хотхингера (высокий столбиком под вазелиновым шелон) и. инкубировала 24 ч. Эгаш культурами зараасчдц белых 'шсюй. Коыгролом служила та ке лсуль-"'7ры без добаачешш ДИК и соотватсгвух^хв исходные Ецрулентнио лави, а такге раствори ДНК.

показали результаты опита, от вирулентных доноров, добаьлешшя к аьарулонтныы гомологичным реципиентам, передавала им утраченное свойство синтеза энхоротоксина, хотя из числа за-рааешшх тавотных (по 12) погасало небольшое количество, по 3-4 в кдздой группе. Таким образом, с помощью трансформации продстаиллотся возмопшы перенос фактора патогешюсти от исход-них вирулентных штаммов (П.регП^х^пг! и С1.оер|;1сша к пх ави рулетным варяашам, но вирулентность у траисфоршвтов оказалась нисколько шла, чем у соответствующих доноров. У тран-сфориант'' отмечали восстановление ферментативной активности, цраченно! авируленткымц вариантами сьреп'гЗпБепо и С1.ввр-:1сиш . ь .фоцессе их ослабления. В частности, шшыш С1. ¡■в; Гг1 и^епа восстановила ферлюнхацав инозиту я арасшнозн, С1.ис[ аеиш - глюкозы.

b.I. Передача гемо;штмчоскогс фактора я ферментативных свойств от клостридий к ¿'.coli :i StaphlloooccuB при совместном злыора:.шваыш

Чтобы проследить передачу различных свойств с ааисрохенно-;о состояния от токсигенных анаэробных микроорганизмов к эшерп-мям п стафилококкам, предварительно исследовали влияние ;ia члх низких температур.

Забораайвания бактерий вздет к частичному или полному поз: гляенн-о клеточной станки, «голень асразенности зависит от рэха • i замораживания и состава среды, в которой суспензированы мак-сонно клетки. При замораживании сравнительно ::ндщой спосоо-.^ci'vd обладают белковые и углеводные среды ЦШБ, М1111Б, ерэда ; гллзрозой). Это, по-видимому, связано с том, что белка я угле-.oui» в определенной степени предупреждают кристаллизации связан-îoit поды бактериальной клетки. Но нашим ннотюдешиш бактерии и большей степени повреждаются и погаоают в Q,I5ü растворе иаС]. •Злняют на выживаемость тагахе длпхельность замор; кивания а уро-. инь температуры. При-2-4°С вьтиваамоегь бактерий шве, чеш

-,-J -IIJ -1,

'Ънпоа положение было проверено на штаылах с в оду ¡аил 2 .ùîhou „von: ûi.perfringena А20, B2IÔ, Д213, Д2[1, i.cju

'.'.), M; staphilococcue aureus il 209 a на лыух uiia:.i:ax Облег о стафилококка (Я I a Уи 2), выдалон:шх из вемдуха гиы^или ioc:as лешцвиий. Провопили -¿агорджишннй а, .а jis/î юаыр-иур-:21z 'люченаях! —4° ц -V'0°C, с иуодиймгзльно-'îi.«j 2и 4 Jü I ч, 12 ч а 24 ч, 7 суток, два а (5 местча.

1:пло алмочеао следующее: иналробы я аэ[ юи, за,) ¡¿^•¿«•шшп лрл -70°С на 2U--4C а 1 ч в р-зотиорэ Ü,IbM .¡yßl ,

ли лига!) на 50$, в срагнении с количеством жизнеспособных клеток.

Выживаемость завороженных проб с ЫЗБ, :>1ППБ и сахарозное среды при ~7С°С и экспози^ш 20-40 кин совладало и составило в среднем 70%. При экспозиции I ч погибало 35$ бактериальных клеток. Реним замораживания при -4°С сроком 12-24 ч в 0,15М растворе KnCl вызывает гибель в среднем 40> клеток, на 7 суток -60/з, в течение 2 мое - 90$з и по истечении 6 мес жизнеспособным; оставались лишь 8-22 бактерий в I ыл суспензии.

МПБ, 1ШПБ и сахарозная среда были,более щадяциш, однако при вцдор'кивании их в течение 6 мес в заморохенном состоянии аазнэспособными оставались весьма незначительное количество -36-44 к.г./мл.

Аэробнцо и анаэробные бактерии, независимо от среда замораживания и при режима -70°С, на плотных питательных средах вырастали в форма r -колоний (плоские, шероховатые, с зазубренными, изрезанным: краями). При это;.; токсигошше анаэробы и Staphylococcus aureus Ус 209 герчли вирулентность, но гемолитические свойства сохранялись. Культуры, замороженные при -4°С в раство-ро 0,I5M KaCl такта были R -формы. Вирулентность у гоксн-гешшх анаэробов и Etaphilococcua aureus й 209 была ослабло-на, но не утрачена, гемолитический фактор но элиминировался. То ко культуры, саморокеншо при -4°С на ¡.'ЛЕЕ, ЫПБ и на среде с 20£ сахарозы, в болылинстве своем на пластинчатых средах икали форш 3 -колоний, вирулентность их понижалась незначительно, гемолитическая активность сохранялась.

Совместному захораниванию подвергались 24-часовые культуры доноров с МШБ ¡1 реципиентов с J,!Iffi в объеме по I мл (2'Ю-' м.т./чч). В другом варианте культуры доноров и реципиентов осво-(от культ:;]п::!.но:1 х^жост'/. :iPi;7p;v;yr;ipo:v';i:iCM и по I мл

суспензии клеток (2- 1С9 м.т/мл) донора и реципиента смоигшали отдельно. Пробы смешанных культур ста:« ли в рефрижератор при -4°С на 12 и 24 ч, 7 сут, 2 ь 6 люс. Спеси донора и рлцшиек'га в пробирках замораживались постепенно в течение 6-8 и о итого момента отсчитывали время.

По истечешш указанного времени смеси размораживали, помещая их а водяную Cairo, с подогревом от 0° до 37°С, посла чого дополнительно зыдержилали их при 37°С 4 ч. Затем пробы насовали на г.иокозокровялой агар, содержяций 5 КД/шг пенициллина п 16 БД/мл стрептомицина. На селективной среде с нооеьапи из опытных проб (смесь культур донора и реципиента) выросли колонии рекомбииантов, которым была передана резистонуность к с грето-' мицину. Среди выросших колоний некоторые имели зону гемолиза, что свидетельствовало о переносе iUy-фактора. Эти колонии перэ-носили в !.ШБ, выращлвали 24 ч при 37°С и эараяали белых мыаей ж.м. 18-20 г, внутрибрющцшо в дозе 0,5 мл 4*1Сг м.т. мл. Контролем слухн;ш исходные культуры доноров и реципиентов, выраженных раздельно в течение 24 ч. Ими такие заражали белых :.г.шей. Опытные :лоотше, sapaseiiHue нуль гураны ракоыбинан:ов, оставались кипы. Оставались кавыки текае тавогшю, зараавнныв исхогшма кугьту» pr-Ot реципиентов, Цади, заракешше культурам доноров (aiiooipa-

погибали в течение I6-IÖ-20-24 ч.

Таким образом, при совместней заиорававанш! юколгошаи '¡гаэробов с авирулентными ээерихилш и о^млококкам: вирулентные свойстга не перодаьалиоЕ. Но при з?ок ооомздяноь реэиогень ■ость г. стрепгсьапшь7 а гемолитическая пктншюсуь, ninj прзэшк strr передавался с больней чаотоюй, •»«< Л1у тор, Уджншио срока зпмортаваиая резко co.'tja^j.io число ¡азки» способных клеток. Но и п :>'гом случае ражллЛишищ по гО.'шд

занннм маркерам образовались пропорционально убыванию жизнеспособных клеток.

Штаммы реципиентов е. со и KI2 и MI при совместном замораживании с культурами доноров Cl.perfringens А28, B2I6, С219, Д2П, Д213 восстанавливала ферментативную активность относительно отдельных Сахаров, которые ими били утрачены, но былк сохранеш у доноров - сбраживание сахарозы и галактозы. С донором ci.вернешь А59 наблюдали восстановление ферментации мальтозы; с ел .oedemotienB А59 восстанавливалась также активность к мальтозе, с Cl.chauvoei BI - к мальтозе и сахарозе.

Штаммы стафилококков, замороженные совместно с ci. рег-fringenc(A28, B2I6, C2I9, Д2П, Д213), по сравнению с замороженными раздельно сохраняли форментапшную активность к юльrose, сахарозе, лактозе и молоку. Замороженные с 'Cl.oeptioura А59 штаммы сохраняли способность сбратагвать лактозу, молоко; С Cl.oedcmatienc Л79 - мальтозу; с Cl.chauvooi BI - мальтозы и сахарозу.

Следовательно, возможон перенос тох гонов, которыо дотор-мипируюг ферментацию указанных веществ, в противном случае реципиенты проявили бы такую пв ферментативную активность как п при раздельнск замораживании.

&.2. Способность к рекомбинации штаммов клостркдий, эшерихий к стафилококков, выделенных из организма кивотных

Вццоляли указанные микроорганизм! из внутренних органов (печонь, селезенка, почки, лопаю, середе) п лимфатических узлов бркхшоя полости клиничоскя здорошх, убойных животных (крупный рогашП скот, овцы, спины:).

- 31 -

Пробы из внутренних органов к мззентериальные лимфатические узлы брали сразу хв после убоя клинически здоровых животных на Тбилисском мясокомбинате и обрабатывали по методу, описанному Я.Р.Коваленко /1Э54/.

7 выделенных штампов изучали морфологии, тинкгориальныа, кульгуралъные, биохимические и вирулентные свойства.

От 164 голов исследованных животных выделены 74 штамма анаэробных »цпкроорганизыов, из них вирулентными и слабовирулент-ныыа оказались 10 шташеа, в том числе Cl.perfringene - 6, Cl.oedeiaatier.e - I, Cl.eepticum - 3; В.coli вццзл6но 94 пзолята, из них - вирулентные 6.

Было выделено всего 14 изолятов стафилококков, относящихся к st.albuo , 2 изолята содержали Uly -фактор.

Авирулентные штамш клостридий, эшерихий и стафилококков, выделенные из внутренних органов клинически здоровых убойных эивотных, использовали в качестве реципиентов в опытах по конъюгации. Донорами служила эталонные тсксигенные mrai-au анаэробов: Cl.perfringene А28, B2I6, Л2П, С21Э; Cl.eepticum А59; Cl. oedematiena A79; Cl.chauvoel BI.

Из 19 авирулентных итаммоа Cl. perfringens , взятых в качестве реципиентов, восприняли Knt -фактор от ci.perfvi Ilgens А28 - 8, от B2I6 - 4, от C2I9 - 2, ог Д2П - 3; из 17 шташов Cl.septicum при скрещивании с ui.Bepticuo ,459 способных к рекомбинации оказалось 7; из 10 шташов cl.oedematiena, взятых в опыт, скрещивались с штагл.юм Cl. oedamatienB А79 -5; из 18 шташов Cl.chauvoel скрещивались с Cl.clieuvoei DI - 9.

Авирулентные изоляти кишечной палочки (СО) иепользоь^лн ь качестве реципиентов для скрещивания с Toi:c::rui:i;iar.! д^иираш.

Отбор рекомбинантов вели по передаче резистентности к стрептомицину. Селективные среды - глюкозокровяной агар л среда Эндо содержали 5 ЦД/мл пенициллина и 40 2Д/мл стрептомицина. Из 88 изолятов Б.СОИ , взятых в опыт, восприняли устойчивость к стрептомицину при скрещивании с штаммами ci. perfringene телом А2В - 31 (35, 282), с типом B2I6 - 35 (39,82), с типом C2I9 -27 (30,7$), с типом Д211 - 24 (27,32); с Cl.eepticum А59 -21 (23,92); С Cl.oedematiene - 14 (15,92); С Cl.chauYoei -14 (15,92).

Культуры рекомбинантов проверяли в ГН с антитоксическими сыворотками доноров. Мыши, зараженные смесью культуры раком-бинанта с гомологичной донору антитоксической сывороткой, оставались кипы при гибели контрольных, зараженных культурой реком-бинанта. Изолятам е. coli , выделанным из органов убойных . животных, одновременно с устойчивостью к стрептомицину сообщались и токсигенные свойства.

Стафилококков было выделено 14 изолятов, 2 из них вызывали гемолиз эритроцитов на глюкозокровяноы агаре. В качестве реципиентов использовали оставшиеся 12 изолятов staphilococcuo albus.

Рекомбинанты стафилококков приобретали устойчивость к стрептомицину и гемолитическую активность, Что касается передачи вирулентности, то она была выражена слабев, и белые мыши, зараженные внутрибрюшинно дозой в I мл, хотя и заболевали, но оставались живы. Культуры рекомбинантов исследовали на способность ферментации маннига и плазмокоагуляцип. 3 из 7 изолятов рекомбинантов, полученных от скрещивания с ci.perfringene , вызывали коагуляцию плазмы крови кролика. Из числа рекомбинантов, полученных СО скрещивания С Cl.eepticum , у одного изо-

лята обнаружили гемолитическую активность вместе о положительной цробой на манниг и коагуляцией плазмы крови кролика. Реком-бинантаы, полученным от скрещивания с ci.oedenatiens и 01. chauvoei , была сообщена только резистентность к стрептомицину. Культуры рекомбинантов, гемолипирующие эритроциты барана, ферментирующие шнннг, коагулирующие плазму крови кролика, испытали на некротические свойства путем заражения кроликов внуг-рикожно 2 млрд взвесью N&ci в дозе 0,2 мл. Испытанные штаммы рекомбинантов st. albue выбывали на 5-6 сутки некроз кожи. Передача свойства некротоксинообразования осуществлялась как и перенос энтеротоксина, хотя выявлялась и слабее, чем у доноров. Совершенно отчетливо прослеживается передача гемолитической активности.

5.3. Способность к рекомбинации штаммов клостридий, зшернхий и стафилококков, выделенных из воздуха животноводческих и птицеводческих помещений

Из воздуха помещений для КРС выделено иэолягов: в. coli - 269, стафилококков - 360, кюстридий - 36, Для белых мишай при внутрибршшнном заражении вирулентными и слаоошфулинтныш оказались: Е, coli - 42 (10,8$), отафалокоюси - а4 (Ib;¿), клостридии - 8 (22,2,1). 9 изолятоз Е. coli обладали аполитической активностью.

Из 54 вирулентных и слабовирулентных изолятов сга^плгжо^иии К Staph, aureus относились 41, к St. albua - 13. lice h-jo íhi.j золотистых стафилококков гемолизировали эритроциты барана, tвi., albue - 6; 34 разлагали маншт ь анаэросных усаоваях, 15 -коагу.тировали плазму крови кротка.

Из Ö изолятоз токспгишшх к.-:ос1,!.11,гл1й ó fu.úi о i л зс пни i;

CI. perfringene типу А, по одному - к типу В и к типу Д и I -к Cl.eepticum . Бое 8 изолятов обладали гемолитическими свойства:,ш. Из воздуха птичников выделено 320 изолятов кишечной палочки, в том числе вирулентных и слабовирулентных - 94 (29,372), стафилококков - 450, с том числе вирулентных и слабовируленгных

- 72 (162), клостридий - 39, в том числе вирулентных - 5 (12,82).

Исследовали также содержимое и смывы скорлупы инкубационных яиц. Из содержимого яйца было выделено 40 изолятов в. coli, из них 12 (302) на глюкозокровяном агаре давали зону гемолиза, 9 - были вирулентны для белых мшпей. Стафилококки и клостридии из содержимого яиц не выделялись.

Из смыва скорлупы инкубацлонных яиц было выделено 156 изолятов к.coli , стафилококков - 214, сальмонелл - 190, цротей

- 38, клостридий - 43. Из выделенных Е. coli оказались патогенными 52 (33,32), стафилококков - 48 (22,482), сальмонелл -64 (33,682), протей - 5 (13,152), клостридий - 14 (32,562),

8 изолятов клостридий были отнесены к ci. perfringene типу А, 4 - к типу В и 2 - к типу С.

Вирулентные изоляты выделенных микроорганизмов исследовали в реакции агглютинации с пшвриммунныш сыворотками анаэробных микроорганизмов: ci. perfringene типов А28, B2I6, C2I9, Д2П; Cl.eepticum А59; CI. oedematiene A79; CI. chauvoei BI, а также с сыворотками, полученными гипериммунизацией кроликов антигенами рекомбинантов е. coli KI2.

Из 194 изолятов эшерихий 134 реагировали в РА положительно, из 164 изолятов стафилококков - 69; все изоляты сальмонелл и протея но реагировали; клостридии, как и следдвало ожидать, реагировали полотатально, причем доказана перекрестная агглю- ■ тпнпция ( ci.perfringene типоз В и С и Д).

В дальнейшем исследовали аьчрулсштные изояятн мнкроорганлз-мов, выпиленные из воздуха .киьогноводческих помещений, птичников, содержимого яиц и сглшоз скорлупы. Испытали ду на пригодность в качестве реципиентов при скрощнанни с токсигвшшш анаэробами. Отсор рокомбанянгов вели по сообщении lüy -4«кто-ра. Далее изучали совместный перекос и других свойств - синтез;: энтеротоксина а резистентность к антибиотикам.

Иэоллты реципиентов на гдюкозокроа/шом агаре на давали зону гьмолнза, не у сива .-¡л белых шааи, били рэыютшшш к пвни-цаллину а чувствительны к стрептомицину. Количество культур по видам öüKT-чрий было: эперихий - 9Э, сальмонелл - 76, стофклокок-ков - 9CJ.протей - 40. 3 качество доноров использовали три эталонных штамма анаэробов: Cl. f.erfrlr.^ene типов A2d, B2I6, и ci.!зе;>ticua А59. Зев три штагл.в бы.ги высокочувствительны к пзницдллину (0,2 ИД/мл) а резистентны к стрептомицину (до 150200 ЫЯ/;.-л). Использовали такие 12 штаммов тсксигшшых клострп-дпй, выделенных из воздуха помещений и скорлупы лиц; из них к •п. perfringeiis ГИИу А ОТНОСИЛИСЬ 6, К ТИПУ В - 4, 1С ГИ1/у Д -X ; к (H.tüpticun - 1.

Рошиш'знтной способностью обладали а га млн к. r-oli и ога-•ллококкоп. Из 09 язоллтоз к. coli с ci.perfrintjena А23 ortM попали е.: G7, о ci.rerfrim-ene B2I6 - 39, с Cl.ßsptlcu» /■53 - А 7,

Ü3 90 изолятов стафилококков с с1, .per/rl^i^n АЙЙ окряцк-:зяись 'с\, а сi .perfringcna B2I6 - 33, с Cl .нчрисчт ЛЬ9 -

Doo 12 изодятсв токсягйншх еиааробоа облагали донор,виш c.noi'-.T.viMii. Наблгдэли ссгместныЯ перенос трог прн'-тто» :;trr

iil" П r.nt -<$й?.ТОРСЯ.

- 36 -

5.4. Способность штаммов эиерихий, стафилококков и клостридий, выделенных из комбинированного корма, к агглютинации с гппереданными сыворотками токсигенных агаэробоз

Пробы корма брали в короннике и свинарнике экспериментального хозяйства 1ТЗВУШ непосредственно из кормушек и в местах хранения. После эмульгирования комбинированного корг.н в физиологическом растворе КаС1 часть пробирок прогревали до температуры 80°С в течение 20 мин, другую часть оставляли без термического воздействия. Высевы производили на плотные питательные среды - глюкозокровяной агар, среду Экдо и МПА.

Для изолирования анаэробов в глюкозокровяной агар вносили 1000 ЕД/мл неошцина.

На глюкозокровяной агаре с неомицином из прогретых проб в условиях анаэробиоза вырастали колонии лиш> спорообразуюаих клостридий. Без антибиотика, из непрогретых проб, вырастали колонии эшерихий, стафилококков, стрептококков и др. На среде Эн-до отмечали рост в основном кишечной палочки.

Из 160 исследованных проб комбинированного корма было выделено б2 изолята клостридий, в том числе: С1.регГг1п£епе . - 54, из них относились к типу А - 36 (12 штаммов токсигенные), к типу В - 9 (6 штаммов токсигенные), к типу С - 2 (авирулентные), к типу Д - 5 (3 штамма токсигенные) и к типу Е - 2 (авирулентные); ci.B6pti.cuar выделено 6 изолятов (2 вирулентные) и 2 изолята сьоеаетаиепе (авируленгные). Все выделенные культуры анаэробов обладали гемолитическими свойствами.

Из негретых проб, которые высевали на безантибиогиковый глюкозокровяной агар и инкубировали в аэробных условиях, отби-

ради в основном колония с зоной гемолиза. Из 124 нэолитов к гемолитическим эшер;:хиям относилась 17, к стафилококкам - 97, В ТОМ числе К Staph, aureuti - 86, Staph, albus - II.

Вирулентные культуры килечной палочки и стафилококков с гемолитачоскз'.ми свойстзаш исследовали в РА., получавший нами с гиперим.гункыш сыворотками против токсигеинчх анаэробов. В качества контроля Орали токсигенныа клостридии, выделенные из комбинированного кор^а.

Самый большой процент реагирующих иэолчтоэ эшерихий и стафилококков приходился на гипериммунныа сыворотки против типов ci, perfringeno - 76; из них с сывороткой типа А - 31, тита В - 22, типа С - 7, типа Л - II. С иммуннсымроткой против ci. eepticum реагировало 92 изсллт.оз, с сывороткой против

Cl.oedeamtiene - СТОЛЬКО же, С сывороткой против Cl.cheu/oei - 62. Что касается выделенных токсиганных анаэробов, то положительные РА совпадали с результатами реакции нейтрализации.

5.5. Способность культур различных «нкро'фганинмов, выделанных из вымени коров больных :<*отцтом, к агглгтинаияп с гапериммуннкма сыворотками токсиганных анаэробов

Больных маститом коров выявляли о помощь и 52 рай вора давастана и пробой отстаивания. Исследовали 70 коров с клмшлв.., ким маститом и 96 - о субклиначоским. Всего нос падав. < но 320 проб.

Получено 57 изолятов эщврихий, п том числе 29 [>уленчhwx, яз пах с гемолитической активностью - 1Ь. И^я глсгачаолоЯ яя<штп1акапип вирулентные «•у.чт.туг» били опмчж к олр-ьчтм-'i^, OL 14, ОГОТ , 0127,

- 38 -

Выделены 72 изолята стафилококков с гемолитической активностью, относящиеся К Staphi locoocur aureus . ПОМИМО Г6МО-токсина культуры продуцировали иекротокслн. При введении кроликам 24 ч бульонной культуры внутрикохно на 3-4 сутки наблюдали некроз.

Вез 49 изолятов стрептококков были отнесены к груяло В. Культуры, выделенные от коров с клинической формой юстата, были более вирулентны для белых мыаей.

Выделено II изолятов протея, вттрулентных для белых мышей, 7 из них относились К Proteus vulgaris И 4 - К Proteus mira-buie . Патогенные пзоляты от коров с мэститамя (эшврихии 29, стафилококков 72, стрептококков 49, про те .1 II) были исследованы в РА на способность агглютинироваться с гипериммунныш сыворотками против гоксигенных анаэробов.

Все выделенные виды микроорганизмов, кроме Proteus реагаро-вали положительно с тперидаунными сыворотками токсигвкных клос.-тридий. Сашй большой процент реагируших изолятов приходился нл гипериммунную сыворотку ci. perfringens А28: Е. coli - 51,7;$, Staphilococcue aureus - 61,1% E Streptococcus - 30,65J. Ио всех пммунсывороток к токекгеиным анаэробам наибольший процент положительно роагируп'днх изолятов отмечен с сыворотками типов Cl.perfx'iJigons,

6. Иммуногеннко свойства рекомбинантных штаммов Е. coli

- зэ -

6.1. Формирование иммунитета у бетах ьзкей, зараженных субинфицирующкш дозами культуры рекомбинантов

Были использованы культуры рексмбкнантов, полученные из следующих скрестзаемнх пар: ci.perfringens А28 х E.coli KI2, CI. perfringens B2I6 X Е. coli KI2, Cl.septlcua А59 X Е. coli Н2, CI. perfringens A23 X E. coli MI, СЧ. perfringens 3216 X E. coli Cl.septican A59 X E. coli Щ.

Предварительно культуры реяомбикантов по вирулентны?.! свойствам титровал! на белых шиах. Заратали их гремя разными доза-га - 0,15 мл, 0,3 мл и 0,5 мл. Вводил! 24 ч бульонные культуры с концентрацией 4-10^ м.т/гл, подкожно в область спини. Доза 0,15 мл заметных изменений в состоянии здоровья тавотных не вызывала; при дозе 0,3 мл у тавотных развивалось незначительное угнетение; доза 0,5 мл убивала всех или 2-х из 3 мшей.

Для иммунизации выбрали дозу 0,15 мл суточной бульонной

п

т-г/льгурц с концентрацией 4.10 г.:. "/мл. Контролем служили нсход-inro реципнонтные птам.и е. coli 'Л.2 и .'Я ка !.'ИБ 24 ч pccia. ,\*7яьтурц зподллп двукратно с интервалом в 7 дней. lía 14 день л&сьоллз контрольное заражение пн&ттфованных л интактных гзг-зотг.«... З'ульгуры рекомбпнангов, яспользо?аигшо .•» качютво тсавых за:а:л:;( сйза:аш хорозо вырэгошаля икмуногонньгя спойстса?.г; закцлгароганшо белыо шел оставались яявы при контрольном за parejera /зирулонтнымя культу^ага доноров и рокомбинактов. Это ези-дэтольстБуог о сообщения репяпаентшм штамкаи S. coli KI2 и !Д зчрулектных свойств от токсигоншх анаэробов. Реципиенты, получившие Sr.t -Фактор от доноров, становилась ашунсгвщг, об./с-лсз;Ши:;:.л продохра некто от гибели вакцаюфсеантшх белпе wc,.'!

при контрольном заражении.

Исходные агаммы е. coli И2 и Ж, примененные для иммунизации, не защищали животных от гибели при заражении сгаымами как доноров, так п рекомбинантов. Следовательно, они не содержали специфических антигенов Н7 против штаммов доноров, ни против рекомбинантов.

Тем же методом иммунизировали беременных самок белых мышей - двукратно с интервалом в 5 дней между введениями, в дозе по 0,2 мл суточной бульонной культурой рекомбинантов. Было привито 36 беременных самок; контролем служили 18 непривитых шшей.

Родившимся мышатам из опытной и контрольной групп на десятый день peros давали смыв клеток рекомбинантов с агаровой среды 24 ч роста по 250 млн м.т. Мышата, родизвдеся от иммунизя-розанных матерей, оставались гсивы, от неиммунизированных - гибли, либо переболавали тяжело.

Таким образом, живые культуры рекомбинантов, используемые в субинфекци окной дозе для кммунизацг.и беременных самок белых мышей; обеспечивали формирование колострального иммунитета у новорожденных шпат.

6.2. Иммуногенная активность вакцин, приготовленных из культур рекомбинантов е.coli

Штамм Е. coli КГ2 скрещивали раздельно с ci.perfringene типов А28, B2I6, C2I9, Д2П; с Cl.eepticum А59; С Cl.oedeae-tiens А79; с Cl.chauvoei BI. Из важдой скрещиваемой пары

отбирали рекомбинанты е. coli KI2 с сообщенным свойством син-

монотеза энтеротокснна и готовили из них форшлинизированные и поливалентные вакцины. Активность испытывали на тавотных. Сравнивав лз: их с активностью вакцины из исходного реципиентного штамкз

E. coli КГ2.

Имх-унологячэскую эффективность проверили путем заражения привитых животных вирулентными культурами доноров ( CI.perfringene . Cl.eepticum , Cl.oedenatiens , Cl.chauvoei

а поливалентную - к вирулентным гагг.ю.те.1 е. coli (09, 012?, 073, 08, 02).

Иммунизировали белых шкей, морских свинок и стельных коров. Белых .\ii2ei! вакцинировали двукратно, с интервалом в 12 дней, з дозе 0,5 мл подкожно. Ка 10 день провопили контроль:;со заражение исхог.:а;м:: вирулентными культурам доноров. Моновакцинн, изготовленные из рекомбинантов стамг.а Е. coli KI2, обладали им-муногенными свойствами и предохраняли белых мышей от гибели при заражении соответствующими исходнмг.д культурами доноров; вагая-fa из исходного реципиентного таи,а е. сои KI2 иммуногенны-ма свойствами не обладала ни в одном из использованных донорных птаммов.

Поливалентная вакцина, полученная путем смошнвания в рав-кнх объемах указанных выше моновакцин, такие загущала белых мы-;:eif от табели, пр;гчем как от токсигенннх донортх штаммов анаэробных микроорганизмов, гак и от вирулентных сорогрупп е.coli.

Поливалентной вакциной кммунпзироваля 40 морских сеянок подкожно а область груди, в дозо I мл. На 21 день после повторного гшодонил вакцины провели контрольное заражение исходными шрулвнишш куль турима ( Cl.perfringena , Cl.ofideaiatienE , (il.;:t;pticu3 , S. coli ).

лульгурн предварительно титровались па морских свипк.'ос, а з опыте использовала 2Д Ш

Вакцина проявила зммукогешше свойстаа, и при аонтрольнсу зпраг.екпн псе привитые тавотные виляла.

- 42 -

С целью получения колострального иммунитета у новорожденных телят против колибактериоза поливалентной вакциной иммунизировали коров на 7-7,5 мес. сгальности. Опыт проведен на 42 коровах.

Опытных животных (21 гол.) вакцинировали дважды, с интервалом в 14 дней, в дозе 3 и 5 мл внутримышечно в обласпь крупа. Контрольных животных (21 гол.) оставили без иммунизации.

Перед иммунизацией и через 16 дней после второй прививки проверяли титр агглютининов (РА) в сыворотке крови против возбудителей колибактериоза. До иммунизации титр агглютининов в сыворотке не превышал 1:5, а после иммунизации повышался до 1:250 - 1:400.

В течение одного месяца вели клиническое наблюдение зано-воропденкыш телятами, обращая особое внимание на своевременную выпойку молозива. У телят, полученных от вакцинированных коров, за период наблюдения расстройство желудочно-кишечного тракта не отмечалось, в контрольной группа заболели 12 (57,14$?) телят. Диагноз на колибактериоз подтвержден бактериологическим исследованием.

Таким образом, поливалентная вакцина оказалась эффективным средством против колибактериоза телят.

6.3. Специфическая активность сыворотки, полученной гипериммунизацией животных рекомбинантага е.со Ii

Для гипериммунизацни животных и получения антитоксической сыворотки против колибактериоза использовали семь кроссов штамма Е. coli KI2 с сообщенной токсигенностыэ, полученных путем скреетвания авпрулентного реципиента е. coli KI2 с донорами -токсигенннш анаэробными бактериями - ci.perfringena типов

А28, B2I6, C2I9, Д2П; Cl.eepticum A59; Cl.oedematiena A79; Cl. chauvoei BI.

Вместе со способностью токсинообразоаания каждый вариант рекомбинанта е. coli KI2 приобрел антигенную специфичность. Из этих вариантов по принятой методике готовили антигены, которые сдазивали в равных объемах (Рй 7,4-7,6) и использовали для пшвриммунизацяа бычков. Активность сыворотки к вирулентным . серогруппаы е. coli повышалась до разведения 1:400 - 1:600, к штаммам анаэробов (использованных доноров) - 1:600 - 1:800.

Активность гипсриммунной сыворотки (превентивные свойства) проверили на 100 мышах (контрольная группа, 60 гол.). Испытуемую сыворотку опытным животным зводали в дозе 0,5 мл, а контроль-галл - нормальную бычьи сыворотку в той не дозе. Через 24 ч после введения сыворотки ялвогных заражали 2 DLM культур: Cl.perfringenaranOB А28, B2I6, Д2П; Cl.eepticua А59; Cl. oederoatiens A79; E. coli 0101, Olli, 0119, 09, 0128. Из 100 белых мыпей, привитых гаперяммунной сывороткой, выжила 97 гол., яз 60, привитых нормальной бычьей снвороткой, пали reo.

Испытание данной сцвороткл ■> качество лечебного средства n"or:n холлбактериоза новорожденных толя? гтокзпало пг .т.-сокуг)

isu^ подвергала: 66 гзжгс, '3 больш:: оставили для геп-"ратл. Оыгссотку вводили ьц?грзг.;«?«»чпо з область крупа. Зсо то-"лнга, подворгавтиося лочогдгэ, выздоровела. ОптимпльноЯ Сила

,т.'ээ со ?лл.

6,.4. Иммунологическая эффективность вакцины, изготовленной из эталонных штаммов ток-сигснных анаэробов против колибактериоза

Приготовление такой вакцины обосновано тем, что гоксигенные клостридии влияют на вирулентные свойства кишечной палочки, что выражается в сообщении эшерихиям анаэробными бакгерияш способности синтеза энтерогоксина. В силу подобного действия патогенные эшерихии являются носителями детерминант токсигенности анаэробов. Следовательно, вакцины, приготовленные из токсигенных штаммов клостридии, должны предохранить молодняк от заболевания колибактериозом.

Для изготовления вакцины использовали следующие эталонные штаммы: Cl.perfringene типов А28, B2I6, C2I9, Д2П; С1. вер-ticum А59; CX. oedematien8 А79; Cl. chauvoei BI. Из них готовили формолвакданы.

Вакцинировали белых мышей, кроликов, стельных коров и супоросных свиноматок. Стельные коровы и супоросные свиноматки иммунизировались за 1,5 месяца до отела и опороса соответственно. Животных иммунизировали двукратно, с интервалом в 12-14 дней. На 20 день после повторного введения вакцины проводили контрольное заражение вирулентными культурами cl.perfringene типа А28, B2I6, Д2П; Cl.septicum А59; Cl.oedematiena А79; в. coli 09, 0101, Olli, 0119, 0128. Из 100 голов вакцинированных белых мышей при контрольном заражении выжило 87, невакцини-ровакные (50 гол.) пали все.

Опыты на кроликах дали также положительный результат. Из 50 вакцинированных кроликов при контрольном заражении пали лишь 2 гол., а в контрольной группе из 30 невакцинированных выжили

только 2 кролика.

Ист га ли вакцину на супоросных. свиноматках в Крцанисском свиноводческом коглплокса Гардабанского района Грузинской ССР. Животных опытно;! грушш (СО гол.) и;ллунизировали вакиной, из-готозленнсй из эталонных итагаюв токсигетшх клострядкй (серия №4, яэгот. Л-1Э89 г.), а контрольной (30 гол.) вводилась "Вакцина поливалентная гщфОо:сисьал»5стниовая формолтиомерзало-вая" против колибактериоза (эаерихиоза) поросят (серия 12, изгот. ХП-1989 г.).

Вакцины вводили, согласно наставлению, внутримышечно з область пей, по 5 мл, дзукратно, с интервалом в 12 дной. В опытной группе из 561 народившихся поросят с признаками колибакте-риоза пало 33 гол. (5,8£), в контрольной аз 568 - 90 гол. (15,3«), Процент падежа поросят в опытной группе значительно ниже по сравнению с контрольной, что дает основание рекомендовать испытуемую вакцину для широкого применения на производство.

В Цнорско?л животноводческом комплексе Сигнагского ралона Грузинской ССР ззяли X коров на 7-7,5 месяце стельности. 18 »даров иммунизировали вакциной из эталонных игамгюв токсигенкых клостркдпй двукратно, с интервалом в 14 дней, внутримышечно в область крула, в доза 3 и 5 мл. Для контроля оставили 18 короз (не привитых). Перед вакцичаццей и через 20 дней посла повторного введения антигена у животных брал:? кровь и сыворотку, исследовали в РА с целью определения татра агглютининов к пзтоге!»-шм штаммам Е. со11 0115, 0117, С127, 0101, СПЭ, 078. До вакцинации татр агглютининов был не выше 1:5, поело вакцинации татр повышался до 1:150 - 1:300.

Родившиеся от у.ммунязярованных коров телята колибактерпо-зом но заболели, а из контрольной грунт.' заболело 8 (44,4.'?).

Эту же вакцину испытали в Телетском иголочном комплексе Гардабанского района. Иммушзировали 355 горов на 7-7,5 мес. стольносга. Невакцинированными оставили 120 стельных коров. Вводили вакцину внутри:.щ:печно в область крупа, двукратно, с интервалом в 14 дней, в дозе по 5 мл. В опытной группе коров титр ■агглютинчнов в сыворотке крови повышался до разведения 1:200 -1:300; в контрольной титр оставался на прежнем уровне.

В опытной группе колибактериозом заболело 12 гол. (3,382), в контрольной - 38 (31,662).

Результаты исследования показывают, что поливалентная вакцина, изготовленная из эталонных штаммов токсигенных анаэробов, обладает иммуногенными свойствами и предохраняет новорожденных телят от колибактериоза.

Указанную вакцину использовали для получения гипериммунной сыворотки в качестве лечебного средства против клостридиозов и эшерихиозоз животных.

С этой целью гипериммунизировали бычков. Цикл иммунизации состоял из четырех инъекций. Тигр агглютининов против клостри-дий был в сродном от 1:1400 до 1:1800, против эшерихий - от 1:400 до 1:450. В связи с тем, что птамш эшерихий агглютинировались гипориммунной сывороткой токсигенных клостридий, надо предполагать у них наличие общих антигенов. Это дало основание использовать ее как лечебное средство против анаэробных инфекций и эперихиозов. .

Гипортт.тушгуто сыворотку испытали на белых шшах, поросятах и тплятах. На белых мысах испытали превентивные свойстза. В опытной группе (ЭО гол.) пало только 7 гол., в контрольной (45 гол.) пало 44.

Испытуемую сыворотку лрпмзкилп на больных колибактериозом

. - 47 -

новоротдояшх поросятах в Криз киоском свиноводческом ко?.*ллексе Гардабчнсхого района. Предварительным исследованном бил установлен колибакториоэ. От павших и больных поросят выделили вирулентные итамгзд е. сои , отнссяшося к сорогруппсм 016, 0139. Лечили испытуемой сывороткой 1200 больных поросят, 1300 - обрабатывали с превентивной целью. Прегараг давали перорально я дозе 10-12 ш. Всего обработано 2500 гол., из :гах сохранено 2493 гол. Данные опыта подтверждают активность препарата.

Лечебный эффект данной сыворотки проверил:: на телятах, больных колибактвриозом, в Цнорском жизстнопо,оческом комплексе Сиг-нагского райокп. Исключили налитаа анаэробной инфекция. Выд'тя-лись патогенные серогрупш Е. coll 018, 086.

Было отобрано 42 больных теленка, 36 из них подвергли лечении, а 6 оставили для контроля. Вводили сыворотку внутримышечно а двух дозах - 60 и 80 мл. На каадую дозу взяты по 18 больных телят. Все обработанные телята выздоровели.

По данным опыта гипериммункая сыворотка обладает лечебным свойством, при этом оптимальнон считаем дозу 00 мл.

7. В Ы В О Д Ы

1. Патогенные клостридии видов cl.perfringene , Cl.sep-ticun , Cl.oedetnatieno И CI. chauvoei путем конъюгации

способны передавать е. coli патогенные свойства, гом^литячзс-кую активность, антигенные детер.-.^нанты и фэрмевтпос^харолитп-ческутз активность. Выявлена взаиюзавасииосгь в передаче этих свойстн и возможность независимой раздельной л односременьоЗ передачи названных признаков.

2." Ку.тьтуральрля жидкость .рекомбинангов, освобожденная

от ?.«кробннх тел, а также цельные культуры рвкомбинантов обладают кожконекротиаирующиы действием, при этом некротические свойства сильнее выражены у цельных культур рвкомбинантов.

3. Установлена способность ишунсывороток, полученных гн-перимцунизацией кроликов антигенами Cl.perfringene , CI.sep-tlcum , Cl. oedematiens , CI. chauvoel нейтрализовать КулЬТу-рц рвкомбинантов е.coli с переданной вирулентностью ог соог- .. ветстаующих доноров - клостридий. Эти же сыворотки в разведениях 1:200 - 1:450 агглютинируй! рекомбиванга Б.coll с патогенныш свойствами, переданшми от токсигеншх анаэробов.

4. Все четыре вида токсигвнных анаэробов, использованные в качестве доноров, при хоаыохвции способны передавать ревдшент-ным штаьыаы в.coil устойчивость к стрептомицину. Цри совместно» выращивании культур донора (клостридии) и реципиента ( в.coli ) в жидкой питательной среде в результате антагонистического действия эшерихий цроисходит постепенная элиминация из культура лыюй среды клеток донора.

5; Ассоциированное выращивание токсигеншх анаэробов с авирулентшми втаышыи г. coli с доследующим селекционированием патогенных особей - рвкомбинантов через организм белых мышей позволяет изолировать трансконьюганш с более выраженными то:хигекныш свойствами.

6. Низкие температуры и стрептомицин при воздействии на токсигенные анаэробы приводят к утрате ими вирулентных свойств. ДЕК от токсигенцых клостридий, добавленная к гомологичным ави-рулонтным вариантам, сообдает им утраченное свойство синтеза энтеротоксина и восстанавливает ферментативную активность.

7. Цри совместном замораживания токсигенных клостридцй с ьв::рулонтны:.а эаерихияз.и и стафилококками патогенные свойства

не передаются, но сообщаются гемолитаческая активность и устойчивость к стрепгоудцину.

8. Стафилококки и эшерихии при ассоциированном инкубирования с токсигенныш анаэробами в 0,15 М растворе Kaci приобретают гемолитические свойства, а также вирулонтность, но в значительно меньяей степени, чем у соответствующих доноров.

9. 7 эпизоотических штампов е.coli , принадлежащих к различным серогруппам и выделенных от больных и павяих от коли-бвктериоза животных, обнаружена антигенная связь с токсигенными анаэробаш - ci. perfringens , Cl. septicum , Cl. oedema-ti«ns , Cl. chauvoei .

10. Авирулентные штаммы клостридкй, эаерихий и стафилокок-коз, выделенные из внутренних органов клг.нически здоровых убойных животных и использованные в качестве реципиентов при скрещивании с токсигенными эталонными атамг.ама акаэроЗов, приобретают патогенные свойства и гемолитическую активность; кроме этого эшерихиям передается резистентность к неомицину, а стафилококкам - устойчивость к стрептомицину.

П. Вирулентные штаммы эпюряхий.и стафилококков, выделенные из объектов внешней среды, реагируют положительно в РА с гаперт.о.'ушгыки скворогкаш токсигеншх анаэробов и монорецептср-ныки сыворотками против рекембинантоа.

12, Из авнруленгных птагг.гов эзергасий, стафилококков, сальмонелл, протей, выделенных из воздуха животноводческих помещений, птичплков, содержимого яиц п сшвов скорлупы и использованных в качестве реципиентов для скрещивания с токсигенншл* анаэробами, только культуры эшеряхий и стафилококков были способны

к рекоыбикпда.

13. Вакцина, приготовлешгая кз культур тренсконьюгонтов

E. coli с сообщенной токсигенноотью, обладает кммуногекшши свойстваш и предохраняет живот!шх от табели прц заражении ток-сигзнкими культурами яьаэробов и эшэрлхий. Телята и поросята, рожденные от иммунизированных матерей, приобретают колостраль-ный имгтунитет.

14. Сыворотка, полученная гипериммукизацией животных антигенами трансконьюгантов е.coli обладает защитным и нейтрализующим свойством в отношении токсигенных штаммов анаэробов и эперихий и оказывает лечебное действие при колибактериозе телят.

15. Вакцина, приготовленная из эталонных штаммов токсигенных анаэробов, при иммунизации стелышх коров и супоросных свиноматок, обеспечивала у новорожденных телят и поросят формирование колострального иммунитета против анаэробных инфекций и коли-бактериоза.

16. Сыворотка, полученная гипериммунизацией животных антигенами эталонных штаммов патогенных клостридий, обладает лечеб-Ю1М свойством против колибактериоза телят и поросят.

8. ПРАКТЛЧЗСККЕ ПРЕДСОНЕНИЯ

На основании обнаруженного на mi явлония - переноса патогенных свойств, гомологической активности и антигенных дотор-минант от токсигешшх клостридай к е. со Ii и стафилококкам сделаны следующие предложения:

1. Доказана возможность получения гибридных штаммов с полезными свойствами в результата скрещивания токсигенных аиаэ-робных микроорганизмов с авпрулрктными эвирихиямп, сообщив при этом патогенныо, гемолитические к антигенные свойства, характерные для клосгридиГ:.

2. Разработана методика селекционирования рекомбпнантоь

at. coll из организма Селит мышей, инфицированных смесью клос-тридий с ?шерихия?,:н.

3. Разработана методика скрещивания анаэробных микроорганизмов с эяерихиями и стафилококками в физиологическом растворе i.'aCl.

4. Из рекомбинантшх штаммоа е.coli изготовлен* вакцина

I

j получека гяпериммушшя зыворстка против клостридиозов и эшери-хиозоп.

5. Из эталонных штаммов гоксигоншх клостридий изготовлена вакцина и получеш гипериммунная сыворопса против колдбакторио-за ч анаэробных инфекций молодняка сельскохозяйственных етвот-

ЧИХ.

9. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ, В KOTCFUX ОТРАЖЕШ ОСНОВНЫЕ I/ATEF/АЛЫ ГЛСС'ЕРТАЦИИ "£, Начкебия Д.В. Влияние некоторых £изичвск::х и химических факторов на свойства CI. perfringene // Бюл.ВДЭВ. - 1973. - B.I6. - С.24-26.

Начкебия Д.В., Парснания Г.В., Куликовский А.З. Изучение изменчивости ci.perfringens типа Д // Ветеринария. -Т977 - Я 10. - С.60-62.

пачквбия Д.В., Парцвания Б.В., Куликовский A.B. Ульграструк-лра походного и трансформированного штамма ci.perfringene -ina Д // Сб.трудов ГЗВУИИ. - 1977. - Т.40. - C.IB7-I92. 1,' .'Ьрцвания Б.В., Начкебия Д.В. Роль ci.perfringens з патологии сельскохозяйствошшх тавотных // Сб.трудов ГЗВУИИ. -*;977, - "Т.40. - С Л83-186. ' , 'Зарцвапия Б.В., Начкебия Д.В. Бактериальное загрязнение аез-7ха т гстьотноводчеекпх комплексах // Са.чяртвелос соллаз

- 52 -

меурнеоба. - 1977. - С.21-22.

6. Парцвашш Б.З., Нг.чкабия Л.В. Клострндш во внутренних органах животных // Сакаргвелос соплис меуртеоба. - 1Э78. - Я 3. - С.14-15,

7. Парцвания Б.В., Начкебия Д.В. Патогенные клостридии в паренхиматозных органах клинически здорозых убойных тавотных // Тр. ГрузСХИ. - 1978. - Т.103, в.41. - С.23-30.

8. Начкебия Д.В. Обсемзненность внутренних органов с.х,животных штамгвми Б.coli и ci.perfringens // !.!n?ep.I респ.конфер, в обл.кивотновод. и ветеринарии. - Тбилиси, 1979. - С.104-106.

9. Парцвания Б.В., Начкебия Д.В. Эпсилон-токсин в вегетативных клетках cl.perfringens типа Д // Тр. ГрузСХИ. - 1980. -Т.109, В.43-44. - С.67-73.

10. Самойленко Е.Б., Джикия В.Г., Начкебия Д.В. Диагностика и лечение маститов коров в Крцанисском экспериментальном хозяйстве // Матер. П респ.кснф.1ТЗВУ/!И. - 22-25 сентября 1982 г., Тбилиси. -Т.. 1982. - С.106-107.

XI. Начкебия Д.В., Джикия Л.Г., Гвардааладзе В.И., Уруаадзе А.Я. Определение лизовдмной активности яиц, облученных лучами ге~ ■ймй-неовового лазера // Всесоюз.науч.-произв.сов.по примен. оптич.излучения в с.х.произз. / 11-14 сентября 1984 г., Львов/. - Л., 1984. - С.32.

12. Гварджаладзе В.И., Дкикия Л.Г., Начкебия Д.В., Шаматава З.П., Цхакая Т.Н. Бактерицидное действие лучей лазеря на возбуди-толей колпбактериоза птиц // Задачи птицеводства в выполнении Продовольственной программы СССР: Тезисы докл.науч.конфврен. /22/24 октября 1Э85 г., Баку). - Б., I9S5. - C.I9S-I99.

•13. Начкебия Д.В. К вопросу вирулентности е.coli // Сакартве-