Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Влияние стимуляторов на продуктивность перевиваемых хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота культур клеток

министерство сельской) хоачйавА И продовольствия российской федерации (Лосковся&ч вэтаринариая акахцемяя им. К.И.Скрябина

г Г Б ОД

I 7 ОКТ "¡р^Л На правах рукописи

' '. кош ДИАРРА влияние стимуляторов на продуктивность перевиваемых хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота культур КЛЕТОК. •

16-.00.02- патология, онкология и морфология яивотгшх 16.00.03- ветеринарная микробиология,вирусология,ЭПИЗООТОЛОГИЯ, МИКОЛОГИЯ и июлунолбгия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учечой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994 г.

' Работа внтголЬнеяа в Московской ветеринарной академия им. & К.И. Скрябина.

■Научные руководители : академик РАСХН,доктор ветеринарных: наук

профессор ШИШКОВ В",П. кандидат биологических наук , старший

науччий сотрудник КРИКУН В,А,

ОФипяачьнне отттючпчта:

доктор ветеричврчнх наук КУНАКОВ A.A.

Доктор биологических неук, профессор ВОРОНИН Е.С.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии ' .имени Я.Р. -КОВАЛЕНКО ,

Защита состоится "-S^"" /СО 19Э4 г.в ^^^асов на заседании специализированного совета Д V<iÖ.36.Ql по защите Диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московс ветеринарной академии им. К.И. Скрябина 109472, ул. академика Скрябина 23 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ааддемяи. Автореферат разослан " 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совзта

Слесореико H.A.

лАРЛКТВЕИСТйКА РАБОЭД

Работа посвящена изучению влияния стимулирующих препаратов на хронически инфицированные ВЖРС культуры деревина емьк лини;* клеток РЬК-В1У и ТЭК ЫВА 76, на репликацию вируса и продукцию вирусных днтигенов.

Актуальность исследований. Лейкоз крупного рогатого скота -хроническое инфекционное'заболевание опухолевой природы, наносящее народному хозяйству значительный экономический ущерб, слагаюидайся из вынужденной преждевременной выбраковка и убоя лшвотных, недополучения, приплода, снижения продуктивности, ограничения пле^шсолаки и реализации молока,, утилизации пораженных туи, а такие потерь, связанных с оздоровительными мероприятиями в неблагополучных хозяйствах.

Зпизоотологические исследования 1£64; 1тюп А о1.)

1968)' и экспериментальное воспроизведение лейкоза у крупного рогатого скота и на чвцах (Меи^г^е! <? , 1зй8) позволили предполокить инфекционную природу этого заболевания.

В 1969 г. отШь Т-М. с соавторакш обнаружит и выделяла от больного лейкозом животного вирус типа С. На основан:;;: морфологических, баохшачесгах и ш.гуйологических свойств выделенный вирус бил классифицирован как онкорнавирус , 1974; Жданов и

др., 1974),.изучены его ультраструктура и морфогенез ( Меныаикова а др., 1984а1. , 1977). пути передачи хз79;

Валихов, 1978; Крикун, Х984), разработанны эффективные методы иммунодиагностики {Ихы/^С^МпЛ Л 01, 1975; ^дд е&€ УАа&Ьь. , [974, 1976).

По биохимическим и морфологическим свойствам вирус лейкоза крупного рогатого окота млеет много общего с открытии в последние годы вирусами Т-клеточных лейкозов человека, что еце более ювышает значимость исследовании лейкоза крупного рогатого скота ■ с

как уникально:-: модельной, системы., . . ?

' Разрабатываются эффективные мэры про&идактикн а дута оздоровления хозяпсте, неблагополучных по лейкозу, на основании серодиагностики (Крикун и др., 1954; Кахглансон, 1586). Однако широкое использование иглглунодпагностики. лейкоза крупного рогатого скота стад хавается с трудностями,' СЕЯзанныли с наработкой необходимого количества вируса к вирусных антигенов. •

Для получения препаративных количеств вируса лейкоза крупного рогатого скота (Е'ЛчгС) п его антигенов в начале использовались первичные культ-.-ры клеток крови большзс лейкозом животных VI й(., 19С9).. Б последуще;л были получены перевиваемые- культуры -клеток,хронически инёнцпровашшЕ ВЫСРС ($м^^иЧКаМем' , 1374, 1976;

Крикун и др., 1979), которые позволил;: стабильно получать глзкопротеидай и полипептидный - антигены БШС.

* . ^ Ееобходикость получения препаративных количеств ШоСРС и его

раотворкла антигенов яда приготовления вакцин и диагностиков диктуег поиск новых ко;лпонентоь питательной сроды, позволякцкх сти-дуллровать репликации БЗКРС и продукт® его антигенов в культурах Е8ревавазшх хронически ин-.Т.-иццровашшх линиП клеток.

Б свези с этим, указанные причины делавт разработку элективных методов получения вируса лейкоза крупного, рогатого1скота и его растворимых антигенов в перевиваемых культурах клеток задачей весила* актуальной, от решения которой во 1,:аогои зависит экскошЛ-кое производство диагностпкуков и вакцин дрстнв лейкоза крупного.,, рогатого скота.

Цель и задачи исследования. Цельу настоящей рабоп* было,-изучение особенностей течения хронической инфекции аир-уса лейкоза,,.-.-, крупного рогатого скота в перевг.ваеьик культу рах. клеток й'опреде-ление опии,ильных условии Для ;прсдукдии' вируса;.н; како:яедия::раст-„'

воримого гликопротеидного антигена в культуральной жидкости при воздействии стимулирующих препаратов.

В соответствии с целью работы были поставлены следущие задачи:

1. Изучить морфологии клеток двух перевиваемых линяй клеток,хро-нически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

2. Изучить влияние инсулина, диметилсульфоксида (ДМСО). и полибре-на на ростовые и морфологические параметры перевиваемых культур клеток, хронически 'инфицированных ВЛКРС.

3. Дать оценку антиген- я вирус-продуцярупцей способности перевиваемых клеток ЬЬ V и ТЭК МВА 76, выращенных на средах с добавлением различных концентраций инсулина, ДМСО и полибрена.

Научная новизна.' Дана характеристика "культуральным свойства« двух перевиваемых линий клеток хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Изучено влияние различных доз инсулина, диметилсульфоксида и полибрена на морфо-функциональные особенности хронически инфицированных ВЛКРС перевиваемых линий клеток в процессе пассирования.

Изучены закономерности развития хронической инфекции ВЛКРС в переваЕае1щх культурах клеток при различных условиях культивирования. '

Остановлено стйлулдрузздео действие инсулина на проляфераднэ пэрзвлваеглнх-клеток, хрондчосгл инфицированных ВЛКРС..

Похазапо стямуляруидео дейстаяв ДГ'СО на развитие хронической иЕфбкцип БИРС в ксрвзпваекнх культура клеток и на продукцию растворимого гликопротеидного антйгеяа.

7с?аноплено, что поддкаткоп подабрен способствует усилению Еяруспродукцтш в хронически лн'ТлЗцарованннх ВШС перевираемых кульгурах клогок.

Выявлена•корреляция мекду репликацией ВЛКРС, выявляемо}';» в гесте еннцитиеобразоваяля, с продукцией растворимого гликопротеад-кого антигена, определяемого в реакции тлунодиффузви.

Практическая ценность работы. Результаты исследования препаратов, влияющих it-j рост и продуктивность перевиваемых линий клеток, хронически инфицированных БЛКРС, могут быть использованы для поЕшенЕя эффективности и экономичности производства диагностикумо • и вакцин.

Цублккацик. По теме диссертации опубликована I статья и 2 сданы в печать.

Апробация диссертации. Материалы диссертации додоаени на научно-методической конференции по патологической анатомии сельско хозяйственных шшотных (г.Вороне?., 1993 г.), на научно-ыетодическо

меявузовскоЗ конференции по подготовке кадров для зарубеглкх. стран »

С.ША, 1993 г.) и заседаниях Ученого совета ИВА.

_ Объем к структура работн. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результате к выводов.

I. СОБСТВЕННЫЕ КССЯ£Ц0ВАШ1Я 1.1. Материалы г. методы.

Работу проводили в лаборатория ге;.:сбластозоь к шй.уко:.:одуля-торов :,"оскоеско'' ветеринаркой акаде^я к.:. К/Л.Скрябина.

В работе использовали дзв перевиваемые линяв глоток,хронически и&ТицпроЕзнннэ вирусом лейкоза хрупкого рогатого скота, подученные из почки эмбриона овцы (РиС-ВИ/ ) а-ткауса эмбриона коровы (ТЭК4£ВА--7С) и кошачью линия клеток, тган&^орюгрованную вирусом ; ■

саркомы Ьшией (CC-8I).

Перевиваемые линии клеток культивировали в 300 мл матрассах с использованием среды Игла и ¡99 , взятых в равных соотношениях с добавлением 10$ сыворотки крови плодов коров и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл). Посевная концентрация клеток составила 3-5 х I04 клеток в I мл. Клетки культивировали в течение 4-7 суток при 37°С- С поверхности стекла клетки снимали смесью 0,02$ раствора Версена с 0,05£ раствором трипсина в соотношении 9:1. Для изучения морфологии клетки выращивали на покровных стеклах в пенициллиновых флаконах. Морфологию оценивали в фиксированных метанолом, окрашенных по РоманоЕСкому-Гимза препаратах, заключению: в бальзам.

Жизнеспособность клеток в культурах определяли методом исключения красителя г- 0,1$ трипанового синего. Ростовые свойства ком-ианентов питательной среды определяли путем вычисления индекса пролиферации (отношение количества выросших клеток к количеству за-зеянных). • ■

Для выявления инфекционного вируса лейкоза крупного рогатого зкота в культурах.клеток использовали тест синцитиеобразоваипя [ТСО), основанный на способности ВЛКРС образовывать синцитии в чувствительных культурах клеток. В качестве тест культуры использовала перевиваемке^клетки CC-8I, выращенные на покровных стеклах ' з пэшшдялиновых флаконах. Через'5 дней культивирования зарааен-ше и не зараженные иидикаторные клетки на покровных стеклах фиксировали метанолом и окрашйвали по Романовскому-Гимза. Синцитием ;читаля многоядерную клетку, содерзаяу» не менее 5 ядер.

Антигоны ВЛКРС получали из культуральной аидкостл путем ее '0-кратной концентрации методом форсированного диализа против СЭГ-бОСО. Антигены проверяли на специфичность и активность с по-2-Э£0 . ,

мощью реакции иммунодиййузии (РИД) в геле агара. Учат реакций проводили через 48 часов инкубация чашек Петри во влажной камере при 20-27°С, путем просмотра в проходящем рассеянном свете.

Реакцию считали половительной, если между лункой с испытуемым антигеном и контрольной специфической сывороткой образуется полоса преципитации, или испытуемый антиген способствует загибу контрольной линии преципитации в сторону центральной лунки с контрольной сывороткой. Титром антигена считали его последнее разведение, формирующее линии преципитации или способствующее загибу контрольной линии преципитации.

Все-цифровые данные, полученные в экспериментах, статистически обрабатывали по Е.В.Гублер? (1978) и Г.ф. Лакину (1980).

1.2. Результаты исследований.

1.2.1. Морфологическая и культуральная характеристики пере. , виваемых линий клеток, хронически.инфицированных ВЛКРС.

Культуры клеток на уровне 200-350 пассаже!: были

представлены бибробластоподобными полигональными клетками. В краевой зоне иояослоя в дативных культурах на 3-4 сутки наблюдали равномерны:/. ориентированный рост вытянутых клеток. Клетки были светлыми .рефрактклышки со слабо проявляющейся зернистостью цитоплазмы. В окрашенных по Рошнозвскому-Тимза препаратах в фибробласто-подобных клетках просматривалось центрально расположенное ядро овальной форма, содержащее 4-6 ядрышек..Цитоплазма меток.была сл! бо эозано^'Ильна и.имела нежно зернистую структуру. В монослов клс-ток иногда встречались атипичные форма, которые были представлены гигантскими-клетками о одним большим ядром. Довольно часто встречались 2-х и 3-х ядерные клетки. Клегкл.с четырьмя г больаиы количеством ядер встречалась крайне.редко.-На згех стадах культави роБднля вабтщаш: ашадгельиоС^сяо^»крухиявдюсся 'кйемк^равйо-:

царяо располагающихся по всему монослою ( по-видимому, отмирающие клетка). Клетки, обладают выраженными адгезивными свойствами, прочно удерживаются на стекле.

Через 1,5-2 часа после засева основная масса клеток прикрепляется к стеклу, а через 4-5 часов наблюдается распластывание клеток. 'В сформированном монослое клетки приобретали вытянутую форму, располагаясь ориентированно, формируя клеточные тяжи..В последутам появляются фокусы'многослойного роста. После сформирования плотного монослоя начинается общий процесс старения хиеток. Клетки приобретают равномерную выраяенную зернистость. Без смены среды через 10-15 суток начинается отслаивание пласта клеток от стекла. Через 20-25 суток после"пересева проявляется полная дегенерация клеток.

■ Перевиваемые клетки линии ТЗК МВД 76 на разных уровнях пассажей имели стабильную морфологию и были представлены эпителиоподоб-ными клетками. Крупные ядра клеток округлой формы располагались в большинстве эксцентрично. В них различался мэлкосетчагий хроматин и 3-6 ядрышек. По размерам клетки ТЭК МВА 76 были менее стабильны, чем РЩ-&Ц/ . :,Нередко встречались гигантские клетки с больпш круГ-Тсм.. ядром с 1С-12' ядрышками. Цитоплазма клеток обладала ела-бой зернистостью и выраженной эозинофильностью. В монослов клеток иногда встречались 2-х и 3-х ядерные клетки а очень редко клетки с -четырьмя 'ядрами, -В нативных культурах диЖйузно по всему монослою наблюдались округлившиеся (отааршшше) клетки.

Клетки обладают слабо виракекно;* адгезивной активностью и . легко снимаются раствором Версена с поверхности стекла. Через 1,5-2 часа после посева большая часть клеток прикрепляется к стеклу, а через 3-4 часа начинает распластываться.

Прп низкой посевной концентрации (ЗхЮу кл/мл среды)через

- Б -

сутки--формируются островки роста'с ровными краями. К 3-4 суткам oci ровки сливаются и образуют оплошной монослой.. Затем ыонослой уплотняется, клетки приобретают круглую (Тхзрму. Без смены среды к 10-П суткам клетки стареют, становятся зернистыми и даЩгзно сползают в среду. . • /.'•

1.2.2. Действие инсулина на пролиферацию хронически инфицированных ЕЛКРС перевиваемых клеток, на репликацию вируса и на продукцию его растворимых антигенов. \ Целью настоящих исследований являлось изучение возможности повышения продуктивности'хронически инфицированных ВЛКРС культур клеток под действием инсулина.

Известно, что инсулин оказывает стимулирующее действие на транспорт глюкозы и нейтральных аминокислот, включая аданин, серин, цастенн к леГдан в тканях кивотных ( hJ/tiI е^" о/.., 1984 it ol., IS89) и тем'самым повышает метаболические процесса "и стимулирует пролиферацию клеток и репликацию вирусов.

Б наших исследованиях действие инсулина изучали на хронически инфицированных культурах клеток Fil!» Ы-/ и ТЭК МВА 76. Инсулин добавляли в питательную среду в дозах 0,5; 1,0 и 2,0 ед/кл. Каздую дозу испытывали на трех параллельных культурах. Установлено; что инсулин в указанных дозах не оказывает токсического действия на : югетки обеих культур на протянении 10 пассаяеП (срок наблюдения), не изменяет их морфолога» и адгезивные свойства, 1изнеспособность клеток оставалась в пределах S6-S7/Î, как и в контрольных культурах.

Добавление инсулина в питательную среду в дозах I к 2 ед/ià существенно (Р<0,01) повышало проли$-еративвую активность адоток : обеих линий и сопровождалось ускорением $ормвровзнвя монослоя примерно' на. сутки - по сравнению е контрольной культуряш. В . дозе 0,5 ед/кл среды инсулин не оказнваа• аэгзтного .влаяизая^ва.размяр'-гГ-:-яение клеток в культурах.

В табл. 1.2.2.I. представлены данные о влиянии различных ; доз инсулина на накопление вируса и растворимого гликопротеидного антигена ВЛКРС в культурах клеток. ;

Таблица I.2.2.I. .

Влияние инсулина на продукцию вируса лейкоза крупного рогатого скота и вирусных антигенов в хронически инфицированных культурах клеток FLtL-fcU/ . и ТЭК МВА 76 (итоги 10 пассажей).

Культура ■ клеток Концентр мдея инсулина в среде, ел/щ Посевная концент-тЯ кл/мл Титр ГП антигена в Р/Л Продукция * ВЙСРС в ТСО

FU- Ш 0,5 • Зх104 1:6,2 53,1

1.0 . Зх104 1:13,6 168,6

2,0 Зх104 . 1:13,8 173,2

контроль ЗхГО4 1:5,6 48,9

ТЭК-пШ-76 0,5 ЗхГО4 1:3,2 . 30,9

1.0 ЗхГО4 1:10,4 75,5

2,0 ЗхГО4 1:10,8 78,7

контроль ЗхГО4 1:3,0 25,7

' Р 4. 0,001 '■ Х1"»»»««*^ &

Суммированные данные по 10 пассажам-указывают на то, что в . дезе 0,5 ед/г.га инсулин не оказывает существенного влияния на на-:опление гликопротеидного антигена в культуралвной явдкости. -Тит-щ антигена суцвтавенно но отличались от титров в контрольных куль-■урах. Повышение дозы инсулина до I ед/мл сопровождалось повше-яа.м продукции антигена примерно-в2,4 рйза в культурах клеток U-R.LV и в 3,4 раза в культурах клеток ТЭК 1.ГВЛ 76 (Р<0,00Г)'. :овшение дозы инсулина до 2' вд/мляе:' сопровождалось дальнейшие по-шеялем титров зятигеиз в культурэдьной гадости обеих культур леток*' ' ; ■ . - - .. . .

• - ГО -

'Продукция инфекционного вируса, определяемая в тесте синци-тиеобразования (ТОО), в культурах с добавлением инсулина в дозе '0,5 ед/мл шфательной среды также не изменялась по сравнению о контрольными культурами, тогда как добавление инсулина в дозе

1 ед/мл среды сопровождалось увеличением репликации инфекционного вируса в 3,4 раза для культур клеток ЛИ- BL^ и в 3,3 раза для ТЭК МВА 76 (Р<0,01). После добавления инсулина в концентрации

2 ед/ад' продукция вируса в обеих культурах оставалась на прежнем уровне. -

Увеличение концентрации вируса и вирусного антигена в куль-.турах, обогащенных инсулином, можно объяснить более активной прод] • ферацией клеток. При этом оптимальная стимулирующая доза инсулина для'используемого типа, питательной среда составляла I ед/мл среды

1.2.3. Действие даметил сульфоксида на течение, хроническо; инфекция ВЛКРС в перевиваемых культурах клеток.

Диметил сульфоксид (ДОО) способствует проникновению вируса ' в клетку и нашел применение в тесте синцитиеобразования (ТСО) дд выявления инфекцконного ВЛКРС (jfoka/y)., gi сЛ. # IS84, 1985; Борисенко н др., 1990). Кроме того, ДМСО продлевает продуктивное состояние клеток даже в культурах со сформировавшимся плотным мо-нослоеы CTwvOvia ¿t d> IS85).

Исходя из перечисленных свойств ДМСО, мы поставили задачу изэ чить действие препарата на течение хронической инфекции ВЛКРС в перевиваемых .культурах клеток ТЭК МВА 76 и FLK-BIV. находящихся в различных физиологических состояниях (б период активного роста а в период сформировавшегося монослоя).'

Б первой серив опытов изучали влияние 'различных доз ДЫСО на аазнеспооббаость клеток, индекс пролиферации и сроки формирована гиопослоя па протяжении 10 пассакей.

В концентрациях 0,5 п 1,0% в питательной среде ДМСО не оказывал токсического действия на перевиваемые клетки. Показатели яиз-неспособностп, индексов пролиферации и сроков формирования монослоя в обработанных этими дозами дасо культурах не отличались от этих показателей в контрольных культурах.

В культурах клеток обеих линий, содержащих ДМСО э концентрации, показатели индекса пролиферации а срока формирования монослоя была несколько низе, чем в контрольных культурах. Доведение концентрации ДГЛСО в культурах до 3% оказывало заметное токсическое • действие на клетки. Существенно сшдиалась жизнеспособность клеток, более чем в 2 раза снижался индекс пролиферации, увеличивались сроки формирования монослоя.

В концентрациях до 2% ДМСО но влиял на морфологические характеристики ¡щеток. Адгезивные свойства клеток такяе но изменялись на протяЕенйи 10 пассалеП.

Во второй серии опытов изучено влияние различных доз ЖСО.на продукции инфекционного вируса п глпкопротевдного антигена в перевиваемых культурах клеток ИЛ- Ей/ я ТЭК 1ЛВА 76 на протяжении 10- пассазей.

'Добавление в культуральную'Среду 0,5^ ДГЛСО не оказывало заметного влияния на репликация вируса и продукцию гликопротеидного антигена в обеих культурах. Пассирование перевиваемых клеток ГЗК .'.SA 75 и FLK-LLV с использованием среды, содержащей 1% ДМСО, сопрОЕовдаетс'я'повышениом продукции вируса. -ВируссодвряащиЕ материал из такиа: культур индуцировал в 1,4 раза больше синцитиов по сравнении с контрольными культурами (Р40,01)'(Табл. 1.2.3.1.). •. ECO в "концентрации способствовал также повышению продукции глйкопрбтеидного антагеиа ВДКРС в культурах клеток ТЗК ША 76' в С,5 разз (Р<С,С1) и в культурах-клеток FLt'-ULtf в 1,7 раза

:?<O,ODIV. ■••■■■•■

При -увеличении концентрации ДЖО в питательной среде до 2% и 3& отмечалось заметное угнетение репликации вируса в хронически ин-^фицированяы*, культурах клеток ТЭК МВА 76 в 2,5 и 14,8 раз, а в культурах клеток FLI-BLV в 2;17 и в 10 раз соответственно. При

этих хе концентрациях ДМСО в обеих культурах значительно угнета-

' "t.-' •.■■•*

■дась продукция вирусного антигена.

Таким образом, добавление, ДМСО в питательную среду до 1% концентрации сопровождается усилением репликации вируса и выработкой . гликопротеидного антигена в обеиххронически инфицированных линиях клеток при длительном культивировании (не менее.7 Дней).

Таблица 1.2.3.1. ' Влияние ДЩ) на продукцию вируса лейкоза крупного рогатого скота и вирусных антигенов в хронически инфицированных культурах клеток FLU-SLY и МВА 76 (итоги ГО пассажей) .

Культура клеток Концентрация дасо в "• среде. ■ ; Посевная концент-я кл /щ Титр ГП антигена -в РИЛ Продукция БЖК в ТСО

PU-6LV. 0,5 ЗхЮ4 1:5,2 • 90,02

1,0 Зх104 1:8,8 118,16

2,0 Зх104 • 1:3,0 33,78

3,0 Зх104 цельный 8,36

контроль Зх104 1:5,0 84,29

ТЭК МВА 76 0,5 Зх104 1:3,8 57,15

1,0 , ■ Зх104 Х:4,8 . 71,15

2,0 Зх104 1:06 18,73

3,0 ' Зх104 цельный 3,25

контроль Зх104 1:3,4 48,25

Р ¿0,001

¿>. квли1<otX&o cwmHA-TiAte A. -i •

1.2.4. Воздействие полибрена на продукцию вируса и •ликопротеэддого антигена в хронически инициированных НЕКРС ;ультурах меток П^-ЬИ/ .и ТЗК 1.ША 76.

Введение в культурадьную среда полиброна поннпает чувстви-•ельность клеток мишеней к инфекционному вирусу ВЛКРС 978). Полябрен, являясь поликатионсм, действует на мембраны кло-. ок мкиеней, делая их более чувствительными к абсорбции и проник-овеншэ вируса в метку Уи^х , 1969).

Целью наших исследований било определение оптимальных концеит-аций полибрена для получения максимального выхода вируса и его ликопротвидного антигена в хронически шфщвроваиних ВЛКРС пере-иваемых клетках 11 ТЗК ГЛБА 76.

Полибреи в концентрациям 2, 4 и о миг/мл добанляли в питатель-ую сроду и выращивали культуры клеток в течение 5 суток. Посевная оза составляла 3x10" клеток в I мл среды.

В .концентрациях 2. к 4 мкг/мл среда полкброн не оказывал вы-' «ленного токсического деЗсгвия на клетки и ТЭК 'ЗА 75.

роки формирования моносдоя в обоих культурах при этих дозах до-лбрека па протяжении 10 пассэяеП не отличались от контрольных /льтур. Показатели казнеспособнозти и индексов пролиферации в Зработанннх полпбреногл культурах клеток такко существенно по от- ' гёалаоь от о?их показателей в контрольных культурах.

Однако, в дозе 3 мхг/мл полябрен заметно угнетал проля®ор8К».г> геток и задергивая сроки форетрованая моиослся и обеих культах.

Продукция вируса з 4-х суточных культурах клеток рЦ-31.1/ ■К ;,ЗА 75, рцраценних с добавлением подпбрена в кощеятрацкдх и, 4 шсД'-л била в 2-2,5 раза шзе, чей в. контрольных культур-иг., . 1 продукцию. гяш<опрстеп;ц-:ого адтягейа полабрек в дозах 2.и 4 т/ъ'Л не ока задал существенного: влияния на протяжении ГО пзсса-* (габл. 1.2.4Д.).

- Таблица 1.2.4.1. .

Влияние разных концентраций полибрена на продукцию ВЙСРС вирусных антигенов в хронически инфицированных культурах клеток РИ-ШЛ и ТЭК ЫВА 76. • •

.Культура Концент-я Посевная Титр ГП " Проеткци^

клеток полибрена в cœne: мкг/ш концент-я кл/мл антигена в ИШ ВЛКРС в тех

FLt-BUV 2 ЗхГО4 • 1:6,4 53,02

' 4 ., Зх104 > 1:6,0 73,16

8 . ЗхГО4 1:2,6 • 25,61 ■

контроль ' Зх104 1:6,8 36,5

. ТЭК MBA 76 2 ЗЛО4 . 1:3,4 27,4

' 4. . зло4 1:4,0 33,5

8 • ЗхЮ4 1:1.3 7,8

контроль ЗхЮ4 1:3,8 13,8

Л. . „лvVHlte tMtyJMuU Л

Р<0,001

Установлено, что ем»на среды в-культурах с пологостью сформированным мошслоем (обгччо на 3-4-Я дечь культивирований ка среду, содержащую полибрен в концентрации 4 мкгДи, сопровождалось заметным приростом содержания ияфакщюнчого вируса, выявляемого , в ТОО чераз 18-24 часа культивирования,по сравнению с культура;.®, выращиваемыми баз смены сроды В точение 4-х суток £табл.1.2.4.2).

Применение полиброна в более высокой концентрация Г 8 щег/ш) сопровождалось сяигонном продукции вируса и подавленной выработки ; ганкоцротейдяого антигена.

В результате проведенных исследований нами определены концеил рации полибрена (2 и 4 ыкгДиО^ не снажавдие аизнеспособностъ и прс лвфератЕБнуа активность клеток и усиливающие репликаций 'ВйКРС в ■ хрони часка инфицированная перевива ешх культурах клеток F Lit -8t./

ТЭК ЫВА 76. ■

Таблица 1.2.4.2. ■■ Влияние смены среды на инфекционность ВЛКРС в перевиваемых ' культурах клеток.

Культуры клеток Концентрация полибрена в среде, мкг/глл Среднее кол-во синпитяев в X псеп.

через 4 суток культивирования через 24 часа пос ле смени соедн

ри-яи 4 68,46 187,62

ТЭК :ж 76 4 32,85 1С?, 36-

Р^О.ОО!

Такт.! образом, нами изучено влияние трех препаратов: инсулина, ДМСО и полибрена на рост и продуктивность двух перевиваемых .. культур клеток, хронически инфицированных БИРС. Определены оптимальные дозы препаратов, при которых повышается репликация вируса и продукция растворимого глпкопротоидного антигена ВЛКРС.

Применение указанию; препаратов позволяет повысить выход вируса и вирусных антигенов на единицу объема питательной среды и существенно снизить материальные затраты при крупномасштабном . производстве диагностикумов и других вирусных препаратов.

ВЫВ О ДЫ

• I. Вирус лейкоза крупного рогатого скота монет вызывать, хроническую.инфекция в эпитвлио- а фнбробластолодобных культурах ¡меток, полученных из различных тканей разных видов животных - кр^л. 3 . 2..Хроническая инфекция перевиваемых клеток протекаем без выраженного. цитопатрг.енного-; эффекта -и -сопровоадавтся репликацией ийекционного: ¿ирусйпродущиеП -растворимых вирусных антигенов.

3. Добавление <*ясуд:'.яд в дозсх I и 2 од на ^ мл питательной ;редн 'усиливает пр6лп.~'арацик хронически' инфицированных га^ л

ШКРС культур клеток ТЭК МВА 76 п ßLV , повышает репликацию вируса и продукцию вирусных антигенов.

О '4. Диме^алсульфоксид (Д1ДС0) в 1% концентрации в питательной среде не влияет на пролиферацию клеток, но способствует переходу клеток из непродуктивного состояния в культурах со сформировавшимся монослоем в продуктивное состояние и повышает выработку инфекционного вируса и вирусных антигенов.

5.:Поликатион - полибрен в Дозах от 2 до 4 мкг/мл, увеличивая пороэность мембран клеток мндтней, делает их более проницаемыг,ш для ВЛКРС.и повышает выход инфекционного вируса в хронически инфицированных культурах клеток.

6., Наиболее интенсивная репликация ВЛКРС в хронически инфици-. рованных культурах-клеток происходит в период активной пролкфераци: клеток, .до сформирования сплошного мон'ослоя.

7. Для максимального накопления инфекционного гируса в хронически инфицированных культурах клеток необходимо на 3 сутки культивирования сманить культуральную сре^у на среду, содержащую по-лкбрен, и собирать Еируссодеряащую нидкость через 24 часа после смены среды.

ПРЖШЧЕСШЕ ПРЕИ10ЕЕИШ . .

1. Результаты, изложенные в диссертационной работе, могут быт; использованы в научно-исследовательских лабораториях при культивировании вируса лейкоза крупного рогатого скота в перевиваемых хронически инфицированных ВЛКРС культурах кл&ток FUl - &1У и ТЗК мва .' как с целью изучения механизмов хронической инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота ин витро, так и для изучения его биохимических, антигенных и других свойств.

2. Применение указанных препаратов позволяет повысить выход Еируса и вирусных антигенов на единицу объема питательной среды и существенно снизить материальные затраты при крупномасштабном

производство диагностикумов, вакцин л других внруокых препаратов".-

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЬК ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Конда Диарра, Крикун В.А., Шишков В.П. Морфологическая оданка стимуляции продукции вируса лейкоза крупного рогатого скота в перевиваемых культурах клеток под действием дпмагалвудьфокевдаУ / Диагностика , патогенез,патонорфология а профилактика болезней сельскохозяйственных животных: Материалы Всероо.науч.-мвтодич.конф. по патолог.анатомии с-х животных /19-21 окт.1993 г. Воронеж/, 1994.- С. 84.

Готопрчнт & пег Оё,-/п,л.

фсрмят ¿0х 9с'//& -О 2.2О Тир, 1СО ,